CN104203251A - 内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体的制造方法 - Google Patents

内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体的制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104203251A
CN104203251A CN201380015012.5A CN201380015012A CN104203251A CN 104203251 A CN104203251 A CN 104203251A CN 201380015012 A CN201380015012 A CN 201380015012A CN 104203251 A CN104203251 A CN 104203251A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
monoglycosides
liposome
antibody
paclitaxel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380015012.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104203251B (zh
Inventor
滨田博喜
藤原一郎
妹尾昌治
笠井智成
重广司
村上雅春
三国克彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HAMADA HIROKI
SHIMIZU YOSHIO
Ensuiko Sugar Refining Co Ltd
Okayama University NUC
Original Assignee
SHIOMIZUMINATO REFINED SUGAR CO Ltd
Okayama University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHIOMIZUMINATO REFINED SUGAR CO Ltd, Okayama University NUC filed Critical SHIOMIZUMINATO REFINED SUGAR CO Ltd
Publication of CN104203251A publication Critical patent/CN104203251A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104203251B publication Critical patent/CN104203251B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

为了降低具有优异的抗癌作用的紫杉醇衍生物的副作用，一直在尝试制造内包紫杉醇单糖苷等的脂质体，但存在向这些脂质体内导入效率差，达不到实用等级的问题。本发明提供一种内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体的制造方法，包括以下工序：使内包聚氧乙烯酯衍生物、低级醇，以及缓冲液或水的脂质体与在含有烷撑二醇的缓冲液或水中溶解了紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷而成的溶液进行接触的工序。

Description

内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体的制造方法
技术领域
本发明涉及内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜(docetaxel)单糖苷的脂质体的制造方法。
背景技术
作为抗癌剂大量存在具有抑制细胞的增殖失控的癌细胞的分裂的机制的物质。由于这样的抗癌剂显示非常有效的抗癌作用，所以可有效地使用，但由于对正常的细胞也显示细胞增殖抑制作用，所以副作用多，使用时经常成为阻碍。
因此，对于抗癌剂，需要对正常的细胞不起作用而对癌细胞特异性送达药剂的DDS技术。为了这样降低副作用，将各种抗癌剂与DDS技术进行组合而得到了发展。这样的DDS技术中可优选使用利用由脂质双层膜构成的脂质体的技术。
例如，已开发使用这样的脂质体和奥沙利铂、顺氯氨铂或者卡铂等铂配合物系抗癌剂的技术(专利文献1)。另外，使用主动载药法导入这样的抗癌剂时，仅限于具有弱碱性的抗癌剂，作为用于消除该问题的方法，虽然开发了利用溶解度梯度的主动载药法，但该方法的适用仅限于水溶性高的药剂，其导入效率也非常低(专利文献2)。
另一方面，适用于乳癌、子宫颈癌等的紫杉醇、紫杉萜等几乎不溶于水，因此使其在醇等溶剂中进行溶解而经时制备后给药，但这样的话存在耗费时间，且伴有危险这方面的问题。
出于提高这样的紫杉醇、紫杉萜等的对水的溶解度的目的，制作有各种紫杉醇衍生物，例如，非专利文献1所示，开发有向紫杉醇加成葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖等单糖的技术。
然而，即使是这样的紫杉醇单糖苷、紫杉萜单糖苷等紫杉醇衍生物，也得不到充分的水溶性，关于组合这些衍生物和脂质体的DDS制剂，还没有任何报道。
先行技术文献
专利文献
专利文献1：国际专利公报WO2008/072584号
专利文献2：日本特开2009-132629号广报
非专利文献
非专利文献1：Biol.Pharm.Bull.2008Jun；31(6)：1155-8
发明内容
为了降低具有优异的抗癌作用的紫杉醇衍生物的副作用，尝试制造内包紫杉醇单糖苷、紫杉萜单糖苷等紫杉醇衍生物的脂质体，但存在紫杉醇衍生物等向脂质体内的导入效率差，达不到实用等级这种问题。
为了解决上述课题，本申请发明人反复进行深入研究，结果发现为了在脂质体中高效地导入紫杉醇单糖苷、紫杉萜单糖苷等紫杉醇衍生物，在特定比例的溶剂成分的存在下混合紫杉醇衍生物和脂质体的脂质即可。
另外，还发现通过预先在脂质体内含有溶解紫杉醇衍生物的混合溶剂，能够在脂质体内高效率内包紫杉醇单糖苷、紫杉萜单糖苷等。
而且，发现通过这样的方法得到的内包紫杉醇、紫杉萜单糖苷等的脂质体可作为DDS发挥优异的效果。本发明基于上述见解而完成，包括下述方式。
项1一种内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体的制造方法，其特征在于，包括对含有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷、聚氧乙烯酯衍生物、低级醇、构成脂质体的脂质以及缓冲液或水的混合物实施脂质体形成处理的工序，
该紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷相对于混合物的总容量，含有1500以上且小于3000重量％，相对于该缓冲液或水1容量份，含有0.1～0.2容量份该聚氧乙烯酯衍生物，含有0.1～0.2容量份该低级醇，相对于构成该脂质体的总脂质1重量份，内包0.1～2.5重量份的上述紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷。
项2根据上述项1记载的制造方法，脂质体形成处理是利用薄膜静置水和法、冻结干燥法、液滴法、AC法、超声波法、逆相蒸发法、脂质溶解法、喷雾干燥法、CO2/H2O乳液的制法或者采用微通道的制法中的任一种。
项3根据上述项1或2记载的制造方法，糖苷是选自葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、木糖苷、果糖苷、鼠李糖苷、阿糖胞苷、阿洛糖苷、阿卓糖苷、艾杜糖苷、N-乙酰氨基葡糖苷、N-乙酰氨基半乳糖苷、塔罗糖苷(taloside)、葡萄糖醛酸苷、氨基葡糖苷、氨基半乳糖苷以及岩藻糖苷中的1种糖苷。
项4根据上述项1～3中任一项记载的制造方法，紫杉醇单糖苷为7-α-葡萄糖基氧基乙酰紫杉醇。
项5根据上述项1～4中任一项记载的制造方法，聚氧乙烯酯衍生物为聚氧乙烯蓖麻油酯。
项6根据上述项1～5中任一项记载的制造方法，聚氧乙烯蓖麻油酯为Cremophor(注册商标)EL。
项7一种脂质体制剂，内包有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶解液且具有特异性识别癌细胞的抗体。
项8根据上述项7记载的脂质体制剂，紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶解液是在含有聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的混合溶剂中溶解该紫杉醇和/或紫杉萜单糖苷的溶解液。
项9根据上述项7或8记载的脂质体制剂，糖苷是选自葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、木糖苷、果糖苷、鼠李糖苷、阿糖胞苷、阿洛糖苷、阿卓糖苷、艾杜糖苷、N-乙酰氨基葡糖苷、N-乙酰氨基半乳糖苷、塔罗糖苷、葡萄糖醛酸苷、氨基葡糖苷、氨基半乳糖苷以及岩藻糖苷中的1种糖苷。
项10根据上述项7～9中任一项记载的脂质体制剂，紫杉醇单糖苷为7-α-葡萄糖基氧基乙酰紫杉醇。
项11根据上述项7～10中任一项记载的脂质体制剂，聚氧乙烯酯衍生物为聚氧乙烯蓖麻油酯。
项12根据上述项7～11中任一项记载的脂质体制剂，聚氧乙烯蓖麻油酯为Cremophor(注册商标)EL。
项13根据上述项7～12中任一项记载的脂质体制剂，脂质体分别以3：0.5～3的物质量比含有DPPC和胆固醇。
项14根据上述项7～15中任一项记载的脂质体制剂，相对于脂质体的总脂质的1摩尔量的紫杉醇单糖苷摩尔量为1.0～15.5×10-2。
项17根据上述项7～16中任一项记载的脂质体制剂，癌细胞为乳癌细胞。
项18根据上述项7～17中任一项记载的脂质体制剂，抗体是与HER2蛋白质特异性结合的抗体。
此外，本发明还包括以下示出的方式的发明。
项I一种内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷且具有特异性识别癌细胞的抗体的脂质体的制造方法，包括使内包聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的脂质体与在含有烷撑二醇的缓冲液或水中溶解了紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶液接触的工序。
项II根据上述项I记载的制造方法，溶解了紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶液是溶解于含有烷撑二醇的缓冲液或水中的溶液。
项III根据上述项I或II记载的制造方法，糖苷是选自葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、木糖苷、果糖苷、鼠李糖苷、阿糖胞苷、阿洛糖苷、阿卓糖苷、艾杜糖苷、N-乙酰氨基葡糖苷、N-乙酰氨基半乳糖苷、塔罗糖苷、葡萄糖醛酸苷、氨基葡糖苷、氨基半乳糖苷以及岩藻糖苷中的1种糖苷。
项IV根据上述项I～III中任一项记载的制造方法，紫杉醇单糖苷为7-α-葡萄糖基氧基乙酰紫杉醇。
项V根据上述项I～IV中任一项记载的制造方法，聚氧乙烯酯衍生物为聚氧乙烯蓖麻油酯。
项VI根据上述项I～V中任一项记载的制造方法，聚氧乙烯蓖麻油酯为Cremophor(注册商标)EL。
项VII根据上述项I～VI中任一项记载的制造方法，脂质体分别以3：0.5～3的物质量比含有DPPC和胆固醇。
项VIII根据上述项I～VII中任一项记载的制造方法，接触时间为5～60分钟。
项IX根据上述项I～VIII中任一项记载的制造方法，癌细胞为乳癌细胞。
项X根据上述项I～IX中任一项记载的制造方法，抗体为与HER2蛋白质特异性结合的抗体。
根据本发明的制造方法，能够高效地使紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷内包在脂质体中。另外，通过本发明的方法得到的内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体，能够与特异性识别癌细胞的抗体结合，结合了这样的抗体的通过本发明的制造方法得到的脂质体，作为DDS，非常有用。
附图说明
图1是试验例4的急性毒性试验结果。图的纵轴表示生存比例、横轴表示给药次数。
图2是表示通过试验例5的本发明的制造方法得到的内包紫杉醇单糖苷且担载有识别乳癌细胞的抗体的脂质体的向乳癌细胞的积聚的荧光照片。图中的棒表示10μm。
图3是试验例8的急性毒性试验结果。图的纵轴表示生存比例、横轴表示给药后的天数。
图4是试验例8的急性毒性试验结果。图的纵轴表示体重、横轴表示给药后的天数。
图5是试验例10的体内输送实验结果。左图是表示将内包由Cy5.5标识化的HAS且具有抗体的脂质体尾静脉注射到小鼠后的积聚位置和其积聚程度，图右是表示将内包由Cy5.5标识化的HAS且不具有抗体的脂质体尾静脉注射到小鼠后的积聚位置和其积聚程度。图中的棒箭头表示肿瘤，三角表示肝脏。
图6是将图5所示的成像效果坐标化的图。(A)是肿瘤组织的结果、(B)是肝脏的结果、(C)是将相对于肝脏的在肿瘤组织的积聚度以比例的形式数值化的结果。应予说明，对于数值化而言，根据阈值选择肿瘤和肝脏部位，测定总荧光强，具体而言，使用Digital MicroscopySoftware Slide Book4.2(株式会社Nippon Roper)。
图7是试验例11的体内抗癌活性实验结果。图的纵轴表示肿瘤体积，横轴表示给药后的天数。
图8是试验例11的体内抗癌活性实验结果。图的纵轴表示体重，横轴表示给药后的天数。
图9是试验例11的体内抗癌活性实验结果。图的纵轴表示生存率，横轴表示给药后的天数。
图10是试验例11的小鼠的照片。图中的箭头表示肿瘤。
具体实施方式
＜脂质体的制造方法＞
作为本发明的脂质体的制造方法的一个方式(以后，有时称为“第1方式的制造方法”)的内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体的制造方法，包括对含有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷、聚氧乙烯衍生物、低级醇、构成脂质体的脂质以及缓冲液或水的混合物实施脂质体形成处理的工序。
这里，也可以是以下方法，即，预先制备含有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷和聚氧乙烯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的溶液，将其与构成脂质体的脂质混合，接着供于脂质体形成处理的方法。
作为其它方式，也可以是制备含有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷和聚氧乙烯衍生物以及低级醇的溶液，之后与含有构成脂质体的脂质和缓冲液或水的混合物混合，接着供于脂质体形成处理。
即，无论混合紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷和脂质的顺序如何，紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷相对于紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷、聚氧乙烯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的总容量的使用量为1500以上且小于3000重量％左右。优选为1700以上且小于2500重量％以下左右，更优选为1800～2200重量％左右。
聚氧乙烯衍生物的使用量相对于缓冲液或水1容量份为0.1～0.2容量份左右，优选为0.12～0.19容量份左右，更优选为0.13～0.18容量份左右。
低级乙醇的使用量相对于缓冲液或水1容量份为0.1～0.2容量份左右，优选为0.12～0.19容量份左右，更优选为0.13～0.18容量份左右。
应予说明，本说明书中使用的用语“容量份”是指，在常压和室温环境下测定得到的数值。
聚氧乙烯酯衍生物没有特别限定，例如，可举出聚氧乙烯烷基醚硫酸钠、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸、聚(氧化乙烯·氧化丙烯)甲基聚硅氧烷共聚物、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯硬脂基醚、聚氧乙烯硬脂酸酰胺、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙二醇、聚氧乙烯蓖麻油酯等。
其中，优选为聚氧乙烯蓖麻油酯，更优选为聚氧化烯(C24)蓖麻油脂肪酸酯(Cremophor(注册商标)EL)。
低级醇没有特别限定，通常为碳原子数1～4的醇即可。
缓冲液没有特别限定，例如可举出PBS、MES、ADA、PIPES、ACES、乙醇胺盐酸、BES、TES、HEPES、柠檬酸、硼酸、酒石酸。
作为脂质体的构成成分，可举出磷脂质、胆固醇类、脂肪酸等。具体而言，作为磷脂质，可举出磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、溶血卵磷脂、利用常法将它们加氢而成的磷脂质等天然磷脂质；二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硫代吡啶-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DTP-DPPE)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS)、桐酰磷脂酰胆碱、桐酰磷脂酰乙醇胺、桐酰磷脂酰丝氨酸等合成磷脂质等。
上述磷脂质、胆固醇类、以及脂肪酸可以各自进行适当地修饰。具体的修饰没有特别的限定，例如可举出利用聚乙二醇、聚丙二醇等之类的聚烷撑二醇等进行的修饰。这些磷脂质可以适当地组合使用。
作为胆固醇类，例如可举出胆固醇、植物甾醇等。
另外，作为脂肪酸，例如可举出油酸、棕榈油酸、亚油酸、或含有这些不饱和脂肪酸的脂肪酸混合物等。其中，含有侧链小的不饱和脂肪酸的脂质体因曲率的关系对制作粒径小的脂质体有效。
通过本发明的第1方式的制造方法得到的脂质体在脂质体内包有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷。
本说明书中使用的用语“内包”，可以是在脂质体内部完全包含紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷，而在构成脂质体的脂质双层膜中紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷分子贯通的状态也是“内包”的意思。另外，本说明书中，有时也使用与“内包”同义的“内封”的用词。
通过本发明的第1方式的制造方法得到的脂质体相对于总脂质1重量份内包0.1～2.5重量份左右的紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷。更优选为1.3～2.4重量份，更优选为1.6～2.3重量份左右。
紫杉醇单糖苷和紫杉萜单糖苷，分别是紫杉醇和紫杉萜加成单糖而得的物质。例如，对紫杉醇而言，加成单糖的位置没有特别限定，例如可在紫杉醇所具有的紫杉烷环的10位或7位加成单糖。已知在自然界存在紫杉醇7位的糖衍生物，根据结合的稳定性的观点，优选在7位加成。
另外，对于紫杉萜而言，加成单糖的位置没有特别限定，例如在紫杉萜所具有的紫杉烷环的10位或7位加成单糖。
具体的单糖没有特别限定，例如，可举出葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、艾杜糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、塔罗糖、葡糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、岩藻糖等。其中，从不过度损害紫杉醇和紫杉萜所具有的抗癌效果的观点考虑，优选使用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖等。
即，作为本发明涉及的紫杉醇单糖苷和紫杉萜单糖苷中的糖苷，可举出葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、木糖苷、果糖苷、鼠李糖苷、阿糖胞苷、阿洛糖苷、阿卓糖苷、艾杜糖苷、N-乙酰氨基葡糖苷、N-乙酰氨基半乳糖苷、塔罗糖苷、葡萄糖醛酸苷、氨基葡糖苷、氨基半乳糖苷、岩藻糖苷等。
上述紫杉醇单糖苷和紫杉萜单糖苷，可以在紫杉醇及紫杉萜与单糖之间具有其它基团，例如可举出碳原子数为1～8的烷酰基等。
即，对于上述紫杉醇单糖苷和紫杉萜单糖苷，各自的紫杉醇和紫杉萜的紫杉烷环的7位或10位的羟基的氢原子可以被烷酰氧基取代，所述烷酰氧基是被上述单糖取代的碳原子数为1～8的烷酰氧基。
应予说明，单糖加成前的紫杉醇可以是公知的紫杉醇衍生物。另外，还可举出日本特开平8-73449号公报、日本特开平7-233159号公报等记载的紫杉醇衍生物。
作为上述紫杉醇单糖苷最优选的是由下述式(1)表示的7-α-葡萄糖基氧基乙酰紫杉醇。
上述的紫杉醇单糖苷可使用公知的方法制造，例如可以参照非专利文献1中记载的方法来制造。具体的制造方法如下，即，将所希望加成到紫杉醇的单糖预先乙酰化，如上述所述地通过在紫杉醇所具有的紫杉烷环的7位或10位进行酯化而赋予糖链。
作为上述紫杉萜单糖苷最优选的是由下述式(2)～(4)表示的紫杉萜单糖苷。
式中的α葡萄糖基可以是β葡萄糖基、α半乳糖基、β半乳糖基或者α甘露糖基。
式中的n为2、3、4、6或8中的任一个。
上述紫杉萜单糖苷可使用公知的方法制造，例如，适当参照HETEROCYCLES，2001,Vol54，N0.2，561-566.，Biol.Pharm.Bull.2008，31(6)1155-1158(2008)等记载的方法制造即可。
通过本发明的第1方式的制造方法制造的脂质体的种类由上述脂质体的构成脂质决定，可以是阴离子性脂质体、阳离子性脂质体、两性脂质体中任一种。例如，从对细胞高效导入物质这种观点考虑，与其它种的脂质体相比更优选阳离子性脂质体，但从对细胞发生非特异性吸附的方面考虑，在将通过本发明的方法得到的含有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体向特定的细胞发挥DDS效果方面较差，因此不优选。
本发明的第1方式的制造方法的脂质体形成处理方法可使用公知的方法制造，没有特别限定，例如可通过薄膜静置水和法、冻结干燥法、液滴法、AC法、超声波法、逆相蒸发法、脂质溶解法、喷雾干燥法、利用CO2/H2O乳液的制法、或者采用微通道等的方法制造。
若具体说明本发明的第1方式的制造方法的脂质体形成处理的例子，则例如将上述磷脂质、胆固醇等溶解在适当的有机溶剂中，将其放入适当的容器后在减压下馏去溶剂在容器内面形成磷脂质膜，向其加入含有上述紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶液优选为其缓冲液并进行搅拌，从而能够得到内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体。这样的脂质体可以冻结干燥保存。
另外，通过本发明的第1方式的制造方法得到的脂质体的粒径没有特别限定，但从通过本发明的制造方法得到的脂质体可很好地用作内包具有抗癌作用的紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体制剂的观点考虑，通常为50～300nm左右即可。满足这样的数值范围的脂质体制剂在向生物体内给药时，成为能够通过毛细血管，特别是通过基于由癌细胞诱发的血管生成等的毛细血管等的大小而优选。如果为50nm以上的粒径的脂质体，则由于实质上不易向细胞中泄漏，所以优选。另外，300nm以下的粒径的脂质体在向生物体内给药后不易被血中的白血球(巨噬细胞)吞噬，所以优选。
从这样的观点考虑，可以对通过本发明的第1方式的制造方法得到的脂质体的规定的粒径进行调节。具体而言，在预先进行脂质体形成处理时，可通过变更各种条件来实现，但也可以使其通过调节了细孔径的过滤器来实现。作为通过过滤器来调节脂质体制剂的粒径的方法，可举出使用挤出机等的方法。
通过本发明的第1方式的制造方法得到的脂质体，可以具有识别癌细胞的抗体。这样的抗体可以是单克隆抗体，还可以是多克隆抗体，作为抗体的来源的动物种类也没有特别限定。
另外，若为单链抗体、Domino抗体、短链抗体、多价化抗体、双特异性抗体、Fab化抗体、F(ab′)2化抗体、嵌合抗体、人源化抗体等这样的具有抗原识别功能的分子，则可以是具有任意分子结构的抗体，并不限定于以IgG为代表的具有免疫球蛋白结构的抗体。
这样的抗体与通过上述本发明的制造方法得到的脂质体的脂质双层膜进行结合，其结合方式没有特别限定，通过根据所使用的抗体的结构适当地选择而能够得到具有所希望的抗体的脂质体。
例如，抗体如果为免疫球蛋白，则使用SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)等来使抗体与脂质体结合即可。
另外，抗体的担载可以是在通过上述本发明的第1方式的制造方法内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体上结合抗体，也可以使抗体预先与脂质体的构成脂质结合。为了使结合的抗体更多地呈现在脂质体表面，优选通过本发明的制造方法内包有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体上结合抗体。
本发明的脂质体所具有的抗体可识别癌细胞。这样的癌细胞没有特别限定，可举出肺癌细胞、非小细胞肺癌、乳癌细胞、食道癌、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌、子宫颈癌细胞、子宫内膜癌细胞、前列腺癌细胞、头颈部癌细胞(包含口腔癌细胞、咽癌细胞、喉癌细胞、鼻腔或副鼻腔癌细胞、唾液腺癌细胞、甲状腺癌细胞等)等。
其中，基于紫杉醇的临床应用经验，优选非小细胞肺癌细胞、乳癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞等。
识别上述癌细胞的抗体是特异性识别存在于癌细胞的表层的蛋白质(例如，CD44、CD133等的形成CD蛋白质群的CD蛋白质；生长因子或荷尔蒙的受体；具有膜贯通或膜结合区域的蛋白质等)、肽、糖链等生物体分子的抗体。这样的抗体没有特别限定，只要是已知可在对应的癌细胞的表层进行表达的抗体即可。
例如作为识别乳癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患乳癌的患者采集的乳癌细胞、来自乳癌组织的细胞的Hs274.T细胞、Hs280.T细胞、Hs281.T细胞、Hs343.T细胞、Hs362.T细胞、Hs739.T细胞、Hs741.T细胞、Hs742.T细胞、Hs190.T细胞、Hs319.T细胞、Hs329.T细胞、Hs344.T细胞、Hs350.T细胞、Hs371.T细胞、Hs748.T细胞、Hs841.T细胞、Hs849.T细胞、Hs851.T细胞、Hs861.T细胞、Hs905.T细胞、Hs479.T细胞、Hs540.T细胞、Hs566(B).T细胞、Hs605.T细胞、Hs606细胞、BT-20细胞、UACC-812细胞、HCC1954细胞、Hs574.T细胞、BT-483细胞、BT-549细胞、DU4475细胞、Hs578T细胞、BT-474细胞、UACC-893细胞、HCC38细胞、HCC70细胞、HCC202细胞、HCC1143细胞、HCC1187细胞、HCC1395细胞、HCC1419细胞、HCC1500细胞、HCC1599细胞、HCC1937细胞、HCC2157细胞、HCC2218细胞、HCC1569细胞、MB157细胞、SK-BR3细胞、MDA-MB-330细胞、MDA-MB-453细胞、MDA-MB-157细胞、MDA-MB-134细胞、T-47D细胞、ZR-75细胞、MCF-7细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体(抗ErbB2抗体)、抗CEA抗体等。
例如作为识别肺癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患肺癌的患者采集的肺癌细胞、来自肺癌组织的细胞的Hs229.T细胞、NCI-H2066细胞、NCI-H2286细胞、NCI-H1703细胞、Hs573.T细胞、A549细胞、A427细胞、N417细胞、NCI-H596细胞、SW1573细胞、NCI-H835U细胞、MC11细胞、NCI-H727细胞、NCI-H720细胞、NCI-H810细胞、NCI-H292细胞、NCI-H2126细胞、H69细胞、NCI-H1688细胞、NCI-H1417细胞、NCI-H1672细胞、NCI-H1836细胞、DMS79细胞、DMS53细胞、DMS114细胞、SW1271细胞、NCI-H2227细胞、NCI-H1963细胞、SHP-77细胞、H69细胞，H69AR细胞、NCI-H2170细胞、NCI-H520细胞、SW900细胞等的表层的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗CEA抗体等。
例如作为识别非小细胞肺癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患非小细胞肺癌的患者采集的非小细胞肺癌细胞、来自非小细胞肺癌组织的细胞的NCI-H23细胞、NCI-H522细胞、NCI-H1435细胞、NCI-H1563细胞、NCI-H1651细胞、NCI-H1734细胞、NCI-H1793细胞、NCI-H1838细胞、NCI-H1975细胞、NCI-H2073细胞、NCI-H2085细胞、NCI-H2228细胞、NCI-H2342细胞、NCI-H2347细胞、NCI-H2135细胞、NCI-H2172细胞、NCI-H2444细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体、抗EGFR抗体等。
例如作为识别食道癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患食道癌的患者采集的食道癌细胞、来自食道癌组织的细胞的SGF-3细胞、EC-YO细胞、TE-1细胞、TE-2细胞、TE-3细胞、TE-4细胞、TE-5细胞、TE-6细胞、TE-7细胞、TE-8细胞、TE-9细胞、TE-10细胞、TE-11细胞、TE-12细胞、TE-13细胞、TE-14细胞、TE-15细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体、抗EGFR抗体等。
例如作为识别胃癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患胃癌的患者采集的胃癌细胞、来自胃癌组织的细胞的AZ521细胞、AGS细胞、SNU-1细胞、SNU-5细胞、SNU-16细胞、NCI-N87细胞、Hs746T细胞、KATO III细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗CEA抗体、抗SLX抗体等。
作为识别肝癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患肝癌的患者采集的肝癌细胞、来自肝癌组织的细胞的HepG2细胞、Huh-7细胞、C3A细胞、SNU-398细胞、SNU-449细胞、SNU-182细胞、SNU-475细胞、Hep3B2.1-7细胞、PLHC-1细胞、SNU-387细胞、SNU-423细胞、SK-HEP-1等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体等。
作为识别胰腺癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患胰腺癌的患者采集的胰腺癌细胞、来自胰腺癌组织的细胞的MIAPaCa-2细胞、BxPC-3细胞、HPAF-II细胞、HPAC细胞、Panc03.27细胞、Panc08.13细胞、Panc02.03细胞、Panc02.13细胞、Panc04.03细胞、Panc05.04细胞、Capan-2细胞、CFPAC-1细胞、PL45细胞、Panc10.05细胞、PANC-1细胞、AsPC-1细胞、Capan-1细胞、SW1990细胞、Hs766T细胞、SU.86.86细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗Her2抗体、抗CEA抗体、抗SLX抗体等。
作为识别结肠癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患结肠癌的患者采集的结肠癌细胞、来自结肠癌组织的细胞的WiDr细胞、Caco-2细胞、NCI-H548细胞、Hs255.T细胞、TAC-1细胞、COLO320DM细胞、COLO320HSR细胞、DLD-1细胞、HCT-15细胞、SW480细胞、SW403细胞、SW48细胞、SW1116细胞、SW948细胞、SW1417细胞、LS123细胞、LS180细胞、LS174T细胞、C2BBe1细胞、Hs257.T细胞、Hs587.Int细胞、HT-29细胞、HCT-8细胞、Hs675.T细胞、HCT116细胞、ATRFLOX细胞、Hs698.T细胞、SW626细胞、SNU-C1细胞、COLO205细胞、COLO201细胞、SW620细胞、LoVo细胞、SK-CO-1细胞、T84细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗CEA抗体等。
作为识别卵巢癌的抗体，使用识别存在于属于从患卵巢癌的患者采集的卵巢癌细胞、来自卵巢癌组织的细胞的PA-1细胞、Caov-3细胞、TOV-21G细胞、TOV-112D细胞、Hs38.T细胞、Hs571.T细胞、ES-2细胞、TE84.T细胞、NIH：OVCAR-3细胞、SK-OV-3细胞、Caov-4细胞、OV-90细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体等。
作为识别子宫颈癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患子宫颈癌的患者采集的子宫颈癌细胞、来自子宫颈癌组织的细胞的HeLa细胞、HeLa229细胞、HeLaS3细胞、H1HeLa细胞、Hs588.T细胞、GH329细胞、GH354细胞、HeLaNR1细胞、C-4I细胞、C-4II细胞、DoTc24510细胞、C-33A细胞、SW756细胞、SiHa细胞、HT-3细胞、MS751细胞、CaSki细胞、ME-180细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体等。
作为识别子宫内膜癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患子宫内膜癌的患者采集的子宫内膜癌细胞、来自子宫内膜癌组织的细胞的HHUA细胞、KLE细胞、HEC-1-A细胞、HEC-1-B细胞、HEC-6细胞、HEC-50细胞、HEC-59细胞、HEC-108细胞、HEC-116细胞、RL95-2细胞、SK-UT-1细胞、SK-UT-1B细胞、MES-SA细胞、MES-SA/Dx5细胞、MES-SA/MX2细胞、AN3CA细胞、SNG-P细胞、SNG-M细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体、抗CEA抗体等。
作为识别前列腺癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患前列腺癌的患者采集的前列腺癌细胞、来自前列腺癌组织的细胞的LNCaP细胞、22Rv1细胞、PC-3细胞、MDA PCa2b细胞、TRAMP-C3细胞、DU145细胞、NCI-H660细胞、TSU-PR1PC-82细胞、PPC-1细胞、VCRU-Pr-2细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。具体而言，可举出抗HER2抗体、抗EGFR抗体等。
作为识别头颈部癌细胞中的口腔癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患口腔癌的患者采集的口腔癌细胞、来自口腔癌组织的细胞的Hs53.T细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。
作为识别头颈部癌细胞中的咽癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患咽癌的患者采集的咽癌细胞、来自咽癌组织的细胞的C666-1细胞、NPC-TY861细胞、MPC-Y851细胞、MPC-K852细胞、KKK-YT细胞、MPC-ST细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。
作为识别头颈部癌细胞中的喉癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患喉癌的患者采集的喉癌细胞，来自喉癌组织的细胞的FaDu细胞、Hs840.T细胞、Detroit562细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。
作为识别头颈部癌细胞中的鼻腔或副鼻腔癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患鼻腔或副鼻腔癌的患者采集的鼻腔或副鼻腔癌细胞、来自鼻腔或副鼻腔癌组织的细胞的RPMI2650细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。
作为识别头颈部癌细胞中的唾液腺癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患唾液腺癌的患者采集的唾液腺癌细胞、来自唾液腺癌组织的细胞的SGT-1细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。
作为识别头颈部癌细胞中的甲状腺癌细胞的抗体，使用识别存在于属于从患甲状腺癌的患者采集的甲状腺癌细胞、来自甲状腺癌组织的细胞的HTC/C3细胞、SW579细胞、TT细胞等的表面的蛋白质、肽、糖链等生物体分子的抗体即可。
作为识别这些头颈部癌细胞的抗体，具体而言，可举出抗HER2抗体、抗EGFR抗体等。
从本发明的脂质体制剂所具有的紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷可在所应用的癌细胞的表层大量表达的观点出发，上述抗体中最优选的是抗HER2抗体。
这样的抗体可使用公知的方法制造，也可以购入一般作为分子标靶药物的抗体医药品，使用其有效成分。例如，针对特异性识别上述乳癌细胞等的HER2的抗HER2抗体，是由中外制药以Herceptin(注册商标)进行销售的抗体医药品的有效成分。
本发明的脂质体的制造方法的另一个方式(以后，有时称为“第2方式的制造方法”)，是内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷且具有特异性识别癌细胞的抗体的脂质体的制造方法，包括使含有聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的脂质体与在含有烷撑二醇的缓冲液或水中溶解上述紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷而成的溶液接触的工序。
第2方式的制造方法可以是包括：在使内包聚氧乙烯酯衍生物、低级醇、以及缓冲液或水的脂质体与在含有烷撑二醇的缓冲液或水中溶解紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷而成的溶液接触的工序，以及，其后，在得到的脂质体上结合特异性识别癌细胞的抗体的工序的方法(方法1)，也可以是包括在包含聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的脂质体上预先结合特异性识别癌细胞的抗体，使得到的物质与在含有烷撑二醇的缓冲液或水中溶解紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶液接触的工序的方法(方法2)。
关于第2方式的制造方法中的“紫杉醇单糖苷”、“紫杉萜单糖苷”、“癌细胞”、“特异性识别癌细胞的抗体”、“脂质体”的脂质组成，“脂质体”的制造方法(形成处理方法)、“脂质体”的粒径、使“脂质体”与特异性识别癌细胞的抗体进行结合的“脂质体”的结合方法、“聚氧乙烯酯衍生物”、“低级醇”等，可以将用本发明的第1方式的制造方法详述的内容直接使用或适当地改变后使用。应予说明，脂质体可以是特异性识别癌细胞的抗体的结合的前后的任一种，也可以是内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷前后的任一种。
应予说明，关于第2方式的制造方法中的脂质体的脂质组成，优选含有DPPC和胆固醇，这些具体的物质量比没有特别限定，通常为3：0.5～3左右即可，优选为3：1～3，更优选为3：1～2，最优选为3：1。
关于第2方式的制造方法中的内包于脂质体的聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水，这些的容量比与上述的第1方式的制造方法同样，没有特别限定，通常相对于缓冲液或水1容量份，聚氧乙烯酯衍生物通常为0.1～0.2容量份左右即可，优选为0.12～0.19容量份左右，更优选为0.13～0.18容量份左右即可。
另外，通常相对于缓冲液或水1容量份，低级乙醇为0.1～0.2容量份左右即可，优选为0.12～0.19容量份左右，更优选为0.13～0.18容量份左右即可。
这样的在脂质体中内包聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的方法，适当地参照上述第1方式的制造方法即可。
第2方式的制造方法中的烷撑二醇没有特别限定，例如可举出乙二醇、丙二醇、丁二醇等。应予说明，这些烷撑二醇可以适当地组合使用。
这样的烷撑二醇的使用量相对于上述缓冲液或水的1容量份，通常为0.1～1.5容量份左右即可，优选为0.2～1.0容量份左右，更优选为0.3～0.8容量份左右，最优选为0.4～0.7容量份。
紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷对含有烷撑二醇的缓冲液或水的溶解度，通常为0.1～2mg/mL左右。
第2方式的制造方法中的包含聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的脂质体与在含有烷撑二醇的缓冲液或水中溶解上述紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷而成的溶液的接触时间，没有特别限定，通常为5分钟～60分钟左右即可。更优选为10～30分钟左右，进一步优选为10～20分钟左右。
应予说明，关于接触时的温度等其他条件，没有特别限定，基于公知的主动载药法即可。
在本发明的第2方式的制造方法中，紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷对脂质体的导入效率，通常为50～90％左右，更优选为70～90％。这样的导入效率可以根据在后述的实施例中进行说明的包封率(EE：％)而求得。
应予说明，对于本发明的脂质体的制造方法而言，可以是上述的第1方式，也可以是第2方式，还可以供于精制所得到的脂质体的工序。具体的精制方法采用公知的方法即可，没有特别限定，例如，可举出使用凝胶过滤树脂等层析法、超滤法、透析法等方法。
用上述方法得到的脂质体可用适当的公知的方法保存，没有特别限定，例如可以进行冻结干燥，也可以根据需要在含有公知的防腐剂的对羟基苯甲酸酯、苯氧基乙醇等液体中保存。
通过上述本发明的制造方法得到的脂质体，能够对上述癌细胞赋予基于由脂质体所含有的紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷带来的高效的抗癌活性效果。具体而言，能够抑制癌细胞的增殖，以至于缩小癌组织。另外，通过本发明的制造方法得到的内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的、或者内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶解液的脂质体，通过其含有的抗体的作用能够进行癌细胞特异性送达，所以还有副作用变少这种优点。
因此，具有特异性识别上述癌细胞的抗体的通过本发明的制造方法得到的脂质体可作为脂质体制剂用作癌的治疗剂。
＜脂质体制剂＞
本发明的脂质体制剂内包有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶解液且具有特异性识别癌细胞的抗体。
本发明的脂质体制剂可以将通过上述本发明的制造方法得到的脂质体直接或采用公知的制剂化技术制造即可。
即，本发明的脂质体制剂内包有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶解液且具有特异性识别癌细胞的抗体。
本发明的脂质体制剂中的紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶解液，优选是在含有聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的混合溶剂中溶解紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷而成的溶解液。
关于本发明的脂质体制剂中的“紫杉醇单糖苷”、“紫杉萜单糖苷”、“癌细胞”、“特异性识别癌细胞的抗体”、“脂质体”的脂质组成、“脂质体”的制造方法(形成处理方法)，“脂质体”的粒径，抗体与“脂质体”的结合方法、“聚氧乙烯酯衍生物”、“低级醇”等，可直接或适当改变上述方式的本发明的脂质体的制造方法而使用即可。
脂质体的脂质组成与上述的本发明的脂质体的制造方法中的情况相同，特别是通常以3：0.5～3左右的物质量比含有DPPC和胆固醇即可，优选为3：1～3，更优选为3：1～2，最优选为3：1。
本发明的脂质体制剂中的紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的含有摩尔量相对于脂质体中的总脂质的摩尔量，通常为1.0～15.0×10-2倍的摩尔量左右，优选为7.0～15.0×10-2倍的摩尔量左右。应予说明，这样的紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的摩尔量可以根据在后述的实施例中说明的担载率(LE：％)来求得。
本发明的脂质体制剂通过给药到生物体中从而高效且特异性送达到癌细胞。另外，还兼具送达后侵入细胞内的效果。这样的脂质体制剂的给药方法，没有特别限定，例如优选向血中直接给药。作为具体的给药，可举出经静脉给药、经动脉给药、肌肉内给药、心脏内给药、皮下给药、骨内给药、皮内给药、蛛网膜下(腔)给药、腹腔内给药、膀胱内给药等。给药手段也没有特别限定，采用注射、点滴、注入泵等之类的公知方法即可。
本发明的脂质体制剂的给药量可以根据希望进行癌治疗的患者的年龄、性别、癌变的程度等决定，并没有具体决定，但通常换算成脂质体制剂中含有的紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的量，每次10～100mg/kg左右即可。给药间隔、给药次数等也如上述那样，根据希望进行癌的治疗的患者的年龄、性别、癌变的程度等决定即可。应予说明，作为给药对象的癌只要是以上的本发明的脂质体的制造方法详述的癌就没有特别限定，适当选择即可。
另外，如果使本发明的脂质体制剂担载抗体，作为DDS进行生物体给药，无论目的部位，如何都会发生一定程度积聚在肝脏这样的问题时，则例如通过聚乙二醇进行修饰对此也是有效的。对于这样的方法，适当采用公知的方法即可。
实施例
进一步详细说明本发明。其中，本发明并不限定于以下所示的实施例。
试验例1：7-α-葡萄糖基氧基乙酰紫杉醇的溶解度
对由化学式(1)表示的7-α-葡萄糖基氧基乙酰紫杉醇(以下，本实施例中记为gPTX。)的溶解度进行了研究。
分别称量规定量的用在上述非专利文献1中示出的方法制成的粉末状的gPTX和紫杉醇(以下，在本实施例中记为PTX。)，加入120μL的乙醇，通过涡流使其混合。进而，在溶解液中混合120μL的Cremophor(注册商标)EL(从和光纯药获得)混合后，再混合760μL的PBS(pH7.4)来确认gPTX和PTX的溶解性。将结果示于表1。
表1
※表中×表示不溶○表示溶解-表示不实施。
可明确作为非配糖体的PTX仅以2mg/ml左右的浓度溶解，如果是gPTX，则能以20mg/ml的高浓度溶解。即，可明确PTX和gPTX通常几乎不溶于水，即使是聚氧乙烯蓖麻油：乙醇：PBS(pH7.4)为容量比12：12：76的比例的非水系混合溶剂，PTX也不显示充分的溶解度，但gPTX能够以非常高的浓度溶解于上述非水系混合溶剂中。
另外，作为比较实验例，将gPTX对含有10～40％(容量)的乙二醇(EG)的10mM磷酸缓冲液的溶解度同样地进行实验，结果示于表2。是全部成为1mg/mL的浓度的方式混合gPTX的结果。
表2
乙二醇(EG)(％) 10 20 30 40
1mg/mL的gPTX的溶解度 × × △ ○
※表中×表示不溶△表示部分溶解○表示溶解。
可明确gPTX不溶解于含有10～20％(容量)的乙二醇的PBS中，在含有30％(容量)的乙烯葡萄糖的PBS中开始溶解，在含有40％(容量)的乙烯葡萄糖的PBS溶解。此时的溶解度大约为1mg(gPTX)/mL左右。因此，可明确gPTX本身对只是水系溶剂时几乎不能溶解，为含有30～40％(容量)左右的乙二醇的混合溶剂时能够溶解。
试验例2：7-α-葡萄糖基氧基乙酰紫杉醇内包脂质体
分别称量13.5、1.5以及1.5mg1,2-二棕榈酰基-外消旋-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DPPG)以及胆固醇，在50ml的茄形烧瓶内混合。将混合的脂质用3ml的有机溶剂(氯仿：甲醇＝9：1)溶解后，用旋转蒸发仪干燥，其后，进行2小时的真空干燥，由此完全除去溶剂而制备脂质膜。
接下来，将茄形烧瓶在60℃的温浴中浸渍5分钟后，加入1ml的制备成20mg/ml的浓度的gPTX溶液(聚氧乙烯蓖麻油：乙醇：超纯水＝12：12：76；容量比)或2mg/ml的PTX溶液(聚氧乙烯蓖麻油：乙醇：超纯水＝12：12：76；容量比)，将脂质膜溶解，制备多片层囊泡(MLV)。
将其隔1分钟的间隔进行5分钟的超声处理共3次来制备层状小囊泡(SLV)。为了除去未包入的药剂溶液和游离的脂质，进行超滤(AmiconUltra100K membrane(Millipore公司制))。另外，将内包了gPTX的脂质体以后记为gPTX-L，而且将内包了PTX的脂质体以后记为PTX-L。
进而，作为比较例，代替gPTX，使用上述的1mg/ml的gPTX溶液(含40％(容量)乙二醇10mM磷酸缓冲液)在脂质体内包gPTX。
接着，进行以结合了抗体的脂质体内包上述gPTX的实验。首先，分别称量13.5、1.5以及1.5mg的DPPC、DPPG以及胆固醇，在50ml茄形烧瓶内混合。将混合后的脂质用3ml的有机溶剂(氯仿：甲醇＝9：1)溶解，向其加入27μl(0.2mg)的8mM的N-3-(2-二硫代)丙酰二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DTP-DPPE)溶液。其后，用旋转蒸发仪干燥后，进行2小时的真空干燥从而完全除去溶剂而制备脂质膜。
接下来，将茄形烧瓶在60℃的温浴中浸渍5分钟后，加入1ml的制备成20mg/ml的浓度的gPTX溶液(聚氧乙烯蓖麻油：乙醇：超纯水＝12：12：76；容量比)来溶解脂质膜，制备多片层囊泡(MLV)。
将其隔1分钟的间隔进行5分钟的超声处理共3次来制备层状小囊泡(SLV)。为了除去未包入的药剂溶液和游离的脂质而进行超滤(Amicon Ultra100K membrane(Millipore公司制))。
同时，制备与脂质体结合的抗体。将1mg的N-丁二酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)溶解于脱水甲醇500μl，得到2mg/ml的SPDP溶液。将5μL的SPDP溶液加入到1ml的曲妥珠单抗(人源化抗HER2单克隆抗体)溶液(1mg/ml)中在室温下搅拌30分钟。为了除去未结合的SPDP而在透析管(截留分子量：14000)中加入SPDP修饰曲妥珠单抗溶液，通过100mM乙酸缓冲液(pH4.5)进行透析。透析在4℃的冷暗处中进行，3小时进行4次、12小时进行2次外液交换。
在SPDP修饰曲妥珠单抗溶液中混合50mM的二硫苏糖醇(DTT)溶液500μl，在室温下搅拌30分钟。为了除去未反应的DTT和作为副生成物的吡啶-2-硫酮，进行了超滤((Amicon Ultra10K membrane(Millipore公司制))。
过滤后，与内包有上述PTX或gPTX的脂质体混合，使曲妥珠单抗与脂质体结合。
将在结合有抗体的脂质体中内包有上述gPTX的脂质体以后记为gPTX-IL，而且将内包有PTX的脂质体记为PTX-IL。另外，将在没有抗体的脂质体中内包有上述gPTX的脂质体以后记为gPTX-L，而且将内包有PTX的脂质体记为PTX-L。
另外，作为比较例，代替gPTX，使用上述的1mg/ml的gPTX溶液(含40％乙二醇10mM磷酸缓冲液)进行内包于结合了抗体的脂质体的实验。
得到的内包于脂质体或免疫脂质体内的紫杉醇单糖苷的效率按以下方法计算。首先得到gPTX和PTX的校准曲线。校准曲线是用HPLC检测0.01到0.5mg/ml的药剂溶液(聚氧乙烯蓖麻油：乙醇：PBS(pH7.4)为12：12：76；容量比)，由各药剂浓度中的峰面积作成。
接下来，在制备的脂质体中添加1/10体积量的0.1％的TritonX-100，通过超声波处理破坏脂质体后，用HPLC测定该溶液10μl，使用校准曲线求得被内包的药剂含量。HPLC的柱使用WP300C18、5μm4.6×150mm，测定条件为检测波长227nm，移动相使用甲醇：超纯水＝6：4的溶剂，以1.0ml/min的流速进行送液。
使用下式(1)和(2)，根据得到的药剂含量计算内包封率(Encapsulation efficiency：EE)和担载率(loading efficiency：LE)。
内包封率(EE：％)＝药剂含量/初始使用药剂量×100    (1)
担载率(LE：％)＝{(药剂含量/药剂摩尔重量)/初始脂质摩尔数}×100  (2)
另外，得到的脂质体的粒径作为基于动态光散射法的Z平均粒径进行测定。将这些结果示于下述表3。
表3
由表3所示的结果可明确，溶解于40％的乙二醇中的PTX没有被内包于脂质体。另外，从内包封率来看，可明确溶解于含有聚氧乙烯蓖麻油等的溶剂中的gPTX比PTX优异。
此外，关于PTX对构成脂质体的脂质的担载率，溶解于含有聚氧乙烯蓖麻油的溶剂中的PTX仅显示1.2％左右的数值，与此相对，相同地溶解于含有聚氧乙烯蓖麻油的溶剂中的gPTX，显示13.7％的数值，根据对结合了抗体的脂质体的内包实验，也显示11.4％的数值。这表明，与PTX相比，gPTX对于构成脂质体的脂质的担载量也大约上升9.5～11.4倍。即，表示gPTX有利于在脂质体中内包。
另外，关于内包封率，还可明确溶解于40％(容量)的乙二醇溶液的gPTX，对脂质体仅0.41％、对结合了抗体的脂质体仅0.51％左右内包，与此相对，溶解于含有聚氧乙烯蓖麻油的溶剂中的gPTX，对脂质体内包封率为17.6％，对结合了抗体的脂质体内包封率为14.8％，为30～40倍左右，内包封率上升。
因此，表明在脂质体中内包gPTX时，使用溶解于含有聚氧乙烯蓖麻油的溶剂中的gPTX是非常有利的。
试验例3：抗癌活性评价
通过MTT比色法对使用溶解于二甲基亚砜中的PTX、gPTX以及溶解于40％(容量)的乙二醇溶液中的gPTX制成的gPTX-L和gPTX-IL的IC50进行评价。作为试验对象细胞，使用来自人的乳癌细胞的SK-BR-3。另外，计算了IT50。IT50是表示达到杀死100％细胞的药剂浓度的一半浓度的时间，可以通过相对于时间轴绘制细胞生存率而得到的生存曲线为基础容易地计算。将这些结果示于表4。
表4
药剂名 IC50(nM) IT50(h)
PTX 5.91 15.9
gPTX 46.0 18.7
gPTX-L 47.8 17.2
gPTX-IL 22.1 5.2
根据表4所示的结果，对于IC50而言，无论是gPTX，还是gPTX-L，关于它们的乳癌细胞的杀死效果，没有看到特别的差别。另一方面，对于gPTX-IL而言，显示与这些相比对乳癌细胞的杀死效果高。应予说明，PTX虽然显示最高的对乳癌细胞的杀死效果，但从向个体给予药剂这种观点考虑，无法向想要杀死的癌细胞积极送达药剂，因此即使显示优异的抗癌作用也很有可能向非目标部位送达药剂，所以必然会显现副作用，并不能解决现有的问题。
另外，对于IT50而言，PTX、gPTX以及gPTX-L的直至100％杀死细胞所需的时间没有看到差别。对于gPTX-IL而言，与这3者相比，显示其三分之一左右的数值。即，gPTX-IL与其他3者相比，显示直至杀死细胞所需的时间大幅缩短。认为这是由于gPTX-IL向乳癌细胞积极送达，且进入乳癌细胞内，发挥由PTX本身带来的高抗癌作用。因此，可明确gPTX-IL对乳癌细胞发挥优异的DDS效果。
试验例4：急性毒性试验
通过尾静脉注射每隔1小时的间隔向BALB/c小鼠(♀,5周龄)给药gPTX、gPTX-L、溶剂对照组(聚氧乙烯蓖麻油：乙醇：超纯水＝12：12：76；容量比)共5次(N＝3)。1次的给药以200μl/20g进行。gPTX的合计给药量为200mg/kg。给药中途和给药后进行观察。将结果示于图1。
在给药gPTX的组群中，出现第三次给药时几乎全部被杀死的结果，但在脂质体中内包有gPTX的gPTX-L中，可确认与对照组同程度地生存。根据以上结果，为了增强抗癌作用，可将在脂质体中包入gPTX的gPTX-L，与以往的gPTX的给药量相比更多地给药。
试验例5：细胞观察
使内包有FITC的脂质体(脂质组成与上述相同：以后，记为FITC-L。)和用与上述方法同样制成的结合了曲妥珠单抗的脂质体(脂质组成与上述相同：以后，记为FITC-IL。)作用于来自人类的乳癌细胞的SK-BR-3细胞，进行2小时的培育后，根据使用荧光显微镜的常法来观察细胞。将结果示于图2。
由图2可观察，在FITC-L中，看不到向细胞的积聚，与此相对，在FITC-IL中，不仅向细胞积聚，还进入细胞内部的样子。由以上可明确，结合了曲妥珠单抗的脂质体与在SK-BR-3细胞表面上表达的HER2结合，进而进入细胞内。
试验例6：gPTX内包脂质体的制备改变法(脂质体脂质组成的研 究)
称量13.2、10.6或8.8mg DPPC、2.1、3.7或4.6mg胆固醇以及2.1mgmPEG-DSPE，在50ml的茄形烧瓶内混合。将混合的脂质用3ml的有机溶剂(容量比：氯仿：甲醇＝9：1；容量比)溶解，通过热水浴式超声仪进行5分钟超声处理后，用旋转蒸发仪干燥后，真空干燥一晚，从而完全除去溶剂来制备脂质膜。
接着，使茄形烧瓶在60℃的温浴中浸渍5分钟后，加入1ml的CEP缓冲液(聚氧乙烯蓖麻油EL：乙醇：PBS(pH7.4)＝12：12：76；容量比)将脂质膜溶解，制备多片层囊泡(MLV)。通过对其进行5分钟的超声处理，从而制备层状小囊泡(SLV)。为了除去未包入的缓冲液和游离的脂质，进行超滤(Amicon Ultra100K membrane(Millipore公司制))。
向制备的脂质体加入1ml含有上述1mg/ml的gPTX溶液(溶剂：40％EG的PBS(pH7.4))，在60℃的热水中浸渍15分钟。为了除去未包入的药剂溶液而进行超滤(Amicon Ultra100K membrane(Millipore公司制))。进一步进行2次的以上操作，进行药剂的封入。封入后，进行PBS清洗，完全除去未包入的药剂溶液。
内包在得到的脂质体中的紫杉醇单糖苷的效率，用与上述试验例2同样的方法测定并计算被内包的药剂含量和粒径。将这些结果示于下述表5。
表5
如表5所示，在DPPC：Chol(胆固醇)的重量比为3：1、3：2以及3：3的全部情况中，内包率为60％以上，发挥非常高的效率。此外，DPPC：Chol的重量比为3：1和3：2时，即使内包gPTX，平均粒径也几乎没有变化。
另外，进行来自得到的内包gPTX的脂质体的gPTX的渗漏试验的结果，可明确DPPC：Chol的重量比为3：1的情况下，发挥最优异的gPTX的担载·保持效果(没有数据显示)。
试验例7：gPTX内包脂质体的制备改变法(加温时间的研究)
在试验例6所示的实验中，测定将DPPC：Chol的物质量比为3：1时的加温时间为5分钟、10分钟、30分钟以及60分钟时的封入效率。测定方法用与上述的试验例2同样的方法测定并计算。将这些结果示于下述表6。
表6
加温时间 5分钟 15分钟 30分钟 60分钟
EE 34.9 72.9 62.3 26.8
由表6所示的结果可明确，将加温时间设为15分钟时，能够最高效地使gPTX内包在脂质体内。
试验例8：使用了用改变法得到的gPTX内包脂质体的急性毒性试 验
使用在上述试验例7中得到的gPTX内包脂质体(gPTX-L)进行急性毒性试验。
具体而言，通过尾静脉注射每隔3小时的间隔向BALB/c小鼠(♀，6周龄)分别给药gPTX、gPTX-L、CEP buffer(聚氧乙烯蓖麻油：乙醇：超纯水＝12：12：76；容量比)以及PBS，共进行2次给药(N＝4)。1次给药以200μl/20g进行。gPTX的合计给药量换算成gPTX各自的总量为150及100mg/kg。进行给药中途和给药后的观察。将结果示于图3。
如图3所示，使总量成为150mg/kg而进行gPTX给药的群组中，在给药后1日确认3只死亡，在给药CEP buffer的群组中，给药后1日确认2只死亡。另一方面，使总量gPTX成为150mg/kg而进行gPTX-L给药的群组中，与PBS同样，在14天期间，生存率为100％。
接着，图4中测定上述各给药群中的体重变化。在给药gPTX的群组中，可确认体重显著减少，但在作为gPTX的总量为同量给药的gPTX-L的群组中，可确认与给药PBS的群相同的体重变化。由这些结果可明确，与gPTX相比，内包gPTX的脂质体显示优异的安全性。
试验例9：使用了用改变法得到的gPTX内包脂质体的细胞送达实 验
向内包上述gPTX的脂质体(gPTX-L)，加入溶解于470μl PBS的3mg/ml的Mal-PEG-DSPE，在50℃的热水中浸渍10分钟。
同时，制备与脂质体结合的抗体。向溶解在HEPES缓冲液(25mM的HEPES，140mM的NaCl，pH8.0)中的1.5mg的曲妥珠单抗溶液加入500nmol的2-亚氨基硫烷溶液，室温、遮光下反应1小时，向曲妥珠单抗导入SH基。将反应后溶液使用Sephadex G-25柱除去未反应物质，进行对PBS的缓冲液的交换。
接着，混合导入了SH基的曲妥珠单抗溶液和脂质体溶液，通过在4℃振荡一晚从而使曲妥珠单抗与脂质体结合。为了除去未反应的曲妥珠单抗而进行超滤(VIVASPIN2 300K membrane(Sartorius公司制))。由此，得到内包结合了抗体的gPTX的脂质体(gPTX-IL)。
另外，作为对照，在脂质体的制备中向脂质体溶液加入470μl的3mg/ml的mPEG-DSPE，在50℃的热水中浸透10分钟。其后，进行超滤(Amicon Ultra100K membrane(Millipore公司制))。
与上述试验例3同样地测定抗癌活性。使用的细胞是使用来自人类的乳癌细胞SK-BR-3和结肠腺癌HT-29。具体而言，以5000cells/well在96孔板上播种细胞，培育24小时。其后，以各种浓度加入PTX、gPTX、gPTX-L以及gPTX-IL进行培育。
72小时后，通过MTT比色法计算细胞的生存率。首先，根据生存率曲线求出杀死50％的细胞的浓度(IC50)。接着，根据生存率曲线进行杀死50％的细胞的时间(IT50)的计算。播种上述细胞后，以根据上述生存率曲线求得的成为IC100的浓度加入上述各种，培育1、2、6、12、24、48以及72小时后，进行培养基交换。加入药剂之后在72小时后与上述实验同样地进行MTT比色法，求得生存率，根据生存率计算IT50。将结果示于表7和表8。
表7
※IC50、IC100单位均为nM。
由表7所示的IC50和IC100的结果可明确，PTX、gPTX、gPTX-L以及gPTX-IL，均对乳癌细胞及结肠腺癌细胞发挥极其优异的抗癌活性。另外，从gPTX和PTX的比较结果可明确，虽然因在PTX结合糖链，抗癌活性衰减，但通过将其内包在脂质体内，(参照gPTX-L和gPTX-IL。)抗癌活性能够发挥与PTX同等的作用。其中，在gPTX-L与gPTX-IL之间，没有看到特别的抗癌活性的差别。即，给出了抗体的有无对抗癌活性不会带来特别改变的启示。
表8
由表8所示的和IT50的结果可明确，gPTX-IL与gPTX-L相比，其IT50的数值低。这表示用于杀死各种癌细胞的时间短，表明PTX能够更短时间高效地被送达癌细胞，由此能够更迅速地杀死癌细胞。
试验例10：具有抗体的脂质体的体内输送实验
接着，为了以体内实验验证结合了抗体的脂质体的向肿瘤组织的送达，制作结合有内包荧光色素的抗体的脂质体。具体而言，使10mg的人血清白蛋白(HSA)溶解于0.1M的碳酸钠缓冲液(pH9.3)1ml中，得到10mg/ml的HSA溶液。使10mg/ml的HSA溶液1ml溶解于1样品瓶的Cy5.5Monofunctional dye中。将其在室温下振荡30分钟后，使用Sephadex G-25柱，除去未反应物得到Cy5.5结合HSA(HSA-Cy5.5)。
根据上述试验例制备脂质膜，使其在60℃温浴中浸渍5分钟后，加入HSA-Cy5.5溶液，溶解脂质膜。使该溶液在60℃温浴中浸渍并且进行3分钟超声处理。为了除去未包入的HSA-Cy5.5而进行超滤(AmiconUltra100K membrane(Millipore公司制))。其后，使用试验例8所示的方法使抗体(Trastumab)与得到的脂质体结合。
通过皮下注射以3.0×106cells/mouse向ICR-nu/nu小鼠(♀，5周龄)注射HT-29细胞，给药内包结合了抗体的HSA-Cy5.5的脂质体。作为比较实验，还给药内包不结合抗体的HSA-Cy5.5的脂质体。在肿瘤体积达到大约100mm3的时刻，通过尾静脉注射给药HSA-Cy5.5内包脂质体(L)或者具有抗体的脂质体(IL)。在给药后1、2、3、4、5、6、24以及48小时后，利用CCD照相机(体内微距成像系统I.C.E.)拍摄Cy5.5的荧光(激发光650nm/荧光波长710nm)。将结果示于图5和图6。
由图5所示的结果可明确，无论有无抗体，脂质体都会根据EPR效果而在肿瘤处积聚。然而，结合抗体的脂质体更高效地向肿瘤组织积聚，而向肝脏的积聚少。
由图6所示的结果可明确，具有抗体的脂质体与不具有抗体的脂质体相比，始终大量向肿瘤组织积聚，另一方面，不具有抗体的脂质体始终向肝脏组织大量积聚。另外，不具有抗体的脂质体在给药后48小时内，与具有抗体的脂质体不同，没有看到向肿瘤组织积聚。
试验例11：内包gPTX且具有抗体的脂质体的体内抗癌活性实验
通过皮下注射以3.0×106cells/mouse向ICR-nu/nu小鼠(♀，5周龄)给药HT-29细胞。在肿瘤体积为50～200mm3左右的时刻，利用尾静脉注射每隔3小时的间隔进行2次给药上述gPTX、试验例7中制成的gPTX-L、试验例9中制成的gPTX-IL、曲妥珠单抗、试验例9中不内包gPTX且不结合抗体(曲妥珠单抗)而制成的脂质体(empty L)、试验例9中不内包gPTX且结合抗体(曲妥珠单抗)而制成的脂质体(empty IL)、CEP缓冲液以及PBS(N＝4)。1次给药以200μl/20g进行。gPTX的合计给药量为150mg/kg，曲妥珠单抗为200mg/kg。进行给药后的肿瘤体积变化的观察。将结果示于图中。肿瘤体积根据下述式(3)计算。
肿瘤体积＝(肿瘤短边2×肿瘤长边)/2     (3)
另外，还测定各给药群的体重变化及生存率。将结果示于图6～9。
由图6所示的结果可明确，gPTX-IL与gPTX同样地能够发挥显著优异的抑制肿瘤增殖的效果。另一方面，其它给药群几乎看不到肿瘤增殖抑制效果。
另外，由图7所示的结果可知，gPTX-IL在给药后虽然能看到体重的减少，但在其后恢复，结果，成为与其他给药群等同样的体重变化。
而且，CEP给药群在给药后3小时全部死亡，gPTX给药群中给药后3小时死亡2只，进而在1周后死亡1只。在图7所示的体重变化中，gPTX给药群的体重显著降低是由死亡的小鼠引起的。
这些肿瘤增殖效果能够从图10所示的照片中清楚看到。
由以上可明确，内包gPTX且结合了特异性识别Her2的单克隆抗体即曲妥珠单抗的脂质体，能够发挥显著抑制作为结肠腺癌的HT-29担癌小鼠的肿瘤组织中的增殖。另外，还明确了这样的脂质体通过给药没有显示体重减少，致死率低，所以发挥副作用极少这样的效果。由以上可明确，这种脂质体作为对癌细胞发挥极其优异的效果的脂质体制剂而有用。

Claims (15)

1.一种内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷且具有特异性识别癌细胞的抗体的脂质体的制造方法，包括如下工序：使包含聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的脂质体与在含有烷撑二醇的缓冲液或水中溶解了紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷而成的溶液接触的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，糖苷是选自葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、木糖苷、果糖苷、鼠李糖苷、阿糖胞苷、阿洛糖苷、阿卓糖苷、艾杜糖苷、N-乙酰氨基葡糖苷、N-乙酰氨基半乳糖苷、塔罗糖苷、葡萄糖醛酸苷、氨基葡糖苷、氨基半乳糖苷以及岩藻糖苷中的1种糖苷。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，聚氧乙烯酯衍生物为聚氧乙烯蓖麻油酯。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，脂质体分别以3：0.5～3的物质量比含有DPPC和胆固醇。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，接触时间为10～40分钟。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，癌细胞为乳癌细胞。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，抗体为与HER2蛋白质特异性结合的抗体。
8.一种脂质体制剂，其内包有紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶解液且具有特异性识别癌细胞的抗体。
9.根据权利要求8所述的脂质体制剂，其中，紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的溶解液是在含有聚氧乙烯酯衍生物、低级醇以及缓冲液或水的混合溶剂中溶解了紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷而成的溶解液。
10.根据权利要求8或9所述的脂质体制剂，其中，糖苷是选自葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、木糖苷、果糖苷、鼠李糖苷、阿糖胞苷、阿洛糖苷、阿卓糖苷、艾杜糖苷、N-乙酰氨基葡糖苷、N-乙酰氨基半乳糖苷、塔罗糖苷、葡萄糖醛酸苷、氨基葡糖苷、氨基半乳糖苷以及岩藻糖苷中的1种糖苷。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的脂质体制剂，其中，聚氧乙烯酯衍生物为聚氧乙烯蓖麻油酯。
12.根据权利要求8～11中任一项所述的脂质体制剂，其中，脂质体分别以3：0.5～3的重量比含有DPPC和胆固醇。
13.根据权利要求8～12中任一项所述的脂质体制剂，其中，相对于脂质体的总脂质1摩尔量的紫杉醇单糖苷摩尔量为1.0～15.0×10-2。
14.根据权利要求8～13中任一项所述的脂质体制剂，其中，癌细胞为乳癌细胞。
15.根据权利要求8～14中任一项所述的脂质体制剂，其中，抗体是与HER2蛋白质特异性结合的抗体。
CN201380015012.5A 2012-03-22 2013-03-22 内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体的制造方法 Expired - Fee Related CN104203251B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-065743 2012-03-22
JP2012065743 2012-03-22
PCT/JP2013/058242 WO2013141346A1 (ja) 2012-03-22 2013-03-22 パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドタキセルモノグリコシドを内包するリポソームの製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104203251A true CN104203251A (zh) 2014-12-10
CN104203251B CN104203251B (zh) 2017-05-31

Family

ID=49222795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380015012.5A Expired - Fee Related CN104203251B (zh) 2012-03-22 2013-03-22 内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体的制造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10682330B2 (zh)
EP (1) EP2829273B1 (zh)
JP (1) JP5490326B2 (zh)
CN (1) CN104203251B (zh)
WO (1) WO2013141346A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108136031A (zh) * 2015-10-07 2018-06-08 盐水港精糖株式会社 包含紫杉烷化合物的脂质体
CN108883069A (zh) * 2016-01-04 2018-11-23 中央研究院 基于酯化/皂化的用于微脂体负载的方法
CN110981837A (zh) * 2019-12-03 2020-04-10 沈阳药科大学 紫杉醇弱酸性衍生物主动载药脂质体及其制备与应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10864161B2 (en) 2017-10-13 2020-12-15 American University Of Sharjah Systems and methods for targeted breast cancer therapies
CN114588103B (zh) * 2022-03-31 2023-04-11 山东大学 负载紫杉醇脂质体的泊洛沙姆温敏凝胶及制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999022759A1 (en) * 1997-10-31 1999-05-14 Walter Reed Army Institute Of Research Method of inhibiting side effects of pharmaceutical compositions containing amphiphilic vehicles or drug carrier molecules

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1209059A (zh) * 1995-12-21 1999-02-24 基因实验室技术有限公司 紫杉烷类组合物及方法
US5767297A (en) 1997-02-05 1998-06-16 Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. Taxoid derivative and method of producing thereof
JP3816621B2 (ja) * 1996-02-20 2006-08-30 塩水港精糖株式会社 タキソイド誘導体およびその製造法
WO1999018113A1 (fr) * 1997-10-08 1999-04-15 Bio Research Corporation Of Yokohama Derives taxoides et leur procede de production
US7361683B2 (en) * 2004-11-24 2008-04-22 Yung Shin Pharm. Ind., Co., Ltd Paclitaxel aqueous injection solution and methods for preparing the same
JP2006265152A (ja) * 2005-03-23 2006-10-05 Beacle Inc 癌治療用薬剤及びその作製方法
US20080206139A1 (en) * 2006-11-03 2008-08-28 The Penn State Research Foundation Delivery system for diagnostic and therapeutic agents
EP2090305A4 (en) 2006-12-08 2012-12-26 Katayama Chemical Ind Co Ltd LIPOSOME ENCAPSULATING HIGH-CONCENTRATION <O> AMINE </ O> COMPLEX, AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
JP2009132629A (ja) 2007-11-28 2009-06-18 Terumo Corp リポソーム製剤の製造方法
CN102552123A (zh) * 2011-12-31 2012-07-11 江苏奥赛康药业股份有限公司 一种供注射用紫杉醇组合物及其制备方法
JP6171227B2 (ja) * 2012-02-23 2017-08-02 株式会社リュージュサイエンス 陽イオン性多糖類共重合体の抗癌剤デリバリーシステム

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999022759A1 (en) * 1997-10-31 1999-05-14 Walter Reed Army Institute Of Research Method of inhibiting side effects of pharmaceutical compositions containing amphiphilic vehicles or drug carrier molecules

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASAHARU MURAKAMI 等: "Encapsulation of glycosylated paclitaxel into liposome targeting Her2", 《JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108136031A (zh) * 2015-10-07 2018-06-08 盐水港精糖株式会社 包含紫杉烷化合物的脂质体
CN108136031B (zh) * 2015-10-07 2022-02-18 盐水港精糖株式会社 包含紫杉烷化合物的脂质体
CN108883069A (zh) * 2016-01-04 2018-11-23 中央研究院 基于酯化/皂化的用于微脂体负载的方法
CN108883069B (zh) * 2016-01-04 2021-07-20 中央研究院 基于酯化/皂化的用于微脂体负载的方法
CN110981837A (zh) * 2019-12-03 2020-04-10 沈阳药科大学 紫杉醇弱酸性衍生物主动载药脂质体及其制备与应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013141346A1 (ja) 2013-09-26
EP2829273A1 (en) 2015-01-28
US20160256566A2 (en) 2016-09-08
EP2829273B1 (en) 2018-08-29
US10682330B2 (en) 2020-06-16
CN104203251B (zh) 2017-05-31
EP2829273A4 (en) 2015-11-04
JP5490326B2 (ja) 2014-05-14
US20150056270A1 (en) 2015-02-26
JPWO2013141346A1 (ja) 2015-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jin et al. Cancer-cell-biomimetic Upconversion nanoparticles combining chemo-photodynamic therapy and CD73 blockade for metastatic triple-negative breast cancer
Wang et al. Liposomes for tumor targeted therapy: a review
ElBayoumi et al. Tumor-targeted nanomedicines: enhanced antitumor efficacy in vivo of doxorubicin-loaded, long-circulating liposomes modified with cancer-specific monoclonal antibody
Sharma et al. Liposomes as targeted drug delivery systems in the treatment of breast cancer
Vodovozova et al. Antitumour activity of cytotoxic liposomes equipped with selectin ligand SiaLeX, in a mouse mammary adenocarcinoma model
Brown et al. The treatment of breast cancer using liposome technology
Hirai et al. Novel and simple loading procedure of cisplatin into liposomes and targeting tumor endothelial cells
Ding et al. Designing aptamer-gold nanoparticle-loaded pH-sensitive liposomes encapsulate morin for treating cancer
Moase et al. Anti-MUC-1 immunoliposomal doxorubicin in the treatment of murine models of metastatic breast cancer
Drummond et al. Liposome targeting to tumors using vitamin and growth factor receptors
Elbayoumi et al. Antinucleosome antibody-modified liposomes and lipid-core micelles for tumor-targeted delivery of therapeutic and diagnostic agents
Waelti et al. Targeting her-2/neu with antirat Neu virosomes for cancer therapy
CN104203251B (zh) 内包紫杉醇单糖苷和/或紫杉萜单糖苷的脂质体的制造方法
CN100577210C (zh) 利用免疫应答系统的药物传递系统
CN106137967A (zh) 靶向脑胶质瘤的双重修饰脂质体给药系统的制备和应用
Rampado et al. Nanovectors design for theranostic applications in colorectal cancer
Mori et al. Characterization of organ-specific immunoliposomes for delivery of 3′, 5′-O-dipalmitoyl-5-fluoro-2′-deoxyuridine in a mouse lung-metastasis model
Keihan Shokooh et al. Bio-inspired and smart nanoparticles for triple negative breast cancer microenvironment
Matsumoto et al. A liposomal gemcitabine, FF-10832, improves plasma stability, tumor targeting, and antitumor efficacy of gemcitabine in pancreatic cancer xenograft models
Huang et al. A novel hydrolysis-resistant lipophilic folate derivative enables stable delivery of targeted liposomes in vivo
Li et al. Co-delivery of F7 and crizotinib by thermosensitive liposome for breast cancer treatment
JP6495466B2 (ja) タキサン化合物を内包するリポソーム
Geng et al. Radiation-guided drug delivery to tumor blood vessels results in improved tumor growth delay
Asakura et al. Chemotherapeutic effect of CD147 antibody-labeled micelles encapsulating doxorubicin conjugate targeting CD147-expressing carcinoma cells
Qi et al. Precise engineering of cetuximab encapsulated gadollium nanoassemblies: in vitro ultrasound diagnosis and in vivo thyroid cancer therapy

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20170216

Address after: Tokyo, Japan

Applicant after: ENSUIKO SUGAR REFINING CO.,LTD.

Applicant after: HAMADA HIROKI

Applicant after: SHIMIZU YOSHIO

Applicant after: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION OKAYAMA University

Address before: Tokyo, Japan

Applicant before: ENSUIKO SUGAR REFINING CO.,LTD.

Applicant before: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION OKAYAMA University

Applicant before: HAMADA HIROKI

Applicant before: Fujiwara Ichiro

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170531