TW201735903A - 基於酯化／皂化用於微酯體負載之方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述一種於添加烷酯基而形成酯化的化合物後，負載親水性化合物至微脂體之方法。負載之後，烷酯基水解而再次在微脂體內部形成親水性化合物。本文亦描述一種負載呈葡萄糖醛酸苷甲酯形式之藥物至微脂體之方法。在微脂體內部，藥物之葡萄糖醛酸苷甲酯形式皂化成藥物之葡萄糖醛酸苷形式，以較佳保存藥物。當細胞吸收、微脂體降解及酵素水解後，可從細胞內移除結合至藥物之葡萄糖醛酸苷殘基，以再次生成母體藥物。就癌症而言，此方法可用於安全地遞送藥物至腫瘤。

Description

基於酯化/皂化用於微脂體負載之方法
本發明涉及葡萄糖醛酸苷酯(如葡萄糖醛酸苷甲酯)之負載及在pH梯度微脂體內皂化為葡萄糖醛酸苷。
微脂體係生物穩定的脂質囊泡，製造來攜帶藥物至標靶組織，且數個微脂體藥物目前已於臨床上使用。多數FDA已核准或於臨床試驗第II/III期用以運載抗癌藥物之奈米粒子為微脂體1-3。微脂體呈現眾多的優點，諸如具有生物相容性4、非免疫原性5、在循環中穩定但在標靶位置分解時，可100%釋放其負載。微脂體包覆主要的缺點包括難以主動負載藥物至微脂體以及對微脂體內之疏水性藥物具有較差的保存6-8。未成熟「爆裂」釋放及自微脂體持續洩漏藥物不僅會對健康組織產生有害的副作用，亦會由於降低標靶負載而減低治療效果。疏水性藥物亦會使微脂體膜失去穩定性，導致甚至更快釋放所包覆的藥物9。亦觀察到疏水性藥物之負載受限於膜內快速形成之針狀沉澱物10。另一方面，負載於微脂體之親水性藥物累積於 水核內且不與微脂體膜進行交互作用。此等劑型更加穩定且較少受上述問題影響。然而，微脂體膜較差的溶解度使高濃度的親水性藥物難以主動負載至微脂體內。
可藉由添加諸如糖部分之親水基團以降低藥物之疏水性。糖結合後顯著增強親水性之良好實例為在疏水性藥物的母結構上添加葡萄糖醛酸苷殘基11-15。將葡萄糖醛酸苷部分附接至疏水性藥物係預期大量降低藥物自微脂體之洩漏。反過來說，其可促進疏水性藥物穩定保存於微脂體內，從而減低較少系統之毒性之藥物洩漏以及使更多藥物到達標靶組織。然而，目前尚未揭露對於負載葡萄糖醛酸苷藥物至微脂體之有效方法。
藥物負載之方法可分為兩種類別：被動及主動。被動方法仰賴在自乾燥的脂質膜形成囊泡之過程中，將藥物包覆於微脂體內。在被動方法中，微脂體的內部濃度等同於大量介質中之外部濃度。主動方法仰賴化學驅動力，導致化合物累積於預先成形的微脂體內部。由主動方法所提供的負載效率顯著大於由被動負載所達到之負載效率。
仰賴基於醋酸鈣之跨膜梯度以負載雙親性弱酸至微脂體內之方法係由Barenholz et al.(美國專利第5,939,096號16)及Clerc et al.所開發17。在此方法中，弱酸在低pH值很容易通過膜，因而穿透至微脂體。接著在內部高pH值於離子化後被捕捉於內部。內部的醋酸係用作為質子，從微脂體內部穿梭到外部，其目的為當負載弱酸 時，維持內部高pH。相反的，鈣之低膜穿透性會引起高內部鈣濃度，其可使弱酸藥物沉澱於微脂體內以具更佳的穩定性。然而此方法係為雙親性弱酸而開發，並不適用於諸如葡萄糖醛酸苷類之親水性弱酸。弱酸家族成員之葡萄糖醛酸苷類之特徵在於對脂質膜有很差的親和力且強烈有利於水相，意謂葡萄糖醛酸苷類排除自兩性化合物之範圍外。
本文中所描述之方法係基於烷基酯之負載以有效地負載藥物之葡萄糖醛酸苷衍生物。其條件係設為可使微脂體內部之葡萄糖醛酸苷甲酯衍生物轉化成親水性葡萄糖醛酸苷衍生物。此外，微脂體吸收至標靶細胞且從藥物經酵素剪切葡萄糖醛酸苷基團之後再生母體藥物。如補充表1所示，已合成許多抗癌藥物之葡萄糖醛酸苷11-14、18-44，但是並未提出主動負載該等至微脂體內之方法。
共價添加糖苷殘基(諸如藉由葡萄糖醛酸苷化的葡萄糖醛酸苷殘基)係製造更多抗癌藥物之水溶性衍生物之方法11-15。本文中之「葡萄糖醛酸苷」可為經由糖苷鍵或化學鍵連基(chemical linker)以將葡萄糖醛酸結合至另一個物質之任何物質。至今，已合成許多抗癌藥物之葡萄糖醛酸苷且可商購取得許多其他類型之葡萄糖醛酸苷11-14、22、23、27、28、38、41、43、45-49。經化學修飾後，此等藥物變更具水溶性。了解這些特性後，負載葡萄糖醛酸苷可提供疏水性藥物之較佳的微脂體保存。此外，注射抗癌藥物之游離葡萄糖醛酸苷亦會受快速清除率影響50。微脂體包覆 可幫助延長體內葡萄糖醛酸苷之半衰期。
本發明的一態樣提供在具有內部pH大於外部pH之微脂體內負載葡萄糖醛酸苷之描述。內部pH可大於7且外部pH小於7。內部pH可約為8且外部pH可約為5。本文證實葡萄糖醛酸苷衍生物之負載，有2種疏水性抗癌化合物：9-胺基喜樹鹼(9AC)、5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼(BQC)，及1種疏水性螢光化合物：4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone)，其為最近發現可對抗前列腺癌發展之前景看好的無毒性治療劑51。
葡萄糖醛酸苷之負載係在烷基酯，特別地為甲酯，形式(葡萄糖醛酸苷-甲酯)下實現，葡萄糖醛酸苷-甲酯為葡萄糖醛酸苷之更具膜穿透性形式。將葡萄糖醛酸苷-甲酯加入pH值(外部pH)小於微脂體核心內之介質之pH(內部pH)之外部介質中。負載葡萄糖醛酸苷-甲酯之後，內部pH足以自發地水解甲酯基並藉由微脂體內部之皂化改造葡萄糖醛酸苷。
在另一態樣中，實現在葡萄糖醛酸苷化前與後之疏水性藥物之微脂體保存之比較。將非-葡萄糖醛酸苷及葡萄糖醛酸苷化合物負載至微脂體，並偵測在生物環境中之藥物穩定性。
在另一態樣中，描述在活體外殺死癌細胞或在哺乳動物內減少腫瘤尺寸。本文中所描述之任何負載葡萄糖醛酸苷之微脂體以有效量施予哺乳動物，以減少腫瘤尺寸且對哺乳動物毒性最小。
在另一態樣中，評估比較游離的葡萄糖醛酸苷藥物與包覆於微脂體內之葡萄糖醛酸苷藥物之藥物動力學。靜脈注射游離的葡萄糖醛酸苷及微脂體葡萄糖醛酸苷，並偵測血液清除率。
在另一態樣中，在細胞吸收葡萄糖醛酸苷負載之微脂體及經溶酶體酵素β-葡萄糖醛酸苷酶剪切之後之疏水性藥物再生係於活體外癌細胞培養及荷人類腫瘤哺乳動物中證實。
在另一態樣中，證實在腫瘤內之再生藥物(活化形式)的量顯著地高於血液循環內之再生藥物的量。
在另一態樣中描述其中製備母體疏水性藥物之葡萄糖醛酸苷形式之方法。該藥物之親水性形式接著藉由將烷酯基結合至藥物之親水性形式以進行酯化(例如甲酯)，然後形成酯化化合物。藉由本文中描述更仔細之方法，將該酯化化合物加入微脂體懸浮液中。將微脂體施予腫瘤細胞之後，觀察到在細胞內，微脂體會降解為溶酶體，釋放葡萄糖醛酸苷化形式之藥物至溶酶體內。之後溶酶體內之β-葡萄糖醛酸苷酶(酵素)可切斷葡萄糖醛酸苷與藥物或間隔基-藥物(spacer-drug)之間的糖苷鍵，從而再生母體化合物。
其他的態樣及優點將於圖式及詳細說明中呈現。
實施例藉由附圖說明，其中：
第1圖顯示葡萄糖醛酸苷基結合至疏水性藥物後，水溶解度增加。(縮寫：9AC，9-胺基喜樹鹼；BQC，5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼)n=3。誤差槓，SD。使用雙尾非對稱學生氏T-測試(Two-tailed unpaired Student’s T-test)於統計分析。星號代表顯著性；p<0.0001(***)。
第2圖顯示從葡萄糖醛酸苷合成葡萄糖醛酸苷甲酯(-mE)。9-胺基喜樹鹼葡萄糖醛酸苷(9AC-G)、5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼葡萄糖醛酸苷(BQC-G)及4-甲基傘形酮葡萄糖醛酸苷(4MU-G)至葡萄糖醛酸苷甲酯(-mE)之化學合成係實現於甲醇及添加硫酸之酸性條件下。
第3圖顯示於65℃、酸性甲醇中，時間依賴性的從葡萄糖醛酸苷合成葡萄糖醛酸苷-甲酯。結果係獲得自高效液相層析(HPLC)。(RFU=相對的螢光單位)。
第4圖顯示葡萄糖醛酸苷及葡萄糖醛酸苷-甲酯之辛醇-水分布。將葡萄糖醛酸苷及葡萄糖醛酸苷-甲酯於不混溶的水相及有機相(檸檬酸pH 5及1-辛醇)中，並於室溫且搖動下培養隔夜。分析來自各相之樣本，以表徵化合物之分布。n=3至5。
第5圖顯示依式：log P辛醇/水=log([溶質]辛醇/[溶質]水)計算在1-辛醇及檸檬酸pH 5之各相中葡萄糖醛酸苷及葡萄糖醛酸苷-甲酯之Log P。n=3至5。誤差槓，SD。
第6圖顯示9-胺基喜樹鹼葡萄糖醛酸苷甲酯(9ACGmE)之穩定度。於75℃，pH 5偵測9ACGmE之穩 定度。藉由HPLC並以分別為370nm及460nm之激發及發射波長進行定量。(縮寫：9AC，9-胺基喜樹鹼；9AC-G，9-胺基喜樹鹼葡萄糖醛酸苷；9AC-GmE，甲酯形式之9AC-G)。n=3。誤差槓，SD。
第7圖顯示在鹼性pH，9-胺基喜樹鹼葡萄糖醛酸苷甲酯(9AC-GmE)轉化成9-胺基喜樹鹼葡萄糖醛酸苷(9AC-G)。於75℃，pH 8.5隨時間偵測9AC-GmE轉化成-9AC-G。藉由HPLC並以分別為370nm及460nm之激發及發射波長進行定量。n=3，誤差槓，SD。
第8圖顯示於65℃，在甲醇及硫酸(H2SO4)內生成葡萄糖醛酸苷甲酯。
第9圖顯示所提出的葡萄糖醛酸苷甲酯藥物衍生物及微脂體內轉化成葡萄糖醛酸苷藥物衍生物之負載機制。葡萄糖醛酸苷甲酯係加入至微脂體之外部介質。於pH 5及75℃，葡萄糖醛酸苷-甲酯穩定於微脂體外部，但可穿透微脂體之脂質雙層。在微脂體內部，於內部較高pH，游離的氫氧根離子會與葡萄糖醛酸苷-甲酯反應，經由皂化釋放甲醇(CH3OH)及葡萄糖醛酸苷形式之衍生物。離子化的葡萄糖醛酸苷可與微脂體內部鈣離子沉澱。
第10圖顯示於75℃，在混合如第9圖之描述所製備之具有外部低pH及內部高pH之微脂體之後，9AC-GmE於外部介質中消失。
第11圖顯示於75℃，在微脂體與9AC-GmE混合之後，於微脂體內部出現9AC-G。
第12圖顯示在藥物負載之前，藉由低溫電子顯微鏡成像微脂體。(比例尺=100nm)。
第13圖顯示在負載9-胺基喜樹鹼(9AC)之後，藉由低溫電子顯微鏡成像微脂體。(比例尺=100nm)。
第14圖顯示在負載5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼(BQC)之後，藉由低溫電子顯微鏡成像微脂體。箭頭顯示沉澱之內部的BQC。(比例尺=100nm)。
第15圖顯示在負載9-胺基喜樹鹼葡萄糖醛酸苷甲酯(9AC-GmE)及內部轉化成9AC-G之後，藉由低溫電子顯微鏡成像微脂體。箭頭顯示沉澱之內部的9AC-G。(比例尺=100nm)。
第16圖顯示在負載5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼萄糖苷酸甲酯(BQC-GmE)及內部轉化成BQC-G之後，藉由低溫電子顯微鏡成像微脂體。箭頭顯示沉澱之內部的BQC-G。(比例尺=100nm)。
第17圖顯示經負載之微脂體之HPLC分析。將9AC-GmE加入微脂體之外部介質，於75℃負載1小時，並藉由尺寸篩除層析以移除非包覆的殘基。圖顯示未經裂解下，將微脂體直接注射至管柱之層析圖。(RFU=相對的螢光單位)。
第18圖顯示經負載之微脂體之HPLC分析。將9AC-GmE加入微脂體之外部介質，於72℃負載1小時，並藉由尺寸篩除層析以移除非包覆的殘基。圖顯示經1% Triton X-100裂解後，將微脂體直接注射至管柱之層 析圖。(RFU=相對的螢光單位)。
第19圖顯示葡萄糖醛酸苷-甲酯之負載。9AC-GE、BQC-GmE及4MU-GE(從重量比為1：5開始，藥物：液體)之負載能力係藉由HPLC分析外部介質內藥物之消散而表徵。n=3，誤差槓，SD。
第20圖顯示葡萄糖醛酸苷-甲酯之內轉化。經由皂化之9AC-GmE至9AC-G、BQC-GmE至BQC-G及4MU-GmE至4MU-G之內轉化係於移除外部藥物及裂解微脂體後，藉由HPCL分析其含量而表徵。n=3，誤差槓，SD。
第21圖顯示葡萄糖醛酸苷衍生物負載為葡萄糖醛酸苷-甲酯之最終藥物與脂質之莫耳比。最終藥物與脂質之比例係藉由HPLC以檢測內部的葡萄糖醛酸苷之最終含量而表徵，且脂質量係藉由巴特列特(Bartlett)法之磷分析而測得。n=3，誤差槓，SD。
第22圖顯示比較葡萄糖醛酸苷甲酯或葡萄糖醛酸苷甲酯衍生物及相較於藥物葡萄糖醛酸苷，由藥物葡萄糖醛酸苷甲酯所提供之倍數改善之負載效能。n=3，誤差槓，SD。使用雙尾非對稱學生氏T-測試於統計分析。星號代表顯著性；p<0.001(**)及p<0.0001(***)。
第23圖顯示當培養於37℃，在含有10% EBS之PBS中之微脂體之藥物保留。曲線顯示經過7天之後，比較母體9AC及9AC-G之間之保留。n=3，誤差槓，SD。
第24圖顯示當培養於37℃，在含有10% FBS 之PBS中之微脂體之藥物保留。曲線顯示經過7天之後，比較母體BQC及BQC-G之間之保留。n=3，誤差槓，SD。
第25圖顯示負載有BQC或BQC-G之微脂體之膜厚度。厚度係基於獲自低溫電子顯微鏡之顯微照片，其在ImageJ(NIH)放大為真實尺寸而測量。在隨機地測量不同位置之空微脂體或負載有BQC或BQC-G之微脂體之膜厚度之前，使用「設置尺規」(Set Scale)工具測定相應於100nm比例尺之像素量。藉由顯微照片之格交疊以獲得隨機化法，並於格與微脂體膜接觸之個時間點測量厚度，直到收集40個值。使用雙尾非對稱學生氏T-測試於統計分析。星號代表顯著性；p<0.01(*)及p<0.0001(***)。
第26圖顯示負載有9AC或9AC-G之微脂體之膜厚度。厚度係基於獲自低溫電子顯微鏡之顯微照片，其在ImageJ(NIH)放大為真實尺寸而測量。在隨機地測量不同位置之空微脂體或負載有9AC或9AC-G之微脂體之膜厚度之前，使用「設置尺規」(Set Scale)工具測定相應於100nm比例尺之像素量。藉由顯微照片之格交疊以獲得隨機化法，並於格與微脂體膜接觸之個時間點測量厚度，直到收集40個值。使用雙尾非對稱學生氏T-測試於統計分析。星號代表顯著性；p<0.0001(***)。
第27圖顯示負載9AC至微脂體內之後，膜缺陷之影像。白色框係置於膜顯示為去穩定之雙層之位置。
第28圖顯示葡萄糖醛酸苷殘基結合至母體 化合物之可逆性。此處，9AC係藉由HPLC分析葡萄糖醛酸苷結合之前(1)及之後(2)而分析。結合之後，9AC-G培養於酸性甲醇中並顯示完整轉化成9AC-GmE(3)及在鹼性水中切換回9AC-G(4)。在pH4.5與人類酵素β-葡萄糖醛酸苷酶培養以模擬溶酶體條件之9AC-G，可再生原始的母體藥物9AC(5)。(RFU=相對的螢光單位)
第29圖代表在癌細胞內，細胞吸收、溶酶體降解及藥物再激活之機制之示意圖。一些細胞設計為表現包括融合至細胞外抗PEG片段抗原結合(Fab)抗體之低密度脂蛋白受體(LDL-R)之跨膜結構域之嵌合受體，以證實在母體藥物再生中細胞吸收之重要性。不表現嵌合受體(野生型)之細胞也可以藉由稱為胞飲作用之機制吸收微脂體。微脂體包括9AC-G或螢光素-雙-葡萄糖醛酸苷(fluorescein-di-G)作為之後的分析。
第30圖顯示藉由溶酶體酵素人類β-葡萄糖醛酸苷酶活化9AC-G為9AC。
第31圖顯示藉由溶酶體酵素人類β-葡萄糖醛酸苷酶活化螢光素-雙-葡萄糖醛酸苷為螢光素。
第32圖顯示在野生型HCC36培養基內及與9AC-G微脂體隨時間培養後之MDA-MD468人類癌細胞內之9AC之量。發現兩種細胞在培養基內之9AC會增加，但在不含有細胞之控制組孔內則9AC不會增加。n=3，誤差槓，SD。
第33圖顯示在野生型HCC36之培養基內及 設計為在表面上表現嵌合LDL-R/抗PEG受體之HCC36人類癌細胞內之9AC之量。相較於野生型細胞，工程細胞(engineered cell)(HCC36抗PEG)可產生較多的9AC。當HCC36抗PEG細胞與β-葡萄糖醛酸苷酶抑制劑一起培養或當酵素之表現降低時，產生的9AC量顯著地降低。n=3，誤差槓，SD。使用雙尾非對稱學生氏T-測試(Two-tailed unpaired Student’s T-test)於統計分析。星號代表顯著性；ns=非顯著性，p<0.001(***)及p<0.0001(***)。在相同時間點進行抗HCC36抗PEG細胞之統計比較。
第34圖顯示將HCC36抗PEG細胞與螢光素-雙-葡萄糖醛酸苷微脂體之培養。觀察到細胞內螢光素-雙-葡萄糖醛酸苷(非螢光)活化為螢光素(綠色)。(紅色為微脂體、紫紅色為溶酶體及綠色為螢光素)。
第35圖顯示處理游離的9AC-G後，人類血清白蛋白之中和效應。將人類肝癌細胞(HCC36)以具有或不具有人類血清白蛋白(40mg/mL)之游離的9AC-G處理24小時。藉由3H-胸腺核苷結合分析觀察細胞增殖。人類血清白蛋白抑制未負載至微脂體之游離的9AC-G之效力。n=3，誤差槓，SD。
第36圖顯示微脂體負載之後，人類血清白蛋白對中和9AC-G之穩定度。人類肝癌細胞(HCC36)以具有或不具有人類血清白蛋白(40mg/mL)之微脂體9AC-G處理24小時。藉由3H-胸腺核苷結合分析觀察細胞增殖。微脂體外部之人類血清白蛋白並未抑制負載至微脂體之 9AC-G之效力。n=3，誤差槓，SD。
第37圖顯示利用3H-胸腺核苷結合分析以比較9AC-G微脂體與小紅莓微脂體(Doxisome®)對抗LS174T結腸癌細胞之生長抑制。在96孔盤中之各孔種植5000個細胞並培養隔夜。24小時內添加漸變濃度之微脂體藥物至細胞，並檢測胸腺核苷之結合。n=3，誤差槓，SD。
第38圖顯示利用3H-胸腺核苷結合分析以比較9AC-G微脂體與小紅莓微脂體(Doxisome®)對抗MDA-MD-468人類乳癌細胞之細胞毒性。在96孔盤中之各孔種植5000個細胞並培養隔夜。24小時內添加漸變濃度之微脂體藥物至細胞，並檢測胸腺核苷之結合。n=3，誤差槓，SD。
第39圖顯示比較小鼠內游離的9AC-G與微脂體9AC-G之藥物動力學。游離的9AC-G或微脂體9AC-G以25mg/kg之劑量經靜脈注射入Nod/SCID小鼠之尾巴。於不同的時間點收集血液樣品，並藉由HPLC檢測9AC-G之濃度。n=3，誤差槓，SD。
第40圖顯示活體內游離的9AC、9AC-G及微脂體9AC-G之毒性。將Nod/SCID小鼠皮下接種107個MDA-MB-468細胞。當腫瘤達到75至100mm3時，開始每週一次注射以進行治療，共治療4次。藉由體重流失以監測毒性。n=7，誤差槓，SD。
第41圖顯示活體內微脂體9AC-G之抗腫瘤活性。將Nod/SCID小鼠皮下接種107個MDA-MB-468細胞。 當腫瘤達到75至100mm3時，開始每週一次注射微脂體9AC-G以進行治療，共治療4次。圖闡明腫瘤體積演變。n=7，誤差槓，SD。利用單向ANOVA(one-way ANOVA)，其次藉由杜納多重比較(Dunnett’s multiple comparisons)以檢測組別間腫瘤尺寸之差異。星號代表顯著性；ns=非顯著性及p<0.0001(***)。
第42圖顯示利用9AC、9AC-G或9AC-G微脂體治療後之小鼠存活。n=7，誤差槓，SD。
第43圖顯示於靜脈注射9AC-G微脂體之後，相較於荷MDA-MB468腫瘤小鼠之血液，腫瘤內母體藥物9AC之累積。n=3，誤差槓，SD。使用雙尾非對稱學生氏T-測試於統計分析。星號代表顯著性；p<0.001(**)及p<0.0001(***)。
第44圖顯示12至16週大之雌性NOD/SCID免疫缺陷小鼠經皮下注射MDA-MB-468人類乳癌細胞(100μL PBS內含有107個細胞)之腫瘤生長。當腫瘤達到75mm3至100mm3時，7隻小鼠之組別以每週間隔四次靜脈注射9AC-G(10mg/kg)或小紅莓微脂體(Doxisome®，1mg/kg)以進行治療。n=7，誤差槓，SD。利用單向ANOVA，其次藉由杜納多重比較以檢測組別間腫瘤尺寸之差異。星號代表顯著性；p<0.001(**)及p<0.0001(***)。
第45圖敘述以每週四次靜脈注射1mg/kg或3mg/kg小紅莓微脂體(Doxisome®)治療之7隻小鼠之組別之小紅莓微脂體之毒性。藉由體重流失以評估毒性。 n=7，誤差槓，SD。
表1顯示9 AC-G微脂體及小紅莓微脂體之50%生長抑制濃度(IC50)。於3株人類大腸癌細胞株(LS174T、HT29及HCT116)、3株人類肺癌細胞株(CL1-5、NCI-H2170及SK-MES-1)及1株人類乳癌細胞株(MDA-MB-468)進行分析。呈現相較於小紅莓微脂體，9AC-G微脂體之平均倍數改善，以及藉由雙尾非對稱學生氏T-測試計算平均IC50值之統計顯著性差異。
補充表1描述已合成之葡萄糖苷酸抗癌藥物之非詳盡列表。在一些情況下，參考文獻包括葡萄糖苷酸表徵及生物活性。
當所附申請專利範圍特別闡明本案技術之特徵，此等技術連同其目的及優點可從下列詳細的說明及附圖中得到最好的了解。
除非本文另有說明或顯然與上下文矛盾，本發明內容(尤其申請專利範圍之內容)中所使用之術語「一」(“a”)及「一」(“an”)及「該」(“the”)及相似的指示對象，解釋為涵蓋單數及複數兩者。除非本文另有說明，本文中所列舉數值之範圍僅意圖作為指示座落於範圍內之個別單獨數值之簡略的表達方法，且各單獨數值併入說明書中，如同本文個別列舉。除非本文另有說明或顯然與上下文矛盾，所有本文描述之方法可於任何適當的順序。本文所提供任何以及所有實施例之用法，或例示性語 言(例如，「諸如」)，僅意圖更適當地闡明本發明且除申請專利範圍之外，並未在本發明範圍提出限制。說明書中沒有任何語言可被解釋為指示任何未請求之元件作為實施本發明之必要元件。
本文中描述本發明之較佳的實施例，包括發明人已知可實施本發明之最佳模式。應明白實施例僅係例示性，且不應作為限制本發明之範圍。
一態樣提供負載酯化的化合物(葡萄糖醛酸苷-甲酯)至微脂體之方法。可用外部pH小於7且足夠高以將酯化的化合物轉化成親水性化合物之內部pH製備微脂體懸浮液。可藉由將烷酯基結合至親水性化合物以製備酯化的化合物。烷酯基可為甲酯基。可將酯化的化合物加入微脂體懸浮液中，其中酯化的化合物負載至微脂體內。在微脂體內，酯化的化合物可皂化以生成親水性化合物(葡萄糖醛酸苷)。該方法可有效地以葡萄糖醛酸苷化之親水形式，增加疏水性化合物之微脂體保存。該方法可有效地將葡萄糖醛酸苷化之親水形式之疏水性化合物負載至微脂體之水核內。該方法亦可有效地將葡萄糖醛酸苷負載至微脂體之水核內，並改善活體內親水性化合物之半衰期。內部pH可大於7且外部pH小於7。或者，內部pH可從7.5至8.5且外部pH可從4.5至5.5。或者，內部pH可約為8且外部pH可約為5。或者，內部pH可為8且外部pH可為5。
另一態樣提供負載葡萄糖醛酸苷甲酯至微脂體之方法。可用外部pH小於7且足夠高以將葡萄糖醛 酸苷甲酯轉化成葡萄糖醛酸苷之內部pH製備微脂體懸浮液。可藉由將甲酯基結合至葡萄糖醛酸苷以製備葡萄糖醛酸苷甲酯。可將葡萄糖醛酸苷甲酯加入微脂體懸浮液中，其中葡萄糖醛酸苷甲酯負載至微脂體內。在微脂體內，葡萄糖醛酸苷甲酯可皂化以生成葡萄糖醛酸苷。該方法可有效地增加葡萄糖醛酸苷之微脂體負載及保存。該方法可有效地改善活體內葡萄糖醛酸苷之半衰期。內部pH可大於7且外部pH小於7。或者，內部pH可從7.5至8.5且外部pH可從4.5至5.5。或者，內部pH可約為8且外部pH可約為5。或者，內部pH可為8且外部pH可為5。
另一態樣提供製備負載葡萄糖醛酸苷之微脂體之方法。葡萄糖醛酸苷可與甲醇及酸反應以形成葡萄糖醛酸苷甲酯(葡萄糖醛酸苷-mE)。可用內部pH可大於7且外部pH小於7以製備微脂體。可用內部pH 7.5至8.5以製備微脂體。之後微脂體可與含有葡萄糖醛酸苷-甲酯且具有pH 4.5至5.5之溶液接觸。之後可從溶液中純化微脂體。微脂體之內部pH可約為8且微脂體之外部pH可約為5。或者，微脂體之內部pH可為8且外部pH可為5。
在以上態樣中，微脂體可製備為包括足以達到治療有效劑量之內部高濃度的葡萄糖醛酸苷。微脂體可用外部低且內部高之pH梯度而製造。不受理論束縛，此方法之基本策略係基於經至少下列步驟之包覆機制：1.負載葡萄糖醛酸苷甲酯(-mE)及2.微脂體內部生成之酯基之內部皂化(水解)及截獲葡萄糖醛酸苷。
葡萄糖醛酸苷甲酯顯著地較其相應葡萄糖醛酸苷更具膜通透性，使負載至微脂體之葡萄糖醛酸苷甲酯分子之數量相較於負載至微脂體之葡萄糖醛酸苷分子之數量實質地增加。不受理論束縛，負載至微脂體之動力取決於分子分配至微脂體之脂質雙層。對於脂質雙層具有有限的分配之葡萄糖醛酸苷可趨於將微脂體外部保留於水溶液中，因為在微脂體外部之水溶液與脂質雙層之分配比可能非常高。然而，葡萄糖醛酸苷之甲酯形式(葡萄糖醛酸苷甲酯)可更快地進入脂質雙層並轉移至微脂體內部之由微脂體之脂質雙層所包圍之水相。
具有高pH之微脂體內部之水相可能是有助益的。高pH可使葡萄糖醛酸苷甲酯上之酯基透過皂化機制而快速的水解。將葡萄糖醛酸苷甲酯水解為對應的葡萄糖醛酸苷可驅動來自脂質雙層之葡萄糖醛酸苷甲酯至微脂體內水相的平衡。再者，對應的葡萄糖醛酸苷相對於葡萄糖醛酸苷甲酯，對於脂質雙層可具有更多有限的親和力，如前所述，因此葡萄糖醛酸苷可趨於保留在微脂體內部，而非穿透脂質雙層至微脂體外部之水相中。
無須任何特別的化學技能或設備，可藉由將葡萄糖醛酸苷溶解於具有酸催化劑之甲醇而合成葡萄糖醛酸苷甲酯。反應可在介於50℃至70℃之溫度，如60℃至65℃而實施。反應可藉由色析法，例如HPLC而監控。反應時間可為一個小時或更長。可進行純化以自酸催化劑中純化出葡萄糖醛酸苷甲酯。可藉由HPLC並使用C18逆 向管柱而純化葡萄糖醛酸苷甲酯，並以含有5%甲醇之水沖洗。在此水洗步驟中，葡萄糖醛酸苷甲酯留置於管柱上。隨後可用甲醇洗滌出葡萄糖醛酸苷甲酯，例如100%甲醇或幾近100%甲醇。可用旋轉蒸發、冷凍乾燥或任何其他的乾燥方法以從葡萄糖醛酸苷甲酯中移除甲醇。
第1圖顯示葡萄糖醛酸苷殘基之結合急遽地增加母體化合物之水溶性，暗示較佳保留於微脂體內。
第2圖顯示可將9-胺基喜樹鹼葡萄糖醛酸苷(9AC-G)、5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼-β-D-葡萄糖醛酸苷(BQC-G)及4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4MU-G)培養於含有作為催化劑之強酸(硫酸)的甲醇內。於65℃，1小時後，如第3圖所示，藉由高壓液相層析證實大部分的葡萄糖醛酸苷類(9AC、BQC及4MU)會轉化成葡萄糖醛酸苷-甲酯(9AC-GmE、BQC-GmE及4MU-GmE)。如第4及5圖顯示在辛醇-水之分配分析中，分別相較於9AC、BQC及4MU，新合成的9AC-GmE、BQC-GmE及4MU-GmE展現增加分配至有機相。此結果顯示甲酯修飾可增加於脂質膜內之溶解性且增加主動負載效率。
本文所描述的方法可更進一步涉及使用衍生化合物，其中葡萄糖醛酸殘基之羧酸基是由甲酯取代，以生成具有顯著提高膜穿透性之葡萄糖醛酸苷甲酯。其在外部低pH負載至微脂體(於此之葡萄糖醛酸苷甲酯係穩定的)可得到高藥物-脂質比例(第6圖)。不受理論束縛，藉由加熱約1小時，內部的高pH有助於甲酯之自發性水解， 以生成內部的葡萄糖醛酸苷(第7圖)。藉由使用此方法，可以非常高的藥物-脂質比例，穩定地包覆葡萄糖醛酸苷，而傳統的弱酸負載方法則無法包覆有效量。
第8圖敘述葡萄糖醛酸苷於酸性甲醇內形成葡萄糖醛酸苷甲酯。第9圖敘述使葡萄糖醛酸苷-甲酯(藥物-甲酯)於外部介質內通過微脂體之脂質雙層及在微脂體內部高pH下，將葡萄糖醛酸苷甲酯轉化成葡萄糖醛酸苷(藥物-G)之理論機制。微脂體內之高氫氧根離子濃度可將甲酯鍵去穩定化，釋放出甲醇，而再次形成藥物之葡萄糖醛酸苷形式。甲醇可擴散至微脂體外，但內部形成的葡萄糖醛酸苷係親水性的，且無法容易地擴散穿透微脂體之脂質雙層。葡萄糖醛酸苷藥物衍生物亦可形成與微脂體內部高濃度的鈣離子形成沉澱，以保持穩定包覆於微脂體內部。
第10圖顯示在如第9圖所描述之微脂體外部介質內添加葡萄糖醛酸苷-甲酯。在上升的溫度，於微脂體之外部介質觀察到9AC-GmE，顯示葡萄糖醛酸苷之甲酯形式藉由穿透微脂體膜而負載於微脂體內部。在第11圖中，由於負載之9AC-GmE的皂化，相應之親水性葡萄糖醛酸苷(9AC-G)隨著時間的推移顯現於微脂體內部。
相較於空的微脂體(第12圖)，藉由低溫電子顯微鏡，可觀察到微脂體內部之葡萄糖醛酸苷之累積及保留，諸如第15圖(9AC-G)及第16圖(BQC-G)所示。母體化合物9AC及BQC亦可負載至與用於負載9AC-G及BQC-G之相同劑型之微脂體內部。此處負載之原理依靠pH依賴 型內酯-羧酸平衡。在低pH，9AC及BQC之內酯環係閉合的，使更多的親脂形式進入微脂體內。在內部鹼性pH，內酯環開啟以形成可與內部鈣離子沉澱之羧酸基。第13及14圖分別顯示負載母體9AC及BQC後之微脂體。其觀察證實在葡萄糖醛酸苷形式下負載9AC及BQC有助於增加這些藥物累積於核心及沉澱於內部。
包覆的化合物有許多的應用。抗癌藥物產業可從包覆葡萄糖醛酸苷化的抗癌藥物以最大化遞送藥物至腫瘤且對於病患的安全上得到助益。喜樹鹼是著名的抗腫瘤藥物之家族，以及其葡萄糖醛酸苷衍生物可降低其毒性且增加其專一性。此外，葡萄糖醛酸苷SN-38(SN-38G)係用於治療大腸癌病患之CPT-11之代謝產物。抗癌藥物產業對於包覆SN-38G於微脂體內可能係極大的興趣。尤其諸如太平洋紫杉醇或MMAE之可溶性藥物可以葡萄糖醛酸苷形式負載至微脂體之核內。這可能導致較佳的穩定性及安全性之藥物傳遞。
葡萄糖醛酸苷-甲酯可穩定於pH介於4及6之間，例如pH 5。葡萄糖醛酸苷-甲酯之甲酯基可藉由皂化作用於鹼性pH水解。在鹼性pH之微脂體內部可進行皂化以在微脂體內部再形成葡萄糖醛酸苷。
微脂體可藉由任何的方法而製備。微脂體可包括磷膽鹼脂質。微脂體可包括磷酸乙醇胺。微脂體也可包括膽固醇。微脂體之pH可藉由用於再水合乾燥的脂質膜之緩衝溶液之pH而調控，該乾燥的脂質膜係由微脂 體之脂質成分所製備。之後可使用不同於微脂體內部pH之特定pH進行尺寸篩除層析，以篩選具有所需pH梯度之微脂體。微脂體內部之pH可超過7，例如pH 7、8或9，且外部之緩衝溶液之pH可小於7，例如4、5或6。可使用動態光散射法以偵測微脂體顆粒之平均直徑。可將葡萄糖醛酸苷-甲酯負載至外部pH小於內部pH之微脂體。
可藉由先將葡萄糖醛酸苷-甲酯與微脂體分別地於60℃至80℃之間預培養5-15分鐘，例如75℃，10分鐘，以將葡萄糖醛酸苷-甲酯併入微脂體內，而之後用一定程度的輕度搖動將它們進行混合一段時間，例如1小時，以使葡萄糖醛酸苷-甲酯進行負載且內部皂化為葡萄糖醛酸苷。可用尺寸篩除層析以除去殘留於微脂體外部之葡萄糖醛酸苷-甲酯。用清潔劑稀釋之負載的微脂體樣本可進一步進行HPLC，以分析葡萄糖醛酸苷-甲酯之負載效率以及葡萄糖醛酸苷之轉化。第17圖顯示不使用清潔劑溶解微脂體時，注射負載9AC-G之微脂體之HPLC。在外部介質內並未觀察到藥物。第18圖顯示相同的微脂體於使用清潔劑進行溶解之後之HPLC分析。溶解之後釋放負載之9AC-G，並於色譜上觀察。
不受理論束縛，在弱酸環境下(諸如pH 5)，葡萄糖醛酸苷-甲酯穩定於微脂體外部，且由於改善有機環境內之溶解度而可與脂質雙層進行交互作用。最終，葡萄糖醛酸苷-甲酯會從微脂體之外部遷移至內部環境。將微脂體內部暴露於相對高之pH(諸如pH 8.5)可導致葡萄糖醛酸 苷-甲酯之甲酯基快速的水解，以在微脂體之內部環境生成葡萄糖醛酸苷。這些葡萄糖醛酸苷可能與微脂體脂質雙層間具有實質上較低的交互作用能力，而因此相較於葡萄糖醛酸苷-甲酯，葡萄糖酸酸苷會以實質上較低之速率從微脂體內部遷移至微脂體外部環境。
第19、20及21圖描述葡萄糖醛酸苷-甲酯之負載、內部轉化成葡萄糖醛酸苷，及母體藥9-胺基喜樹鹼(9AC)、5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼(BQC)及4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4MU-G)之個別最終藥物-脂質莫耳比。
甲酯化可用於實質上增加負載葡萄糖醛酸苷至微脂體之能力。藉由實施任何本文所述之方法，包括甲酯化葡萄糖醛酸苷及負載甲酯至具有內部pH高於外部環境pH之微脂體，可能實現增加5倍負載葡萄糖醛酸苷之能力、增加10倍、增加15倍、增加20倍、增加25倍、增加30倍、增加35倍、增加40倍或增加45倍，以及增加超過275倍，如第22圖所證實者。
在另一態樣中，提供包括抗癌藥物之葡萄糖醛酸苷之微脂體。微脂體可藉由以下方法而製備，在具有外部pH之溶液中添加葡萄糖醛酸苷之甲酯形式至前驅微脂體，且微脂體之內部pH大於外部pH。微脂體之內部足夠高的pH可將葡萄糖醛酸苷之甲酯形式轉化成葡萄糖醛酸苷。內部pH可大於7且外部pH小於5。內部pH可從7.5至8.5且外部pH可從4.5至5.5。內部pH可約為8 且外部pH可約為5。內部pH可為8且外部pH可為5。
此態樣所提供的微脂體可藉由施予這些包括抗癌藥物之葡萄糖醛酸苷之微脂體至有需要治療的哺乳動物或人類病患，以用於治療癌症或減少腫瘤尺寸之方法。或者，依據任何本文中所述之態樣或實施例之微脂體負載可用於藉由施予至有需要以該微脂體治療之哺乳動物或人類病患，以治療癌症或減少腫瘤尺寸。癌症可為肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、胃癌、頭頸癌、黑色素瘤、胰腺癌、腎細胞癌或大腸癌。癌症可起源於任何器官，特別係肺部、乳房、卵巢、胃、腎臟、肝臟或大腸。可使用不同的抗癌藥物。抗癌藥物可為一種或多種的4-甲基傘形酮、9-胺基喜樹鹼、5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼、阿柔比星(aclarubicin)、放線菌黴素(actinomycin)、安吖啶(amsacrine)、苯達莫司汀(bendamustine)、貝沙羅汀(bexarotene)、樺木醇(betulin)、比卡魯胺(bicalutamide)、博萊黴素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、博舒替尼(bosutinib)、硫酸布他卡因(busulfan)、卡巴他賽(cabazitaxel)、卡本扎尼(cabozantinib)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、雙氯乙基亞硝脲、氯芥苯丁酸、順鉑、克拉屈濱(cladribine)、考比替尼(cobimetinib)、環巴胺(cyclopamine)、環磷醯胺、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、達沙替尼(dasatinib)、道諾黴素(daunorubicin)、地西他濱 (deeitabine)、二嗪酮(diaziquone)、歐洲紫杉醇、小紅莓、恩雜魯胺(enzalutamide)、泛艾黴素(epirubicin)、得舒緩(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、依妥普賽(etoposide)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶、福莫司汀(fotemustine)、羥苯胺芥(hydroxyaniline mustard)、羥基尿素、艾瑞莎(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、依鲁替尼(ibrutinib)、伊達比星(idarubicin)、依弗邁(ifosfamide)、伊馬替尼(imatinib)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、伊沙匹隆(ixabepilone)、拉帕替尼(lapatinib)、來那度胺(lenalidomide)、利妥唑(letrozole)、白葉酸(leucovorin)、環己亞硝、氮芥(mechlorethamine)、氮芥苯丙胺酸、美巴隆(merbarone)、硫醇嘌呤、美司那(mesna)、胺甲葉酸、絲裂黴素、米土先強(mitoxantrone)、替莫唑胺(mitozolomide)、單甲基奧瑞他汀(monomethyl auristatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奈拉濱(nelarabine)、尼羅替尼(nilotinib)、尼魯米特(nilutamide)、N-亞硝基-N-甲基尿嘧啶、諾波黴素(novobiocin)、奧馬他辛(omacetaxine)、太平洋紫杉醇、帕比司他(panobinostat)、帕唑帕尼(pazopanib)、培美曲塞(pemetrexed)、噴司他丁(pentostatin)、普卡黴素(plicamycin)、泊馬度胺(pomalidomide)、普纳替尼(ponatinib)、普賴蘇穠(prednisolone)、PR-104A、吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine)、榭皮素、雷替曲塞(raltitrexed)、瑞格菲尼(regorafenib)、羅米地辛(romidepsin)、鲁索替尼(ruxolitinibm)、司莫司汀 (semustine)、SN-38、索尼吉布(sonidegib)、蕾沙瓦(sorafenib)、鏈佐黴素(streptozotocin)、辛二酰苯胺羥胺酸(suberoylanilide hydroxamic acid)、紓癌特(sunitinib)、托美丁(tamibarotene)、泰莫西芬(tamoxifen)、他地那蘭(tarcedinaline)、替加氟(tegafur)、坦西莫司(temsirolimus)、沙奧特帕(thiotepa)、坦尼坡賽(teniposide)、拓普替康(topotecan)、曲普瑞林(triptorelin)、曲貝替定(trabectedine)、凡德他尼(vandetanib)、威羅菲尼(vemurafenib)、維奈克拉(venetoclax)、長春新鹼、長春氟寧(vinflunine)、溫諾平(vinorelbine)、長春鹼、長春地辛(vindesine)、維莫德吉(vismodegib)及伏立諾他(vorinostat)。
可用微脂體藥物釋放分析以評估葡萄糖醛酸苷及非葡萄糖醛酸苷藥物之間的藥物保存。在此分析中，比較負載母體藥物(疏水性)或葡萄糖醛酸苷化形式(親水性)之微脂體。於37℃下，含有10%胎牛血清(FBS)之磷酸緩衝的鹽水(PBS)之仿生理條件下透析微脂體。洩漏於微脂體外之藥物係經由稀釋於1000倍較大體積而流失。保留於微脂體內部之藥物係藉由HPLC分析9AC(第23圖)及BQC(第24圖)之母體及葡萄糖醛酸苷形式。在葡萄糖醛酸苷形式下可得到藥物較強的保留。
負載BQC(第25圖)及9AC(第26圖)之後，微脂體之膜厚度係增加的。這也支持了之疏水性化合物藉由疏水交互作用而累積於微脂體之膜內的概念。此種形式之負載被認為係不穩定的，且藥物容易洩漏至微脂體外 部。負載9AC-GmE及BQC-GmE以分別包覆9AC-G及BQC-G會造成微脂體之膜厚度接近於負載藥物之前之微脂體之膜厚度，其顯示了藥物從膜轉換至微脂體水核內之趨性。
觀察到在一些負載9AC之微脂體出現膜損壞，其造成原因可能來自於微脂體膜內之9AC的累積(第27圖)。疏水性藥物傾向於分配至微脂體膜，其與脂質尾端進行交互作用且有時會破壞雙層。
於pH 4.5，仿溶酶體內pH之活體外試驗證實，結合至葡萄糖醛酸苷之藥物可藉由人類溶酶體酵素、β-葡萄糖醛酸苷酶再生成其母體形式。9AC-G完整轉化成9AC(第28圖)。在真實的條件下，推斷微脂體之葡萄糖醛酸苷可被細胞吸收且如第29圖所示，微脂體降解後可在微脂體內釋放葡萄糖醛酸苷。使用兩個實例說明化合物之再生：9AC-G(藉由酵素水解而移除之觸發式自我降解(self-immolative)之化學鍵連基而連結，第30圖)以及螢光素(直接連結至葡萄糖醛酸苷殘基，第31圖)。加入9AC-G微脂體後，在HCC36及MDA-MB468人類癌細胞之介質內發現有效量9AC。另一方面，若細胞未呈現，則不會發現9AC，意謂9AC之再生係依賴於細胞(第32圖)。當藉由工程低密度脂蛋白受體穿膜域(LDL-R TM)與抗PEG Fab細胞外域而人為地增加細胞吸收微脂體時，介質內9AC量會顯著地增加。當加入β-葡萄糖醛酸苷酶抑制劑，或當藉由基因剔除(gene knockdown)而降低β-葡萄糖醛酸苷酶之表現量時，9AC產量會顯著地降低(第33圖)，這些結果顯示， 再生母體化合物依賴於細胞吸收及β-葡萄糖醛酸苷酶。為了進一步說明母體化合物之再生能力，將工程有LDL-R/抗PEG受體之HCC36細胞與微脂體螢光素-雙-G(非螢光)一起培養。剛開始，微脂體(紅色)被細胞吸收並與微脂體開始共定位(紫紅色)。之後，細胞質轉為綠色，證實螢光素-雙-G轉換成螢光素之活性(第34圖)。
包覆葡萄糖醛酸苷而負載有葡萄糖醛酸苷-甲酯之微脂體之抗癌活性可於活體外或活體內進行評估。在活體外分析，可種植癌細胞株於孔或盤中且可將不同濃度的微脂體葡萄糖醛酸苷加入細胞一段時間，例如24小時，並進行細胞死亡分析。可用氚化胸腺核苷分析細胞增殖。此外，人類血清白蛋白會結合至游離的9AC-G並使藥物失活，然而，在微脂體形式下，9AC-G並不會結合至人類血清白蛋白且效率不會受影響(第35圖及第36圖)。第37及38圖之數據顯示評估相較於此處作為臨床驗證之微脂體藥物之微脂體小紅莓(Doxisome®)，微脂體9AC-G之細胞毒性之活體外分析。將微脂體小紅莓(Doxisome®)及微脂體9AC-G毒性與9AC-G、3種人類大腸癌細胞(LS174T、HT29及HCT116)、3種肺癌細胞(CL1-5、NCI-H2170及SK-MES-1)及1種人類乳癌細胞(MDA-MB-468)進行評估。對於所有的細胞株，相較於微脂體小紅莓，9AC-G微脂體提供顯著較佳對抗LS174T、HT29、HCT116、CT1-5、NCI-H2170及MDA-MB-468之抗增生活性，以及等同對抗SK-MES-1之抗增生活性。評估微脂體藥物之IC50並總結於 表1。
負載葡萄糖醛酸苷之微脂體可施予至有需要殺死癌細胞之哺乳動物或人類病患。例如，癌細胞可來自肺部、乳房或大腸。可以靜脈內施予。可評估腫瘤減少及/或負載葡萄糖醛酸苷之微脂體之毒性。負載葡萄糖醛酸苷之微脂體可有效地減少腫瘤尺寸。
實施例1：從葡萄糖醛酸苷甲酯(-mE)合成葡萄糖醛酸苷
如先前文獻20所描述，從母體化合物合成9-胺基喜樹鹼葡萄糖醛酸苷(9AC-G)及5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼-β-D-葡萄糖醛酸苷(BQC-G)。4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4MU-G)係購自於Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
藉由將25mg葡萄糖醛酸苷溶解於含有作為催化作用之3.5μl H2SO4之1mL甲醇內，以合成9AC-G、BQC-G及4MU-G之葡萄糖醛酸苷-甲酯衍生物。溶液培養於60℃至65℃且藉由HPLC分析不同時間點之樣本以偵測反應(第3圖)。反應通常於1小時候終止。藉由HPLC純化9AC-G、BQC-G及4MU-G之葡萄糖醛酸苷-甲酯形式(9AC-mG、BQC-mG及4MU-mG)以移除H2SO4及殘留的葡萄糖醛酸苷。9AC-mG、BQC-mG及4MU-mG負載於手工製備的LiChroprep® RP-18(40-63μm)管柱(Merck，德國)並以含有5%甲醇之水的移動相進行清洗。在這些洗滌條件下，並不會洗滌出葡萄糖醛酸苷-甲酯，其會被留置於管柱內。之後，將移動相改變為100%甲醇並收集洗滌液。在旋轉蒸發 下將甲醇內純的9AC-mG、BQC-mG及4MU-mG進行乾燥並懸浮於DMSO。藉由HPLC分析偵測各化合物之最終濃度並將濃度調整為10mg/mL。
藉由將化合物稀釋於1：1體積之辛醇及100mM，pH 5之檸檬酸緩衝溶液以測得不同化合物的分布(第4圖)。於室溫下將溶液輕輕攪拌24小時，於2,500×g進行旋轉，並藉由HPLC量化各相中葡萄糖醛酸苷或葡萄糖醛酸苷-甲酯以及以logP辛醇/水=log([溶質]辛醇/[溶質]水)計算分配係數(第6圖)。
使用逆相C18管柱(XbridgeTM C18,4.6×150mm,5μm)進行HPLC分析。9AC、9AC-G、9AC-GmE、4MU、4MU-G及4MU-GmE樣本在由24%乙腈所組成之移動相以2mL/min速度流動，而BQC、BQC-G及BQC-GmE樣本則於由30%乙腈所組成之移動相以2mL/min速度流動。所有的移動相皆以25mM檸檬酸調整為pH 2.9(藉由加入10N NaOH)，在真空下藉由超音波震盪進行除氣，並通過0.2μm瓶頂過濾膜進行過濾(Nalgene® Rapid-Flow)。利用螢光偵測器(Jasco FP-2020)以370/460nm之激發/放射波長對9AC、9AC-G、9AC-GmE、BQC-G、BQC-GmE以及370/575nm之激發/放射波長對BQC進行偵測。利用U.V.偵測器(Jasco U.V.975)以310nm對4-MU、4MU-G及4MU-GmE進行偵測。收集數據並於Gold軟體進行分析(Beckman)。
9AC-GmE之特性於不同的pH及溫度進行研究。所觀察到的是9AC-GmE在pH 5非常穩定，但是甲酯 基於鹼性pH容易藉由皂化反應而水解(第6及7圖)。因此，在高pH，9AC-GmE之甲酯基會水解以再形成9AC，證明反應的可逆性。
實施例2：製備微脂體
此實施例描述製備由1,2雙硬脂醯基sn甘油3磷膽鹼(DSPC)、1,2雙硬脂醯基sn甘油3磷酸乙醇胺[甲氧基(聚乙烯乙二醇)2000](DSPE-PEG2000)及膽固醇所組成之微脂體，且微脂體內部pH為8.5及外部pH為5。將三氯甲烷內之DSPC、DSPE-PEG2000及膽固醇儲備液以65：5：30莫耳比與10mg總脂質量進行混合。於65℃，藉由旋轉蒸發(Büchi,Ratovapor RII)以形成乾燥的脂質膜，並於65℃，以250mM醋酸鈣，pH 8.5，50mM HEPES緩衝溶液再次水解為10mg/mL之最終脂質濃度。使用液態氮將微脂體懸浮液進行5次冷凍/解凍循環，之後於72℃，使用迷你-擠壓機(Avanti Polar Lipid,Inc.Alabaster,AL)並各通過400nm、200nm及100nm聚碳酸膜進行擠壓21次，並轉移至冰中。藉由Sephadex® G50對抗250mM硫酸鈉，pH 5，50mM檸檬酸之尺寸篩除層析以獲得橫過微脂體膜之pH梯度。在負載前，將所得到的「預備負載」之微脂體儲存於4℃，至多可儲存1個月。最終的脂質濃度係以巴特列特(Bartlett)磷分析法測得，且顆粒之平均直徑係藉由動態光散射法(Malvern Instruments Zetasizer Nano system)而偵測。
依據這些初步結果，藉由利用250mM醋酸鈣、調整為pH 8.5之50mM HEPES緩衝溶液再次水解乾燥 的脂質膜，以獲得具有內部及外部高pH環境之微脂體。之後藉由使用Sephadex G50之尺寸篩除層析法，將外部介質更換為250mM硫酸鈉，調整為pH 5之50mM檸檬酸。在那階段，所得到具有高內部/低外部pH之微脂體可準備負載葡萄糖醛酸苷-甲酯。
實施例3：微脂體之藥物負載
將實施例2所製備之微脂體以250mM硫酸鈉，pH 5，50mM檸檬酸稀釋為4mg/mL。實施例1所製備之葡萄糖醛酸苷-甲酯以10mg/mL濃度儲存於DMSO。在以下的實施例中，2mg微脂體及0.4mg葡萄糖醛酸苷-甲酯於75℃分開預熱10分鐘，且混合1小時並偶爾輕輕震動。藉由Sephadex® G50對抗Tris系緩衝溶液(50mM Tris-氯、pH 7.4，150mM氯化鈉)之尺寸篩除層析，以移除未包覆的葡萄糖醛酸苷-甲酯。於將微脂體稀釋於1% Triton X-100，pH 2.9，25mM檸檬酸之後，藉由HPLC測定負載效率以及微脂體內部之葡萄糖醛酸苷-甲酯轉化成葡萄糖醛酸苷。
葡萄糖醛酸苷-甲酯穩定於微脂體外部(pH 5)且由於改善於有機環境中的溶解度而可與脂質雙層進行交互作用。葡萄糖醛酸苷-甲酯會從微脂體之外部通過並穿透微脂體之脂質雙層至內部環境。包覆的葡萄糖醛酸苷-甲酯接著暴露於會快速水解甲酯基之內部高pH(pH 8.5)以生成葡萄糖醛酸苷。
負載之後，為了藉由HPLC分析包覆於微脂 體內部之藥物之特性，透過含1% Triton X-100之溶液以溶解微脂體。如同層析圖(第17圖)顯示，未溶解的微脂體在外部介質內並未含有藥物，然而經Triton X-100處理的微脂體顯示釋放9AC-G(第18圖)。在層析圖上僅測得微量之9AC-GmE，證實內部微脂體藥物之9AC-GmE轉化為9AC-G之高效率。
微脂體係成像於負載藥物之前(第12圖)與負載9AC(第13圖)及BQC(第14圖)之後。亦於9AC-GmE(第15圖)及BQC-GmE(第16圖)負載至微脂體內部並藉由內部高pH而轉化成9AC-G及BQC-G之後而獲得成像。成像係藉由Holey覆蓋碳膜的400目銅網格(HC300-Cu,PELCO)在氬氣中發光放電、於碳側上氧氣氛10秒而獲得。將4μl體積之微脂體(2mg/mL)滴至網格上，於20℃點漬於100%濕度3秒，並速凍結成液態乙烷，藉由使用Vitrobot(FEI,Hillsboro,OR)之液態氮冷卻。之後將網格儲存於液態氮下，並使用低溫載台轉移至低溫電子顯微鏡。以200kV，70nm光圈之TecnaiTM F20電子顯微鏡(FEI)得到於碳膜孔洞內微脂體影像。各曝光之低劑量條件為約20e-/A2。以5k及50k放大率以及2nm至3nm散焦取得影像，並記錄於4k×4k CCD相機(Gatan，美國)。
除了9AC-G及BQC-G之外，依循相同的酯化及內部微脂體之皂化方法，亦將4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4MU-G)負載於微脂體。所有這些化合物皆在葡萄糖醛酸苷-甲酯形式負載且在微脂體內部轉化成葡萄 糖醛酸苷(第19及20圖)。最終的藥物-脂質莫耳比顯示於第21圖中。相較於以葡萄糖醛酸苷形式負載，當以葡萄糖醛酸苷-甲酯形式負載時，9AC、BQC及4MU分別得到超過275倍、10.5倍及55倍之改善。
實施例4：改善的藥物保存
使用相同的微脂體製劑，將9AC及BQC之母體形式負載至微脂體內。在外部低pH下，疏水性9AC及BQC為中性且其中之一會與微脂體膜進行交互作用，或藉由可逆的開啟內酯環為略少疏水性之羧酸鹽形式以成為於高pH帶負電荷之微脂體。於37℃，將微脂體之9AC、BQC、9AC-G及BQC-G稀釋於補充有10%胎牛血清之PBS，為期7天。來自微脂體之葡萄糖醛酸苷之藥物洩漏相較於其疏水性母體藥物顯著地減低(第23及24圖)。分別稀釋1天及3天後，微脂體之9AC及BQC從其載體展現超過90%之突發的釋放行為。7天後，微脂體之BQC-G及9AC-G皆可保留超過其貨物之80%。此數據顯示在葡萄糖醛酸苷化後，微脂體內之疏水性藥物之保留有顯著地改善。此外，負載葡萄糖醛酸苷之微脂體儲存於4℃、Tris系緩衝溶液(TBS)內可維持穩定超過數個月。
為了補足藥物保留分析，在缺少或存在有9AC-G抑制劑、人類血清白蛋白之條件下，測試游離的9AC-G及微脂體之9AC-G對抗人類肝癌細胞(HCC36)之毒性(第35及36圖)。我們的結果顯示存在有人類血清白蛋白之條件下，游離的9AC-G毒性會受抑制而人類血清白蛋 白不會影響微脂體9AC-G毒性。其可歸因於微脂體會保護內部的9AC-G免於與人類血清白蛋白進行交互作用，從而避免9AC-G去活性。微脂體內部之9AC-G之穩定保留及保護可使高濃度的活化9AC-G到達腫瘤。
觀察到母體9AC及BQC之負載導致微脂體膜之厚度增加(第25及26圖)。這顯示藥物藉由疏水性交互作用而累積在微脂體之脂質雙層。降低藥物在微脂體之脂質雙層之累積係透過負載藥物之葡萄糖醛酸苷形式而增加藥物於微脂體水核的累積而達成。相較於膜負載，藥物之核負載導致更穩定之微脂體藥物形式。此外，微脂體膜內之藥物累積可能藉由雙層結構之去穩定化而造成膜內之缺陷，如第27圖所觀察到的。
實施例5：再生母體藥物
疏水性藥物之葡萄糖醛酸苷化會導致藉由增加水溶解度而降低藥物毒性及降低細胞膜穿透性。對於微脂體負載，為了完整的利用疏水性藥物之葡萄糖醛酸苷化，於細胞吸收微脂體後，應再生母體化合物。如第28圖所示，9AC可結合至葡萄糖醛酸苷殘基，其可在甲酯形式間互換以進行負載且轉換回葡萄糖醛酸苷形式以穩定保留於微脂體內。於pH4.5，將微脂體酵素β-葡萄糖醛酸苷酶加至9AC-G，以仿有效再生9AC之微脂體條件，顯示微脂體內部之潛在的藥物再生。為了證實此機制之真實性，將癌細胞培養物與微脂體9AC-G或非-螢光的螢光素-雙-G(第29圖)培養，定期分析細胞之母體化合物(9AC及螢光素) 之再生。細胞藉由已知的胞飲作用而具有自然吸收微脂體或奈米顆粒之能力。為了增加細胞吸收微脂體，藉由將低密度脂蛋白之穿膜域與抗PEG抗體之Fab片段融合，以建造細胞表面受體。人工受體之抗PEG部分可結合於微脂體表面上之PEG並促進受體-媒介胞飲作用至細胞內。使用HCC36及MDA-MB468人類癌細胞進行活體外細胞培養分析，在加入9AC-G微脂體之後，細胞培養液內觀察到時間-依賴性出現9AC。沒有細胞情況下，微脂體9AC-G無法自行產生9AC，意謂細胞負責此再生(第32圖)。當細胞藉由工程的抗-PEG受體而人為的增加吸收微脂體時，發現培養液內9AC量也會增加(第33圖)。另一方面，當在同一個時間點將細胞與β-葡萄糖醛酸苷酶抑制劑一起培養或當將細胞處理RNAi時，細胞培養液內的9AC量會降低。總而言之，結果顯示母體化合物之再生需要將微脂體吸收至細胞內且依賴於酵素β-葡萄糖醛酸苷酶。此外，可在共軛焦顯微鏡研究表現抗-PEG受體之HCC36細胞中觀察藥物再生。在將微脂體(紅色)與溶酶體(紫紅色)共定位後，添加微脂體螢光素-雙-G證實了細胞內之螢光素(綠色)之再生。
實施例6：改善的藥物動力學
此實施例係關於相較於游離的9AC-G，9AC-G之微脂體劑型是否能夠展現長時間的藥物動力學。游離的及微脂體之9AC-G以25mg/kg靜脈遞送至12週至16週大之雌性小鼠。藉由收集血清樣本以監控9AC-G之總 血清量，其中血漿係藉由將紅血球進行離心而獲得。將血清蛋白沉澱於乙睛：甲醇：0.2M三氯乙酸(2：2：1，體積：體積混合)。將樣本離心以去除沉澱的蛋白質，並以含1% Triton X-100之緩衝溶液進行稀釋以溶解微脂體，並藉由HPLC分析9AC-G。第39圖顯示相較於微脂體之9AC-G(起始半衰期=36.5分鐘；終末半衰期=10.1小時)，快速清除游離的9AC-G(起始半衰期=9.3分鐘；終末半衰期=38.6分鐘)。在相同的劑量下，注射6小時後，發現微脂體之9AC-G之血漿濃度較游離的9AC-G平均高出350倍。這些結果表明PEG-微脂體可用於作為葡萄糖醛酸苷載體以延長體內之半衰期，且與先前微脂體之藥物動力學報告一致。
實施例7：微脂體之抗癌活性
於活體外及活體內評估9AC-G微脂體之抗癌活性。在活體外，於96孔盤之各孔種植5000個細胞之不同的人類癌細胞株(LS174T、HCT116、HT29、MDA-MB468、NCI-H2170、CL1-5及SKMES-14)。在移除藥物之前，將分級濃度之9ACG-微脂體或小紅莓微脂體(Doxisome®)加入細胞內24小時，並將細胞額外培養72小時。藉由3H-胸腺核苷結合分析進行細胞增殖分析，其中將由培養液稀釋之1μ Ci 3H-胸腺核苷加入各孔中並放置隔夜。之後在玻璃-纖維濾膜(PerkinElmer Unifilter-96,GF/C)上，藉由胰蛋白酶收集細胞，並於TopCount閃爍計數器(PerkinElmer)上測量放射活性。最終細胞抑制係測定為「來自控制組之抑制%」=(c.p.m.(樣本)×100/e.p.m.(控制組))。 代表性殺死曲線顯示於第37及38圖，且不同細胞及所使用之藥物的IC50總結於表1。
其次，於NOD/SCID小鼠之乳癌活體模式中，每隻小鼠皮下種植107個MDA-MD468細胞。當腫瘤之平均尺寸達到75至100mm3時，開始進行治療。小鼠以10mg/kg之劑量靜脈注射9AC-G微脂體、游離的母體9AC(2mg/kg)或游離的9AC-G(10mg/kg)。第40圖顯示於治療期間內監控小鼠之重量，以評估此劑量之毒性。明顯地，如第41圖所示，在4次以9AC-G微脂體治療之後，6、7隻治療的小鼠可觀達到低毒性且無法偵測到腫瘤。在其他治療組別中，游離的9AC或游離的9AC-G對於腫瘤生長有較小的功效。當小鼠以9AC-G微脂體治療時，小鼠存活顯著地增加，但以游離的9AC或游離的9AC-G治療則不會(第42圖)。我們觀察到注射9AC-G微脂體24小時後，在腫瘤內活化的母體藥物9AC之量比血液內高出30倍(第43圖)。這現象可能係由於藉由奈米顆粒透過洩漏血液腫瘤血管而累積且保留於腫瘤內而增加通透性及保留效果(enhanced permeability and retention effect,EPR)。腫瘤內累積9AC-G微脂體會造成在腫瘤本身內增加生成9AC量之結果。
經由比較，在腫瘤接種第84天，4週注射微脂體小紅莓(以1mg/kg Doxisome®)僅減低腫瘤進展速率而藉由9AC-G微脂體則可達到強烈的腫瘤抑制(第44圖)。為了改善抗腫瘤活性，增加Doxisome劑量至3mg/kg，會 產生以9AC-G微脂體處理不會出現的主要毒性。結果，所有的小鼠在第3次以3mg/kg Doxisome治療後的3天內皆死亡(第45圖)。
當呈現並描述實施例時，在不背離本文之概念下，對於那些本領域具有通常知識者進行更多的可能性修改是顯而易見的。因此，除了在申請專利範圍之本質之外，所請求保護的主題並不受限制。
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Claims (36)

  1. 一種負載酯化後的化合物至微脂體之方法，包括：(1)藉由將酯基結合至化合物製備一酯化形式之化合物，視需要地，其中，該酯基係烷酯基，及該烷酯基視需要地係甲酯基；(2)製備微脂體懸浮液，該微脂體懸浮液之外部pH小於7且內部pH足夠高以將該酯化的化合物轉化成親水性化合物；以及(3)將該酯化的化合物加入該微脂體懸浮液中，其中，該酯化的化合物係負載至該微脂體內，其中，該微脂體內酯化的化合物係經皂化以生成該化合物。
  2. 一種負載葡萄糖醛酸苷酯至微脂體之方法，包括：(1)製備微脂體懸浮液，該微脂體懸浮液之外部pH小於7且內部pH足夠高以將葡萄糖醛酸苷酯轉化成葡萄糖醛酸苷；(2)藉由將酯基結合至葡萄糖醛酸苷以製備葡萄糖醛酸苷酯；以及(3)將該葡萄糖醛酸苷酯加入該微脂體懸浮液中，其中，該葡萄糖醛酸苷酯係負載至該微脂體內，其中，該微脂體內葡萄糖醛酸苷酯係經皂化以生成葡萄糖醛酸苷。
  3. 一種負載葡萄糖醛酸苷烷酯至微脂體之方法，包括：(1)製備微脂體懸浮液，該微脂體懸浮液之外部pH小 於7且內部pH足夠高以將葡萄糖醛酸苷烷酯轉化成葡萄糖醛酸苷；(2)藉由將烷酯基結合至葡萄糖醛酸苷以製備葡萄糖醛酸苷烷酯；以及(2)將該葡萄糖醛酸苷烷酯加入該微脂體懸浮液中，其中，該葡萄糖醛酸苷烷酯係負載至該微脂體內，且其中，該微脂體內葡萄糖醛酸苷烷酯係經皂化以生成葡萄糖醛酸苷。
  4. 一種負載葡萄糖醛酸苷甲酯至微脂體之方法，包括：(1)製備微脂體懸浮液，該微脂體懸浮液之外部pH小於7且內部pH足夠高以將葡萄糖醛酸苷甲酯轉化成葡萄糖醛酸苷；(2)藉由將甲酯基結合至葡萄糖醛酸苷以製備葡萄糖醛酸苷甲酯；以及(3)將該葡萄糖醛酸苷甲酯加入該微脂體懸浮液中，其中，該葡萄糖醛酸苷甲酯係負載至該微脂體內，且其中，該微脂體內葡萄糖醛酸苷甲酯係經皂化以生成葡萄糖醛酸苷。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該方法有效地以葡萄糖醛酸苷化之親水形式，增加該疏水性化合物之微脂體保存。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該方法有 效地增加葡萄糖醛酸苷之微脂體保存。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該方法係有效地將葡萄糖醛酸苷化之親水形式之親水性化合物負載至微脂體之水核內。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該方法係有效地將葡萄糖醛酸苷負載至微脂體之水核內。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該方法係有效地改善活體內之該化合物之半衰期。
  10. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該方法係有效地改善活體內之該葡萄糖醛酸苷之半衰期。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該內部pH係大於7且該外部pH是小於7。
  12. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該內部pH係大於7且該外部pH是小於7。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該內部pH係從7.5至8.5且該外部pH是從4.5至5.5。
  14. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該內部pH係從7.5至8.5且該外部pH是從4.5至5.5。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該內部pH係約為8且該外部pH約為5。
  16. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該內部pH係約為8且該外部pH約為5。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該內部pH係為8且該外部pH為5。
  18. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該內部pH係為8且該外部pH為5。
  19. 一種負載葡萄糖醛酸苷至微脂體之方法，包括：(1)將葡萄糖醛酸苷於酸性甲醇中反應以形成葡萄糖醛酸苷甲酯(葡萄糖醛酸苷-mE)；(2)製備微脂體，其中，該微脂體具有內部pH 7.5至pH 8.5；(3)將該微脂體與含有葡萄糖醛酸苷-mE且具有pH 4.5至pH 5.5之溶液接觸；以及(4)從該溶液純化該微脂體。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中，該內部pH約為8且該外部pH約為5。
  21. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中，該內部pH為8且該外部pH為5。
  22. 一種製備負載有葡萄糖醛酸苷之微脂體之方法，包括：(1)將葡萄糖醛酸苷於酸性甲醇中反應以形成葡萄糖醛酸苷甲酯(葡萄糖醛酸苷-mE)；(2)製備微脂體，其中，該微脂體具有內部pH 7.5至pH 8.5；(3)將該微脂體與含有葡萄糖醛酸苷-mE且具有pH 4.5至pH 5.5之溶液接觸；以及(4)從該溶液純化該微脂體。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之方法，其中，該內部pH約為8且該外部pH約為5。
  24. 如申請專利範圍第22項所述之方法，其中，該內部pH為8且該外部pH為5。
  25. 一種包括抗癌藥物之葡萄糖醛酸苷之微脂體，其中，該微脂體係藉由包括將葡萄糖醛酸苷之甲酯加入至在具有外部pH之溶液中之前驅微脂體之過程中製備而得者，其中，該微脂體具有大於該外部pH之內部pH，且其中該內部pH足夠高以將葡萄糖醛酸苷之甲酯轉化成葡萄糖醛酸苷。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之微脂體，其中，該內部pH係大於7且該外部pH係小於7。
  27. 如申請專利範圍第25項所述之微脂體，其中，該內部pH係從7.5至8.5且該外部pH係從4.5至5.5。
  28. 如申請專利範圍第25項所述之微脂體，其中，該內部pH約為8且該外部pH約為5。
  29. 如申請專利範圍第25項所述之微脂體，其中，該內部pH為8且該外部pH為5。
  30. 一種治療癌症或減少腫瘤尺寸之方法，包括施予有效減少腫瘤尺寸之量之如申請專利範圍第25至29項中任一項所述之微脂體至有需要治療的哺乳動物或人類病患，以減少腫瘤尺寸。
  31. 一種治療癌症或減少腫瘤尺寸之方法，包括施予有效減少腫瘤尺寸之量之依據申請專利範圍第1至24項中任一項所述之方法所製備之微脂體至有需要治療的哺乳動物或人類病患，以減少腫瘤尺寸。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之方法，其中，該癌症係肺癌、乳癌或大腸癌，且其中該腫瘤係起源於肺部、乳房或大腸。
  33. 如申請專利範圍第31項所述之方法，其中，該抗癌藥物係選自由下列所組成之群組：4-甲基傘形酮、9-胺基喜樹鹼、5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼、阿柔比星(aclarubicin)、放線菌黴素(actinomycin)、安吖啶(amsacrine)、樺木醇(betulin)、博萊黴素(bleomycin)、硫酸布他卡因(busulfan)、雙氯乙基亞硝脲、氯芥苯丁酸、順鉑、克拉屈濱(cladribine)、環巴胺(cyclopamine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、歐洲紫杉醇、小紅莓(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、雌莫司汀(estramustine)、依妥普賽(etoposide)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶、羥苯胺芥(hydroxyaniline mustard)、伊達比星(idarubicin)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、伊沙匹隆(ixabepilone)、白葉酸(leucovorin)、環己亞硝、氮芥苯丙胺酸、硫醇嘌呤、美司那(mesna)、胺甲葉酸、絲裂黴素、米土先強(mitoxantrone)、單甲基奧瑞他汀(monomethyl auristatin)、太平洋紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)、PR-104A、吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine)、榭皮素、雷替曲塞(raltitrexed)、SN-38、辛二醯苯胺羥胺酸(suberoylanilide hydroxamic acid)、泰克地那林(tarcedinaline)、他比特定(trabectedine)、坦尼坡賽(teniposide)、拓普替康(topotecan)、長春新鹼、溫諾平(vinorelbine)、長春鹼及長春地辛(vindesine)。
  34. 一種治療癌症或減少腫瘤尺寸之方法，包括施予有效減少腫瘤尺寸之量之依據申請專利範圍第1至22項中任一項所述之方法負載之微脂體至有需要治療的哺乳動物或人類病患，以減少腫瘤尺寸。
  35. 如申請專利範圍第34項所述之方法，其中，該癌症係肺癌、乳癌或大腸癌，或其中該癌症係起源於肺部、乳房或大腸。
  36. 如申請專利範圍第34項所述之方法，其中，該抗癌藥物係選自由下列所組成之群組：4-甲基傘形酮、9-胺基喜樹鹼、5,6-二氫-4H-苯并[脫]喹啉-喜樹鹼、阿柔比星、放線菌黴素、安吖啶、樺木醇、博萊黴素、硫酸布他卡因、雙氯乙基亞硝脲、氯芥苯丁酸、順鉑、克拉屈濱、環巴胺、達卡巴嗪、放線菌素、道諾黴素、歐洲紫杉醇、小紅莓、泛艾黴素、雌莫司汀、依妥普賽、氟尿苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、羥苯胺芥、伊達比星、愛萊諾迪肯、伊沙匹隆、白葉酸、環己亞硝、氮芥苯丙胺酸、硫醇嘌呤、美司那、胺甲葉酸、絲裂黴素、米土先強、單甲基奧瑞他汀、太平洋紫杉醇、培美曲塞、PR-104A、吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯、榭皮素、雷替曲塞、SN-38、辛二醯苯胺羥胺酸、泰克地 那林、他比特定、坦尼坡賽、拓普替康、長春新鹼、溫諾平、長春鹼及長春地辛。
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