CN108883069B - 基于酯化/皂化的用于微脂体负载的方法 - Google Patents

Abstract

本文描述一种于添加烷酯基而形成酯化的化合物后，负载亲水性化合物至微脂体的方法。负载之后，烷酯基水解而再次在微脂体内部形成亲水性化合物。本文亦描述一种负载呈葡萄糖醛酸苷甲酯形式的药物至微脂体的方法。在微脂体内部，药物的葡萄糖醛酸苷甲酯形式皂化成药物的葡萄糖醛酸苷形式，以优选保存药物。当细胞吸收、微脂体降解及酵素水解后，可从细胞内移除结合至药物的葡萄糖醛酸苷残基，以再次生成母体药物。就癌症而言，此方法可用于安全地递送药物至肿瘤。

Description

基于酯化/皂化的用于微脂体负载的方法

技术领域

本发明涉及葡萄糖醛酸苷酯(如葡萄糖醛酸苷甲酯)的负载及在pH梯度微脂体内皂化为葡萄糖醛酸苷。

背景技术

微脂体是生物稳定的脂质囊泡，制造来携带药物至标靶组织，且数个微脂体药物目前已于临床上使用。多数FDA已核准或于临床试验第II/III期用以运载抗癌药物的奈米粒子为微脂体^1-3。微脂体呈现众多的优点，诸如具有生物兼容性⁴、非免疫原性⁵、在循环中稳定但在标靶位置分解时，可100％释放其负载。微脂体包覆主要的缺点包括难以主动负载药物至微脂体以及对微脂体内的疏水性药物具有较差的保存(retention)^6-8。未成熟「爆裂」释放及自微脂体持续泄漏药物不仅会对健康组织产生有害的副作用，亦会由于降低标靶负载而减低治疗效果。疏水性药物亦会使微脂体膜失去稳定性，导致甚至更快释放所包覆的药物⁹。亦观察到疏水性药物的负载受限于膜内快速形成的针状沉淀物¹⁰。另一方面，负载于微脂体的亲水性药物累积于水核内且不与微脂体膜进行交互作用。此等剂型更加稳定且较少受上述问题影响。然而，微脂体膜较差的溶解度使高浓度的亲水性药物难以主动负载至微脂体内。

可藉由添加诸如糖部分的亲水基团以降低药物的疏水性。糖结合后显着增强亲水性的良好实例为在疏水性药物的母结构上添加葡萄糖醛酸苷残基^11-15。将葡萄糖醛酸苷部分附接至疏水性药物是预期大量降低药物自微脂体的泄漏。反过来说，其可促进疏水性药物稳定保存于微脂体内，从而减低较少全身性毒性的药物泄漏以及使更多药物到达标靶组织。然而，目前尚未揭露对于负载葡萄糖醛酸苷药物至微脂体的有效方法。

药物负载的方法可分为两种类别：被动及主动。被动方法仰赖在自干燥的脂质膜形成囊泡的过程中，将药物包覆于微脂体内。在被动方法中，微脂体的内部浓度等同于大量介质中的外部浓度。主动方法仰赖化学驱动力，导致化合物累积于预先成形的微脂体内部。由主动方法所提供的负载效率显着大于由被动负载所达到的负载效率。

仰赖基于醋酸钙的跨膜梯度以负载双亲性弱酸至微脂体内的方法是由

Barenholz等人(美国专利第5,939,096号¹⁶)及Clerc等人所开发¹⁷。在此方法中，弱酸在低pH值很容易通过膜，因而穿透至微脂体。接着在内部高pH值于离子化后被捕捉于内部。内部的醋酸是用作为质子，从微脂体内部穿梭到外部，其目的为当负载弱酸时，维持内部高pH。相反的，钙的低膜穿透性会引起高内部钙浓度，其可使弱酸药物沉淀于微脂体内以具更优选的稳定性。然而此方法是为双亲性弱酸而开发，并不适用于诸如葡萄糖醛酸苷类的亲水性弱酸。弱酸家族成员的葡萄糖醛酸苷类的特征在于对脂质膜有很差的亲和力且强烈有利于水相，意谓葡萄糖醛酸苷类排除自两性化合物的范围外。

本文中所描述的方法是基于烷基酯的负载以有效地负载药物的葡萄糖醛酸苷衍生物。其条件是设为可使微脂体内部的葡萄糖醛酸苷甲酯衍生物转化成亲水性葡萄糖醛酸苷衍生物。此外，微脂体吸收至标靶细胞且从药物经酵素剪切葡萄糖醛酸苷基团之后再生母体药物。如补充表1所示，已合成许多抗癌药物的葡萄糖醛酸苷^{11-14、18-44}，但是并未提出主动负载所述至微脂体内的方法。

发明内容

共价添加糖苷残基(诸如藉由葡萄糖醛酸苷化的葡萄糖醛酸苷残基)是制造更多抗癌药物的水溶性衍生物的方法^11-15。本文中的「葡萄糖醛酸苷」可为经由糖苷键或化学键连基(chemical linker)以将葡萄糖醛酸结合至另一个物质的任何物质。至今，已合成许多抗癌药物的葡萄糖醛酸苷且可商购取得许多其他类型的葡萄糖醛酸苷^{11-14、22、23、27、28、38、41、43、45-49}。经化学修饰后，此等药物变更具水溶性。了解这些特性后，负载葡萄糖醛酸苷可提供疏水性药物的优选的微脂体保存。此外，注射抗癌药物的游离葡萄糖醛酸苷亦会受快速清除率影响⁵⁰。微脂体包覆可帮助延长体内葡萄糖醛酸苷的半衰期。

本发明的一态样提供在具有内部pH大于外部pH的微脂体内负载葡萄糖醛酸苷的描述。内部pH可大于7且外部pH小于7。内部pH可约为8且外部pH可约为5。本文证实葡萄糖醛酸苷衍生物的负载，有2种疏水性抗癌化合物：9-氨基喜树碱(9AC)、5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱(BQC)，及1种疏水性荧光化合物：4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone)，其为最近发现可对抗前列腺癌发展的前景看好的无毒性治疗剂⁵¹。

葡萄糖醛酸苷的负载是在烷基酯，特别地为甲酯，形式(葡萄糖醛酸苷-甲酯)下实现，葡萄糖醛酸苷-甲酯为葡萄糖醛酸苷的更具膜穿透性形式。将葡萄糖醛酸苷-甲酯加入pH值(外部pH)小于微脂体核心内介质的pH值(内部pH)的外部介质中。负载葡萄糖醛酸苷-甲酯之后，内部pH足以自发地水解甲酯基并藉由微脂体内部的皂化改造葡萄糖醛酸苷。

在另一态样中，实现在葡萄糖醛酸苷化前与后的疏水性药物的微脂体保存的比较。将非-葡萄糖醛酸苷及葡萄糖醛酸苷化合物负载至微脂体，并侦测在生物环境中的药物稳定性。

在另一态样中，描述在活体外杀死癌细胞或在哺乳动物内减少肿瘤尺寸。本文中所描述的任何负载葡萄糖醛酸苷的微脂体以有效量施予哺乳动物，以减少肿瘤尺寸且对哺乳动物毒性最小。

在另一态样中，评估比较游离的葡萄糖醛酸苷药物与包覆于微脂体内的葡萄糖醛酸苷药物的药物动力学。静脉注射游离的葡萄糖醛酸苷及微脂体葡萄糖醛酸苷，并侦测血液清除率。

在另一态样中，在细胞吸收葡萄糖醛酸苷负载的微脂体及经溶酶体酵素β-葡萄糖醛酸苷酶剪切之后的疏水性药物再生是于活体外癌细胞培养及荷人类肿瘤哺乳动物中证实。

在另一态样中，证实在肿瘤内的再生药物(活化形式)的量显着地高于血液循环内的再生药物的量。

在另一态样中描述其中制备母体疏水性药物的葡萄糖醛酸苷形式的方法。所述药物的亲水性形式接着藉由将烷酯基结合至药物的亲水性形式以进行酯化(例如甲酯)，然后形成酯化化合物。藉由本文中描述更仔细的方法，将所述酯化化合物加入微脂体悬浮液中。将微脂体施予肿瘤细胞之后，观察到在细胞内，微脂体会降解为溶酶体，释放葡萄糖醛酸苷化形式的药物至溶酶体内。之后溶酶体内的β-葡萄糖醛酸苷酶(酵素)可切断葡萄糖醛酸苷与药物或间隔基-药物(spacer-drug)之间的糖苷键，从而再生母体化合物。

其他的态样及优点将于图式及详细说明中呈现。

附图说明

实施例藉由附图说明，其中：

图1显示葡萄糖醛酸苷基结合至疏水性药物后，水溶解度增加。(缩写：9AC，9-氨基喜树碱；BQC，5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱)n＝3。误差杠，SD。使用双尾非对称学生氏T-测试(Two-tailed unpaired Student’s T-test)于统计分析。星号代表显着性；p<0.0001(***)。

图2显示从葡萄糖醛酸苷合成葡萄糖醛酸苷甲酯(-mE)。9-氨基喜树碱葡萄糖醛酸苷(9AC-G)、5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱葡萄糖醛酸苷(BQC-G)及4-甲基伞形酮葡萄糖醛酸苷(4MU-G)至葡萄糖醛酸苷甲酯(-mE)的化学合成是实现于甲醇及添加硫酸的酸性条件下。

图3显示于65℃、酸性甲醇中，时间依赖性的从葡萄糖醛酸苷合成葡萄糖醛酸苷-甲酯。结果是获得自高效液相层析(HPLC)。(RFU＝相对的荧光单位)。

图4显示葡萄糖醛酸苷及葡萄糖醛酸苷-甲酯的辛醇-水分布。将葡萄糖醛酸苷及葡萄糖醛酸苷-甲酯于不混溶的水相及有机相(柠檬酸pH 5及1-辛醇)中，并于室温且摇动下培养隔夜。分析来自各相的样本，以表征化合物的分布。n＝3至5。

图5显示依式：log P_辛醇/水＝log([溶质]_辛醇/[溶质]_水)计算在1-辛醇及柠檬酸pH 5的各相中葡萄糖醛酸苷及葡萄糖醛酸苷-甲酯的Log P。n＝3至5。误差杠，SD。

图6显示9-氨基喜树碱葡萄糖醛酸苷甲酯(9ACGmE)的稳定度。于75℃，pH 5侦测9ACGmE的稳定度。藉由HPLC并以分别为370nm及460nm的激发及发射波长进行定量。(缩写：9AC，9-氨基喜树碱；9AC-G，9-氨基喜树碱葡萄糖醛酸苷；9AC-GmE，甲酯形式的9AC-G)。n＝3。误差杠，SD。

图7显示在碱性pH，9-氨基喜树碱葡萄糖醛酸苷甲酯(9AC-GmE)转化成9-氨基喜树碱葡萄糖醛酸苷(9AC-G)。于75℃，pH 8.5随时间侦测9AC-GmE转化成-9AC-G。藉由HPLC并以分别为370nm及460nm的激发及发射波长进行定量。n＝3，误差杠，SD。

图8显示于65℃，在甲醇及硫酸(H₂SO₄)内生成葡萄糖醛酸苷甲酯。

图9显示所提出的葡萄糖醛酸苷甲酯药物衍生物及微脂体内转化成葡萄糖醛酸苷药物衍生物的负载机制。葡萄糖醛酸苷甲酯是加入至微脂体的外部介质。于pH 5及75℃，葡萄糖醛酸苷-甲酯稳定于微脂体外部，但可穿透微脂体的脂质双层。在微脂体内部，于内部较高pH，游离的氢氧根离子会与葡萄糖醛酸苷-甲酯反应，经由皂化释放甲醇(CH₃OH)及葡萄糖醛酸苷形式的衍生物。离子化的葡萄糖醛酸苷可与微脂体内部钙离子沉淀。

图10显示于75℃，在混合如图9的描述所制备的具有外部低pH及内部高pH的微脂体之后，9AC-GmE于外部介质中消失。

图11显示于75℃，在微脂体与9AC-GmE混合之后，于微脂体内部出现9AC-G。

图12显示在药物负载之前，藉由低温电子显微镜成像微脂体。(比例尺＝100nm)。

图13显示在负载9-氨基喜树碱(9AC)之后，藉由低温电子显微镜成像微脂体。(比例尺＝100nm)。

图14显示在负载5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱(BQC)之后，藉由低温电子显微镜成像微脂体。箭头显示沉淀的内部的BQC。(比例尺＝100nm)。

图15显示在负载9-氨基喜树碱葡萄糖醛酸苷甲酯(9AC-GmE)及内部转化成9AC-G之后，藉由低温电子显微镜成像微脂体。箭头显示沉淀的内部的9AC-G。(比例尺＝100nm)。

图16显示在负载5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱萄糖苷酸甲酯(BQC-GmE)及内部转化成BQC-G之后，藉由低温电子显微镜成像微脂体。箭头显示沉淀的内部的BQC-G。(比例尺＝100nm)。

图17显示经负载的微脂体的HPLC分析。将9AC-GmE加入微脂体的外部介质，于75℃负载1小时，并藉由尺寸筛除层析以移除非包覆的残基。图显示未经裂解下，将微脂体直接注射至管柱的层析图。(RFU＝相对的荧光单位)。

图18显示经负载的微脂体的HPLC分析。将9AC-GmE加入微脂体的外部介质，于72℃负载1小时，并藉由尺寸筛除层析以移除非包覆的残基。图显示经1％Triton X-100裂解后，将微脂体直接注射至管柱的层析图。(RFU＝相对的荧光单位)。

图19显示葡萄糖醛酸苷-甲酯的负载。9AC-GE、BQC-GmE及4MU-GE(从重量比为1:5开始，药物：液体)的负载能力是藉由HPLC分析外部介质内药物的消散而表征。n＝3，误差杠，SD。

图20显示葡萄糖醛酸苷-甲酯的内转化。经由皂化的9AC-GmE至9AC-G、BQC-GmE至BQC-G及4MU-GmE至4MU-G的内转化是于移除外部药物及裂解微脂体后，藉由HPCL分析其含量而表征。n＝3，误差杠，SD。

图21显示葡萄糖醛酸苷衍生物负载为葡萄糖醛酸苷-甲酯的最终药物与脂质的摩尔比。最终药物与脂质的比例是藉由HPLC以检测内部的葡萄糖醛酸苷的最终含量而表征，且脂质量是藉由巴特列特(Bartlett)法的磷分析而测得。n＝3，误差杠，SD。

图22显示比较葡萄糖醛酸苷甲酯或葡萄糖醛酸苷甲酯衍生物及相较于药物葡萄糖醛酸苷，由药物葡萄糖醛酸苷甲酯所提供的倍数改善的负载效能。n＝3，误差杠，SD。使用双尾非对称学生氏T-测试于统计分析。星号代表显着性；p<0.001(**)及p<0.0001(***)。

图23显示当培养于37℃，在含有10％FBS的PBS中的微脂体的药物保留。曲线显示经过7天之后，比较母体9AC及9AC-G之间的保留。n＝3，误差杠，SD。

图24显示当培养于37℃，在含有10％FBS的PBS中的微脂体的药物保留。曲线显示经过7天之后，比较母体BQC及BQC-G之间的保留。n＝3，误差杠，SD。

图25显示负载有BQC或BQC-G的微脂体的膜厚度。厚度是基于获自低温电子显微镜的显微照片，其在ImageJ(NIH)放大为真实尺寸而测量。在随机地测量不同位置的空微脂体或负载有BQC或BQC-G的微脂体的膜厚度之前，使用「设置标尺」(Set Scale)工具测定相应于100nm比例尺的像素量。藉由显微照片的格交迭以获得随机化法，并于格与微脂体膜接触的个时间点测量厚度，直到收集40个值。使用双尾非对称学生氏T-测试于统计分析。星号代表显着性；p<0.01(*)及p<0.0001(***)。

图26显示负载有9AC或9AC-G的微脂体的膜厚度。厚度是基于获自低温电子显微镜的显微照片，其在ImageJ(NIH)放大为真实尺寸而测量。在随机地测量不同位置的空微脂体或负载有9AC或9AC-G的微脂体的膜厚度之前，使用「设置标尺」(Set Scale)工具测定相应于100nm比例尺的像素量。藉由显微照片的格交迭以获得随机化法，并于格与微脂体膜接触的个时间点测量厚度，直到收集40个值。使用双尾非对称学生氏T-测试于统计分析。星号代表显着性；p<0.0001(***)。

图27显示负载9AC至微脂体内之后，膜缺陷的影像。白色框是置于膜显示为去稳定的双层的位置。

图28显示葡萄糖醛酸苷残基结合至母体化合物的可逆性。此处，9AC是藉由HPLC分析葡萄糖醛酸苷结合之前(1)及之后(2)而分析。结合之后，9AC-G培养于酸性甲醇中并显示完整转化成9AC-GmE(3)及在碱性水中切换回9AC-G(4)。在pH4.5与人类酵素β-葡萄糖醛酸苷酶培养以模拟溶酶体条件的9AC-G，可再生原始的母体药物9AC(5)。(RFU＝相对的荧光单位)

图29代表在癌细胞内，细胞吸收、溶酶体降解及药物再激活的机制的示意图。一些细胞设计为表现包括融合至细胞外抗PEG片段抗原结合(Fab)抗体的低密度脂蛋白受体(LDL-R)的跨膜结构域的嵌合受体，以证实在母体药物再生中细胞吸收的重要性。不表现嵌合受体(野生型)的细胞也可以藉由称为胞饮作用的机制吸收微脂体。微脂体包括9AC-G或荧光素-双-葡萄糖醛酸苷(fluorescein-di-G)作为之后的分析。

图30显示藉由溶酶体酵素人类β-葡萄糖醛酸苷酶活化9AC-G为9AC。

图31显示藉由溶酶体酵素人类β-葡萄糖醛酸苷酶活化荧光素-双-葡萄糖醛酸苷为荧光素。

图32显示在野生型HCC36培养基内及与9AC-G微脂体随时间培养后的

MDA-MD468人类癌细胞内的9AC的量。发现两种细胞在培养基内的9AC会增加，但在不含有细胞的控制组孔内则9AC不会增加。n＝3，误差杠，SD。

图33显示在野生型HCC36的培养基内及设计为在表面上表现嵌合LDL-R/抗PEG受体的HCC36人类癌细胞内的9AC的量。相较于野生型细胞，工程细胞(engineered cell)(HCC36抗PEG)可产生较多的9AC。当HCC36抗PEG细胞与β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂一起培养或当酵素的表现降低时，产生的9AC量显着地降低。n＝3，误差杠，SD。使用双尾非对称学生氏T-测试(Two-tailed unpaired Student’s T-test)于统计分析。星号代表显着性；ns＝非显着性，p<0.001(***)及p<0.0001(***)。在相同时间点进行抗HCC36抗PEG细胞的统计比较。

图34显示将HCC36抗PEG细胞与荧光素-双-葡萄糖醛酸苷微脂体的培养。观察到细胞内荧光素-双-葡萄糖醛酸苷(非荧光)活化为荧光素(绿色)。(红色为微脂体、紫红色为溶酶体及绿色为荧光素)。

图35显示处理游离的9AC-G后，人类血清白蛋白之中和效应。将人类肝癌细胞(HCC36)以具有或不具有人类血清白蛋白(40mg/mL)的游离的9AC-G处理24小时。藉由³H-胸腺核苷结合分析观察细胞增殖。人类血清白蛋白抑制未负载至微脂体的游离的9AC-G的效力。n＝3，误差杠，SD。

图36显示微脂体负载之后，人类血清白蛋白对中和9AC-G的稳定度。人类肝癌细胞(HCC36)以具有或不具有人类血清白蛋白(40mg/mL)的微脂体9AC-G处理24小时。藉由³H-胸腺核苷结合分析观察细胞增殖。微脂体外部的人类血清白蛋白并未抑制负载至微脂体的9AC-G的效力。n＝3，误差杠，SD。

图37显示利用³H-胸腺核苷结合分析以比较9AC-G微脂体与小红莓微脂体

对抗LS174T结肠癌细胞的生长抑制。在96孔盘中的各孔种植5000个细胞并培养隔夜。24小时内添加渐变浓度的微脂体药物至细胞，并检测胸腺核苷的结合。n＝3，误差杠，SD。

图38显示利用³H-胸腺核苷结合分析以比较9AC-G微脂体与小红莓微脂体

对抗MDA-MD-468人类乳癌细胞的细胞毒性。在96孔盘中的各孔种植5000个细胞并培养隔夜。24小时内添加渐变浓度的微脂体药物至细胞，并检测胸腺核苷的结合。n＝3，误差杠，SD。

图39显示比较小鼠内游离的9AC-G与微脂体9AC-G的药物动力学。游离的9AC-G或微脂体9AC-G以25mg/kg的剂量经静脉注射入Nod/SCID小鼠的尾巴。于不同的时间点收集血液样品，并藉由HPLC检测9AC-G的浓度。n＝3，误差杠，SD。

图40显示活体内游离的9AC、9AC-G及微脂体9AC-G的毒性。将Nod/SCID小鼠皮下接种10⁷个MDA-MB-468细胞。当肿瘤达到75至100mm³时，开始每周一次注射以进行治疗，共治疗4次。藉由体重流失以监测毒性。n＝7，误差杠，SD。

图41显示活体内微脂体9AC-G的抗肿瘤活性。将Nod/SCID小鼠皮下接种10⁷个MDA-MB-468细胞。当肿瘤达到75至100mm³时，开始每周一次注射微脂体9AC-G以进行治疗，共治疗4次。图阐明肿瘤体积演变。n＝7，误差杠，SD。利用单向ANOVA(one-way ANOVA)，其次藉由杜纳多重比较(Dunnett’s multiple comparisons)以检测组别间肿瘤尺寸的差异。星号代表显着性；ns＝非显着性及p<0.0001(***)。

图42显示利用9AC、9AC-G或9AC-G微脂体治疗后的小鼠存活。n＝7，误差杠，SD。

图43显示于静脉注射9AC-G微脂体之后，相较于荷MDA-MB468肿瘤小鼠的血液，肿瘤内母体药物9AC的累积。n＝3，误差杠，SD。使用双尾非对称学生氏T-测试于统计分析。星号代表显着性；p<0.001(**)及p<0.0001(***)。

图44显示12至16周大的雌性NOD/SCID免疫缺陷小鼠经皮下注射MDA-MB-468人类乳癌细胞(100μL PBS内含有10⁷个细胞)的肿瘤生长。当肿瘤达到75mm³至100mm³时，7只小鼠的组别以每周间隔四次静脉注射9AC-G(10mg/kg)或小红莓微脂体(

1mg/kg)以进行治疗。n＝7，误差杠，SD。利用单向ANOVA，其次藉由杜纳多重比较以检测组别间肿瘤尺寸的差异。星号代表显着性；p<0.001(**)及p<0.0001(***)。

图45叙述以每周四次静脉注射1mg/kg或3mg/kg小红莓微脂体

治疗的7只小鼠的组别的小红莓微脂体的毒性。藉由体重流失以评估毒性。n＝7，误差杠，SD。

表1显示9AC-G微脂体及小红莓微脂体的50％生长抑制浓度(IC₅₀)。于3株人类大肠癌细胞株(LS174T、HT29及HCT116)、3株人类肺癌细胞株(CL1-5、NCI-H2170及SK-MES-1)及1株人类乳癌细胞株(MDA-MB-468)进行分析。呈现相较于小红莓微脂体，9AC-G微脂体的平均倍数改善，以及藉由双尾非对称学生氏T-测试计算平均IC₅₀值的统计显着性差异。

补充表1描述已合成的葡萄糖苷酸抗癌药物的非详尽列表。在一些情况下，参考文献包括葡萄糖苷酸表征及生物活性。

符号说明

无。

具体实施方式

当所附权利要求书特别阐明本案技术的特征，此等技术连同其目的及优点可从下列详细的说明及附图中得到最好的了解。

除非本文另有说明或显然与上下文矛盾，本发明内容(尤其权利要求书的内容)中所使用的术语「一」(“a”)及「一」(“an”)及「所述」(“the”)及相似的指示对象，解释为涵盖单数及复数两者。除非本文另有说明，本文中所列举数值的范围仅意图作为指示座落于范围内的个别单独数值的简略的表达方法，且各单独数值并入说明书中，如同本文个别列举。除非本文另有说明或显然与上下文矛盾，所有本文描述的方法可于任何适当的顺序。本文所提供任何以及所有实施例的用法，或例示性语言(例如，「诸如」)，仅意图更适当地阐明本发明且除权利要求书之外，并未在本发明范围提出限制。说明书中没有任何语言可被解释为指示任何未请求的组件作为实施本发明的必要组件。

本文中描述本发明的优选的实施例，包括发明人已知可实施本发明的最优选模式。应明白实施例仅是例示性，且不应作为限制本发明的范围。

一态样提供负载酯化的化合物(葡萄糖醛酸苷-甲酯)至微脂体的方法。可用外部pH小于7且足够高以将酯化的化合物转化成亲水性化合物的内部pH制备微脂体悬浮液。可藉由将烷酯基结合至亲水性化合物以制备酯化的化合物。烷酯基可为甲酯基。可将酯化的化合物加入微脂体悬浮液中，其中酯化的化合物负载至微脂体内。在微脂体内，酯化的化合物可皂化以生成亲水性化合物(葡萄糖醛酸苷)。所述方法可有效地以葡萄糖醛酸苷化的亲水形式，增加疏水性化合物的微脂体保存。所述方法可有效地将葡萄糖醛酸苷化的亲水形式的疏水性化合物负载至微脂体的水核内。所述方法亦可有效地将葡萄糖醛酸苷负载至微脂体的水核内，并改善活体内亲水性化合物的半衰期。内部pH可大于7且外部pH小于7。或者，内部pH可从7.5至8.5且外部pH可从4.5至5.5。或者，内部pH可约为8且外部pH可约为5。或者，内部pH可为8且外部pH可为5。

另一态样提供负载葡萄糖醛酸苷甲酯至微脂体的方法。可用外部pH小于7且足够高以将葡萄糖醛酸苷甲酯转化成葡萄糖醛酸苷的内部pH制备微脂体悬浮液。可藉由将甲酯基结合至葡萄糖醛酸苷以制备葡萄糖醛酸苷甲酯。可将葡萄糖醛酸苷甲酯加入微脂体悬浮液中，其中葡萄糖醛酸苷甲酯负载至微脂体内。在微脂体内，葡萄糖醛酸苷甲酯可皂化以生成葡萄糖醛酸苷。所述方法可有效地增加葡萄糖醛酸苷的微脂体负载及保存。所述方法可有效地改善活体内葡萄糖醛酸苷的半衰期。内部pH可大于7且外部pH小于7。或者，内部pH可从7.5至8.5且外部pH可从4.5至5.5。或者，内部pH可约为8且外部pH可约为5。或者，内部pH可为8且外部pH可为5。

另一态样提供制备负载葡萄糖醛酸苷的微脂体的方法。葡萄糖醛酸苷可与甲醇及酸反应以形成葡萄糖醛酸苷甲酯(葡萄糖醛酸苷-mE)。可用内部pH可大于7且外部pH小于7以制备微脂体。可用内部pH 7.5至8.5以制备微脂体。之后微脂体可与含有葡萄糖醛酸苷-甲酯且具有pH 4.5至5.5的溶液接触。之后可从溶液中纯化微脂体。微脂体的内部pH可约为8且微脂体的外部pH可约为5。或者，微脂体的内部pH可为8且外部pH可为5。

在以上态样中，微脂体可制备为包括足以达到治疗有效剂量的内部高浓度的葡萄糖醛酸苷。微脂体可用外部低且内部高的pH梯度而制造。不受理论束缚，此方法的基本策略是基于经至少下列步骤的包覆机制：1.负载葡萄糖醛酸苷甲酯(-mE)及2.微脂体内部生成的酯基的内部皂化(水解)及截获葡萄糖醛酸苷。

葡萄糖醛酸苷甲酯显着地较其相应葡萄糖醛酸苷更具膜通透性，使负载至微脂体的葡萄糖醛酸苷甲酯分子的数量相较于负载至微脂体的葡萄糖醛酸苷分子的数量实质地增加。不受理论束缚，负载至微脂体的动力取决于分子分配至微脂体的脂质双层。对于脂质双层具有有限的分配的葡萄糖醛酸苷可趋于将微脂体外部保留于水溶液中，因为在微脂体外部的水溶液与脂质双层的分配比可能非常高。然而，葡萄糖醛酸苷的甲酯形式(葡萄糖醛酸苷甲酯)可更快地进入脂质双层并转移至微脂体内部的由微脂体的脂质双层所包围的水相。

具有高pH的微脂体内部的水相可能是有帮助的。高pH可使葡萄糖醛酸苷甲酯上的酯基透过皂化机制而快速的水解。将葡萄糖醛酸苷甲酯水解为对应的葡萄糖醛酸苷可驱动来自脂质双层的葡萄糖醛酸苷甲酯至微脂体内水相的平衡。再者，对应的葡萄糖醛酸苷相对于葡萄糖醛酸苷甲酯，对于脂质双层可具有更多有限的亲和力，如前所述，因此葡萄糖醛酸苷可趋于保留在微脂体内部，而非穿透脂质双层至微脂体外部的水相中。

无须任何特别的化学技能或设备，可藉由将葡萄糖醛酸苷溶解于具有酸催化剂的甲醇而合成葡萄糖醛酸苷甲酯。反应可在介于50℃至70℃的温度，如60℃至65℃而实施。反应可藉由色析法，例如HPLC而监控。反应时间可为一个小时或更长。可进行纯化以自酸催化剂中纯化出葡萄糖醛酸苷甲酯。可藉由HPLC并使用C18逆向管柱而纯化葡萄糖醛酸苷甲酯，并以含有5％甲醇的水冲洗。在此水洗步骤中，葡萄糖醛酸苷甲酯留置于管柱上。随后可用甲醇洗涤出葡萄糖醛酸苷甲酯，例如100％甲醇或几近100％甲醇。可用旋转蒸发、冷冻干燥或任何其他的干燥方法以从葡萄糖醛酸苷甲酯中移除甲醇。

图1显示葡萄糖醛酸苷残基的结合急遽地增加母体化合物的水溶性，暗示优选保留于微脂体内。

图2显示可将9-氨基喜树碱葡萄糖醛酸苷(9AC-G)、5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱-β-D-葡萄糖醛酸苷(BQC-G)及4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4MU-G)培养于含有作为催化剂的强酸(硫酸)的甲醇内。于65℃，1小时后，如图3所示，藉由高压液相层析证实大部分的葡萄糖醛酸苷类(9AC、BQC及4MU)会转化成葡萄糖醛酸苷-甲酯(9AC-GmE、BQC-GmE及4MU-GmE)。如图4及图5显示在辛醇-水的分配分析中，分别相较于9AC、BQC及4MU，新合成的9AC-GmE、BQC-GmE及4MU-GmE展现增加分配至有机相。此结果显示甲酯修饰可增加于脂质膜内的溶解性且增加主动负载效率。

本文所描述的方法可更进一步涉及使用衍生化合物，其中葡萄糖醛酸残基的羧酸基是由甲酯取代，以生成具有显着提高膜穿透性的葡萄糖醛酸苷甲酯。其在外部低pH负载至微脂体(于此的葡萄糖醛酸苷甲酯是稳定的)可得到高药物-脂质比例(图6)。不受理论束缚，藉由加热约1小时，内部的高pH有助于甲酯的自发性水解，以生成内部的葡萄糖醛酸苷(图7)。藉由使用此方法，可以非常高的药物-脂质比例，稳定地包覆葡萄糖醛酸苷，而传统的弱酸负载方法则无法包覆有效量。

图8叙述葡萄糖醛酸苷于酸性甲醇内形成葡萄糖醛酸苷甲酯。图9叙述使葡萄糖醛酸苷-甲酯(药物-甲酯)于外部介质内通过微脂体的脂质双层及在微脂体内部高pH下，将葡萄糖醛酸苷甲酯转化成葡萄糖醛酸苷(药物-G)的理论机制。微脂体内的高氢氧根离子浓度可将甲酯键去稳定化，释放出甲醇，而再次形成药物的葡萄糖醛酸苷形式。甲醇可扩散至微脂体外，但内部形成的葡萄糖醛酸苷是亲水性的，且无法容易地扩散穿透微脂体的脂质双层。葡萄糖醛酸苷药物衍生物亦可形成与微脂体内部高浓度的钙离子形成沉淀，以保持稳定包覆于微脂体内部。

图10显示在如图9所描述的微脂体外部介质内添加葡萄糖醛酸苷-甲酯。在上升的温度，于微脂体的外部介质观察到9AC-GmE，显示葡萄糖醛酸苷的甲酯形式藉由穿透微脂体膜而负载于微脂体内部。在图11中，由于负载的9AC-GmE的皂化，相应的亲水性葡萄糖醛酸苷(9AC-G)随着时间的推移显现于微脂体内部。

相较于空的微脂体(图12)，藉由低温电子显微镜，可观察到微脂体内部的葡萄糖醛酸苷的累积及保留，诸如图15(9AC-G)及图16(BQC-G)所示。母体化合物9AC及BQC亦可负载至与用于负载9AC-G及BQC-G的相同剂型的微脂体内部。此处负载的原理依靠pH依赖型内酯-羧酸平衡。在低pH，9AC及BQC的内酯环是闭合的，使更多的亲脂形式进入微脂体内。在内部碱性pH，内酯环开启以形成可与内部钙离子沉淀的羧酸基。图13及图14分别显示负载母体9AC及BQC后的微脂体。其观察证实在葡萄糖醛酸苷形式下负载9AC及BQC有助于增加这些药物累积于核心及沉淀于内部。

包覆的化合物有许多的应用。抗癌药物产业可从包覆葡萄糖醛酸苷化的抗癌药物以最大化递送药物至肿瘤且对于病患的安全上得到帮助。喜树碱是著名的抗肿瘤药物的家族，以及其葡萄糖醛酸苷衍生物可降低其毒性且增加其专一性。此外，葡萄糖醛酸苷SN-38(SN-38G)是用于治疗大肠癌病患的CPT-11的代谢产物。抗癌药物产业对于包覆SN-38G于微脂体内可能是极大的兴趣。尤其诸如太平洋紫杉醇或MMAE的可溶性药物可以葡萄糖醛酸苷形式负载至微脂体的核内。这可能导致优选的稳定性及安全性的药物传递。

葡萄糖醛酸苷-甲酯可稳定于pH介于4及6之间，例如pH 5。葡萄糖醛酸苷-甲酯的甲酯基可藉由皂化作用于碱性pH水解。在碱性pH的微脂体内部可进行皂化以在微脂体内部再形成葡萄糖醛酸苷。

微脂体可藉由任何的方法而制备。微脂体可包括磷胆碱脂质。微脂体可包括磷酸乙醇氨。微脂体也可包括胆固醇。微脂体的pH可藉由用于再水合干燥的脂质膜的缓冲溶液的pH而调控，所述干燥的脂质膜是由微脂体的脂质成分所制备。之后可使用不同于微脂体内部pH的特定pH进行尺寸筛除层析，以筛选具有所需pH梯度的微脂体。微脂体内部的pH可超过7，例如pH 7、8或9，且外部的缓冲溶液的pH可小于7，例如4、5或6。可使用动态光散射法以侦测微脂体颗粒的平均直径。可将葡萄糖醛酸苷-甲酯负载至外部pH小于内部pH的微脂体。

可藉由先将葡萄糖醛酸苷-甲酯与微脂体分别地于60℃至80℃之间预培养5-15分钟，例如75℃，10分钟，以将葡萄糖醛酸苷-甲酯并入微脂体内，而之后用一定程度的轻度摇动将它们进行混合一段时间，例如1小时，以使葡萄糖醛酸苷-甲酯进行负载且内部皂化为葡萄糖醛酸苷。可用尺寸筛除层析以除去残留于微脂体外部的葡萄糖醛酸苷-甲酯。用清洁剂稀释的负载的微脂体样本可进一步进行HPLC，以分析葡萄糖醛酸苷-甲酯的负载效率以及葡萄糖醛酸苷的转化。图17显示不使用清洁剂溶解微脂体时，注射负载9AC-G的微脂体的HPLC。在外部介质内并未观察到药物。图18显示相同的微脂体于使用清洁剂进行溶解之后的HPLC分析。溶解之后释放负载的9AC-G，并于色谱上观察。

不受理论束缚，在弱酸环境下(诸如pH 5)，葡萄糖醛酸苷-甲酯稳定于微脂体外部，且由于改善有机环境内的溶解度而可与脂质双层进行交互作用。最终，葡萄糖醛酸苷-甲酯会从微脂体的外部迁移至内部环境。将微脂体内部暴露于相对高的pH(诸如pH 8.5)可导致葡萄糖醛酸苷-甲酯的甲酯基快速的水解，以在微脂体的内部环境生成葡萄糖醛酸苷。这些葡萄糖醛酸苷可能与微脂体脂质双层间具有实质上较低的交互作用能力，而因此相较于葡萄糖醛酸苷-甲酯，葡萄糖醛酸苷会以实质上较低的速率从微脂体内部迁移至微脂体外部环境。

图19、图20及图21描述葡萄糖醛酸苷-甲酯的负载、内部转化成葡萄糖醛酸苷，及母体药9-氨基喜树碱(9AC)、5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱(BQC)及4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4MU-G)的个别最终药物-脂质摩尔比。

甲酯化可用于实质上增加负载葡萄糖醛酸苷至微脂体的能力。藉由实施任何本文所述的方法，包括甲酯化葡萄糖醛酸苷及负载甲酯至具有内部pH高于外部环境pH的微脂体，可能实现增加5倍负载葡萄糖醛酸苷的能力、增加10倍、增加15倍、增加20倍、增加25倍、增加30倍、增加35倍、增加40倍或增加45倍，以及增加超过275倍，如图22所证实者。

在另一态样中，提供包括抗癌药物的葡萄糖醛酸苷的微脂体。微脂体可藉由以下方法而制备，在具有外部pH的溶液中添加葡萄糖醛酸苷的甲酯形式至前驱微脂体，且微脂体的内部pH大于外部pH。微脂体的内部足够高的pH可将葡萄糖醛酸苷的甲酯形式转化成葡萄糖醛酸苷。内部pH可大于7且外部pH小于5。内部pH可从7.5至8.5且外部pH可从4.5至5.5。内部pH可约为8且外部pH可约为5。内部pH可为8且外部pH可为5。

此态样所提供的微脂体可藉由施予这些包括抗癌药物的葡萄糖醛酸苷的微脂体至有需要治疗的哺乳动物或人类病患，以用于治疗癌症或减少肿瘤尺寸的方法。或者，依据任何本文中所述的态样或实施例的微脂体负载可用于藉由施予至有需要以所述微脂体治疗的哺乳动物或人类病患，以治疗癌症或减少肿瘤尺寸。癌症可为肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、胃癌、头颈癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾细胞癌或大肠癌。癌症可起源于任何器官，特别是肺部、乳房、卵巢、胃、肾脏、肝脏或大肠。可使用不同的抗癌药物。抗癌药物可为一种或多种的4-甲基伞形酮、9-氨基喜树碱、5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱、阿柔比星(aclarubicin)、放线菌霉素(actinomycin)、安吖啶(amsacrine)、苯达莫司汀(bendamustine)、贝沙罗汀(bexarotene)、桦木醇(betulin)、比卡鲁氨(bicalutamide)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、博舒替尼(bosutinib)、硫酸布他卡因(busulfan)、卡巴他赛(cabazitaxel)、卡本扎尼(cabozantinib)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、双氯乙基亚硝脲、氯芥苯丁酸、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、考比替尼(cobimetinib)、环巴氨(cyclopamine)、环磷酰氨、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、放线菌素(dactinomycin)、达沙替尼(dasatinib)、道诺霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、二嗪酮(diaziquone)、欧洲紫杉醇、小红莓、恩杂鲁氨(enzalutamide)、泛艾霉素(epirubicin)、得舒缓(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、依妥普赛(etoposide)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶、福莫司汀(fotemustine)、羟苯氨芥(hydroxyanilinemustard)、羟基尿素、艾瑞莎(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、依鲁替尼(ibrutinib)、伊达比星(idarubicin)、依弗迈(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、爱莱诺迪肯(irinotecan)、伊沙匹隆(ixabepilone)、拉帕替尼(lapatinib)、来那度氨(lenalidomide)、利妥唑(letrozole)、白叶酸(leucovorin)、环己亚硝、氮芥(mechlorethamine)、氮芥苯丙氨酸、美巴隆(merbarone)、硫醇嘌呤、美司那(mesna)、氨甲叶酸、丝裂霉素、米土先强(mitoxantrone)、替莫唑氨(mitozolomide)、单甲基奥瑞他汀(monomethyl auristatin)、奈达铂(nedaplatin)、奈拉滨(nelarabine)、尼罗替尼(nilotinib)、尼鲁米特(nilutamide)、N-亚硝基-N-甲基尿嘧啶、诺波霉素(novobiocin)、奥马他辛(omacetaxine)、太平洋紫杉醇、帕比司他(panobinostat)、帕唑帕尼(pazopanib)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、泊马度氨(pomalidomide)、普纳替尼(ponatinib)、普赖苏秾(prednisolone)、PR-104A、吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine)、榭皮素、雷替曲塞(raltitrexed)、瑞格菲尼(regorafenib)、罗米地辛(romidepsin)、鲁索替尼(ruxolitinibm)、司莫司汀(semustine)、SN-38、索尼吉布(sonidegib)、蕾沙瓦(sorafenib)、链佐霉素(streptozotocin)、辛二酰苯氨羟氨酸(suberoylanilidehydroxamic acid)、纾癌特(sunitinib)、托美丁(tamibarotene)、泰莫西芬(tamoxifen)、他地那兰(tarcedinaline)、替加氟(tegafur)、坦西莫司(temsirolimus)、沙奥特帕(thiotepa)、坦尼坡赛(teniposide)、拓普替康(topotecan)、曲普瑞林(triptorelin)、曲贝替定(trabectedine)、凡德他尼(vandetanib)、威罗菲尼(vemurafenib)、维奈克拉(venetoclax)、长春新碱、长春氟宁(vinflunine)、温诺平(vinorelbine)、长春碱、长春地辛(vindesine)、维莫德吉(vismodegib)及伏立诺他(vorinostat)。

可用微脂体药物释放分析以评估葡萄糖醛酸苷及非葡萄糖醛酸苷药物之间的药物保存。在此分析中，比较负载母体药物(疏水性)或葡萄糖醛酸苷化形式(亲水性)的微脂体。于37℃下，含有10％胎牛血清(FBS)的磷酸缓冲的盐水(PBS)的仿生理条件下透析微脂体。泄漏于微脂体外的药物是经由稀释于1000倍较大体积而流失。保留于微脂体内部的药物是藉由HPLC分析9AC(图23)及BQC(图24)的母体及葡萄糖醛酸苷形式。在葡萄糖醛酸苷形式下可得到药物较强的保留。

负载BQC(图25)及9AC(图26)之后，微脂体的膜厚度是增加的。这也支持了的疏水性化合物藉由疏水交互作用而累积于微脂体的膜内的概念。此种形式的负载被认为是不稳定的，且药物容易泄漏至微脂体外部。负载9AC-GmE及BQC-GmE以分别包覆9AC-G及BQC-G会造成微脂体的膜厚度接近于负载药物之前的微脂体的膜厚度，其显示了药物从膜转换至微脂体水核内的趋性。

观察到在一些负载9AC的微脂体出现膜损坏，其造成原因可能来自于微脂体膜内的9AC的累积(图27)。疏水性药物倾向于分配至微脂体膜，其与脂质尾端进行交互作用且有时会破坏双层。

于pH 4.5，仿溶酶体内pH的活体外试验证实，结合至葡萄糖醛酸苷的药物可藉由人类溶酶体酵素、β-葡萄糖醛酸苷酶再生成其母体形式。9AC-G完整转化成9AC(图28)。在真实的条件下，推断微脂体的葡萄糖醛酸苷可被细胞吸收且如图29所示，微脂体降解后可在微脂体内释放葡萄糖醛酸苷。使用两个实例说明化合物的再生：9AC-G(藉由酵素水解而移除的触发式自我降解(self-immolative)的化学键连基而链接，图30)以及荧光素(直接连结至葡萄糖醛酸苷残基，图31)。加入9AC-G微脂体后，在HCC36及MDA-MB468人类癌细胞的介质内发现有效量9AC。另一方面，若细胞未呈现，则不会发现9AC，意谓9AC的再生是依赖于细胞(图32)。当藉由工程低密度脂蛋白受体穿膜域(LDL-R TM)与抗PEG Fab细胞外域而人为地增加细胞吸收微脂体时，介质内9AC量会显着地增加。当加入β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂，或当藉由基因剔除(gene knockdown)而降低β-葡萄糖醛酸苷酶的表现量时，9AC产量会显着地降低(图33)，这些结果显示，再生母体化合物依赖于细胞吸收及β-葡萄糖醛酸苷酶。为了进一步说明母体化合物的再生能力，将工程有LDL-R/抗PEG受体的HCC36细胞与微脂体荧光素-双-G(非荧光)一起培养。刚开始，微脂体(红色)被细胞吸收并与微脂体开始共定位(紫红色)。之后，细胞质转为绿色，证实荧光素-双-G转换成荧光素的活性(图34)。

包覆葡萄糖醛酸苷而负载有葡萄糖醛酸苷-甲酯的微脂体的抗癌活性可于活体外或活体内进行评估。在活体外分析，可种植癌细胞株于孔或盘中且可将不同浓度的微脂体葡萄糖醛酸苷加入细胞一段时间，例如24小时，并进行细胞死亡分析。可用氚化胸腺核苷分析细胞增殖。此外，人类血清白蛋白会结合至游离的9AC-G并使药物失活，然而，在微脂体形式下，9AC-G并不会结合至人类血清白蛋白且效率不会受影响(图35及图36)。图37及图38的数据显示评估相较于此处作为临床验证的微脂体药物的微脂体小红莓

微脂体9AC-G的细胞毒性的活体外分析。将微脂体小红莓

及微脂体9AC-G毒性与9AC-G、3种人类大肠癌细胞(LS174T、HT29及HCT116)、3种肺癌细胞(CL1-5、NCI-H2170及SK-MES-1)及1种人类乳癌细胞(MDA-MB-468)进行评估。对于所有的细胞株，相较于微脂体小红莓，9AC-G微脂体提供显着优选对抗LS174T、HT29、HCT116、CT1-5、NCI-H2170及MDA-MB-468的抗增生活性，以及等同对抗SK-MES-1的抗增生活性。评估微脂体药物的IC₅₀并总结于表1。

负载葡萄糖醛酸苷的微脂体可施予至有需要杀死癌细胞的哺乳动物或人类病患。例如，癌细胞可来自肺部、乳房或大肠。可以静脉内施予。可评估肿瘤减少及/或负载葡萄糖醛酸苷的微脂体的毒性。负载葡萄糖醛酸苷的微脂体可有效地减少肿瘤尺寸。

实施例1：从葡萄糖醛酸苷甲酯(-mE)合成葡萄糖醛酸苷

如先前文献²⁰所描述，从母体化合物合成9-氨基喜树碱葡萄糖醛酸苷(9AC-G)及5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱-β-D-葡萄糖醛酸苷(BQC-G)。4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4MU-G)是购自于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。

藉由将25mg葡萄糖醛酸苷溶解于含有作为催化作用的3.5μl H₂SO₄的1mL甲醇内，以合成9AC-G、BQC-G及4MU-G的葡萄糖醛酸苷-甲酯衍生物。溶液培养于60℃至65℃且藉由HPLC分析不同时间点的样本以侦测反应(图3)。反应通常于1小时后终止。藉由HPLC纯化9AC-G、BQC-G及4MU-G的葡萄糖醛酸苷-甲酯形式(9AC-mG、BQC-mG及4MU-mG)以移除H₂SO₄及残留的葡萄糖醛酸苷。9AC-mG、BQC-mG及4MU-mG负载于手工制备的

RP-18(40-63μm)管柱(Merck，德国)并以含有5％甲醇的水的移动相进行清洗。在这些洗涤条件下，并不会洗涤出葡萄糖醛酸苷-甲酯，其会被留置于管柱内。之后，将移动相改变为100％甲醇并收集洗涤液。在旋转蒸发下将甲醇内纯的9AC-mG、BQC-mG及4MU-mG进行干燥并悬浮于DMSO。藉由HPLC分析侦测各化合物的最终浓度并将浓度调整为10mg/mL。

藉由将化合物稀释于1:1体积的辛醇及100mM，pH 5的柠檬酸缓冲溶液以测得不同化合物的分布(图4)。于室温下将溶液轻轻搅拌24小时，于2,500×g进行旋转，并藉由HPLC量化各相中葡萄糖醛酸苷或葡萄糖醛酸苷-甲酯以及以logP_辛醇/水＝log([溶质]_辛醇/[溶质]_水)计算分配系数(图6)。

使用逆相C18管柱(Xbridge^TM C18,4.6×150mm,5μm)进行HPLC分析。9AC、9AC-G、9AC-GmE、4MU、4MU-G及4MU-GmE样本在由24％乙腈所组成的移动相以2mL/min速度流动，而BQC、BQC-G及BQC-GmE样本则于由30％乙腈所组成的移动相以2mL/min速度流动。所有的移动相皆以25mM柠檬酸调整为pH 2.9(藉由加入10N NaOH)，在真空下藉由超音波震荡进行除气，并通过0.2μm瓶顶过滤膜进行过滤(

Rapid-Flow)。利用荧光侦测器(Jasco FP-2020)以370/460nm的激发/放射波长对9AC、9AC-G、9AC-GmE、BQC-G、BQC-GmE以及370/575nm的激发/放射波长对BQC进行侦测。利用U.V.侦测器(Jasco U.V.975)以310nm对4-MU、4MU-G及4MU-GmE进行侦测。收集数据并于Gold软件进行分析(Beckman)。

9AC-GmE的特性于不同的pH及温度进行研究。所观察到的是9AC-GmE在pH 5非常稳定，但是甲酯基于碱性pH容易藉由皂化反应而水解(图6及图7图)。因此，在高pH，9AC-GmE的甲酯基会水解以再形成9AC，证明反应的可逆性。

实施例2：制备微脂体

此实施例描述制备由1,2双硬脂酰基sn甘油3磷胆碱(DSPC)、1,2双硬脂酰基sn甘油3磷酸乙醇氨[甲氧基(聚乙烯乙二醇)2000](DSPE-PEG2000)及胆固醇所组成的微脂体，且微脂体内部pH为8.5及外部pH为5。将三氯甲烷内的DSPC、DSPE-PEG2000及胆固醇储备液以65:5:30摩尔比与10mg总脂质量进行混合。于65℃，藉由旋转蒸发(Büchi,RatovaporRII)以形成干燥的脂质膜，并于65℃，以250mM醋酸钙，pH 8.5，50mM HEPES缓冲溶液再次水解为10mg/mL的最终脂质浓度。使用液态氮将微脂体悬浮液进行5次冷冻/解冻循环，之后于72℃，使用迷你-挤压机(Avanti Polar Lipid,Inc.Alabaster,AL)并各通过400nm、200nm及100nm聚碳酸膜进行挤压21次，并转移至冰中。藉由

G50对抗250mM硫酸钠，pH5，50mM柠檬酸的尺寸筛除层析以获得横过微脂体膜的pH梯度。在负载前，将所得到的「预备负载」的微脂体储存于4℃，至多可储存1个月。最终的脂质浓度是以巴特列特(Bartlett)磷分析法测得，且颗粒的平均直径是藉由动态光散射法(Malvern Instruments ZetasizerNano system)而侦测。

依据这些初步结果，藉由利用250mM醋酸钙、调整为pH 8.5的50mM HEPES缓冲溶液再次水解干燥的脂质膜，以获得具有内部及外部高pH环境的微脂体。之后藉由使用Sephadex G50的尺寸筛除层析法，将外部介质更换为250mM硫酸钠，调整为pH 5的50mM柠檬酸。在那阶段，所得到具有高内部/低外部pH的微脂体可准备负载葡萄糖醛酸苷-甲酯。

实施例3：微脂体的药物负载

将实施例2所制备的微脂体以250mM硫酸钠，pH 5，50mM柠檬酸稀释为4mg/mL。实施例1所制备的葡萄糖醛酸苷-甲酯以10mg/mL浓度储存于DMSO。在以下的实施例中，2mg微脂体及0.4mg葡萄糖醛酸苷-甲酯于75℃分开预热10分钟，且混合1小时并偶尔轻轻震动。藉由

G50对抗Tris系缓冲溶液(50mM Tris-氯、pH 7.4，150mM氯化钠)的尺寸筛除层析，以移除未包覆的葡萄糖醛酸苷-甲酯。于将微脂体稀释于1％Triton X-100，pH 2.9，25mM柠檬酸之后，藉由HPLC测定负载效率以及微脂体内部的葡萄糖醛酸苷-甲酯转化成葡萄糖醛酸苷。

葡萄糖醛酸苷-甲酯稳定于微脂体外部(pH 5)且由于改善于有机环境中的溶解度而可与脂质双层进行交互作用。葡萄糖醛酸苷-甲酯会从微脂体的外部通过并穿透微脂体的脂质双层至内部环境。包覆的葡萄糖醛酸苷-甲酯接着暴露于会快速水解甲酯基的内部高pH(pH 8.5)以生成葡萄糖醛酸苷。

负载之后，为了藉由HPLC分析包覆于微脂体内部的药物的特性，透过含1％TritonX-100的溶液以溶解微脂体。如同层析图(图17)显示，未溶解的微脂体在外部介质内并未含有药物，然而经Triton X-100处理的微脂体显示释放9AC-G(图18)。在层析图上仅测得微量的9AC-GmE，证实内部微脂体药物的9AC-GmE转化为9AC-G的高效率。

微脂体是成像于负载药物之前(图12)与负载9AC(图13)及BQC(图14)之后。亦于9AC-GmE(图15)及BQC-GmE(图16)负载至微脂体内部并藉由内部高pH而转化成9AC-G及BQC-G之后而获得成像。成像是藉由Holey覆盖碳膜的400目铜网格(HC300-Cu,PELCO)在氩气中发光放电、于碳侧上氧气氛10秒而获得。将4μl体积的微脂体(2mg/mL)滴至网格上，于20℃点渍于100％湿度3秒，并速冻结成液态乙烷，藉由使用Vitrobot(FEI,Hillsboro,OR)的液态氮冷却。之后将网格储存于液态氮下，并使用低温载台转移至低温电子显微镜。以200kV，70nm光圈的Tecnai^TM F20电子显微镜(FEI)得到于碳膜孔洞内微脂体影像。各曝光的低剂量条件为约

以5k及50k放大率以及2nm至3nm散焦取得影像，并记录于4k×4k CCD相机(Gatan，美国)。

除了9AC-G及BQC-G之外，依循相同的酯化及内部微脂体的皂化方法，亦将4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4MU-G)负载于微脂体。所有这些化合物皆在葡萄糖醛酸苷-甲酯形式负载且在微脂体内部转化成葡萄糖醛酸苷(图19及图20图)。最终的药物-脂质摩尔比显示于图21中。相较于以葡萄糖醛酸苷形式负载，当以葡萄糖醛酸苷-甲酯形式负载时，9AC、BQC及4MU分别得到超过275倍、10.5倍及55倍的改善。

实施例4：改善的药物保存

使用相同的微脂体制剂，将9AC及BQC的母体形式负载至微脂体内。在外部低pH下，疏水性9AC及BQC为中性且其中一者会与微脂体膜进行交互作用，或藉由可逆的开启内酯环为略少疏水性的羧酸盐形式以成为于高pH带负电荷的微脂体。于37℃，将微脂体的9AC、BQC、9AC-G及BQC-G稀释于补充有10％胎牛血清的PBS，为期7天。来自微脂体的葡萄糖醛酸苷的药物泄漏相较于其疏水性母体药物显着地减低(图23及图24)。分别稀释1天及3天后，微脂体的9AC及BQC从其载体展现超过90％的突发的释放行为。7天后，微脂体的BQC-G及9AC-G皆可保留超过其货物的80％。此数据显示在葡萄糖醛酸苷化后，微脂体内的疏水性药物的保留有显着地改善。此外，负载葡萄糖醛酸苷的微脂体储存于4℃、Tris系缓冲溶液(TBS)内可维持稳定超过数个月。

为了补足药物保留分析，在缺少或存在有9AC-G抑制剂、人类血清白蛋白的条件下，测试游离的9AC-G及微脂体的9AC-G对抗人类肝癌细胞(HCC36)的毒性(图35及图36)。我们的结果显示存在有人类血清白蛋白的条件下，游离的9AC-G毒性会受抑制而人类血清白蛋白不会影响微脂体9AC-G毒性。其可归因于微脂体会保护内部的9AC-G免于与人类血清白蛋白进行交互作用，从而避免9AC-G去活性。微脂体内部的9AC-G的稳定保留及保护可使高浓度的活化9AC-G到达肿瘤。

观察到母体9AC及BQC的负载导致微脂体膜的厚度增加(图25及图26)。这显示药物藉由疏水性交互作用而累积在微脂体的脂质双层。降低药物在微脂体的脂质双层的累积是透过负载药物的葡萄糖醛酸苷形式而增加药物于微脂体水核的累积而达成。相较于膜负载，药物的核负载导致更稳定的微脂体药物形式。此外，微脂体膜内的药物累积可能藉由双层结构的去稳定化而造成膜内的缺陷，如图27所观察到的。

实施例5：再生母体药物

疏水性药物的葡萄糖醛酸苷化会导致藉由增加水溶解度而降低药物毒性及降低细胞膜穿透性。对于微脂体负载，为了完整的利用疏水性药物的葡萄糖醛酸苷化，于细胞吸收微脂体后，应再生母体化合物。如图28所示，9AC可结合至葡萄糖醛酸苷残基，其可在甲酯形式间互换以进行负载且转换回葡萄糖醛酸苷形式以稳定保留于微脂体内。于pH4.5，将微脂体酵素β-葡萄糖醛酸苷酶加至9AC-G，以仿有效再生9AC的微脂体条件，显示微脂体内部的潜在的药物再生。为了证实此机制的真实性，将癌细胞培养物与微脂体9AC-G或非-荧光的荧光素-双-G(图29)培养，定期分析细胞的母体化合物(9AC及荧光素)的再生。细胞藉由已知的胞饮作用而具有自然吸收微脂体或奈米颗粒的能力。为了增加细胞吸收微脂体，藉由将低密度脂蛋白的穿膜域与抗PEG抗体的Fab片段融合，以建造细胞表面受体。人工受体的抗PEG部分可结合于微脂体表面上的PEG并促进受体-媒介胞饮作用至细胞内。使用HCC36及MDA-MB468人类癌细胞进行活体外细胞培养分析，在加入9AC-G微脂体之后，细胞培养液内观察到时间-依赖性出现9AC。没有细胞情况下，微脂体9AC-G无法自行产生9AC，意谓细胞负责此再生(图32)。当细胞藉由工程的抗-PEG受体而人为的增加吸收微脂体时，发现培养液内9AC量也会增加(图33)。另一方面，当在同一个时间点将细胞与β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂一起培养或当将细胞处理RNAi时，细胞培养液内的9AC量会降低。总而言之，结果显示母体化合物的再生需要将微脂体吸收至细胞内且依赖于酵素β-葡萄糖醛酸苷酶。此外，可在共轭焦显微镜研究表现抗-PEG受体的HCC36细胞中观察药物再生。在将微脂体(红色)与溶酶体(紫红色)共定位后，添加微脂体荧光素-双-G证实了细胞内的荧光素(绿色)的再生。

实施例6：改善的药物动力学

此实施例是关于相较于游离的9AC-G，9AC-G的微脂体剂型是否能够展现长时间的药物动力学。游离的及微脂体的9AC-G以25mg/kg静脉递送至12周至16周大的雌性小鼠。藉由收集血清样本以监控9AC-G的总血清量，其中血浆是藉由将红血球进行离心而获得。将血清蛋白沉淀于乙腈：甲醇：0.2M三氯乙酸(2:2:1，体积：体积混合)。将样本离心以去除沉淀的蛋白质，并以含1％Triton X-100的缓冲溶液进行稀释以溶解微脂体，并藉由HPLC分析9AC-G。图39显示相较于微脂体的9AC-G(起始半衰期＝36.5分钟；终末半衰期＝10.1小时)，快速清除游离的9AC-G(起始半衰期＝9.3分钟；终末半衰期＝38.6分钟)。在相同的剂量下，注射6小时后，发现微脂体的9AC-G的血浆浓度较游离的9AC-G平均高出350倍。这些结果表明PEG-微脂体可用于作为葡萄糖醛酸苷载体以延长体内的半衰期，且与先前微脂体的药物动力学报告一致。

实施例7：微脂体的抗癌活性

于活体外及活体内评估9AC-G微脂体的抗癌活性。在活体外，于96孔盘的各孔种植5000个细胞的不同的人类癌细胞株(LS174T、HCT116、HT29、MDA-MB468、NCI-H2170、CL1-5及SKMES-14)。在移除药物之前，将分级浓度的9ACG-微脂体或小红莓微脂体

加入细胞内24小时，并将细胞额外培养72小时。藉由³H-胸腺核苷结合分析进行细胞增殖分析，其中将由培养液稀释的1μCi ³H-胸腺核苷加入各孔中并放置隔夜。之后在玻璃-纤维滤膜(PerkinElmer Unifilter-96,GF/C)上，藉由胰蛋白酶收集细胞，并于TopCount闪烁计数器(PerkinElmer)上测量放射活性。最终细胞抑制是测定为「来自控制组的抑制％」＝(c.p.m.(样本)×100/c.p.m.(控制组))。代表性杀死曲线显示于图37及图38，且不同细胞及所使用的药物的IC₅₀总结于表1。

其次，于NOD/SCID小鼠的乳癌活体模式中，每只小鼠皮下种植10⁷个MDA-MD468细胞。当肿瘤的平均尺寸达到75至100mm³时，开始进行治疗。小鼠以10mg/kg的剂量静脉注射9AC-G微脂体、游离的母体9AC(2mg/kg)或游离的9AC-G(10mg/kg)。图40显示于治疗期间内监控小鼠的重量，以评估此剂量的毒性。明显地，如图41所示，在4次以9AC-G微脂体治疗之后，6、7只治疗的小鼠可观达到低毒性且无法侦测到肿瘤。在其他治疗组别中，游离的9AC或游离的9AC-G对于肿瘤生长有较小的功效。当小鼠以9AC-G微脂体治疗时，小鼠存活显着地增加，但以游离的9AC或游离的9AC-G治疗则不会(图42)。我们观察到注射9AC-G微脂体24小时后，在肿瘤内活化的母体药物9AC的量比血液内高出30倍(图43)。这现象可能是由于藉由奈米颗粒透过泄漏血液肿瘤血管而累积且保留于肿瘤内而增加通透性及保留效果(enhanced permeability and retention effect,EPR)。肿瘤内累积9AC-G微脂体会造成在肿瘤本身内增加生成9AC量的结果。

经由比较，在肿瘤接种第84天，4周注射微脂体小红莓(以1mg/kg

)仅减低肿瘤进展速率而藉由9AC-G微脂体则可达到强烈的肿瘤抑制(图44)。为了改善抗肿瘤活性，增加Doxisome剂量至3mg/kg，会产生以9AC-G微脂体处理不会出现的主要毒性。结果，所有的小鼠在第3次以3mg/kg Doxisome治疗后的3天内皆死亡(图45)。

当呈现并描述实施例时，在不背离本文的概念下，对于那些本领域具有通常知识者进行更多的可能性修改是显而易见的。因此，除了在权利要求书的本质之外，所请求保护的主题并不受限制。

表1

补充表1

[参考文献]

1.Bozzuto,G.；Molinari,A.Liposomes as Nanomedical Devices.Int JNanomedicine 2015,10,975-999.

2.Pattni,B.S.；Chupin,V.V.；Torchilin,V.P.New Developments in LiposomalDrug Delivery.Chem Rev 2015,115,10938-10966.

3.Torchilin,V.P.Interview with Vladimir P Torchilin:LiposomalCarriers for Drug Delivery.Ther Deliv 2013,4,537-538.

4.Mallick,S.；Choi,J.S.Liposomes:Versatile and BiocompatibleNanovesicles for Efficient Biomolecules Delivery.J Nanosci Nanotechnol2014,14,755-765.

5.Lasic,D.D.；Needham,D.The”Stealth”Liposome:A PrototypicalBiomaterial.Chem Rev 1995,95,2601-2628.

6.Peer,D.；Karp,J.M.；Hong,S.；Farokhzad,O.C.；Margalit,R.；Langer,R.Nanocarriers as an Emerging Platform for Cancer Therapy.Nat Nano 2007,2,751-760.

7.Chen,H.；Kim,S.；Li,L.；Wang,S.；Park,K.；Cheng,J.-X.Release ofHydrophobic Molecules from Polymer Micelles into Cell Membranes Revealed by

Resonance Energy Transfer Imaging.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 2008,105,6596-6601.

8.Zhigaltsev,I.V.；Maurer,N.；Akhong,Q.-F.；Leone,R.；Leng,E.；Wang,J.；Semple,S.C.；Cullis,P.R.Liposome-Encapsulated Vincristine,Vinblastine andVinorelbine:A Comparative Study of Drug Loading and Retention.Journal ofControlled Release 2005,104,103-111.

9.Bhardwaj,U.；Burgess,D.J.Physicochemical Properties of Extruded andNon-Extruded Liposomes Containing the Hydrophobic DrugDexamethasone.International Journal of Pharmaceutics 2010,388,181-189.

10.Bernsdorff,C.；Reszka,R.；Winter,R.Interaction of the AnticancerAgent Taxol(Paclitaxel)with Phospholipid Bilayers.J Biomed Mater Res 1999,46,141-149.

11.Leu,Y.L.；Roffler,S.R.；Chern,J.W.Design and Synthesis of Water-Soluble Glucuronide Derivatives of Camptothecin for Cancer ProdrugMonotherapy and Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy(Adept).J Med Chem1999,42,3623-3628.

12.Leu,Y.L.；Chen,C.S.；Wu,Y.J.；Chern,J.W.Benzyl Ether-LinkedGlucuronide Derivative of 10-Hydroxycamptothecin Designed for SelectiveCamptothecin-Based Anticancer Therapy.J Med Chem 2008,51,1740-1746.

13.Prijovich,Z.M.；Leu,Y.L.；Roffler,S.R.Stability of the New Prodrug9-Aminocamptothecin Glucuronide(9acg)in the Presence of Human SerumAlbumin.Biochem Pharmacol 2003,66,1181-1187.

14.Schmidt,F.；Monneret,C.Prodrug Mono Therapy:Synthesis andBiological Evaluation of an Etoposide Glucuronide-Prodrug.Bioorg MedChem2003,11,2277-2283.

15.Rautio,J.；Kumpulainen,H.；Heimbach,T.；Oliyai,R.；Oh,D.；Jarvinen,T.；Savolainen,J.Prodrugs:Design and Clinical Applications.Nat Rev Drug Discov2008,7,255-270.

16.Clerc,S.；Barenholz,Y.Liposome Drug-Loading Method andComposition.Google Patents:1999.

17.Clerc,S.；Barenholz,Y.Loading of Amphipathic Weak Acids intoLiposomes in Response to Transmembrane Calcium Acetate Gradients.BiochimBiophys Acta 1995,1240,257-265.

18.Alaoui,A.E.；Saha,N.；Schmidt,F.；Monneret,C.；Florent,J.C.New Taxol(Paclitaxel)Prodrugs Designed for Adept and Pmt Strategies in CancerChemotherapy.Bioorg Med Chem 2006,14,5012-5019.

19.Bakina,E.；Wu,Z.；Rosenblum,M.；Farquhar,D.Intensely CytotoxicAnthracycline Prodrugs:Glucuronides.J Med Chem 1997,40,4013-4018.

20.Lougerstay-Madec,R.；Florent,J.C.；Monneret,C.；Nemati,F.；Poupon,M.F.Synthesis of Self-Immolative Glucuronide-Based Prodrugs of a PhenolMustard.Anticancer Drug Des 1998,13,995-1007.

21.Angenault,S.；Thirot,S.；Schmidt,F.；Monneret,C.；Pfeiffer,B.；Renard,P.Cancer Chemotherapy:A Sn-38(7-Ethyl-10-Hydroxycamptothecin)GlucuronideProdrug for Treatment by a Pmt(Prodrug Monotherapy)Strategy.Bioorg Med ChemLett 2003,13,947-950.

22.Baba,T.；Kidera,Y.；Kimura,N.T.；Aoki,K.；Kamura,T.；Taniguchi,S.；Nishikawa,K.5-Fluorouracil O-Beta-D-Glucuronide as a Newly SynthesizedChemically Modified,Nontoxic Anticancer Drug.Gan 1978,69,283-284.

23.Gauthier,C.；Legault,J.；Lavoie,S.；Rondeau,S.；Tremblay,S.；Pichette,A.Synthesis and Cytotoxicity of Bidesmosidic Betulin and Betulinic AcidSaponins.J Nat Prod 2009,72,72-81.

24.de Graaf,M.；Pinedo,H.M.；Oosterhoff,D.；van der Meulen-Muileman,I.H.；Gerritsen,W.R.；Haisma,H.J.；Boven,E.Pronounced Antitumor Efficacy byExtracellular Activation of a Doxorubicin-Glucuronide Prodrug afterAdenoviral Vector-Mediated Expression of a Human Antibody-Enzyme FusionProtein.Hum Gene Ther 2004,15,229-238.

25.Grinda,M.；Clarhaut,J.；Renoux,B.；Tranoy-Opalinski,I.；Papot,S.ASelf-Immolative Dendritic Glucuronide Prodrug of Doxorubicin.Medchemcomm2012,3,68-70.

26.Grinda,M.；Clarhaut,J.；Tranoy-Opalinski,I.；Renoux,B.；Monvoisin,A.；Cronier,L.；Papot,S.A Heterodimeric Glucuronide Prodrug for Cancer Tritherapy:The Double Role of the Chemical Amplifier.ChemMedChem 2011,6,2137-2141.

27.Hamon,F.；Renoux,B.；Chadeneau,C.；Muller,J.M.；Papot,S.Study of aCyclopamine Glucuronide Prodrug for the Selective Chemotherapy ofGlioblastoma.Eur J Med Chem 2010,45,1678-1682.

28.Houba,P.H.；Boven,E.；van der Meulen-Muileman,I.H.；Leenders,R.G.；Scheeren,J.W.；Pinedo,H.M.；Haisma,H.J.A Novel Doxorubicin-Glucuronide ProdrugDox-Ga3 for Tumour-Selective Chemotherapy:Distribution and Efficacy inExperimental Human Ovarian Cancer.Br J Cancer 2001,84,550-557.

29.Houba,P.H.；Leenders,R.G.；Boven,E.；Scheeren,J.W.；Pinedo,H.M.；Haisma,H.J.Characterization of Novel Anthracycline Prodrugs Activated byHuman Beta-Glucuronidase for Use in Antibody-Directed Enzyme ProdrugTherapy.Biochem Pharmacol 1996,52,455-463.

30.Kamal,A.；Tekumalla,V.；Raju,P.；Naidu,V.G.；Diwan,P.V.；Sistla,R.Pyrrolo[2,1-C][1,4]Benzodiazepine-Beta-Glucuronide Prodrugs with aPotential for Selective Therapy of Solid Tumors by Pmt and AdeptStrategies.Bioorg Med Chem Lett 2008,18,3769-3773.

31.Leenders,R.G.；Damen,E.W.；Bijsterveld,E.J.；Scheeren,H.W.；Houba,P.H.；van der Meulen-Muileman,I.H.；Boven,E.；Haisma,H.J.Novel Anthracycline-Spacer-Beta-Glucuronide,-Beta-Glucoside,and -Beta-Galactoside Prodrugs forApplication in Selective Chemotherapy.Bioorg Med Chem 1999,7,1597-1610.

32.Legigan,T.；Clarhaut,J.；Renoux,B.；Tranoy-Opalinski,I.；Monvoisin,A.；Berjeaud,J.M.；Guilhot,F.；Papot,S.Synthesis and Antitumor Efficacy of a Beta-Glucuronidase-Responsive Albumin-Binding Prodrug of Doxorubicin.J Med Chem2012,55,4516-4520.

33.Prijovic,Z.M.；Leu,Y.L.；Roffler,S.R.Bqc-G,a Tumor-Selective Anti-Cancer Prodrug.Google Patents:2013.

34.Prijovich,Z.M.；Chen,B.M.；Leu,Y.L.；Chern,J.W.；Roffler,S.R.Anti-Tumour Activity and Toxicity of the New Prodrug 9-AminocamptothecinGlucuronide(9acg)in Mice.Br J Cancer 2002,86,1634-1638.

35.Prijovich,Z.M.；Leu,Y.L.；Roffler,S.R.Effect of Ph and Human SerumAlbumin on the Cytotoxicity of a Glucuronide Prodrug of 9-Aminocamptothecin.Cancer Chemother Pharmacol 2007,60,7-17.

36.Nolen,H.,3rd；Fedorak,R.N.；Friend,D.R.Budesonide-Beta-D-Glucuronide:A Potential Prodrug for Treatment of Ulcerative Colitis.J PharmSci 1995,84,677-681.

37.Nolen,H.W.,3rd；Friend,D.R.Menthol-Beta-D-Glucuronide:A PotentialProdrug for Treatment of the Irritable Bowel Syndrome.Pharm Res 1994,11,1707-1711.

38.Renoux,B.；Legigan,T.；Bensalma,S.；Chadeneau,C.；Muller,J.M.；Papot,S.A New Cyclopamine Glucuronide Prodrug with Improved Kinetics of DrugRelease.Org Biomol Chem 2011,9,8459-8464.

39.Skopp,G.；Lutz,R.；Potsch,L.；Ganssmann,B.；Klinder,K.；Schmidt,A.；Aderjan,R.；Mattern,R.An in Vitro Experiment for Postmortem VascularPermeation.The Passage of Morphine and Morphine Glucuronides across aVascular Wall.J Forensic Sci 1997,42,486-491.

40.Schmidt,L.E.；Rasmussen,A.；Norrelykke,M.R.；Poulsen,H.E.；Hansen,B.A.The Effect of Selective Bowel Decontamination on the Pharmacokinetics ofMycophenolate Mofetil in Liver Transplant Recipients.Liver Transpl 2001,7,739-742.

41.Thomas,M.；Clarhaut,J.；Tranoy-Opalinski,I.；Gesson,J.P.；Roche,J.；Papot,S.Synthesis and Biological Evaluation of Glucuronide Prodrugs of theHistone Deacetylase Inhibitor Ci-994 for Application in Selective CancerChemotherapy.Bioorg Med Chem 2008,16,8109-8116.

42.Thomas,M.；Rivault,F.；Tranoy-Opalinski,I.；Roche,J.；Gesson,J.P.；Papot,S.Synthesis and Biological Evaluation of the Suberoylanilide HydroxamicAcid(Saha)Beta-Glucuronide and Beta-Galactoside forApplication in SelectiveProdrug Chemotherapy.Bioorg Med Chem Lett 2007,17,983-986.

43.Tietze,L.F.；Schuster,H.J.；Schmuck,K.；Schuberth,I.；Alves,F.Duocarmycin-Based Prodrugs for Cancer Prodrug Monotherapy.Bioorg Med Chem2008,16,6312-6318.

44.Wang,J.；Davis,M.；Li,F.；Azam,F.；Scatina,J.；Talaat,R.A NovelApproach for Predicting Acyl Glucuronide Reactivity Via Schiff BaseFormation:Development of Rapidly Formed Peptide Adducts for Lc/Ms/MsMeasurements.Chem Res Toxicol 2004,17,1206-1216.

45.Cheng,T.L.；Chou,W.C.；Chen,B.M.；Chern,J.W.；Roffler,S.R.Characterization of an Antineoplastic Glucuronide Prodrug.BiochemPharmacol 1999,58,325-328.

46.Gu,Y.；Tingle,M.D.；Wilson,W.R.Glucuronidation of Anticancer ProdrugPr-104a:Species Differences,Identification of Human Udp-Glucuronosyltransferases,and Implications for Therapy.J Pharmacol Exp Ther2011,337,692-702.

47.Yang,J.H.；Hsia,T.C.；Kuo,H.M.；Chao,P.D.；Chou,C.C.；Wei,Y.H.；Chung,J.G.Inhibition of Lung Cancer Cell Growth by Quercetin Glucuronides Via G2/MArrest and Induction of Apoptosis.Drug Metab Dispos 2006,34,296-304.

48.Wang,S.M.；Chern,J.W.；Yeh,M.Y.；Ng,J.C.；Tung,E.；Roffler,S.R.SpecificActivation of Glucuronide Prodrugs by Antibody-Targeted Enzyme Conjugates forCancer Therapy.Cancer Res 1992,52,4484-4491.

49.Ediz,M.；Avcibasi,U.；Unak,P.；Muftuler,F.Z.；Medine,E.I.；Yurt Kilcar,A.；Demiroglu,H.；Gumuser,F.G.；Sakarya,S.Investigation of TherapeuticEfficiency of Bleomycin and Bleomycin-Glucuronide Labeled with(131)I on theCancer Cell Lines.Cancer Biother Radiopharm2013,28,310-319.

50.Rahman,A.；Carmichael,D.；Harris,M.；Roh,J.K.ComparativePharmacokinetics of Free Doxorubicin and Doxorubicin Entrapped in CardiolipinLiposomes.Cancer Res 1986,46,2295-2299.

51.Yates,T.J.；Lopez,L.E.；Lokeshwar,S.D.；Ortiz,N.；Kallifatidis,G.；Jordan,A.；Hoye,K.；Altman,N.；Lokeshwar,V.B.Dietary Supplement 4-Methylumbelliferone:An Effective Chemopreventive and Therapeutic Agent forProstate Cancer.J Natl Cancer Inst 2015,107.

Claims (26)

1.一种用于负载葡萄糖醛酸苷酯至微脂体的方法，包括：

(a)制备微脂体悬浮液，所述微脂体悬浮液的外部pH小于7且内部pH足够高以将葡萄糖醛酸苷酯转化成葡萄糖醛酸苷；

(b)藉由将酯基结合至所述葡萄糖醛酸苷以制备葡萄糖醛酸苷酯；以及

(c)将所述葡萄糖醛酸苷酯加入所述微脂体悬浮液中，其中，所述葡萄糖醛酸苷酯是负载至所述微脂体内，

其中，所述微脂体内的所述葡萄糖醛酸苷酯是经皂化以生成葡萄糖醛酸苷。

2.一种用于负载葡萄糖醛酸苷烷酯至微脂体的方法，包括：

(a)制备微脂体悬浮液，所述微脂体悬浮液的外部pH小于7且内部pH足够高以将葡萄糖醛酸苷烷酯转化成葡萄糖醛酸苷；

(b)藉由将烷酯基结合至所述葡萄糖醛酸苷以制备所述葡萄糖醛酸苷烷酯；以及

(c)将所述葡萄糖醛酸苷烷酯加入所述微脂体悬浮液中，其中，所述葡萄糖醛酸苷烷酯是负载至所述微脂体内，且

其中，所述微脂体内的所述葡萄糖醛酸苷烷酯是经皂化以生成葡萄糖醛酸苷。

3.一种用于负载葡萄糖醛酸苷甲酯至微脂体的方法，包括：

(a)制备微脂体悬浮液，所述微脂体悬浮液的外部pH小于7且内部pH足够高以将所述葡萄糖醛酸苷甲酯转化成葡萄糖醛酸苷；

(b)藉由将甲酯基结合至所述葡萄糖醛酸苷以制备所述葡萄糖醛酸苷甲酯；以及

(c)将所述葡萄糖醛酸苷甲酯加入所述微脂体悬浮液中，其中，所述葡萄糖醛酸苷甲酯是负载至所述微脂体内，且

其中，所述微脂体内的所述葡萄糖醛酸苷甲酯是经皂化以生成葡萄糖醛酸苷。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法有效地以葡萄糖醛酸苷化的亲水形式，增加疏水性化合物的微脂体保存。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法有效地增加葡萄糖醛酸苷的微脂体保存。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法有效地将葡萄糖醛酸苷化的亲水形式的疏水性化合物负载至微脂体的水核内。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法有效地将葡萄糖醛酸苷负载至微脂体的水核内。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法有效地改善活体内所述葡萄糖醛酸苷的半衰期。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述内部pH大于7且所述外部pH小于7。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述内部pH是从7.5至8.5且所述外部pH是从4.5至5.5。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述内部pH为8且所述外部pH为5。

12.一种负载葡萄糖醛酸苷至微脂体的方法，包括：

(a)将葡萄糖醛酸苷于酸性甲醇中反应以形成葡萄糖醛酸苷甲酯(葡萄糖醛酸苷-mE)；

(b)制备微脂体，其中，所述微脂体具有内部pH从7.5至8.5；

(c)将所述微脂体与含有葡萄糖醛酸苷-mE且具有pH从4.5至5.5的溶液接触；以及

(d)从所述溶液纯化所述微脂体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述内部pH为8且所述溶液的pH为5。

14.一种用于制备负载有葡萄糖醛酸苷的微脂体的方法，包括：

(a)将葡萄糖醛酸苷于酸性甲醇中反应以形成葡萄糖醛酸苷甲酯(葡萄糖醛酸苷-mE)；

(b)制备微脂体，其中，所述微脂体具有内部pH从7.5至8.5；

(c)将所述微脂体与含有葡萄糖醛酸苷-mE且具有pH从4.5至5.5的溶液接触；以及

(d)从所述溶液纯化所述微脂体。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述内部pH为8且所述溶液的pH为5。

16.一种包括抗癌药物的葡萄糖醛酸苷的微脂体，其中，所述微脂体是藉由包括将葡萄糖醛酸苷的甲酯加入至在具有外部pH的溶液中之前驱微脂体的过程中制备而得，其中，所述微脂体具有大于所述外部pH的内部pH，且其中所述内部pH足够高以将所述葡萄糖醛酸苷的甲酯转化成葡萄糖醛酸苷。

17.根据权利要求16所述的微脂体，其中，所述内部pH大于7且所述外部pH小于7。

18.根据权利要求16所述的微脂体，其中，所述内部pH从7.5至8.5且所述外部pH从4.5至5.5。

19.根据权利要求16所述的微脂体，其中，所述内部pH为8且所述外部pH为5。

20.一种有效量的根据权利要求16至19中任一项所述的微脂体于制备用于治疗癌症或减少肿瘤尺寸的药物的用途，包括施予所述微脂体至有需要治疗的哺乳动物或人类病患，以减少肿瘤尺寸。

21.一种有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的方法所制备的微脂体于制备用于治疗癌症或减少肿瘤尺寸的药物的用途，包括施予所述微脂体至有需要治疗的哺乳动物或人类病患，以减少肿瘤尺寸。

22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述癌症是肺癌、乳癌或大肠癌，且其中所述肿瘤是起源于肺部、乳房或大肠。

23.根据权利要求21所述的用途，其中，所述药物是选自由下列所组成的群组：4-甲基伞形酮、9-氨基喜树碱、5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱、阿柔比星、放线菌霉素、安吖啶、桦木醇、博莱霉素、硫酸布他卡因、双氯乙基亚硝脲、氯芥苯丁酸、顺铂、克拉屈滨、环巴氨、达喀尔巴嗪、放线菌素、道诺霉素、欧洲紫杉醇、小红莓、泛艾霉素、雌莫司汀、依妥普赛、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、羟苯氨芥、伊达比星、爱莱诺迪肯、伊沙匹隆、白叶酸、环己亚硝、氮芥苯丙氨酸、硫醇嘌呤、美司那、氨甲叶酸、丝裂霉素、米土先强、单甲基奥瑞他汀、太平洋紫杉醇、培美曲塞、PR-104A、吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯、榭皮素、雷替曲塞、SN-38、辛二酰苯氨羟氨酸、泰克地那林、他比特定、坦尼坡赛、拓普替康、长春新碱、温诺平、长春碱及长春地辛。

24.一种有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的方法负载的微脂体于制备治疗癌症或减少肿瘤尺寸的药物的用途，包括施予所述微脂体至有需要治疗的哺乳动物或人类病患，以减少肿瘤尺寸。

25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述癌症是肺癌、乳癌或大肠癌，或其中所述癌症是起源于肺部、乳房或大肠。

26.根据权利要求24所述的用途，其中，所述药物是选自由下列所组成的群组：4-甲基伞形酮、9-氨基喜树碱、5,6-二氢-4H-苯并[脱]喹啉-喜树碱、阿柔比星、放线菌霉素、安吖啶、桦木醇、博莱霉素、硫酸布他卡因、双氯乙基亚硝脲、氯芥苯丁酸、顺铂、克拉屈滨、环巴氨、达喀尔巴嗪、放线菌素、道诺霉素、欧洲紫杉醇、小红莓、泛艾霉素、雌莫司汀、依妥普赛、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、羟苯氨芥、伊达比星、爱莱诺迪肯、伊沙匹隆、白叶酸、环己亚硝、氮芥苯丙氨酸、硫醇嘌呤、美司那、氨甲叶酸、丝裂霉素、米土先强、单甲基奥瑞他汀、太平洋紫杉醇、培美曲塞、PR-104A、吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯、榭皮素、雷替曲塞、SN-38、辛二酰苯氨羟氨酸、泰克地那林、他比特定、坦尼坡赛、拓普替康、长春新碱、温诺平、长春碱及长春地辛。

Images