CN108136031B - 包含紫杉烷化合物的脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明解决了提供用于使水溶性差的药理活性物质高效地包含在脂质体中的方法的问题。提供了组合物，其包含具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和水溶性差的药理活性物质，其中以(3～8)∶(2～7)∶(0.1～3)∶(0.001～5)的摩尔比包含所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质。

Description

包含紫杉烷化合物的脂质体
技术领域
本发明涉及包封紫杉烷化合物的脂质体。
背景技术
紫杉烷化合物(例如紫杉醇或多西他赛)具有优异的抗癌活性；另一方面，紫杉烷化合物具有包括水溶解度差在内的缺点。因此，紫杉烷化合物通过溶解在包含表面活性剂(例如聚氧乙烯蓖麻油(クレモホ一ル))的乙醇中来向癌症患者施用。
然而，此类表面活性剂对人的显著副作用的新问题最近引起关注。鉴于这个问题，已经尝试开发包封紫杉烷化合物的脂质体以及该脂质体作为DDS制剂的用途。
特别地，如PTL1中公开的，已经知道了利用溶解度梯度原理通过远程加载法将紫杉烷化合物包封在脂质体中的方法。
另一个已知方法是NPL1中公开的使用被动加载法的方法，其包括将紫杉烷化合物预先包含在用于脂质体生产的脂质双层膜中，以及使用如上所述的表面活性剂形成脂质体。
引文列表
专利文献
PTL 1：WO2013/141346
非专利文献
NPL 1：Tao等，Int.J.Pharm；338(2007)317-326
发明内容
技术问题
在PTL1的方法中，将水溶性差的药理活性物质包封在脂质体中的效率非常低。另外，关于在PTL1中公开的包含水溶性差的药理活性物质的脂质双层膜，本发明人证实在水性溶剂中该脂质双层膜与表面活性剂(例如聚氧乙烯蓖麻油)的接触甚至不形成脂质体。本发明的目的是提供用于高效率地将水溶性差的药理活性物质包封在脂质体中的方法。
问题的解决方案
作为解决上述问题的广泛研究的结果，本发明人发现通过使用如下详述的包含特定组分的组合物，可高效地将水溶性差的药理活性物质包封在脂质体中。
本发明是基于上述发现完成的，并且广泛包括以下实施方案。
项目1
组合物，其包含具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和水溶性差的药理活性物质，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比分别为3～8∶2～7∶0.1～3∶0.001～5。
项目2
根据项目1所述的组合物，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质是选自以下的至少一个成员：氢化大豆卵磷脂(HPSC)、卵黄磷脂(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。
项目3
根据项目1或2所述的组合物，其中所述胆固醇化合物是选自以下的至少一个成员：胆固醇、胆固烷醇、7-脱氢胆固醇和植物固醇。
项目4
根据项目1至3中任一项所述的组合物，其中所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质是选自以下的至少一个成员：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
项目5
根据项目1至4中任一项所述的组合物，其中所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质、所述胆固醇化合物和所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质中的任一种是被聚亚烷基二醇修饰的脂质。
项目6
根据项目1至5中任一项所述的组合物，其中所述水溶性差的药理活性物质是选自以下的至少一个成员：紫杉烷化合物、大环内酯化合物、长春花生物碱化合物、喹啉生物碱化合物和依托泊苷化合物。
项目7
根据项目6所述的组合物，其中所述紫杉烷化合物是选自以下的至少一个成员：紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、及其糖苷。
项目8
根据项目6所述的组合物，其中所述大环内酯化合物是选自以下的至少一个成员：巴佛洛霉素、刀豆霉素、阿奇霉素和克拉霉素。
项目9
根据项目1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于形成脂质膜。
项目10
脂质膜，其包含具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和水溶性差的药理活性物质，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比分别为3～8∶2～7∶0.1～3∶0.001～5。
项目11
用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法，其包括在水性溶剂中使项目10所述的脂质膜与聚氧乙烯酯化合物接触的步骤。
项目12
根据项目11所述的方法，其中还包含低级醇作为水性溶剂。
项目13
根据项目11或12所述的方法，其中还包含缓冲液作为水性溶剂。
项目14
根据项目11至13项中任一项所述的方法，其还包括加载识别癌细胞之抗体的步骤。
项目15
脂质体制剂，其包含包封以下的脂质体：具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质、水溶性差的药理活性物质和聚氧乙烯酯化合物，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比分别为3～8∶2～7∶0.1～3∶0.001～5。
I.组合物
组合物(I)涵盖根据以下项目(I-1)至(I-9)中描述的实施方案的发明。
项目(I-1)
组合物，其包含具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和水溶性差的药理活性物质，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比分别为3～8∶2～7∶0.1～3∶0.001～5。
项目(I-2)
根据项目(I-1)所述的组合物，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质是选自以下的至少一个成员：氢化大豆卵磷脂(HPSC)、卵黄磷脂(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。
项目(I-3)
根据项目(I-1)或(I-2)所述的组合物，其中所述胆固醇化合物是选自以下的至少一个成员：胆固醇、胆固烷醇、7-脱氢胆固醇和植物固醇。
项目(I-4)
根据项目(I-1)至(I-3)中任一项所述的组合物，其中所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质是选自以下的至少一个成员：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
项目(I-5)
根据项目(I-1)至(I-4)中任一项所述的组合物，其中所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质、所述胆固醇化合物和所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质中的任一种被聚亚烷基二醇修饰。
项目(I-6)
根据项目(I-1)至(I-4)中任一项所述的组合物，其中所述水溶性差的药理活性物质是选自以下的至少一个成员：紫杉烷化合物、大环内酯化合物、长春花生物碱化合物、喹啉生物碱化合物和依托泊苷化合物。
项目(I-7)
根据项目(I-6)所述的组合物，其中所述紫杉烷化合物是选自以下的至少一个成员：紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、及其糖苷。
项目(I-8)
根据项目(I-6)所述的组合物，其中所述大环内酯化合物是选自以下的至少一个成员：巴佛洛霉素、刀豆霉素、阿奇霉素和克拉霉素。
项目(I-9)
根据项目(I-1)至(I-8)中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于形成脂质膜。
II.脂质膜
脂质膜(II)涵盖根据在以下项目(II-1)中描述的实施方案的发明。
项目(II-1)
脂质膜，其包含具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和水溶性差的药理活性物质，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比分别为3～8∶2～7∶0.1～3∶0.001～5。
III.用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法
用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法(III)涵盖根据在以下项目(III-1)至(III-4)中描述的实施方案的发明。
项目(III-1)
一种用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法，其包括在水性溶剂中使脂质膜(II)与聚氧乙烯酯化合物接触的步骤。
项目(III-2)
根据项目(III-1)所述的方法，其中还包含低级醇作为水性溶剂。
项目(III-3)
根据项目(III-1)或(III-2)所述的方法，其中还包含缓冲液作为水性溶剂。
项目(III-4)
根据项目(III-1)至(III-3)中任一项所述的方法，其中所述方法还包括加载识别癌细胞之抗体的步骤。
IV.脂质体制剂
脂质体制剂(1V)涵盖根据在以下项目(IV-1)至(IV-6)中描述的实施方案的发明。
项目(IV-1)
脂质体制剂，其包含包封以下的脂质体：具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质、水溶性差的药理活性物质和聚氧乙烯酯化合物，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比分别为3～8∶2～7∶0.1～3∶0.001～5。
项目(IV-2)
根据项目(IV-1)所述的脂质体制剂，其中在所述脂质体中还包含低级醇作为水性溶剂。
项目(IV-3)
根据项目(IV-1)和(IV-2)所述的脂质体制剂，其中在所述脂质体中还包含缓冲液作为水性溶剂。
项目(IV-4)
根据项目(IV-1)至第(IV-3)中任一项所述的脂质体制剂，其中所述脂质体还携带识别癌细胞之抗体。
项目(IV-5)
根据项目(IV-1)至(IV-4)中任一项所述的脂质体制剂，其中所述脂质体是通过根据用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法(III)的方法生产的脂质体。
项目(IV-6)
根据项目(IV-1)至(IV-5)中任一项所述的脂质体制剂，其用于治疗或预防癌症。
本发明的有益效果
当生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体时，优选地使用本发明的组合物。
本发明的脂质体制剂表现出减轻副作用的效果。
附图说明
图1为示出了关于PTX-L(A)和gPTX-L(B)的包封效率(EE：％)和加载效率(LE：％)的测试结果的图(N＝4，*表示P＜0.05)。横轴表示添加至脂质体的PTX和gPTX相对于总体的摩尔比值(x)。
图2为示出了关于DTX-L的包封效率(EE：％)和加载效率(LE：％)的测试结果的图(N＝4，*表示P＜0.05)。横轴表示添加至脂质体的DTX相对于总体的摩尔比值(x)。
图3为示出了关于PTX-L(A)和gPTX-L(B)的物理性质评估(粒度：nm，多分散指数，以及ζ电势：mV)的测试结果的图(N＝4)。横轴表示添加至脂质体的PTX和gPTX相对于总体的摩尔比值(x)。
图4为示出了关于DTX-L的物理性质评价(粒度：nm，多分散指数，以及ζ电势：mV)的测试结果的图(N＝3)。横轴表示添加至脂质体的DTX相对于总体的摩尔比值(x)。
图5为示出了关于PTX-L(A)和gPTX-L(B)的保留率(％)和粒度(mm)的测试结果的图(N＝3)。横轴表示添加至脂质体的PTX和gPTX相对于总体的摩尔比值(x)。
图6为示出了关于DTX-L的保留率(％)和粒度(mm)的测试结果的图(N＝3)。横轴表示添加至脂质体的DTX相对于总体的摩尔比值(x)。
图7为示出了关于PTX-L(A)和gPTX-L(B)的抗癌活性评价(IC50值：nM)的测试结果的图(N＝5，*表示P＜0.05)。
图8为示出了关于DTX-L的抗癌活性评价(IC50值：nM)的测试结果的图。
图9为示出了关于BafA1-L的包封效率(EE：％)、加载效率(LE：％)和物理性质评价(粒度：nm，多分散指数，以及ζ电势：mV)的测试结果的图(N＝3，*表示P＜0.05)。横轴表示添加至脂质体的巴佛洛霉素相对于总体的摩尔比值(x)。
图10为示出了关于BafA1-L的抗癌活性评价(IC50值：nM)的测试结果的图(N＝5，*表示P＜0.05)。
图11示出了比较测试例的结果的摄影图像。图像A示出了基于本发明的脂质膜产生的脂质体，以及图像B示出了基于具有NPL1中公开的配方的脂质膜生产的脂质体。
图12为卡普兰-迈耶图，示出了本发明实施例3中描述的使用多西他赛包封脂质体的毒性测试的结果。纵轴表示存活率(％)。横轴表示施用后的天数。
具体实施方式
在本说明书中，术语“脂质”意指单纯脂质、复合脂质、衍生脂质等，但并不特别地限于这些脂质。另外，“脂质”包括被聚合物等修饰的脂质，例如通过聚亚烷基二醇修饰的那些。
(I)组合物
本发明的组合物(I)是这样的组合物，其包含具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和水溶性差的药理活性物质，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比分别为3～8∶2～7∶0.1～3∶0.001～5。
本发明的组合物(I)更优选地是这样的组合物，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比为4～8∶2～6∶0.2～2∶0.01～4。
本发明的组合物(I)更优选地是这样的组合物，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比为5～7∶3～5∶0.3～1.5∶0.05～3。
本发明的组合物(I)最优选地是这样的组合物，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比为5～6∶4～5∶0.5～1∶0.1～2。
具有磷脂酰胆碱基团的脂质没有特别地限制。实例包括磷脂，更特别是HSPC、ECP、DMPC、DPPC、DOPC等。在这些中，氢化大豆卵磷脂(HSPC)是优选的。这些具有磷脂酰胆碱基团的脂质可单独使用或以两种或更多种的适当组合使用。
胆固醇化合物没有特别地限制。实例包括胆固醇、胆固烷醇、7-脱氢胆固醇和植物固醇等。在这些中，胆固醇是优选的。这些胆固醇化合物可单独使用或以两种或更多种的适当组合使用。
具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质没有特别地限制。实例包括磷脂，更特别是DSPE、DPPE、DMPE、DOPE等。在这些中，DSPE是优选的。这些具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质可单独使用或以两种或更多种的适当组合使用。
具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物和具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质中的任一种可被聚亚烷基二醇修饰。
聚亚烷基二醇没有特别地限制。聚亚烷基二醇的实例包括聚乙二醇、聚丙二醇等。在这些中，聚乙二醇是优选的。
聚亚烷基二醇的分子量没有特别地限制。分子量为例如500至3000数均分子量。分子量为例如500至10000重均分子量。
通过聚亚烷基二醇的修饰的形成没有特别地限制。修饰形成的实例包括化学键。特别地，具有磷脂酰胆碱基团的脂质和具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质优选地通过聚亚烷基二醇的化学键修饰，然而，聚亚烷基二醇并不是与其亲脂基团，而是与亲水基团(醇衍生基团)化学键合。具体实例包括通过聚乙二醇修饰的磷脂，例如mPEG-DSPE。
水溶性差的药理活性物质没有特别地限制。例如，可以用具有显著低水溶解度的药理活性物质。在0℃时水溶解度为10000mg/L或更低，优选地1000mg/L或更低。显然，溶解度的下限为0或更高。这样的水溶性差的药理活性物质的具体实例包括紫杉烷化合物、大环内酯化合物、长春花生物碱化合物、喹啉生物碱化合物和依托泊苷化合物等。
紫杉烷化合物没有特别地限制。紫杉烷化合物的实例包括紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、及其糖苷。
糖苷没有特别地限制。可使用已知的糖苷。更特别地，可使用通过单糖(例如葡萄糖或半乳糖)修饰的糖苷。在这些中，葡萄糖苷是优选的。另外，在修饰糖苷的单糖的形状方面，环状糖(例如吡喃糖或呋喃糖)是优选的。优选吡喃葡萄糖苷作为本发明的糖苷。
当在其苷元(aglycone)中具有合适的基团时，糖苷可通过糖修饰。例如，其中在紫杉醇和吡喃葡萄糖苷之间存在氧乙酰基的7-葡糖基氧乙酰基紫杉醇是最优选的。
大环内酯化合物同样没有特别地限制。大环内酯化合物的实例包括巴佛洛霉素、刀豆霉素、阿奇霉素和克拉霉素等。
另外，喹啉生物碱化合物没有特别地限制。喹啉生物碱化合物的实例包括喜树碱、依立替康等。
另外，长春花生物碱化合物没有特别地限制。长春花生物碱化合物的实例包括长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨等。
另外，依托泊苷化合物没有特别地限制。依托泊苷化合物的实例包括依托泊苷、替尼泊苷等。
本发明的组合物(I)可溶解在已知的溶剂中。溶剂没有特别地限制。例如，溶剂可由有机溶剂(例如氯仿)制备，并且，如果必要，通过将其与醇(例如甲醇或乙醇)混合来制备。
本发明的组合物(I)可优选地用于形成以下所述的脂质膜(II)。
(II)脂质膜
本发明的脂质膜(II)可具有与上述组合物(I)相同的组成。更特别地，可涵盖具有与上述组合物(I)相同组成的实施方案作为本发明脂质膜的一个实施方案。
更特别地，本发明的脂质膜(II)是这样的脂质膜，其包含具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和水溶性差的药理活性物质，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比分别为3～8∶2～7∶0.1～3∶0.001～5。
例如，如上所述，当组合物(I)溶解在已知的溶剂中时，可通过将溶液蒸发至干来得到脂质膜(II)。
蒸发至干的方法没有特别地限制；例如，可使用利用蒸发器等的方法。蒸发至干的条件没有特别地限制，并且可设置在其中可形成脂质多层膜(例如脂质双层膜)的范围之内。
由此得到的脂质膜(II)可在以下用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法中优选地用作原料。
III.用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法
本发明的用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法(III)包括在水性溶剂中使上述的脂质膜(II)与聚氧乙烯酯化合物接触的步骤。
在本说明书中的术语“包封”没有特别地限制。包封的实例包括其中水溶性差的药理活性物质完全包封在脂质体中的实施方案，以及其中水溶性差的药理活性物质分子的一部分穿透组成脂质体的脂质多层膜的实施方案。
在本说明书中的术语“接触”没有特别地限制。接触状态的实例包括脂质膜(II)与包含聚氧乙烯酯化合物的水性溶剂混合的实施方案。
在本说明书中的术语“水性溶剂”没有特别地限制。水性溶剂的实例包括至少包含水的溶剂的实施方案。实例还包括包含以下缓冲液和/或低级醇的实施方案。
聚氧乙烯酯化合物没有特别地限制。实例包括聚氧乙烯烷基醚硫酸钠、聚氧乙烯烷基醚磷酸盐、聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸盐、聚(氧乙烯/氧丙烯)甲基聚硅氧烷共聚物、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯硬脂基醚、聚氧乙烯硬脂酸酰胺、聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯聚氧、聚氧乙烯蓖麻油酯等。
在这些中，聚氧乙烯蓖麻油酯是优选的，并且聚氧亚烷基(C24)蓖麻油脂肪酸酯(クレモホール(登録商標)EL，
Figure BDA0001619333990000111
EL)是更优选的。
通过使上述的脂质膜(II)与聚氧乙烯酯化合物接触，并随后对通过接触得到的物质进行已知的脂质体形成处理，可产生包封水溶性差的药理活性物质的脂质体。
脂质体形成处理的方法没有特别地限制。例如，可使用薄膜水合法、超声波处理法、挤出机处理法等。另外，在进行脂质体形成处理之后，可使用膜滤器进行超滤。
上述的水性溶剂的实施方案也可以是除了水之外还包含低级醇的溶剂。低级醇没有特别地限制。实例包括C1-4醇。
上述的水性溶剂的实施方案还可以是除了水和/或低级醇之外还包含缓冲液的溶剂。缓冲液的实例没有特别地限制，并且包括PBS、MES、ADA、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES等。在这些中，PBS是优选的。
上述水性溶剂中聚氧乙烯酯化合物的量没有特别地限制。通常来说，每100体积份的溶剂中，量为10至30体积份，优选地15至25体积份，更优选地17至23体积份，最优选地18至22体积份。
“体积份”是在大气压和室温(约15℃至40℃)的环境下测量的值。
通过本发明的用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法(III)得到的脂质体的粒度的测量值没有特别地限制。通常来说，粒度为约200nm或更小。
另外，通过本发明的用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法(III)得到的脂质体ζ电势的测量值没有特别地限制。通常来说，脂质体可以是约-10mV的阴离子脂质体。
本发明的用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法(III)的实施方案可以是还包括以下步骤的方法：向通过以上方法形成的脂质体加载识别癌细胞之抗体。更特别地，通过本发明的生产方法生产的包封水溶性差的药理活性物质的脂质体可以是携带识别癌细胞之抗体的脂质体。
识别癌细胞之抗体没有特别地限制。抗体的实例包括免疫球蛋白、抗体片段(例如Fab)等。在这些抗体中，免疫球蛋白和IgG是优选的。
用于向脂质体加载识别癌细胞之抗体的方法没有特别地限制。加载可以通过使用接头的化学修饰进行。
癌细胞没有特别地限制。癌细胞的实例包括肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、子宫内膜癌细胞、前列腺癌细胞、头颈癌细胞(包括口腔癌细胞、咽癌细胞、喉癌细胞、鼻或鼻窦癌细胞、唾液腺癌细胞、甲状腺癌细胞)等。
在这些中，基于紫杉醇的临床应用知识，非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞等是优选的。
上述识别癌细胞之抗体的实例包括特异性识别存在于癌细胞的表面层上的生物分子的抗体，所述生物分子例如蛋白质(例如形成CD蛋白群的CD蛋白，例如CD44和CD133；生长因子或激素的受体；以及具有跨膜结构域或膜结合结构域的蛋白质)、肽、糖链、脂质等。抗体没有特别地限制，并且每种癌细胞的表面层上表达的任何已知抗体均可适当地选择。
识别乳腺癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从乳腺癌患者中提取的乳腺癌细胞，更特别是来源于乳腺癌组织的细胞，例如Hs274.T细胞、Hs280.T细胞、Hs281.T细胞、Hs343.T细胞、Hs362.T细胞、Hs739.T细胞、Hs741.T细胞、Hs742.T细胞、Hs190.T细胞、Hs319.T细胞、Hs329.T细胞、Hs344.T细胞、Hs350.T细胞、Hs371.T细胞、Hs748.T细胞、Hs841.T细胞、Hs849.T细胞、Hs851.T细胞、Hs861.T细胞、Hs905.T细胞、Hs479.T细胞、Hs540.T细胞、Hs566(B).T细胞、Hs605.T细胞、Hs606细胞、BT-20细胞、UACC-812细胞、HCC1954细胞、Hs574.T细胞、BT-483细胞、BT-549细胞、DU4475细胞、Hs578T细胞、BT-474细胞、UACC-893细胞、HCC38细胞、HCC70细胞、HCC202细胞、HCC1143细胞、HCC1187细胞、HCC1395细胞、HCC1419细胞、HCC1500细胞、HCC1599细胞、HCC1937细胞、HCC2157细胞、HCC2218细胞、HCC1569细胞、MB157细胞、SK-BR3细胞、MDA-MB-330细胞、MDA-MB-453细胞、MDA-MB-157细胞、MDA-MB-134细胞、T-47D细胞、ZR-75细胞和MCF-7细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体(抗ErbB2抗体)、抗CEA抗体等。
识别肺癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从肺癌患者中提取的肺癌细胞，更特别是来源于肺癌组织的细胞，例如Hs229.T细胞、NCI-H2066细胞、NCI-H2286细胞、NCI-H1703细胞、Hs573.T细胞、A549细胞、A427细胞、N417细胞、NCI-H596细胞、SW1573细胞、NCI-H835U细胞、MC11细胞、NCI-H727细胞、NCI-H720细胞、NCI-H810细胞、NCI-H292细胞、NCI-H2126细胞、H69细胞、NCI-H1688细胞、NCI-H1417细胞、NCI-H1672细胞、NCI-H1836细胞、DMS79细胞、DMS53细胞、DMS114细胞、SW1271细胞、NCI-H2227细胞、NCI-H1963细胞、SHP-77细胞、H69细胞、H69AR细胞、NCI-H2170细胞、NCI-H520细胞和SW900细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗CEA抗体等。
识别非小细胞肺癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从非小细胞肺癌患者中提取的非小细胞肺癌细胞，更特别是来源于非小细胞肺癌组织的细胞，例如NCI-H23细胞、NCI-H522细胞、NCI-H1435细胞、NCI-H1563细胞、NCI-H1651细胞、NCI-H1734细胞、NCI-H1793细胞、NCI-H1838细胞、NCI-H1975细胞、NCI-H2073细胞、NCI-H2085细胞、NCI-H2228细胞、NCI-H2342细胞、NCI-H2347细胞、NCI-H2135细胞、NCI-H2172细胞和NCI-H2444细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体、抗EGFR抗体等。
识别食管癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从食管癌患者中提取的食管癌细胞，更特别是来源于食管癌组织的细胞，例如SGF-3细胞、EC-YO细胞、TE-1细胞、TE-2细胞、TE-3细胞、TE-4细胞、TE-5细胞、TE-6细胞、TE-7细胞、TE-8细胞、TE-9细胞、TE-10细胞、TE-11细胞、TE-12细胞、TE-13细胞、TE-14细胞和TE-15细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体、抗EGFR抗体等。
识别胃癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从胃癌患者中提取的胃癌细胞，更特别是来源于胃癌组织的细胞，例如AZ521细胞、AGS细胞、SNU-1细胞、SNU-5细胞、SNU-16细胞、NCI-N87细胞、Hs746T细胞和KATO III细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗CEA抗体、抗SLX抗体等。
识别肝癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从肺癌患者中提取的肝癌细胞，更特别是来源于肝癌组织的细胞，例如HepG2细胞、Huh-7细胞、C3A细胞、SNU-398细胞、SNU-449细胞、SNU-182细胞、SNU-475细胞、Hep3B2.1-7细胞、PLHC-1细胞、SNU-387细胞、SNU-423细胞和SK-HEP-1细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体等。
识别胰腺癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从胰腺癌患者中提取的胰腺癌细胞，更特别是来源于胰腺癌组织的细胞，例如MIAPaCa-2细胞、BxPC-3细胞、HPAF-II细胞、HPAC细胞、Panc03.27细胞、Panc08.13细胞、Panc02.03细胞、Panc02.13细胞、Panc04.03细胞、Panc05.04细胞、Capan-2细胞、CFPAC-1细胞、PL45细胞、Panc10.05细胞、PANC-1细胞、AsPC-1细胞、Capan-1细胞、SW1990细胞、Hs766T细胞和SU.86.86细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体、抗CEA抗体、抗SLX抗体等。
识别结肠癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从结肠癌患者中提取的结肠癌细胞，更特别是来源于结肠癌组织的细胞，例如WiDr细胞、Caco-2细胞、NCI-H548细胞、Hs255.T细胞、TAC-1细胞、COLO320DM细胞、COLO320HSR细胞、DLD-1细胞、HCT-15细胞、SW480细胞、SW403细胞、SW48细胞、SW1116细胞、SW948细胞、SW1417细胞、LS123细胞、LS180细胞、LS174T细胞、C2BBe1细胞、Hs257.T细胞、Hs587.Int细胞、HT-29细胞、HCT-8细胞、Hs675.T细胞、HCT116细胞、ATRFLOX细胞、Hs698.T细胞、SW626细胞、SNU-C1细胞、COLO205细胞、COLO201细胞、SW620细胞、LoVo细胞、SK-CO-1细胞和T84细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗CEA抗体等。
识别卵巢癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从卵巢癌患者中提取的卵巢癌细胞，更特别是来源于卵巢癌组织的细胞，例如PA-1细胞、Caov-3细胞、TOV-21G细胞、TOV-112D细胞、Hs38.T细胞、Hs571.T细胞、ES-2细胞、TE84.T细胞、NIH：OVCAR-3细胞、SK-OV-3细胞、Caov-4细胞和OV-90细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体等。
识别宫颈癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从宫颈癌患者中提取的宫颈癌细胞，更特别是来源于宫颈癌组织的细胞，例如HeLa细胞、HeLa229细胞、HeLaS3细胞、H1HeLa细胞、Hs588.T细胞、GH329细胞、GH354细胞、HeLaNR1细胞、C-4I细胞、C-4II细胞、DoTc24510细胞、C-33A细胞、SW756细胞、SiHa细胞、HT-3细胞、MS751细胞、CaSki细胞和ME-180细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体等。
识别子宫内膜癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从子宫内膜癌患者中提取的子宫内膜癌细胞，更特别是来源于子宫内膜癌组织的细胞，例如HHUA细胞、KLE细胞、HEC-1-A细胞、HEC-1-B细胞、HEC-6细胞、HEC-50细胞、HEC-59细胞、HEC-108细胞、HEC-116细胞、RL95-2细胞、SK-UT-1细胞、SK-UT-1B细胞、MES-SA细胞、MES-SA/Dx5细胞、MES-SA/MX2细胞、AN3CA细胞、SNG-P细胞和SNG-M细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体、抗CEA抗体等。
识别前列腺癌细胞之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从前列腺癌患者中提取的前列腺癌细胞，更特别是来源于前列腺癌组织的细胞，例如LNCaP细胞、22Rv1细胞、PC-3细胞、MDA PCa 2b细胞、TRAMP-C3细胞、DU145细胞、NCI-H660细胞、TSU-PR1PC-82细胞、PPC-1细胞和VCRU-Pr-2细胞。
特别地，抗体的实例包括抗HER2抗体、抗EGFR抗体等。
识别口腔癌细胞(其为一种头颈癌细胞)之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从口腔癌患者中提取的口腔癌细胞，更特别是来源于口腔癌组织的细胞，例如Hs53.T细胞。
识别咽癌细胞(其为一种头颈癌细胞)之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从咽癌患者中提取的咽癌细胞，更特别是来源于咽癌组织的细胞，例如C666-1细胞、NPC-TY861细胞、MPC-Y851细胞、MPC-K852细胞、KKK-YT细胞和MPC-ST细胞。
识别喉癌细胞(其为一种头颈癌细胞)之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从喉癌患者中提取的喉癌细胞，更特别是来源于喉癌组织的细胞，例如FaDu细胞、Hs840.T细胞和Detroit 562细胞。
识别鼻或鼻窦癌细胞(其为一种头颈癌细胞)之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从鼻或鼻窦癌患者中提取的鼻或鼻窦癌细胞，更特别是来源于鼻或鼻窦癌组织的细胞，例如RPMI2650细胞。
识别唾液腺癌细胞(其为一种头颈癌细胞)之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从唾液腺癌患者中提取的唾液腺癌细胞，更特别是来源于唾液腺癌组织的细胞，例如SGT-1细胞。
识别甲状腺癌细胞(其为一种头颈癌细胞)之抗体的实例包括识别存在于细胞表面上的生物分子(例如蛋白质、肽、糖链、脂质等)的抗体，所述细胞例如从甲状腺癌患者中提取的甲状腺癌细胞，更特别是来源于甲状腺癌组织的细胞，例如HTC/C3细胞、SW579细胞和TT细胞。
特别地，这些识别头颈癌之抗体的实例包括抗HER2抗体、抗EGFR抗体等。
用于向本发明的脂质体加载识别癌细胞之抗体的方法没有特别地限制。例如，可使用在PTD1中公开的方法。
IV.脂质体制剂
本发明的脂质体制剂包含通过上述用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法(III)得到的脂质体。
更特别地，本发明的脂质体制剂是包含脂质体的脂质体制剂，所述脂质体包含具有磷脂酰胆碱基团的脂质、胆固醇化合物、具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质、水溶性差的药理活性物质、聚氧乙烯酯化合物以及可药用载体和添加剂，其中所述具有磷脂酰胆碱基团的脂质、所述胆固醇化合物、所述具有磷脂酰乙醇胺基团的脂质和所述水溶性差的药理活性物质的摩尔比分别为3～8∶2～7∶0.1～3∶0.001～5。
基于包封在脂质体中的水溶性差的药理活性物质表现出治疗效果的各种疾病，脂质体制剂可用于预防或治疗疾病。
例如，当由紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、及其糖苷所代表的基于紫杉烷的化合物用作待包封于脂质体中的水溶性差的药理活性物质时，包含脂质体的脂质体制剂可应用于预防或治疗癌症、阿尔茨海默病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎(自身免疫病)、由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、病毒性肝炎(传染性炎症)等。该制剂还可用于表现出例如解热、镇痛、镇咳、细菌、免疫抑制或抗寄生虫效果的目的。
例如，当由巴佛洛霉素、巴佛洛霉素、刀豆霉素、阿奇霉素和克拉霉素所代表的大环内酯化合物用作待包封于脂质体制剂中的水溶性差的药理活性物质时，包含脂质体的脂质体制剂可应用于预防或治疗癌症、阿尔茨海默病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎(自身免疫病)、由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、病毒性肝炎(传染性炎症)等。该制剂还可用于表现出例如解热、镇痛、镇咳、细菌、免疫抑制或抗寄生虫效果的目的。
例如，当由喜树碱和依立替康所代表的喹啉生物碱化合物用作待包封于脂质体中的水溶性差的药理活性物质时，包含脂质体的脂质体制剂可应用于预防或治疗癌症、阿尔茨海默病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎(自身免疫病)、由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、病毒性肝炎(传染性炎症)等。该制剂还可用于表现出例如解热、镇痛、镇咳、细菌、免疫抑制或抗寄生虫效果的目的。
例如，当由长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨所代表的长春花生物碱化合物用作待包封于脂质体中的水溶性差的药理活性物质时，包含脂质体的脂质体制剂可应用于预防或治疗癌症、阿尔茨海默病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎(自身免疫病)、由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、病毒性肝炎(传染性炎症)等。该制剂还可用于表现出例如解热、镇痛、镇咳、细菌、免疫抑制或抗寄生虫效果的目的。
癌症没有特别地限制。癌症的实例包括肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、子宫内膜癌细胞、前列腺癌细胞、头颈癌细胞(口腔癌细胞、咽癌细胞、喉癌细胞、鼻或鼻窦癌细胞、唾液腺癌细胞、甲状腺癌细胞等)。
本发明的脂质体制剂可向例如患有以上所列各种疾病的患者施用。施用途径没有特别地限制。施用的实例包括静脉注射，例如滴注、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射等。合适的施用方法可根据患者的年龄和症状来选择。
作为脂质体制剂的特定施用方法，可使用注射器或滴注来施用药物组合物。另外，还可将导管插入患者体内(例如腔或血管内)，并且将导管尖端引导至靶部位附近，并随后通过导管从期望的靶部位、其附近、或预期具有向靶部位的血流的部位施用该制剂。
本发明的脂质体制剂以足以治疗或至少部分地抑制疾病的症状的量向忠有以上所列各种疾病的患者施用。
包封于脂质体制剂中的药物的有效剂量没有特别地限制。例如，当转换成包封在脂质体制剂中的水溶性差的药理活性物质的量时，剂量可以是约0.01至50mg/kg。
本发明的脂质体制剂可包含可药用载体和添加剂。可药用载体和添加剂没有特别地限制。可使用已用于该领域中的多种已知载体和添加剂。
以下示出了实施例以更具体地描述本发明。然而，本发明并不局限于这些实施例。
生产实施例1
包封PTX、gPTX或DTX的脂质体
通过薄膜水合法制备了包封PTX(紫杉醇)、gPTX(7-葡糖基氧乙酰基紫杉醇)或DTX(多西他赛)的脂质体。
称取9.6mg氢化大豆卵磷脂(HPSC)、3.2mg胆固醇(Chol)、3.2mg1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG-DSPE)和紫杉烷化合物(PTX、gPTX或DTX)并以HSPC∶Chol∶mPEG-DSPE∶紫杉烷化合物＝6∶4∶0.5∶X的摩尔比添加至茄形烧瓶。
特别地，称取0.9mg、1.8mg或3.5mg(x＝0.5至2)PTX，2.2mg、4.4mg或6.6mg(x＝1至3)gPTX和1.7mg、3.3mg或5.0mg(x＝1至3)DTX并添加至茄形烧瓶。
将4mL有机溶剂(氯仿∶甲醇＝9∶1)添加至茄形烧瓶，并且使混合脂质充分溶解。然后，使用旋转蒸发仪将混合脂质真空干燥以完全除去有机溶剂，并形成包封紫杉烷化合物的脂质膜。
将1mL CEP(聚氧乙烯蓖麻油EL∶乙醇∶磷酸缓冲盐水(PBS)＝20∶15∶65(体积比))添加至由此生产的脂质膜上，在加热至60℃时混悬，从而形成脂质体。为调整粒度，在60℃的加热下进行声波处理。然后，为了使用100-KDa的膜滤器通过超滤除去任何未包封的药物，用PBS替换脂质体外部液体。
使用ELS-8000(Otsuka Electronics Co.，Ltd.)通过动态光散射法和电泳光散射法测量由此制备的脂质体的粒度和ζ电势。另外，通过反向HPLC测量脂质体中的药物浓度，并计算包封效率和加载效率。
通过反向高效液相色谱法(反向HPLC)确定包封于脂质体中的药物浓度。测量条件如下。使用WP300，C18.5μm，4.6×150mm作为HPLC柱。对于PTX和gPTX使用227nm的检测波长，并且对于DTX使用229nm的检测波长。使用甲醇∶超纯水＝7∶3的溶剂作为流动相。更特别地，将10μL脂质体样品进样到HPLC柱中，并在流动相中以1.0mL/min的流量输送流体。
使用以下的公式(1)和(2)，基于得到的药物量计算包封效率和加载效率。
包封效率(EE：％)＝药物量/初始使用的药物量×100(1)
加载效率(LE：％)＝{(药物量/药物摩尔重量)/初始脂质摩尔数}×100(2)
制备实施例2
包封巴佛洛霉素A1(BafA1)的脂质体
通过薄膜水合法制备了包封BafA1的脂质体。称取9.6mg HSPC、3.2mg Chol、3.2mgmPEG-DSPE和BafA1并以HSPC∶Chol∶mPEG-DSPE＝6∶4∶0.5∶x的摩尔比添加至茄形烧瓶。
称取145μg或290μg(x＝0.1或0.2)BafA1并添加至其中。
将4mL有机溶剂(氯仿∶甲醇＝9∶1)添加至茄形烧瓶，并且使混合脂质充分溶解。然后，使用旋转蒸发仪将混合脂质真空干燥以完全除去有机溶剂，并形成包封BafA1的脂质膜。
使用由此产生的包封BafA1的脂质膜的脂质体形成处理以及脂质体的性质评估以与制备包封紫杉烷化合物的脂质体相同的方式进行。
通过反向HPLC以如下测量条件确定包封于脂质体中的BafA1浓度。使用WP300，C18.5μm，4.6×150mm作为HPLC柱。选择245nm的检测波长，使用甲醇∶超纯水＝8∶3的溶剂作为流动相。更特别地，将10μL脂质体样品进样到HPLC柱中，在流动相中以1.0mL/min的流量输送流体。
使用如上所示的公式(1)和(2)计算包封效率和加载效率。
实施例1
在4℃下的脂质体稳定性测试
在制备上述包封紫杉烷化合物的脂质体后，将脂质体在4℃下静置。在2周后和在4周后，使用100-KDa膜滤器通过超滤除去任何漏出到脂质体外部液体中的药物。然后，通过动态光散射法测量了脂质体的粒度；另外，通过反向HPLC确定了在脂质体溶液中的药物浓度。使用以下的公式(3)，基于得到的药物量计算保留率。
保留率(％)＝包封的药物量/初始包封的药物量×100(3)
实施例2
细胞毒性评估
通过使用MTT测定评价包封PTX、gPTX或DTX的脂质体的细胞毒性。作为受试靶细胞，使用来源于人结肠癌的细胞系HT-29细胞、来源于人卵巢癌的细胞系SK-OV-3细胞和来源于人乳腺癌的细胞系SK-BR-3细胞。将癌细胞以5000个细胞/孔接种到96孔板中。
在24小时的培养后，向每孔添加不同浓度的药物。在暴露于药物72小时后，添加终浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，然后培养4小时。然后，将产生的甲
Figure BDA0001619333990000211
溶解在甲
Figure BDA0001619333990000212
溶液液体(10％SDS+0.02-调节HCl)中。从每孔的470nm细胞存活曲线中计算使50％细胞死亡的浓度(IC50)。
通过使用以下MTT测定评价了BafA1和包封BafA1的脂质体的细胞毒性。作为受试靶细胞，使用了来源于人结肠癌的细胞系HT-29细胞和来源于人乳腺癌的细胞系MCF7。将癌细胞以5000个细胞/孔接种到96孔板中。24小时的培养后，每孔添加不同浓度的药物。在暴露于药物48小时后，添加终浓度为0.8mg/mL的MTT溶液，然后培养2小时。然后，将产生的甲
Figure BDA0001619333990000221
溶解在甲
Figure BDA0001619333990000222
溶液液体(10％SDS+0.02-调节HCl)中。从每孔的470nm细胞存活曲线计算使50％细胞死亡的浓度(IC50)。
比较例1
与使用已知脂质组成(NPL1)制备包封紫杉醇的脂质体的比较
称取9.6mg HSPC、3.2mg Chol、3.2mg mPEG-DSPE和1.8mg PTX，或14.5mg HSPC、0.8mg Chol、2.8mg mPEG-DSPE和1.8mg PTX(9∶1∶0.5∶1(摩尔比))并添加至茄形烧瓶。将4mL有机溶剂(氯仿∶甲醇＝9∶1)添加至茄形烧瓶，并且使混合脂质充分溶解。然后，使用旋转蒸发仪将脂质溶液真空干燥以完全除去有机溶剂，并形成包封抗癌药物的脂质膜。
将1mL CEP(聚氧乙烯蓖麻油EL∶乙醇∶磷酸缓冲盐水(PBS)＝20∶15∶65(体积比))添加至形成的脂质膜，然后在加热至60℃时混悬，从而形成脂质体。用显微镜观察得到的多层膜脂质体的形成。
多种测试的结果
图1和图2示出了测量各紫杉烷化合物(即PTX、gPTX和DTX)在脂质体中的包封效率(EE：％)和加载效率(LE：％)的结果。
结果证实，当PTX的摩尔比为5mol和10mol时，当gPTX的摩尔比为10mol时以及当DTX的摩尔比为10mol和20mol时，包封效率接近100％。在每种药中，当摩尔比提高时，存在加载效率升高的趋势。
图3和图4中所示的包封紫杉烷化合物的脂质体的性质评价表明根据粒度、多分散指数和ζ电势，所有的脂质体都可用作脂质体制剂。特别地，200nm或更小的粒度适合于确保EPR效果，并且负ζ电势在防止在肝中的容易识别方面是理想的。
根据如图5和图6中所示的保留率，表明所有包封紫杉烷化合物的脂质体都可用作脂质体制剂。另外，在4℃下4周保存期时间确认粒度没有显著改变。
图7和图8示出了包封紫杉烷化合物(即PTX、gPTX和DTX)的各脂质体在癌细胞中的抗癌活性的评价。结果显示包封不同紫杉烷化合物的所有脂质体表现出针对多种癌细胞的优选的抗癌活性。特别地，显示了当PTX包封于脂质体中时，其展示了更理想的抗癌活性。
图9和图10示出了关于包封巴佛洛霉素的脂质体的测试结果；测试以对于不同紫杉烷化合物的测试相同的方式进行。如图9中所示的巴佛洛霉素进入脂质体中的包封效率(EE：％)显示了如在紫杉烷化合物中那样，当摩尔比为1mol时，达到了接近100％的包封效率。同样，当摩尔比提高时，存在着加载效率(LE：％)升高的趋势。另外，关于粒度和ζ电势，已经证实与基于紫杉烷的药物相同的趋势。
另外，图10的结果证实包封于脂质体中的BafA1表现出与BafA1相同或更大程度的细胞毒性。
图11的结果显示出当生产已知脂质组成的包封紫杉醇的脂质膜并加工成脂质体时(见图11(B))，没有形成与图11(A)所示一样的脂质体膜。这种针状形式的结构未阐明；然而，其被认为是紫杉醇聚集体。
实施例3
脂质体存活测试
对上述脂质体进行存活测试以确定作为脂质体制剂的安全性。
使用SPF/VAF小鼠(品系：BALB/cAnNCr1Cr1j；Charles River LaboratoriesJapan，Inc.)。将6周龄的雌性BALB/c小鼠分组，每组4只小鼠。小鼠饲养在23℃的环境中并喂养无菌的水和食物。
在溶解于生理盐水的多西他赛脂质体(DTX-L)中，将通过使用相对于整个脂质体的摩尔量(x)为2的多西他赛得到的DTX-L通过尾静脉以根据多西他赛量为10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg或150mg/kg的量施用于每只小鼠。另外，以类似方式施用PBS作为对照。图12示出了结果。
当添加根据多西他赛量为150mg/kg量的DTX-L时，施用后1天的存活率为25％，并且施用两天后为0％。当添加根据多西他赛量为100mg/kg量的DTX-L时，施用后1天的存活率下降至75％，并且然后直到施用后15天未观察变化。
因此，这表明DTX-L的施用量上限为约50mg/kg。由于DTX-L以至少约95％的包封效率包封多西他赛，根据基于上限的计算，可向体重66kg的患者施用约3g或更多。该值明显远大于目前批准的多西他赛剂量值。

Claims (17)

1.组合物，其包含氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和紫杉醇，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和紫杉醇的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶0.5～1。
2.组合物，其包含氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和7-葡糖基氧乙酰基紫杉醇，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和7-葡糖基氧乙酰基紫杉醇的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶1～2。
3.组合物，其包含氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和多西他赛，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和多西他赛的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶1～2。
4.组合物，其包含氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和巴佛洛霉素，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和巴佛洛霉素的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶0.1。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于形成脂质膜。
6.脂质膜，其包含氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和紫杉醇，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和紫杉醇的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶0.5～1。
7.脂质膜，其包含氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和7-葡糖基氧乙酰基紫杉醇，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和7-葡糖基氧乙酰基紫杉醇的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶1～2。
8.脂质膜，其包含氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和多西他赛，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和多西他赛的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶1～2。
9.脂质膜，其包含氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和巴佛洛霉素，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和巴佛洛霉素的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶0.1。
10.用于生产包封水溶性差的药理活性物质的脂质体的方法，其包括在水性溶剂中使权利要求6至9中任一项所述的脂质膜与聚氧乙烯酯化合物接触的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中还包含低级醇作为水性溶剂。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中还包含缓冲液作为水性溶剂。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其还包括加载识别癌细胞之抗体的步骤。
14.脂质体制剂，其包含包封以下的脂质体：氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、紫杉醇和聚氧乙烯酯化合物，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和紫杉醇的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶0.5～1。
15.脂质体制剂，其包含包封以下的脂质体：氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、7-葡糖基氧乙酰基紫杉醇和聚氧乙烯酯化合物，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和7-葡糖基氧乙酰基紫杉醇的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶1～2。
16.脂质体制剂，其包含包封以下的脂质体：氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、多西他赛和聚氧乙烯酯化合物，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和多西他赛的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶1～2。
17.脂质体制剂，其包含包封以下的脂质体：氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、巴佛洛霉素和聚氧乙烯酯化合物，其中所述氢化大豆卵磷脂、胆固醇、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和巴佛洛霉素的摩尔比分别为6∶4∶0.5∶0.1。
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