JP2006265152A - 癌治療用薬剤及びその作製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 パクリタキセル誘導体を目的細胞や目的組織に対して特異的に送達することが可能な癌治療用薬剤及びその作製方法を提供する。
【解決手段】 粒子形成能を有するタンパク質、例えばＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質を真核細胞中で発現させることにより中空ナノ粒子を形成し、配糖化により水溶性を高めたパクリタキセル誘導体をこの中空ナノ粒子に封入する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、中空ナノ粒子を用いた癌治療用薬剤及びその作製方法に関し、特に、中空ナノ粒子の内部にパクリタキセル誘導体を封入した癌治療用薬剤及びその作製方法に関する。

近年、医学の分野において、患部に効果的に送達され、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞や目的組織に対して適切な濃度の薬物を適切な速度で送達し、作用させることのできる方法として注目されている。

例えば、パクリタキセルは、肺癌、胃癌、乳癌、卵巣癌等を対象として一般的に用いられている疎水性の抗癌剤であるが、現在のようにヒマシ油及びエタノールに溶解して静脈内投与する形態では過敏症等を引き起こす可能性があるため、α−トコフェロール、界面活性剤及び水層を加えてエマルジョンとし、このエマルジョンを静脈内投与、又はゼラチンカプセルに封入して経口投与することが提案されている（特許文献１を参照）。

特表２００１−５０８４４５号公報 特開２００１−３１６２９８号公報

しかしながら、特許文献１のようにエマルジョンの形態で投与する場合、目的細胞や目的組織に対して特異的にパクリタキセルを送達することができないという問題があった。

一方、本件発明者らは、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子を用いて、目的細胞や目的組織に対して、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的且つ安全に運搬、導入するための方法を提案しているが（特許文献２を参照）、この方法を用いる特定疾患、例えば癌に対する治療薬の開発がさらなる課題となっていた。

本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、パクリタキセル誘導体を目的細胞や目的組織に対して特異的に送達することが可能な癌治療用薬剤及びその作製方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するために、本発明に係る癌治療用薬剤は、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子にパクリタキセル誘導体が封入されてなることを特徴とする。

また、上述した目的を達成するために、本発明に係る癌治療用薬剤は、真核細胞に粒子形成能を有するタンパク質を発現させて中空ナノ粒子を形成し、該中空ナノ粒子にパクリタキセル誘導体を封入することを特徴とする。

ここで、上記タンパク質としては、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質を用いることができる。

本発明に係る癌治療用薬剤、すなわち本発明に係る癌治療用薬剤の作製方法によって作製される癌治療用薬剤は、肝細胞特異的レセプタを表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的にパクリタキセル誘導体を送達することができ、また、表面のレセプタを任意の生体認識分子に改変することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に特異的にパクリタキセル誘導体を送達することが可能となる。

本実施の形態における癌治療用薬剤は、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子にパクリタキセル誘導体を封入することによって、任意の細胞或いは組織、例えば肝細胞、肝組織に特異的にパクリタキセル誘導体を送達することを可能とするものである。このような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々のウイルスから得られるサブウイルス粒子を適用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B Virus；ＨＢＶ）表面抗原タンパク質等が例示される。

また、このような粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子としては、真核細胞でタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。このとき、真核細胞としては、酵母や遺伝子組換え酵母、昆虫細胞、動物細胞等が適用できる。

本件発明者らは、既に、遺伝子組換え酵母でＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質を発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している（J. Bio. Chem., Vol.267, No.3, 1953-1961, 1992）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムやＨＢＶタンパク質を全く含まないので、ウイルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、ＨＢＶの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプタを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高い。

このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。

一方、昆虫細胞や動物細胞は、酵母よりも高等動物に近い真核細胞であるといえ、酵母では再現しきれない糖鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞の系はバキュロウイルスを用いた系で、ウイルス発現を伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテアーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があった。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培地中に含まれる牛胎仔血清が大量に混入することで、その精製が困難であった。しかし、最近になって、バキュロウイルスを介さない昆虫細胞系で、無血清培養可能なものがインビトロゲン（Invitrogen）社により開発され、市販されている。したがって、このような昆虫細胞を用いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタンパク質粒子が得られる。

本実施の形態に用いる中空ナノ粒子では、以上のような種々の方法によって得られた粒子表面のレセプタを任意の生体認識分子に改変することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質を運搬することが可能となる。

勿論、粒子形性能を有するタンパク質は、上述のＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウイルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウイルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを生体認識分子として用いてもよい。

本実施の形態では、以上のような中空ナノ粒子に、任意の細胞又は組織、例えば肝細胞又は肝組織に導入したいパクリタキセル誘導体を封入することによって、癌治療用薬剤を得る。

パクリタキセル誘導体を上述の中空ナノ粒子に導入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。例えば、エレクトロポレーション法、超音波法、単純拡散法、或いは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。

そして、これらの中空ナノ粒子を用いることで、in vivo或いはin vitroで細胞又は組織に特異的にパクリタキセル誘導体を送達することが可能となる。

以下、本発明を適用した具体的な実施例について、図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。

以下の実施例において、ＨＢｓＡｇとは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（Hepatitis B virus surface Antigen）を示す。ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶの外被タンパク質であり、図１の摸式図に示すように、ＨＢｓＡｇには、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の３種類がある。このうち、Ｓタンパク質は、３種のタンパク質に共通した、重要な外被タンパク質であり、Ｍタンパク質は、Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸からなるｐｒｅ−Ｓ２ペプチドが付加したものである。また、Ｌタンパク質は、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８又は１１９アミノ酸からなるｐｒｅ−Ｓ１ペプチドが付加したものである。このＬタンパク質の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。

ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のｐｒｅ−Ｓ１領域は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている（Cell, Vol.46, 429-436, 1986 ; J. of Virol., Vol.73, 2052-2057, 1999）。

真核細胞でＨＢｓＡｇを発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。以下の実施例では、ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を用いた。

実施例１
パクリタキセル誘導体の作製
パクリタキセルは水性溶媒に殆ど溶解しないため、実施例１では、水性溶媒への溶解性を向上させたパクリタキセル誘導体（７−α−ＧＬＧ−ＰＴ）を作製した。

具体的には、下記の反応式に示されるように、パクリタキセルの２’位を常法によりトリエチルシリル化した３．２４４ｇの化合物（ａ）に、８１９ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンと、１．２８４ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とを加えた後、不活性ガス雰囲気下、ジクロロメタン７ｍｌに溶解させた２．３４１ｇのテトラベンジル酢酸オキシα−グルコシド（ｂ）を加え、室温で２３時間攪拌した後、反応溶液を処理・精製し、パクリタキセルの７位にグリコール酸を介して配糖化した４．１４８ｇの化合物（ｃ）を得た。そして、その化合物４．１４８ｇに酢酸１０ｍｌと、パラジウム黒２５０ｍｇとを加え、水素雰囲気下、５０℃にて４２時間激しく攪拌し、さらにテトラヒドロフラン３ｍｌと、水３ｍｌとを加えて室温で１９時間攪拌した。その後、反応溶液を処理・精製して１．１５０ｇの７−α−ＧＬＧ−ＰＴ（ｄ）を得た。

実施例２
遺伝子組換え細胞によるＨＢｓＡｇ粒子の発現
実施例２では、サル腎由来細胞ＣＯＳ７を用いて、パクリタキセル誘導体（７−α−ＧＬＧ−ＰＴ）を封入するためのＨＢｓＡｇ粒子（中空ナノ粒子）を作製した。

具体的には、予め培養しておいたＣＯＳ７細胞を回収し、３００μｌずつ分注したエレクトロポレーション溶液（１８．５ｍｇ グルコース／１０ｍＬ ＲＰＭＩ／１ｍＭ ＤＴＴ）の各サンプルに４×１０^６個／３００μｌとなるように懸濁した。続いて、各サンプル液にＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドを５μｇずつ加えてよく混合し、混合後のサンプル液を４ｍｍギャップのエレクトロポレーション用キュベットに移し、氷上で５分間冷却した。そして、エレクトロポレーションシステムを用いて、０．３ｋＶ、９５０μＦの条件でエレクトロポレーションを行い、再び、キュベットを氷上に移して２分間冷却した。その後、培地としてＤＭＥＭ／５％ＦＢＳを１０ｍＬ加えておいた１００ｍｍディッシュにサンプルを移し、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下、１５時間培養した。培養後、培地をＣＨＯ−ＳＦＭII（GIBCO社製）８ｍＬに置き換え、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下、さらに３日間培養し、ＨＢｓＡｇ粒子が分泌された上清を回収した。そして、回収した上清を粒子抗原濃度が１００ｎｇ／ｍｌ以上になるまで限外濾過により濃縮し、ＨＢｓＡｇ粒子溶液として以降の実験に用いた。限外濾過にはVIVASPIN 20mL CONCENTRATOR-1000,000MWCO（VIVASCIENCE社製）を用いた。

実施例３
パクリタキセル誘導体（７−α−ＧＴＧ−ＰＬ）のＨＢｓＡｇ粒子への封入（癌治療用薬剤の作製）
実施例３では、実施例１で作製したパクリタキセル誘導体（７−α−ＧＬＧ−ＰＴ）を実施例２で作製したＨＢｓＡｇ粒子に封入した。

具体的には、ＤＭＦで濃度を調整した１μｌのパクリタキセル誘導体（７−α−ＧＴＧ−ＰＬ）を、５００μｌのＨＢｓＡｇ粒子溶液（粒子抗原量≒１００ｎｇ）とよく混合し、混合後のサンプル液を４ｍｍギャップのエレクトロポレーション用キュベットに移し、氷上で５分間冷却した。そして、エレクトロポレーションシステムを用いて、０．０５ｋＶ、７５０μＦの条件でエレクトロポレーションを行い、パクリタキセル誘導体（７−α−ＧＬＧ−ＰＴ）をＨＢｓＡｇ粒子に封入した。その後、サンプル液を室温で１０分間静置した後、１．５ｍｌチューブヘ移し、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収した。

実施例４
パクリタキセル誘導体（７−α−ＧＴＧ−ＰＬ）が封入されたＨＢｓＡｇ粒子の細胞への標的化
実施例４では、実施例３で得られたパクリタキセル誘導体（７−α−ＧＬＧ−ＰＴ）の封入されたＨＢｓＡｇ粒子を用いて、胎児肝臓由来細胞ＮＵＥへの標的化実験を行った。

具体的には、先ず、１００μｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳに１×１０^４個／１００μｌとなるように懸濁したＮＵＥ細胞を９６ウェルのプレートに播種し、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下、一晩培養した。続いて、各ウェルの培地を取り除き、実施例３で回収した上清を１００μｌずつ移して、さらに３日間培養した。その後、細胞賦活評価試験のため、各ウェルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromideを５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ溶液に溶解し、孔径０．４５μｍのフィルタで濾過滅菌したもの）を２０μｌずつ加え、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下、５時間培養した。培養後、１００μｌの細胞溶解液（１０％ＳＤＳ及び０．１％ＨＣｌを含む滅菌水）を加えて３７℃で細胞を溶解させ、溶解後に５７０ｎｍでの吸光度を測定した。測定結果を以下の表１及び図２に示す。

表１及び図２から分かるように、コントロールのパクリタキセル誘導体（７−α−ＧＬＧ−ＰＴ）と比較して、パクリタキセル誘導体（７−α−ＧＬＧ−ＰＴ）を封入したＨＢｓＡｇ粒子は、より強く細胞死を引き起こした。これは、パクリタキセル誘導体（７−α−ＧＬＧ−ＰＴ）を封入したＨＢｓＡｇ粒子によってＮＵＥ細胞が標的化され、パクリタキセル誘導体（７−α−ＧＬＧ−ＰＴ）が高効率に送達されたためと考えられる。

本発明の実施例におけるＨＢｓＡｇ遺伝子の各タンパク質領域を表す概略模式図である。 パクリタキセル誘導体（７−α−ＧＴＧ−ＰＬ）が封入されたＨＢｓＡｇ粒子をＮＵＥ細胞に加えたときの細胞賦活評価試験の結果を示す図である。

符号の説明

１ 粒子形成抑制部位、２ 直接的なヒト肝細胞特異的レセプタ、３ 糖鎖１、４ 間接的なヒト肝細胞特異的レセプタ（重合ヒト血清アルブミンレセプタ）、５ 膜貫通領域１、６ 膜貫通領域２、７ 糖鎖２、８ 膜貫通領域３

Claims (6)

1. 粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子にパクリタキセル誘導体が封入されてなることを特徴とする癌治療用薬剤。
2. 上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の癌治療用薬剤。
3. 上記パクリタキセル誘導体は、パクリタキセルを配糖化することにより水溶性を高めたものであることを特徴とする請求項１記載の癌治療用薬剤。
4. 真核細胞に粒子形成能を有するタンパク質を発現させて中空ナノ粒子を形成し、該中空ナノ粒子にパクリタキセル誘導体を封入することを特徴とする癌治療用薬剤の作製方法。
5. 上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする請求項４記載の癌治療用薬剤の作製方法。
6. 上記パクリタキセル誘導体は、パクリタキセルを配糖化することにより水溶性を高めたものであることを特徴とする請求項４記載の癌治療用薬剤の作製方法。
   

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