KR20130108583A

KR20130108583A - 암 치료 또는 암 완화 케어용 옥트레오티드 수식 나노 제제

Info

Publication number: KR20130108583A
Application number: KR1020137009649A
Authority: KR
Inventors: 유코 이와세; 요시에 마이타니
Original assignee: 나노시온 가부시키가이샤
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2013-10-04
Also published as: IL225288A0; JPWO2012035794A1; JP6137527B2; US20130171243A1; AU2011303262A1; US9289463B2; WO2012035794A1; CA2811494A1; SG188554A1

Abstract

본 발명은, 갑상선수양암 등의 암의 치료, 완화 케어 또는 예방용 의약 조성물에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은, 옥트레오티드로 수식된 리포솜을 포함하는 갑상선수양암 등의 암의 치료, 완화 케어 또는 예방용 의약 조성물에 관한 것이다.

Description

암 치료 또는 암 완화 케어용 옥트레오티드 수식 나노 제제{OCTREOTIDE-MODIFIED NANO PREPARATION FOR TREATMENT OF CANCER OR PALLIATIVE CARE OF CANCER}

갑상선수양암(MTC)은, 갑상선의 C 세포의 암화에 기인하는 드문 암이다. MTC는 외과적 절제에 의해 처치되고 있지만, 이에 따라 환자의 퀄리티 오브 라이프(QOL)가 저하된다는 것이 문제가 되고 있었다.

캄토테신의 유도체인 이리노테칸(CPT-11)이 MTC에 대한 효력을 가질 가능성이 시사되어 있지만, CPT-11은 반감기가 짧고, 위독한 부작용을 나타내기 때문에, 그의 사용은 제한되어 있었다(비특허문헌 1).

항암제를 리포솜에 봉입하면, 수동적 표적화에 따라 종양에서의 약물의 축적이 증가하고, 부작용이 경감될 수 있다는 것이 알려져 있다. 또한, 리포솜을 리간드로 수식함으로써, 리포솜의 치료 효과를 증강할 수 있다. 예를 들면, 소마토스타틴 수용체(SSTR)의 고친화성 리간드인 옥트레오티드(Oct)로 수식한 리포솜에 칸타리딘, 디히드로탄시논 등의 항암제를 봉입하여, 유방암, 위암을 처치하는 시도가 이루어져 있다(비특허문헌 2, 3).

본 발명자들은, Oct 수식한 CPT-11 봉입 리포솜을 제작하고, 이것이 SSTR을 발현하는 MTC 유래의 세포주에 대한 세포 독성을 생체 외(in vitro)에서 나타낸다는 것을 보고하였다(비특허문헌 4). 그러나, 생체 내(in vivo)에서 MTC를 처치하기 위한 유효한 방법은 확립되어 있지 않다.

Ohno, R. et al., J. Clin. Oncol., 8:1907-1912(1990) Chang, C. C. et al., Food Chem. Toxicol., 46:3116-3121(2008) Chen, C. H. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:1586-1594(2008) 이와세 유코 등, 일본 약학회, 제130연회, 요지집, 28CE-pm03(2010년)

본 발명의 목적은, 갑상선수양암 등의 암의 치료, 완화 케어 또는 예방용 의약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은:

[1] 옥트레오티드로 수식된 리포솜을 포함하는 암의 치료, 완화 케어 또는 예방용 의약 조성물;

[2] 리포솜에서의 옥트레오티드의 농도가 0.8 mol％ 초과인 [1]의 의약 조성물;

[3] 리포솜이 폴리(에틸렌글리콜)로 더 수식되어 있는 [1] 또는 [2]의 의약 조성물;

[4] 생리 식염수를 대조군으로 한 경우의 연명률을 나타내는 ％ILS가 100 이상인 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 의약 조성물.

[5] 리포솜에 이리노테칸이 봉입되어 있는 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 의약 조성물;

[6] 이리노테칸의 투여량이 20 mg/kg 체중 이하인 [5]의 의약 조성물;

[7] 암이 갑상선수양암인 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 의약 조성물

에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 옥트레오티드로 수식된 리포솜을 포함하는 갑상선수양암 등의 암의 치료, 완화 케어 또는 예방용 의약 조성물이 제공된다.

[도 1] 세포 내 수용에 대한 Oct 농도의 효과를 도시한 도면이다. 값은, 평균±SD이다(n=3). *는, SL과 비교한 유의차(p<0.05)를 나타낸다.
[도 2] 경합 저해 시험의 결과를 도시한 도면이다.
[도 3] 경합 저해 시험의 결과를 도시한 도면이다.
[도 4] 약물 미봉입 리포솜을 사용한 세포 독성 시험의 결과를 도시한 도면이다.
[도 5] PI3K/Akt/TSC2/mTOR/p70S6K 시그널 캐스케이드를 도시한 도면이다.
[도 6] Akt, TSC2 및 p70S6K의 인산화에 대한 Oct-CL의 효과를 도시한 도면이다.
[도 7] 종양 크기에 대한 CPT-11 봉입 리포솜의 효과를 도시한 도면이다.
[도 8] 체중에 대한 CPT-11 봉입 리포솜의 효과를 도시한 도면이다.
[도 9] 생존율에 대한 CPT-11 봉입 리포솜의 효과를 도시한 도면이다.
[도 10] 종양 크기에 대한 CPT-11 봉입 리포솜의 효과를 도시한 도면이다.
[도 11] 체중에 대한 CPT-11 봉입 리포솜의 효과를 도시한 도면이다.
[도 12] 생존율에 대한 CPT-11 봉입 리포솜의 효과를 도시한 도면이다.

본 발명은, 갑상선수양암 등의 암의 치료, 완화 케어 또는 예방용 의약 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용하는 용어 「갑상선수양암」(본 명세서에서 「MTC」라고도 함)은, 갑상선의 칼시토닌 분비 여포방(parafollicular) 세포(C 세포)에서 유래하는 악성 내분비선 종양을 가리킨다. MTC는 갑상선암의 약 3 내지 5％를 차지한다. MTC의 75％는 산발성이고, 나머지 25％는 가족성이다(다발성 내분비 종양 IIA형(MEN2A), 다발성 내분비 종양 IIB형(MEN2B) 및 가족성 갑상선수양암(FMTC)). MTC 상에는 소마토스타틴 수용체가 발현되어 있다는 것이 알려져 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어 「소마토스타틴 수용체」(본 명세서에서 「SSTR」이라고도 함)는, 성장 호르몬 분비 억제 인자인 소마토스타틴을 리간드로 하는 수용체를 가리킨다. SSTR은 7회 막 관통형 G 단백질 공액 수용체이며, MTC 뿐만 아니라 신경 내분비 종양, 위장 췌종양, 하수체 종양, 카르시노이드 종양 등에서 과잉 발현되고 있다(하기 참조). SSTR에 소마토스타틴 아날로그가 결합하면, PI3K, Akt, TSC2, mTOR, p70S6K의 인산화를 통해 시그널이 전달되어, 세포 주기가 억제된다(PI3K/Akt/TSC2/mTOR/p70S6K 시그널 캐스케이드)(문헌 [Grozinsky-Glasberg, S. et al., Endocr. Relat. Cancer, 15:701-720(2008); Theodoropoulou, M. et al., Cancer Res., 66:1576-1582 (2006)).

소마토스타틴 수용체에는 5개의 서브 타입(sst1 내지 5)이 있으며, 옥트레오티드는 sst2, sst3, sst5의 서브 타입의 소마토스타틴 수용체에 대하여 높은 친화성을 갖는다(문헌 [Patel, Y. C., Frontiers in Neuroendocrinology, 20:157-198(1999)]). 배자 발생 중의 신경관 폐쇄에 따라 유주되는 신경제세포(neural crest cells)는, 소마토스타틴에 대한 면역 활성 및 부신 유래의 특성(카테콜아민 양성)을 갖는다. 이것은 신경제세포의 발생 초기에만 출현하는 현상이며(문헌 [Maxwell, G. D. et al., Developmental Biology, 108:203-209(1985); Garcia-Arraras, J. E. et al., Cell and Tissue Research, 295:33-41(1999)]), 그의 대부분은 생후에 소실된다. 이 소마토스타틴 수용체를 소실한 세포는, 암의 발생시에 다시 소마토스타틴 수용체를 발현한다. 이하의 암이 그의 서브 타입(sst2, sst3, sst5)에 대한 선택성을 갖는다는 것이 알려져 있다: 갑상선수양암(C 세포); 하수체 불활성형 선종; 하수체 성장 호르몬몬 선종; 신세포암; 위장췌관계 종양(크롬 친화성 세포); 갈색 세포종; 신경 아세포종/수아종/수막종; 림프종; 방신경절종(문헌 [Reubi, J. C. et al., European Journal of Nuclear Medicine, 28:836-846(2001)]); 유방암(에스트로겐 수용체를 갖는 세포)(문헌 [Reubi, J. C. et al.(상기); Orlando, C. et al., Endocrine-Related Cancer, 11:323-332(2004)); 소세포 폐암(Reubi, J. C. et al.(상기); Papotti, M. et al., Virchows Archiv, 439:787-797(2001)); 간장암(Reubi, J. C. et al.(상기); Blaker, M. et al., Journal of Hepatology, 41:112-118(2004)); 안구내 포도막 멜라노마(문헌 [Filali, M. K. E. et al., Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 246:1585-1592(2008)]); 전이성 육종(문헌 [Friedberg, J. W. et al., Cancer, 86:1621-1627(1999)); 멜라노마(문헌 [Lum, S. S. et al., World Journal of Surgery, 25:407-412(2001)]); 암 조직 주위의 내피 세포(문헌 [Denzler, B. et al., Cancer, 85:188-198(1999)]); 급성 골수성 백혈병(이동능을 갖는 급성 골수성 백혈병 세포)(문헌 [Oomen, S. P. M. A. et al., Leukemia, 15:621-627(2001)). 따라서, 본 발명은, 이러한 소마토스타틴 수용체를 발현하는 임의의 암에 대하여 유효하다.

본 발명은, 옥트레오티드로 수식된 리포솜을 포함하는 갑상선수양암 등의 암의 치료, 완화 케어 또는 예방용 의약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 조성물을 투여하는 공정을 포함하는 MTC 등의 암의 치료, 완화 케어 또는 예방을 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은, 일반적으로 1 나노미터를 초과하는 크기를 갖는다. 이러한 의약 조성물을 본 명세서에서 「나노 제제」라고도 한다. 또한, 1 나노미터를 초과하는 크기를 본 명세서에서 「나노 크기」라고도 한다.

본 발명에 있어서, SSTR에 결합하는 물질을 리간드로서 사용한다. 바람직하게는, SSTR에 결합하는 물질은 옥트레오티드이다. 「옥트레오티드」(본 명세서에서 「Oct」라고도 함)는, 소마토스타틴의 생물학적 활성을 나타내는 데 중요한 부분인 4개의 아미노산(Phe-Trp-Lys-Thr)을 그대로의 서열로 남긴 8개의 아미노산으로 이루어지는 환상 펩티드이고, SSTR에 대한 고친화성을 갖고, 증가한 혈장 반감기를 나타내는 소마토스타틴 아날로그이다. SSTR에 결합하는 물질은 옥트레오티드로 한정되는 것은 아니며, SSTR에 결합하는 능력을 갖고, 본 발명의 의약 조성물에서 사용한 경우, MTC 등의 암의 세포에 대한 독성을 나타내는 임의의 물질을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 「리포솜」은, 인지질을 사용하여 얻어지는 소포를 가리킨다. 본 발명에서 임의의 인지질을 사용할 수 있다. 인지질의 예로서는 한정되는 것은 아니지만, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 등이 사용된다. 또한, 다른 지질, 예를 들면 콜레스테롤(Chol)을 첨가할 수도 있다.

하나의 실시 양태에 있어서, 본 발명에 의한 리포솜은 폴리(에틸렌글리콜)로 더 수식되어 있을 수도 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 「폴리(에틸렌글리콜)」(본 명세서에서 「PEG」라고도 함)은, 에틸렌글리콜이 중합된 폴리에테르를 가리킨다. 본 발명에서 임의의 분자량의 PEG를 사용할 수 있지만, PEG의 분자량은, 바람직하게는 500 이상, 보다 바람직하게는 1000 이상, 더욱 바람직하게는 1500 이상이고, 바람직하게는 6000 이하, 보다 바람직하게는 5000 이하, 더욱 바람직하게는 4000 이하이다. 예를 들면, PEG는 3400의 평균 분자량을 갖는다.

리포솜에 대한 Oct의 비율, 즉 리포솜에서의 Oct의 농도는, 예를 들면 0.8 mol％ 초과, 바람직하게는 1.0 mol％ 이상, 보다 바람직하게는 1.2 mol％ 이상, 더욱 바람직하게는 1.4 mol％ 이상, 특히 바람직하게는 1.6 mol％ 이상이다. 본 발명자들은, 보다 높은 Oct 농도가 MTC 세포에 대한 세포 독성에 유효하다는 것을 발견하였다. 따라서, 리포솜에서의 옥트레오티드의 농도는 높은 것이 바람직하지만, 예를 들면 10 mol％ 이하, 바람직하게는 8 mol％ 이하, 보다 바람직하게는 6 mol％ 이하, 더욱 바람직하게는 5 mol％ 이하이다. Oct 수식한 리포솜에 관한 이전의 보고에서 사용되고 있던 리포솜에서의 Oct의 농도는 약 0.5 mol％이고(비특허문헌 2, 3), 본 발명에서는 보다 고농도의 Oct를 사용하는 것이 바람직하다.

예를 들면, Oct 및 PEG를 포함하는 리포솜을 문헌 [Hattori, Y. et al., J. Control. Release, 136:30-37(2009)]에 기재 방법에 따라 DSPC 및 Chol을 혼합하고, 피틴산(IP-6)을 가하여 진탕함으로써 리포솜을 제조하고, 이것에 Oct, PEG, DSPE의 결합체(Oct-PEG-DSPE)를 가함으로써 얻을 수 있다(후성적 수식). 또는, 상기 문헌 [Hattori, Y. et al.]에 기재된 방법에 따라 DSPE, Chol, Oct-PEG-DSPE를 혼합하고, 피틴산(IP-6)을 가하여 진탕함으로써 Oct 및 PEG를 포함하는 리포솜을 제조할 수도 있다.

Oct에서의 수식은 상기한 바와 같은 방법으로 한정되는 것은 아니며, Oct가 SSTR과 결합 가능한 상태로 리포솜에 포함되는 한, 당 기술 분야에서 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.

또한, 상기한 바와 같은 방법으로 리포솜을 제조하는 경우에는, 리포솜당의 PEG의 양이 Oct가 결합한 Oct-PEG-DSPE의 양에 따라 결정되지만, PEG를 포함하지 않는 리포솜을 제조하거나, PEG의 양을 임의로 증가 또는 감소시킬 수도 있다. 그와 같은 방법은 당 기술 분야에서 공지되어 있다.

약제가 혈관 내에 투여되는 경우에는, 체내에서는 나노 크기보다도 작은 분자밖에 통과할 수 없는 모세 혈관이 대부분을 차지하고 있기 때문에, 나노 제제는, 정상 세포 주변에서는 혈관을 투과하여 세포에 간단히는 도달할 수 없다. 그 때문에 혈관 내에 투여된 나노 제제는 고농도로 혈관 내에 유지되게 된다(문헌 [Igarashi, E., Toxicol Appl Pharmacol, 229:121-34(2008)]). 한편, 암 세포 주변에서는 혈관 신생이 왕성하고, 증식능이 높기 때문에 나노 크기의 물질이라도 용이하게 혈관을 투과할 수 있다. 따라서, 나노 제제는, 혈관 내에서 암 조직 선택성을 갖고 있다. 이 표적 나노 제제는, 암 발생의 시기의 세포에 특히 강하게 발현하는 소마토스타틴 수용체에 대하여 높은 친화성을 갖는 펩티드(Oct)를 암 세포의 표적으로서 사용하고, 나노 크기에 의한 조직 선택성에 의해 선택적으로 암 조직에 도달하고, 암 세포 선택성에 의해 암 세포에 수용되고, 암 세포와의 상호 작용에 의해 길게 암 조직에 체류하는 것이 가능하기 때문에 비표적 나노 제제에 비해 유효성과 안전성에 있어서 유리하고, 환자의 QOL의 개선에도 결부되는 것이 기대된다.

하나의 실시 양태에 있어서, 본 발명에 의한 리포솜에는 약물이 봉입되어 있을 수도 있다. 약물을 상기한 바와 같은 리포솜의 제조시에 첨가함으로써, 약물을 리포솜에 봉입할 수 있다. 약물:리포솜의 질량비는 적절하게 결정되며, 예를 들면 0.1:1 이상, 바람직하게는 0.2:1 이상, 보다 바람직하게는 0.4:1 이상이고, 예를 들면 1:1 이하, 바람직하게는 0.8:1 이하, 더욱 바람직하게는 0.6:1 이하이다.

약물로서는, 예를 들면 이리노테칸, 독소루비신 등의 임의의 항암제를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 의한 리포솜에 봉입되는 약물은 MTC 등의 암에 대하여 작용하는 항암제이고, 보다 바람직하게는 이리노테칸이다. 「이리노테칸」(본 명세서에서 「CPT-11」이라고도 함)은, 캄토테신의 수용성 유도체이고, 카르복시 에스테라아제에 의해 활성형의 SN-38로 변환되어, 토포이소메라제를 저해한다. CPT-11의 투여시에, 설사, 장염, 골수 억제, 구역질, 구토, 하혈, 장폐색, 간질성 폐렴 등의 부작용이 보이는 것이 알려져 있다. 약물의 투여량은 예를 들면 CPT-11의 경우, 예를 들면 30 mg/kg 체중 미만, 바람직하게는 25 mg/kg 체중이하, 보다 바람직하게는 20 mg/kg 체중 이하, 더욱 바람직하게는 15 mg/kg 체중 이하이고, 예를 들면 1 mg/kg 체중 이상, 바람직하게는 2 mg/kg 체중 이상, 보다 바람직하게는 5 mg/kg 체중 이상이고, 가장 바람직하게는 약 10 mg/kg 체중이다. 본 발명에 따르면, CPT-11과 같은 약물의 투여량을 저하시킬 수 있기 때문에, 종래의 고투여량(30 mg/kg 체중)에 따른 상기한 다양한 부작용을 경감할 수 있다.

구토는, 항암제 치료 또는 수술 후에 발생한다. 이것은 환자의 QOL의 저하의 원인으로 되어 있다. 구토는, 항분비약과 항구토약 중 양쪽 또는 어느 하나의 약제를 사용함으로써 억제된다. Oct는 급속히 소화관 분비를 감소시킬 수 있으며, 경련 진정약인 히오신ㆍ부틸브로마이드가 듣지 않는 고도의 장폐색을 갖는 환자에게 특히 중요한 역할을 갖고 있다. Oct는, 완화 케어 치료약으로서 사용되고 있으며, 모르핀, 히오신ㆍ부틸브로마이드나 할로페리돌 등의 다른 완화 케어 약제와의 병용 치료도 가능하다(문헌 [Ripamonti, C. I. et al., European Journal of Cancer, 44:1105-1115(2008)]). 현재, 처방약으로서 사용되고 있는 Oct에 의한 치료에서는, 세포 선택성은 있지만 나노 크기가 아니기 때문에, 통증의 부위 주변조직으로의 선택성은 기대할 수 없다. 그러나, Oct와 병용되고 있는 약제를 봉입한 Oct 수식 나노 제제의 제작에 의해, 통증 부위 주위의 조직으로의 선택적인 집적, Oct에 의한 세포 선택성에 의한 통증의 부위 주변의 조직과 세포로의 집적에 의해 유효한 완화 케어 치료약도 가능해진다.

본 발명의 의약 조성물의 투여는, 전신 투여, 국소 투여 중 어느 것일 수도 있다. 투여 경로는, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내, 비강 내 등의 임의의 경로일 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 부형제, 희석제, 안정화제 등, 제제의 분야에서 사용되는 임의의 성분을 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물을 생체 외에서, 예를 들면 MTC 등의 암 유래 세포주에 대한 세포 독성을 지표로서 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물을 생체 내에서, 예를 들면, 동물에 있어서의 종양 크기, 생존율 등을 조사함으로써 평가할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 연명 효과를, [(처치군 평균 생존 일수)-(대조군 투여군 평균 생존 일수)/(대조군 투여군 평균 생존 일수)]×100(％)의 식에 따라 산출되는 ％ILS(increase of life-span; 연명률)에 의해 평가할 수 있다. 예를 들면, 생리 식염수를 대조군으로 한 경우, ％ILS는 예를 들면 100 이상, 바람직하게는 120 이상, 보다 바람직하게는 150 이상, 더욱 바람직하게는 180 이상, 특히 바람직하게는 200 이상이다.

본 발명자들은 본 발명의 조성물을 사용하여, 생체 내에서 약물 투여 종료 후에도 종양 크기의 증가가 억제되고, 동물이 연명되어, MTC가 완전히 치유될 수 있다는 것을 나타내었다. 종래, MTC의 처치는 외과적 절제에 의해 행해졌었다. 이리노테칸의 MTC에 대한 효력은 시사되어 있지만, 그의 부작용은 위독하고, 유효한 약물 요법은 확립되어 있지 않았다. 본 발명은, MTC 등의 암의 치료, 완화 케어 및 예방에 유효한 의약 조성물을 처음으로 개시하는 것이다. 또한, 본 발명자들은, Oct 및 PEG를 포함하는 약물 미봉입 리포솜이 MTC 세포에 대한 세포 독성을 나타낸다는 것을 발견하였다. Oct는 종래 소마토스타틴 수용체 검출용 진단약이나 약물의 표적화 송달을 위한 리간드로서 사용되고 있으며, 약물 미봉입 Oct 수식 리포솜 자체가 세포 독성을 나타낸다는 것은 예상 밖이었다. 본 발명의 의약 조성물에 의해 나타나는 생체 내에서의 MTC에 대한 효과는, 여기에 봉입된 CPT-11의 효과가 Oct 수식 리포솜에 의해 상가적 또는 상승적으로 증강된 것일 가능성이 있다. 갑상선수양암(C 세포)을 사용한 생체 내 담암 동물 모델 실험에서는, 유리된 약제 및 리간드가 없는 CPT-11 봉입 나노 제제가 부분 관해인 데 비해, CPT-11 봉입 Oct 수식 나노 제제는 완전 관해되었다. 이것은, 최적인 Oct의 수식률에 의한 증강 효과에 의한 것이라고 생각되기 때문에, 본 발명의 Oct 수식 나노 제제는 다른 항암제에 대해서도 동일한 효과를 갖는 것을 기대할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: Oct 수식 리포솜의 특징

(1) 리포솜의 제조 및 수식

디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC, 니찌유) 및 콜레스테롤(Chol, 와코 쥰야꾸)(몰비 55:45; 질량비 80 mg:32 mg)을 에탄올에 용해하고, 70℃로 설정한 회전 증발기를 사용하여 에탄올을 약간 남기고 제거하였다. 이것에 트리에탄올아민으로 pH 6.5로 조정한 80 mM 피틴산(IP-6) 용액(나카라이 테스크)을 가하고, 얻어진 혼합물을 70℃로 따뜻하게 하면서 5분간 격하게 진탕하여, 리포솜을 얻었다. 얻어진 리포솜을 재차 증발기에 가하고, 나머지 에탄올을 제거하였다. 초음파 처리에 의해 리포솜 크기를 약 150 nm로 하였다. 세파덱스(Sephadex) G50을 사용한 겔 여과에 의해 외액을 HBS 완충액(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4)으로 치환하고, 리포솜 분획을 모았다. 인지질 테스트 와꼬(와코 쥰야꾸)를 사용하여 모은 리포솜 분획의 DSPC 농도를 측정하였다. 구한 DSPC 농도 및 DSPC:Chol의 몰비(55:45)에 기초하여 총 지질량을 산출하였다.

제조한 리포솜 용액에 이리노테칸(「CPT-11」, 야쿠르트 본사) 수용액(10 mg/ml)을 CPT-11:총 지질=0.6:1(질량비)이 되도록 가하고, 60℃에서 60분 인큐베이트하여 CPT-11을 봉입하였다. 독소루비신(「DXR」, 와코 쥰야꾸) 봉입 리포솜의 경우에는, DXR:총 지질=0.2:1(질량비)이 되도록 DXR을 가하고, 60℃에서 25분 인큐베이트하여 봉입하였다. 인큐베이션 종료 후, 5분간 빙냉하여 반응을 정지하였다. 미봉입의 약물을 세파덱스 G50을 사용한 겔 여과에 의해 제거하여, 미수식 리포솜(「CL」)을 얻었다.

옥트레오티드-폴리(에틸렌글리콜)₃₄₀₀-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Oct-PEG-DSPE, 고베 텐넨부츠 가가꾸) 수용액을 리포솜 총 지질량의 0.25, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4 또는 1.6 mol％가 되도록 상기에서 얻어진 CL에 가하고, 얻어진 혼합물을 60℃에서 20분간 가온하여(후성적 수식), Oct 수식 리포솜(Oct-CL)으로서 「0.25 Oct-CL」, 「0.8 Oct-CL」, 「1.0 Oct-CL」, 「1.2 Oct-CL」, 「1.4 Oct-CL」 및 「1.6 Oct-CL」을 얻었다.

(4.4 Oct-CL의 제조법임)

4.4 Oct-CL은, DSPC, Chol 및 Oct-PEG-DSPE(몰비 55:45:8.8; 질량비 5.68 mg:2.28 mg:6 mg)를 사용하여, 리포솜의 제조 및 DXR의 봉입은 CL과 동일한 방법으로 행하였다(유전적 수식).

PEG화 비Oct 수식 리포솜(「SL」)을, Oct-PEG-DSPE 대신에 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)₂₀₀₀-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(PEG-DSPE, 니찌유)을 1.6 mol％가 되도록 가하여 제조하였다.

약물 미봉입 리포솜을 약물(CPT-11, DXR) 봉입을 행하지 않은 것 이외에는, 상기한 약물 봉입 리포솜과 동일한 절차로 제조하였다.

(2) Oct 수식 리포솜의 특징

얻어진 Oct 수식 리포솜(0.25 Oct-CL, 0.8 Oct-CL 및 1.6 Oct-CL) 및 미수식 리포솜(CL) 및 PEG화 비Oct 수식 리포솜(SL)에 대하여, 크기(nm) 및 제타 전위(mV)(ELS-Z2(오오쓰카 덴시) 사용) 및 CPT-11 봉입 효율(％)을 측정하였다. 리포솜 중의 약물의 농도를 1％ Triton에 의한 리포솜의 파괴 후, DXR에 대해서는 480 nm에서 UV-1700 파마스펙(PharmaSpec)(시마즈 세이사꾸쇼)을 사용하여, CPT-11에 대해서는 여기 파장 375 nm 및 형광 파장 535 nm에서 왈락(Wallac) ARVO SX1420 멀티 라벨 카운터(퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용하여 측정하였다. 결과를 평균±SD(n=3)로 표 1에 나타낸다.

옥트레오티드(Oct) 농도의 증가에 따라(0 내지 1.6 mol％), 리포솜의 제타 전위가 저하되었다. 이것은, 리포솜이 Oct로 수식된 것을 시사한다. 리포솜의 수식 후의 최종 Oct 농도를 1％ Triton에서의 1:1,000 희석 후에 Oct-EIA 키트(페닌슐라 래보러토리즈(Peninsula Laboratories))를 사용하여 측정한 바, 각각의 Oct 수식 리포솜에서의 Oct의 양은 이론값의 70％보다 많았다. CPT-11 봉입 효율은 CL 이외의 모든 리포솜에서 >82％였다. 모든 타입의 리포솜의 평균 직경 및 그 중에 봉입된 CPT-11의 양은, 암소 4℃에서 적어도 1개월 변화되지 않았다.

실시예 2: 세포 내 수용에 대한 Oct 농도의 효과

소마토스타틴 수용체(SSTR)를 고발현하는 인간 갑상선수양암 세포주인 TT 세포(유럽 세포 배양 콜렉션(European Collection of Cell Cultures; ECACC))로부터 입수)를 6웰 플레이트에, 10％ 열 불활화 소태아 혈청(FBS)을 보충한 Ham's F-12 배지 중, 10⁴ 세포/웰의 밀도로 파종하고, 72시간 배양하였다. 세포에 DXR량으로서 50μg/ml의 0.25 Oct-CL, 0.8 Oct-CL, 1.0 Oct-CL, 1.2 Oct-CL, 1.4 Oct-CL, 1.6 Oct-CL, 4.4 Oct-CL 또는 SL을 포함하는 배지(2 ml/웰)를 첨가하고, 37℃에서 1 또는 2시간 인큐베이트하였다. 또한, CPT-11은 하기의 파장으로 여기되지 않기 때문에, 본 실시예에서는 CPT-11 대신에 DXR을 봉입한 리포솜을 사용하였다. 배지를 제거하고, PBS(pH 7.4)로 3회 세정하고, 이어서, 리포솜의 세포 내 수용을 488 nm 아르곤 이온 레이저를 구비한 FACS 칼리버(Calibur) 유세포 분석기(벡턴-딕킨슨(Becton-Dickinson)) 및 셀 퀘스트(CELL Quest) 소프트웨어(벡턴-딕킨슨 이뮤노시토메트리 시스템(Becton-Dickinson Immunocytometry System))를 사용하여 분석하였다. 2시간의 배양 후의 상대 평균 형광 강도를 도 1에 도시한다. 도 1에 있어서, 0.25, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 4.4 및 SL은 각각 0.25 Oct-CL, 0.8 Oct-CL, 1.0 Oct-CL, 1.2 Oct-CL, 1.4 Oct-CL, 1.6 Oct-CL, 4.4 Oct-CL 및 SL에 대한 결과를 나타내고, *는, SL과의 통계적 유의차를 나타낸다(p<0.05).

도 1에 도시한 바와 같이, Oct 수식되어 있지 않은 SL에 비해 0.25 Oct-CL 및 0.8 Oct-CL의 세포 내 수용은 오히려 낮았다. 또한, 0.25 Oct-CL과 0.8 Oct-CL과의 사이에는 유의한 차는 없었다. 한편, 1.4 Oct-CL, 1.6 Oct-CL 및 4.4 Oct-CL의 세포 내 수용은 다른 것에 비해 유의하게 높았다. 즉, 종래 기술에서 사용되었던 낮은 Oct 농도(약 0.5％)에서는, Oct 수식에 의한 세포 내 수용 증강 효과는 관찰되지 않고, 세포 독성의 발휘에서 높은 Oct 농도(1.6 mol％)에서의 Oct 수식이 유효하다는 것이 나타났다.

2시간 인큐베이트한 후의 1.6 Oct-CL의 형광 강도는 1시간 후의 2배로 증가하였지만, SL에서는 그와 같은 증가는 관찰되지 않았다. 즉, Oct-CL의 세포 내 수용은 인큐베이션 시간 의존적으로 증가한다는 것이 나타났다.

실시예 3: 경합 저해 시험

실시예 2에 있어서 관찰된 세포 내 수용이 소마토스타틴 수용체(SSTR)를 통하고 있는지의 여부를 조사하기 위해, 경합 저해 시험을 행하였다. 상세하게는, 20배몰 과잉량(84 nmol/ml)의 유리 Oct(아크리스 안티바디즈 게임베하(Acris Antibodies GmbH))의 존재하에서의 DXR을 봉입한 1.6 Oct-CL(Oct: 4.2 nmol/ml)의 37℃에서 2시간의 TT 세포 내 수용을 유세포 분석기에 의해 조사하였다. 그 결과, 과잉량의 유리 Oct는 1.6 Oct-CL의 세포 내 수용에 영향을 주지 않았다. 그 이유는 분명하지 않지만, 상기한 결과에 의해 Oct 수식 리포솜의 SSTR에 대한 친화성이 유리 Oct보다 높은 것이 시사되었다.

이어서, 2배 용량(258μL)의 약물을 봉입하지 않은 비어 있는 1.6 Oct-CL(Empty 1.6 Oct-CL), 또는 대조군으로서 비어 있는 SL(Empty SL)의 존재하에서의 DXR을 봉입한 1.6 Oct-CL의 37℃에서 2시간의 TT 세포 내 수용을 유세포 분석기에 의해 조사하였다. 그 결과, 어떠한 경우에도 저해가 관찰되었지만, Empty Oct-CL 존재하에서의 세포 내 수용은 Empty SL 존재하에서의 약 절반이며, Empty Oct-CL 에 의한 세포 내 수용의 유의하게 높은 경합적 저해가 나타났다(도 2(B)). 이 경합적 저해를 모식적으로 도 2(A)에 도시한다. 또한, 공초점 레이저 현미경 관찰에 의해, 봉입한 약물(DXR)은 핵 내에 수용되어 있는 것이 나타났다(도 3). 이와 같이, 약제를 봉입한 1.6 Oct-CL의 핵 내로의 수용이 Oct 수식 의존성인 것이 나타났다.

실시예 3: 세포 독성 시험

(1) CPT-11 봉입 리포솜을 사용한 세포 독성 시험

TT 세포를 96웰 플레이트에 10⁴ 세포/웰의 밀도로 파종하고, 여기에 다양한 농도의 유리 CPT-11, 1.6 Oct-CL 또는 SL을 첨가하고, 48시간, 72시간 및 96시간 인큐베이트하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세정한 후, 발색 시약(셀 카운팅 키트(Cell Counting kit)-8, 도진 가가꾸 겐뀨쇼)을 1웰(100μL)당 10μL 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 측정하여 IC50(㎛)을 산출하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 어떠한 경우에도 세포 독성은 경시적으로 증가하였다. 96시간에서의 SL에 대한 IC50값은, 유리 CPT-11의 것과 거의 동일하였다. 한편, 1.6 Oct-CL의 세포 독성은, 48시간에는 유리 CPT-11보다 낮았지만, 96시간에는 유리 CPT-11의 약 1/2로 유리 CPT-11을 상회하였다. 즉, 어떠한 약물 봉입 리포솜에 대해서도 세포 독성은 보였지만, Oct 수식한 약물 봉입 리포솜을 사용한 경우, 장시간의 인큐베이션 후에 세포 독성이 증강된다는 것이 나타났다. 이것은, 수용체를 통한 엔도사이토시스 기구에 의해 세포 내 수용이 촉진되고, 활성형의 SN-38로의 변환에 의해 발휘되는 CPT-11의 세포 독성이 증강되기 때문인 것이 확인되어 있다(데이터는 나타내지 않음).

(2) 약물 미봉입 리포솜을 사용한 세포 독성 시험

상기 결과로부터, CPT-11 뿐만 아니라 표적화를 위한 리간드로서의 Oct로 수식한 리포솜 자체가 세포 독성을 갖고 있을 가능성이 시사되었다. 따라서, 이어서 세포 독성에 대한 리간드(Oct)의 효과를 평가하기 위해, CPT-11 미봉입의 리포솜을 사용하여 세포 독성 시험을 행하였다. 상세하게는, 96웰 플레이트에 파종한 TT 세포에, 각종 농도(Oct량으로서 0.042 내지 8.4 ㎛)의 약물을 봉입하지 않은 PEG화 비Oct 수식 리포솜(Empty SL), 약물을 봉입하지 않은 1.6 mol％ Oct 수식 리포솜(Empty 1.6 Oct-CL), 약물을 봉입하지 않은 4.4 mol％ Oct 수식 리포솜(Empty 4.4 Oct-CL), 대조군으로서의 유리 Oct를 첨가하여, 96시간 인큐베이트하였다. 세포를 PBS로 세정한 후, 발색 시약을 첨가하고, 450 nm로 흡광도를 측정하였다. 여기서 Empty 4.4 Oct-CL을, 처음부터 Oct-PEG-DSPE를 DSPE:Chol:Oct-PEG-DSPE=55:45:8.8(몰비)이 되도록 가한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 제조하였다. 이것은, Oct-PEG-DSPE가 낮은 수용성이기 때문에, 1.6 mol％보다 높은 농도에서의 후성적 수식이 곤란하기 때문이다.

결과를 도 4에 도시한다. 도 4에서 각 농도에 대하여 4개의 막대는, 각각 좌측으로부터 유리 Oct, Empty 1.6 Oct-CL, Empty 4.4 Oct-CL, Empty SL에 대한 세포 생존율(％)을 나타낸다. 어떠한 농도에서도, 유리된 Oct에 세포 독성이 관찰되었다. 리포솜 중에서는, 보다 고농도의 Oct로 수식된 Empty 4.4 Oct-CL이 어떠한 농도에서도 특히 높은 세포 독성을 나타내고, 이것은 유리 Oct의 것보다 높았다. 이 결과는, 리포솜에서의 고농도의 Oct가 세포 독성을 나타내는 것을 시사한다.

(3) Akt, TSC2 및 p70S6K의 인산화에 대한 Oct-CL의 효과

Oct는, PI3K/Akt/TSC2/mTOR/p70S6K 시그널 캐스케이드(도 5)의 TSC2, mTOR 및 p70S6K 단백질의 인산화에 관여하는 것이 알려져 있다. 상기한 Oct에 의한 세포 독성과 PI3K/Akt/TSC2/mTOR/p70S6K 시그널 캐스케이드와의 관계를 조사하기 위해, 이 경로의 Akt, TSC2 및 p70S6K의 인산화에 대한 Empty 1.6 Oct-CL의 효과를 조사하였다. 상세하게는, TT 세포를 Empty 1.6 Oct-CL(Oct 농도로서 0.42 ㎛) 또는 Empty SL(Empty 1.6 Oct-CL의 지질량에 상당하는 양)로 24시간 처리한 후, 세포 추출액(단백질량: 40μg/레인) 중의 Akt(분자량 60 kDa), TSC2(분자량 200 kDa) 및 p70S6K 단백질(분자량 70 kDa, 85 kDa)을 전기 영동하고, 일차 항체로서의 Akt-항체, TSC2-항체, p70S6K-항체, phospho-Akt-항체, phospho-TSC2-항체 및 phospho-p70S6K-항체(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 전부 1000배 희석) 및 이차 항체로서의 염소 항토끼-HRP(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 2500배 희석)를 사용하여 검출을 행하였다.

도 6에 도시한 바와 같이 Empty 1.6 Oct-CL을 첨가한 경우, p70S6K의 인산화가 저하되었지만, Akt 및 TSC2의 인산화에는 영향이 없었다. Empty SL은, 이번에 검토한 Akt, TSC2 및 p70S6K의 인산화에 영향을 주지 않았다. 이것은, Empty Oct-CL에 의한 세포 독성은 PI3K/Akt/TSC2/mTOR/p70S6K 시그널 캐스케이드에서의 인산화의 저하에 관련하는 것을 시사한다. 또한, 이 인산화의 저하가 Empty SL에서는 일어나지 않기 때문에, 리포솜을 구성하는 지질에 의한 영향이 아니라 리간드인 Oct에 관련하는 것을 시사한다.

실시예 4: 생체 내에서의 CPT-11 봉입 리포솜의 효과

CPT-11을 봉입한 Oct 수식 리포솜의 생체 내에서의 효과를 조사하기 위해 이하의 실험을 행하였다. TT 세포 10⁷개를 마우스(ICR nu/nu 마우스, 6주령, 메스, 오리엔탈 코보)에 이식하여, 100 내지 250cm³의 종양 부피의 종양을 형성시켰다. 각 군 4마리의 마우스에 CPT-11량으로서 10 mg/kg 체중의 미수식 리포솜(CL), 1.6 mol％ Oct-PEG-DSPE로 수식한 리포솜(1.6 Oct-CL), 1.6 mol％ Oct-PEG-DSPE 및 0.9％mol％ PEG-DSPE로 수식한 리포솜(1.6 Oct-SL)을 투여하였다. 투여는 꼬리 정맥으로부터 2회(1일째, 4일째) 행하였다. 대조군으로서, 생리 식염수, 유리 CPT-11(30 mg/kg)을 3회(1일째, 4일째, 7일째) 투여하였다. 종양 크기 및 체중을 경시적으로 측정하였다. 결과를 각각 도 7 및 8에 도시한다. 도 7, 8에서 백색 동그라미, 삼각형, 회색 사각형, 흑색 동그라미, 백색 사각형은 각각 CL, 1.6 Oct-CL, 유리 CPT-11, 생리 식염수, 1.6 Oct-SL에 대한 결과를 나타낸다. 도 7에서 실선의 화살표는 CL, 1.6 Oct-CL, 1.6 Oct-SL의 투여를, 파선의 화살표는 유리 CPY-11, 생리 식염수의 투여를 나타내고, *는 CL에 대한 유의차(p<0.05)를 나타낸다. 또한, 생존 시간 및 누적 생존율을 각각 표 3 및 도 9에 나타낸다. 도 9에서 동그라미, 사각형, 삼각형은 각각 CL, 1.6 Oct-CL, 1.6 Oct-SL에 대한 결과를 나타낸다. 표 3에서의 ％ILS를, 생리 식염수를 대조군으로 하여 [(처치군 평균 생존 일수)-(대조군 투여군 평균 생존 일수)/(대조군 투여군 평균 생존 일수)]×100(％)의 식에 따라 산출하였다. 표 3 중의 메디안은 N 마리의 동물을 포함하는 각각의 군에 대한 생존 시간(일)의 중앙값을 나타낸다.

측정 기간 중, 체중에 유의한 차는 보이지 않았다. 유리 CPT-11을 투여한 경우에는, 생리 식염수를 투여한 경우와 마찬가지로 종양 크기가 증가하고, 연명 효과는 보이지 않았다. CL의 경우도 거의 동일한 결과가 얻어졌다. 한편, Oct 수식한 리포솜(1.6 Oct-CL, 1.6 Oct-SL)을 투여한 경우에는, 모두 종양 크기의 증가가 유의하게 억제되고, 생존 시간 및 생존율이 유의하게 증가하였다. 특히 1.6 Oct-CL 투여군에서는 절반수의 동물이 약물 투여 종료 후에도 300일 이상 생존하여, 종양이 완전히 치유된 것이 시사되었다.

유리 CPT-11은 생체 외에서는 세포 독성을 나타내었지만(실시예 3, 표 2, 도 4 등), 생체 내에서는 대조군으로서 사용한 생리 식염수와 동일한 효과밖에 나타내지 않았다. 이와 같이, 생체 외에서의 결과로부터 생체 내에서의 효과를 예측하는 것은 곤란하였다. 본 발명자들은, 지금까지 유효한 약물 요법이 확립되어 있지 않은 MTC를, Oct 수식 리포솜을 사용하여 생체 내에서 치료할 수 있는 것을 처음으로 나타내었다. 또한, Oct 수식 리포솜을 사용한 경우의 CPT-11의 투여량은, 유리 CPT-11의 투여량보다 꽤 낮았다(1/3). 즉, 본 발명에 따르면, CPT-11의 투여량을 저하시키고, 부작용을 경감할 수 있다는 것이 나타났다.

마찬가지로, CPT-11량으로서 10 mg/kg 체중의 1.6 Oct-CL 및 2.5％mol％ PEG-DSPE로 수식한 리포솜(2.5 Oct-SL) 및 대조군으로서의 생리 식염수를, 100cm³의 종양 부피의 종양을 갖는 각 군 6마리의 마우스에 꼬리 정맥으로부터 2회(1일째, 4일째) 투여하여, 종양 크기, 체중 및 생존율을 경시적으로 측정하였다. 결과를 각각 도 10, 11 및 12에 도시한다. 도 10, 11 및 12에서 백색 삼각형, 동그라미, 흑색 삼각형은 각각 1.6 Oct-CL, SL, 생리 식염수에 대한 결과를 나타낸다. 도 10에서 * 및 #은 각각 SL 및 1.6 Oct-CL에 대한 유의차(p<0.05)를 나타낸다. 이 경우에도, 1.6 Oct-CL 투여군에서 약물 투여 종료 후에도 종양 크기의 증가가 거의 완전히 억제되었다. Oct 수식되어 있지 않은 SL에 대해서도 종양 크기의 억제는 관찰되었지만, 1.6 Oct-CL 투여군에서의 억제 효과가 유의하게 높았다.

Claims

옥트레오티드로 수식된 리포솜을 포함하는 암의 치료, 완화 케어 또는 예방용 의약 조성물.
제1항에 있어서, 리포솜에서의 옥트레오티드의 농도가 0.8 mol％ 초과인 의약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 리포솜이 폴리(에틸렌글리콜)로 더 수식되어 있는 의약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생리 식염수를 대조군으로 한 경우의 연명률을 나타내는 ％ILS가 100 이상인 의약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜에 이리노테칸이 봉입되어 있는 의약 조성물.
제5항에 있어서, 이리노테칸의 투여량이 20 mg/kg 체중 이하인 의약 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 갑상선수양암인 의약 조성물.