BRPI0905833A2 - mÉtodo de preparaÇço de amostra coproparasitolàgina fecal e composiÇço clarificante - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PREPARAÇçO DE AMOSTRA COPROPARASITOLàGICA FECAL E COMPOSIÇçO CLARIFICANTE. A presente invenção trata-se de um método técnico-laboratorial de enriquecimento parasitário e redução de impurezas fecais simultâneos em amostra para diagnóstico de enteroparasitoses humanas e animais. O método ora proposto compreende combinação de procedimentos técnicos laboratoriais apropriados e uso de soluções reagentes, sendo o referido método compatível com técnicas coproparasitológicas convencionais e/ou kits diagnósticos disponíveis no comércio. O invento confere melhoria da sensibilidade diagnóstica devido a dois fatores: a) um enriquecimento seletivo parasitário considerável e, b) uma redução drástica e concomitante de impurezas fecais. Mesmo quando as estruturas de diversas espécies parasitárias estão presentes em pequeno número nas amostras fecais, o invento proposto confere capacidade de apresentar estas estruturas na lâmina, conferindo ao diagnóstico melhor desempenho e sensibilidade.
Description
METODO DE PREPARAQAO DE AMOSTRA COPROPARASITOL0GICA FECAL E COMPOSIQAO CLARIFICANTE
CAMPO DA INVENGAO
A presente invengao trata-se de um metodo tecnico-laboratorial de enriquecimento parasitario e redugao de impurezas fecais simultaneos em amostra para diagnostico de enteroparasitoses humanas e animais. O metodo ora proposto compreende combina^ao de procedimentos tecnicos Iaboratoriais apropriados e uso de solugoes reagentes, sendo ο referido metodo compativel com tecnicas coproparasitologicas convencionais e/ou kits diagnosticos disponiveis no comercio. O invento confere melhoria da sensibilidade diagnostica devido a dois fatores: a) um enriquecimento seletivo parasitario consideravel e, b) uma redugao drastica e concomitante de impurezas fecais. Mesmo quando as estruturas de diversas especies parasitarias estao preserves em pequeno niimero nas amostras fecais, ο invento proposto confere capacidade de apresentar estas estruturas na lamina，conferindo ao diagnostico melhor desempenho e sensibilidade. Os metodos de diagnostico coproparasitologicos hoje existentes apresentam falhas sob mesmas condigoes.
FUNDAMENTOS DA INVENQAO
Atualmente, os exames coproparasitologicos de fezes sao realizados por tecnicas convencionais ou kits comerciais e, em geral, executam apenas uma coleta de amostra. Este procedimento operacional faz com que estes metodos mostrem baixas e medias sensibilidades diagnosticas (Gomes JF, Hoshino- Shimizu S, Dias LCS, Araujo AJSA, Castilho VLP1 Neves ΑΜΑ. Evaluation of a novel kit (TF-Test) for the diagnosis of intestinal parasitic infections. J Clin Lab Analysis 2004; 18: 132-138; Nazer H, Greer W, Sonnelly K, Mohamed AE, Yaish H, Kagalwalla PR. The need for three stool specimens in routine laboratory
examinations for intestinal parasites. Br J Clin Pract 1993; 47:76-78; Hiatt RA, C) 2/20
Markell ΕΚ. How many stool examinations are necessary to detect pathogenic intestinal protozoa. J Trop Med Hyg 1995; 53:36-39). Por apresentarem precarios sistemas de fiItragem e de elimina^o de impurezas, muito destes metodos resultam um sedimento fecal com elevada quantidade de impurezas, dificultando a detec^ao do parasito, alem de induzir ο profissional de microscopia ao falso resultado diagnostico, seja positivo ou negativo.
Em rotinas laboratoriais, as tecnicas coproparasitologicas convencionais mais empregadas sao: Lutz/Hoffman et al., Faust et al·, Rugai et al. e Kato-Katz et al. conforme descrito por De Carli GA (Parasitologia Clinica: Selesao de metodos e tecnicas de Iaboratorio para ο diagnostico das parasitoses humanas. 3a. Edigao. Sao Paulo: Atheneu; 2007) e Garcia LS (Diagnostic medical parasitology. 5th edition. Washington DC: ASM Press; 2007).
Por sua vez, os kits comerciais mais empregados sao: Coprotest (NL Com. Exterior Ltda.) e Paratest (Diagnostek lnd. Com. Prod. Cientificos), ambos nacionais, alem de outros disponiveis somente no comercio exterior (Garcia LS. Diagnostic medical parasitology 5th edition. Washington DC: ASM Press; 2007) como: Macro-Con e Spincon (Meridian Diagnostics Inc.), Parasep (DiaSys/UK) e StiIIQuick (Labo-Moderne/France).
Visando melhorar a sensibilidade diagnostica do exame coproparasitologico de fezes os pedidos de patentee PCT: W0/2003/014705 e PI0104372-2, bem como a publicagao de Gomes JF (Avaliagao de um novo Kit (TF-Test) nacional destinado ao diagnostico de enteroparasitoses em amostras fecais, Dissertagao de Mestrado do Instituto de Biologia pela Universidade Estadual de Campinas, 2004), apresentam um kit (TF-Test) que possibilita ο diagnostico coproparasitologico em amostras fecais coletadas alternadamente em tres dias
diferentes, em uma solugao preservadora a base de formalina neutra, para serem 3/20
processadas em uma Cinica etapa, por meio de centrifugo-sedimenta^ao, realizando as tarefas de remo^ao de impurezas fecais, por meio de uma pega plastica intermediaria， denominada conjunto de fiItros, contendo duas malhas metalicas paralelas; e enriquecimento de estruturas parasitarias em um tubo conico acoplado ao conjunto de filtros (Hoshino-Shimizu S, Gomes JF, Dias LCS. Inovagao tecnologica no projeto, desenvolvimento e produgao de kit diagnostico (Trabalho completo). In: 3°. Congresso Brasileiro de Gestao de Desenvolvimento de Produto; 2001 set. 25- 27; Florianopolis (SC). p. 1-6; Gomes JF, Hoshino- Shimizu S, Falcao AX. Recentes avangos tecnologicos no exame parasitologico de fezes. BioFarma - Revista Tecnico-Cientifica de Farmarcia, Bioquimica e Analises Clinicas e Toxicologicas, vol.3(6): 44-53’ 2008).
O kit proposto nos pedidos de patentes PCT: W0/2003/014705 e PI0104372-2 demonstrou melhoria na sensibilidade do diagnostico (oscilando de 82.6% a 97,8%, dependendo da regiao estudada, p.ex.) significativamente maior que as tecnicas convencionais e kits comerciais (Gomes JF, Hoshino-Shimizu S, Dias LCS, Araujo AJSA1 Castilho VLP1 Neves FAMA. Evaluation of a novel kit (TF- Test) for the diagnosis of intestinal parasitic infections. J Clin Lab Analysis 2004; 18: 132-138; e GOMES JF, Neves FAMA, Pascotto VM, Valle AP, Hoshino- Shimizu S, Dias LCS. Aumento da detecgao de enteroparasitos, com a utiliza^ao do Kit TF-Test, em regioes de baixa prevalencia, BotucatujSP. XIX Congresso Brasileiro de Parasitologia., 2005，Porto AIegre1RS.. Caderno de Resumos, v. 34. p. sup.esp.coprop.-sup.esp.coprop.).
O referido kit apresentou vantagens por ser pratico e possibilitar alto custo beneficio em rotina laboratorial. No entanto, apesar de demonstrar avangos ao exame de fezes, este kit continua a nao produzir ο efeito desejado, seja por permitir a Ieitura de uma pequena aliquota de sedimento fecal, de cerca de 50μΙ, ou por resultar um sedimento ainda com elevada concentragao de impurezas,
C；
4/20 %
apesar de inferior quando comparado com tecnicas convencionais e kits comerciais. A presente invengao propoe um novo metodo tecnico-laboratorial de enriquecimento parasitario e redugao de impurezas fecais simultaneos em amostra para diagnostico de enteroparasitoses humanas e animais compreendendo obten^ao de estruturas parasitarias entre protozoarios e helmintos intestinais. O presente metodo confere melhor aproveitamento do sedimento fecal para analise, aumentando a sensibilidade diagnostica independente da tecnica em questao e adicionalmente confere Iaminas com esfrega90 fecal com redugao drastica de impurezas, atraves da elimina^ao de excessos de corpos ou substancias estranhas presentes em sedimentos fecais processados por tecnicas coproparasitologicas.
O enriquecimento parasitario apresentado no pedido de patente PI0802292- de 23/07/2008 foi amparado pela dupla etapa de flutuagao-espontanea em que uma primeira etapa utiliza a solugao suIfato de zinco para obten?ao seIetiva de cistos, oocistos e esporos de protozoarios e uma segunda etapa utiliza as solutes saturadas de sulfato de magnesio e cloreto de sodio, com alta densidade especifica para a obtengao de ovos e Iarvas de helmintos. No entanto, ο presente metodo de enriquecimento parasitario tern apresentado problema no que se refere a nao flutuagao de ovos de alta densidade especifica ( > 1,19 g/mL ) , mesmo diante de tentativas de alteragao da densidade especifica de diversas solutes reagentes, bem como as acima mencionadas.
Adicionalmente, estas tentativas implicaram negativamente na alteragao da morfologia de varias especies de helmintos, sobretudo os de membranas externas mais delicadas, como exemplo: Ancilostomideos, Schistosoma mansoni e Hymenolepis nana. Desta forma, a dupla etapa de flutuagao-espontanea proposta no pedido de patente PI0802292-5 apresenta desvantagem e um
problema a ser resolvido no que se refere a eliminagao de impurezas frente a ovos de alta densidade especifica (> 1,19 g/mL) e Iarvas de helmintos. Outra desvantagem apresentada neste pedido de patente, bem como outros trabalhos constantes no estado da tecnica, se refere ao uso de formalina sem a indicagao da obrigatoriedade de a mesma estar em soli^ao neutra. Os kits hoje existentes quando fazem uso de formalina nao neutra ο que implica em destrui^ao de algumas especies de parasitos , mais especificamente protozoarios, interferindo na identifica^ao diagnostica dos mesmos.
O pedido de patente US905895 de 16/09/1975 apresenta um metodo de diagnostico apenas de ovos de helmintos de animais de pequeno porte, como
exemplo, caes e gatos.
O pedido de patente GB1530626 de 01/11/1978 detecta ovos de helmintos intestinais de amostras de humanos por um dispositivo denominado camera de flutuagao, no entanto, e um metodo que nao compreende diagnostico de todas as enteroparasitoses em amostras fecais de humanos. Adicionalmente, ο referido pedido de patente supracitado nao apresenta uma solugao para concentragao para obtengao de sedimento fecal.
O pedido de patente UA9265 de 15/09/2005 apresenta um metodo de diagnostico, no entanto, se restringe apenas a detec^ao de ovos de helmintos intestinais em amostras fecais de humanos. Adicionalmente, ο pedido de patente de 2005 refere-se a um metodo que consiste de uma etapa de sedimenta?ao simples ou espontanea e uma etapa de centrifugo-flutua9ao atraves do uso de sulfato de zinco e sacarose e nao apresenta um principio de concentra?ao parasitaria da amostra para a obtengao do sedimento fecal conforme a presente inven^ao ora apresentada. O pedido de patente W02008030607 de 13/03/2008 refere-se a um
equipamento que por meio de centrifugagao detecta somente ovos de helmintos
intestinais em amostras fecais de humanos. ■s β
ι
Araiijo utilizou um metodo de concentrasao parasitaria da amostra em formol-acetato de etila para a quantificagao de ovos de helmintos e avaliagao de sua aplicabilidade em inqueritos epidemiologicos (Araiijo AJUS. Disserta?ao de Mestrado da Faculdade de Ciencias Farmaceuticas da Universidade de Sao Paulo, 2000). Este metodo, quando comparado com a presente inver^ao, apresenta Iimitagao diagnostica por detectar somente ovos de quatro especies parasitarias, sendo: Schistosoma mansoni, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e Ancilostomideo.
apropriada, com maior sensibilidade e especificidade para a detecgao dos parasitos intestinais, uma vez que dele dependera ο tratamento medicamentoso especifico. Mendes realizou um estudo comparativo de tecnicas coproparasitologicas no diagnostico de parasitos intestinais para avaliar a concordancia entre os metodos Kato-Katz e Coprotest® na detecgao de ovos de helmintos.
Na comparagao observou-se uma diferenga estatistica significativa favoravel ao metodo de Kato-Katz, sobretudo para a detecgao de ovos de Trichuris trichiura, porem, demonstrando resultados de diagnosticos ainda com pouca sensibilidade, principalmente em infecgOes com baixa carga parasitaria (Mendes CR et al. Estudo comparativo de tecnicas parasitologicas: Kato-Katz e Coprotest®. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 38(2):178-180, 2005). Convem comentar que, os dois metodos acima citados foram avaliados comparativamente com ο kit TF-Test1 que apresentou sensibilidade diagnostica superior, segundo os achados de Gomes (Gomes JF. Avaliagao de um novo Kit (TF-Test) nacional destinado ao diagnostico de enteroparasitoses em amostras fecais, Dissertagao de Mestrado do Instituto de Biologia pela Universidade Estadual de Campinas, 2004).
Truant (Truant et al. Comparison of formalin-ethyl ether sedimentation, formalin-ethyl acetate sedimentation and zinc sulfate flotation techniques for
O diagnostico coproparasitologico deve ser realizado de maneira da Pro,
7/20
detection of intestinal parasites. Texas 77550, 1981) realizou um estudo comparativo entre tecnicas convencionais de sedimentagao, com ο uso de solugao de formalina em associagao com eter etilico e acetato.de etila, e de flutuasao- espontanea, com ο emprego de sulfato de zinco. O atual estudo apenas comparou a eficiencia diagnostica de dois procedimentos tecnicos convencionais, como por exemplo, de sedimenta^ao e flutuapao-espontanea. Desta maneira, a inven^ao proposta diferencia-se do estudo acima mencionado, sobretudo por se tratar do desenvolvimento de uma nova tecnica coproparasitologica, com diferentes procedimentos tecnicos laboratoriais.
Dryden e colaboradores (Dryden et al. Comparison of common fecal flotation
techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics, vol.6, n.1. 2005) realizaram um estudo comparativo entre tecnicas convencionais de flutuagao para a obtengao de ovos de helmintos e oocistos de protozoarios em fezes de animais. No entanto, a inven?ao proposta apresenta basicamente duas
expressivas vantagens sobre ο mencionado estudo, tais como: a) introduzir inovagao ao diagnostico das enteroparasitoses em humanos e animais; e b) detectar ovos e Iarvas de helmintos e cistos, oocistos e esporos de protozoarios intssti 门 3is.
enriquecimento parasitario e redu?ao de impurezas fecais simultaneos em amostra para diagnostico vantajosamente compreende detecgao de ovos e Iarvas de helmintos e cistos, oocistos e esporos de protozoarios intestinais presentes em amostras fecais, nao se restringindo apenas as de humanos, mas tambem em amostras fecais de animais. Em especial, a presente invengao soluciona ο problema de enriquecimento parasitario e eliminagao de impurezas fecais. Aprimoramentos sao evidenciados na presente inven^ao objetivando manter a integridade das estruturas dos protozoarios sem a destruigao dos mesmos durante
Em relagao ao estado da tecnica, ο presente metodo tecnico-laboratorial de
ο preparo da amostra para diagnostico. BREVE DESCRigAO DA INVENQAO
A presente inver^ao apresenta ο uso de uma composigao clarificante para eliminagao de impurezas das amostras de fezes para analise de diagnostico coproparasitologico.
E tambem um objeto da presente invengao um metodo tecnico-laboratorial
de preparo de amostra para diagnostico promovendo vantajosamente ο aumento de sensibilidade diagnostica as tecnicas coproparasitologicas compreendendo: a) enriquecimento parasitario consideravel; e b) redugao concomitante de impurezas fecais.
O metodo de enriquecimento parasitario e eliminagao de impurezas
proposto pela presente invengao compreende uma etapa de flutua?ao-espontanea seletiva de estruturas parasitarias com densidades especificas inferiores a 1,19 g/mL, incluindo cistos, oocistos e esporos de protozoarios, ovos de baixa e media densidade especifica e Iarvas de helmintos de menor tamanho. A referida etapa de sele^ao das estruturas parasitarias citadas anteriormente compreende flutuagao-espontanea adicionando um reagente.
Adicionalmente, a presente invengao contempla ο enriquecimento parasitario e eliminagao de impurezas do material fecal sedimentado espontaneamente, incluindo ovos de alta densidade especifica (> 1,19g/ml) e Iarvas de helmintos intestinais de maior tamanho, compreendendo eliminagao de impurezas fecais atraves de flutuagao-espontanea com adi^ao de uma composigao clarificante e em seguida conforme metodo ora apresentado na presente invengao, duas solutes reagentes.
O enriquecimento parasitario e eliminagao de impurezas de estruturas parasitarias com densidade especifica inferior a 1,19 g/mL, denominadas estruturas parasitarias leves, proposta nesta invengao e realizado separadamente
g 9/20
em relagao ao enriquecimento parasitario e eliminagao de impurezas de estruturas parasitarias com densidade superior a 1,19 g/mL, denominadas estruturas pesadas. Apos ο processamento Iaboratorial do metodo ora proposto, ambas as amostras de estruturas Ieves e pesadas sao aproveitadas para posterior diagnostico em microscopia de Iuz convencional (optica, p.ex·)·
As vantagens da invengao proposta em relagao aos procedimentos convencionais adotados atualmente sao: a) demonstrar maior sensibilidade diagnostica, por apresentar principio seletivo de remogao parasitaria do sedimento fecal processado, atraves de densidade especifica; b) redugao consideravel dos resuItados diagnosticos falsos negativos e positivos, por mostrar Iaminas livres, em grande parte, de impurezas fecais e analisar mais de 2/3 do sedimento fecal processado; c) rapidez, praticidade e seguran^a diagnostica; d) resgate da credibilidade no diagnostico de enteroparasitoses por parte da classe medica, evitando ο uso empirico, indiscriminado e ineficaz de medicamentos; e) e de permitir utilizar uma tecnica coproparasitologica de alta eficacia diagnostica em inqueritos para fins de Ievantamento epidemiologico em SaCide Piiblica.
BREVE DESCRIQAO DAS FIGURAS
Para melhor esclarecer ο metodo tecnico-laboratorial de enriquecimento parasitario e redugao de impurezas fecais simultaneos em amostra para diagnostico serao demonstradas as figuras da irivengao e sua descrigao, sem, no entanto, restringir ο escopo da presente invengao.
A Figura 1 ilustra ο metodo tecnico-laboratorial de enriquecimento parasitario proposto na presente invengao;
A Figura 2 ilustra ο metodo tecnico-laboratorial de enriquecimento
parasitario e eliminagao de impurezas proposto na presente ΐηνβηςδο; # I 10/20 :5 vh^J-
* 、、..-V·-
A Figura 3 ilustra um exemplo comparativo entre imagens de esfregago fecal com excesso de impurezas obtido conforme tecnicas convencionais de prepare da amostra;
A Figura 4 apresenta exemplos de enriquecimento parasitario de Iaminas preparadas pela atual invengao; e
A Figura 5 elucida outro exemplo comparativo de esfrega?os fecais processados por tres diferentes tecnicas coproparasitologicas. DESCRigAo DETALHADA DA INVENQAO
A presente invengao refere-se a um metodo tecnico-laboratorial de preparo de amostra fecal para um diagnostico coproparasitologico e os exemplos de concretiza^ao aqui apresentados tern a intengao de demonstrar ο efeito melhoria na sensibilidade de diagnostico frente as tecnicas hoje existentes sem no entanto Iimitar ο escopo de protepao.
Inicialmente, a presente ΐηνβηςδο e descrita em acompanhamento as Figuras apensas as quais serao brevemente enunciadas a seguir:
Na Figura 1 e ilustrado ο metodo tecnico-laboratorial de enriquecimento parasitario proposto na presente invengao atraves de flutuagao-espontanea das estruturas Ieves ( <1,19 g/mL) de interesse incluindo cistos, oocistos e esporos de protozoarios e ovos e Iarvas de helmintos intestinais de menor tamanho para posterior detecgao seletiva onde (A) representa um tubo de centrifugagao da tecnica coproparasitologica com todo ο sedimento fecal processado por centrifugo-sedimentagao; (B) representa tubos processadores (A e B) utilizados na invengao para acomodar sedimento fecal e solugoes reagentes; (C) sedimento fecal processado em Iaboratorio sendo adicionado ao tubo processador "A" para a realiza^ao da etapa de flutuagao-espontanea de parasitos; (D) tubos processadores (A e B) contendo sedimento fecal processado; (E) procedimento de adigao de solugao reagente ao sedimento fecal do tubo "A"; (F) menisco formado
na borda do tubo processador "A"; (G) sobreposigao da lamina de microscopia ao < ‘
ν ,广、.
menisco; (H) lamina sobreposta ao menisco em repouso (15 minutos); e (I) lamina e Iaminula preparadas para a Ieitura microscopica cuja area da laminula, Iocalizada na regiao central da lamina, rica em parasitos e Iivre de impureza fecal, e que sera aproveitada a leitura.
Na Figura 2 e iIustrado ο metodo tecnico-laboratorial de enriquecimento
parasitario e eliminagao de impurezas proposto na presente inven9§o atraves de sedimenta^ao-espontanea para obten?ao das estruturas de interesse denominadas pesadas (> 1,19 g/mL), incluindo ovos de aIta densidade especifica e Iarvas de helmintos intestinais de maior tamanho para detec^ao seletiva e flutuagao-espontanea para remogao de impurezas onde (A) uma composi?ao clarificante e adicionada ao tubo processador "B" contendo suspensao fecal; (B) suspensao em repouso no exemplo ora apresentado corresponde a um tempo de minutos; (C) tubo em repouso contendo suspensao fecal, composigao clarificante e uma solugao reagente; (D) tubo em repouso, apos homogeneiza?ao vigorosa, contendo s suspensao fecal, composigao clarificante e duas solu?5es reagentes; (E) impurezas fecais sendo elevadas por flutua^ao-espontanea (densidade especifica); e (F) lamina e laminula preparadas para a leitura microscopica em que a regiao central da referida area da laminula aproveitada a leitura esta rica em parasitos e com reduzida quantidade de impureza fecal. Na Figura 3 e ilustrado um exemplo comparativo nao Iimitativo entre
imagens de esfregago fecal com excesso de impurezas obtido conforme tecnicas convencionais de preparo da amostra vistas do microscopio de Iuz convencional com especial atengao a um cisto de protozoario (Giardia duodenalis) onde (A) corresponde a uma lamina obtida por tecnica de Lutz I Hoffman, Pons e Janer; (B) uma lamina obtida por por kit comercial Paratest® (Diagnostek lnd. Com. Prod. Cient.)； (C) uma lamina obtida por tecnica convencional de TF-Test® (PI -0104372-
2) e, (D) uma lamina obtida pelo metodo proposto pela presente invengao. Na Figura 4 sao apresentados exemplos nao Iimitativos de enriquecimentbvV-,,, parasitario de Iaminas preparadas pela atual inven?ao, em que: a imagem (A) demonstra a Iimpidez e a alta concentra^ao parasitaria por campo de imagem, com cerca de 36 ovos de Ascaris Iumbricoides fertil obtidos pela tecnica de flutuagao-espontanea, em aumento microscopico de 40 vezes; a imagem (B) apresenta lamina processada por sedimenta9ao-espontanea, Iivre de impurezas e preservando a boa morfologia de um ovo de Schistosoma mansoni, com aumento microscopico de 400 vezes; a imagem (C) fazendo exibir lamina processada por flutuagao-espontanea com dois cistos inalterados de Giardia duodenalis, com aumento microscopico de 400 vezes; imagem (D) expoe lamina processada por sedimentagao-espontanea contendo uma larva de tamanho grande de Strongyloides stercoralis, mostrando otima morfologia e aumento microscopico de 400 vezes; a imagem (E) mostra lamina processada por flutuagao-espontanea apresentando um ovo de Hymenolepis diminuta, com 400 vezes de aumento em microscopia; e, por fim, a imagem (F) ilustra lamina processada por sedimentagao-espontanea, com a presen^a de um ovo de Taenia spp. Iivre de impurezas fecais, com aumento microscopico de 400 vezes.
Na Figura 5 e elucidado outro exemplo comparativo nao Iimitativo de esfregagos fecais processados por tres diferentes tecnicas coproparasitologicas, com a presenga de ovo de Schistosoma mansoni, em que (A) equivale uma lamina obtida por tecnica de TF-Tesf-, (B) lamina obtida por tecnica convencional de Kato-Katz; e (D) lamina obtida pelo inovador metodo da atual invensao.
Para efeito da presente invengao, as seguintes defini9oes serao utilizadas: cistos, oocistos e esporos de protozoarios e ovos de baixa e media densidade especifica (< 1,19 g/ml) e Iarvas de helmintos intestinais de menor tamanho sao definidos como estruturas leves; ovos de alta densidade especifica (> 1,19 g/ml) e Iarvas de helmintos intestinais de maior tamanho sao definidos
como estruturas pesadas; impurezas fecais, de natureza animal e vegetal, 公從〜、 -ί •‘
13/20
definidas as como impurezas; recipiente de qualquer natureza e geometria paiU, acondicionamento e analise de amostras sem restrigao definido como tubo; composi^ao clarificante corresponde a uma composigao objeto da presente inven?ao para remogao de impurezas da amostra de fezes em uma etapa especifica do presente metodo.
A presente invengao apresenta ο uso de uma composigao clarificante associado a outros dois reagentes, em que ο aperfeigoamento consiste no uso da referida composigao clarificante com inedita aplicagao para eliminagao de impurezas das amostras de fezes para analise de diagnostico coproparasitologico e a seqiienda das etapas envolvendo a adi^ao tanto da composigao clarificante quanto dos dois reagentes posteriores resultando em efeito surpreendente e vantajosamente promover maior sensibilidade da analise diagnostica. A composigao do referido clarificante compreende um reagente gerador de cloro ativo selecionado dentre hipoclorito de sodio, hidroxido de sodio, cloreto de sodio e bicarbonato de sodio ou suas misturas para gerar um teor de cloro ativo de 2 a 2,5% pp e os dois reagentes utilizados seqiiencialmente compreende formalina neutra e acetato de etila preferencialmente P.A.
A mistura geradora de cloro ativo compreende um teor de hipoclorito de sodio que varia de 10 a 40% em peso, mais preferivelmente, 25%. A mistura geradora de cloro ativo tambem compreende um teor de bicarbonato de sodio de 5 a 20% em peso, mais preferivelmente 12,5%.
Estao apresentados exemplos de concretizagao de seu uso no preparo de amostras para diagnostico coproparasitologico para evidenciar e ilustrar seu efeito frente aos metodos, tecnicas e reagentes citados no estado da tecnica.
E tambem um objeto da presente invengao um metodo tecnico Iaboratorial
de preparo de amostra para diagnostico coproparasitologico das fezes que em
Iinhas gerais compreende as etapas de: a) enriquecimento parasitário, em separado, de estruturas leves e de estruturas pesadas com eliminação de impurezas fecais através do uso de dois tubos de processamento incluindo:
a1) flutuação-espontânea de estruturas leves para a detecção seletiva incluindo cistos, oocistos e esporos de protozoários e ovos de baixa e média densidade específica (<1,19 g/mL) e larvas de helmintos intestinais de menor tamanho em um primeiro tubo contendo amostra fecal;
a2) sedimentação-espontânea de estruturas pesadas incluindo ovos de alta densidade específica (> 1,19 g/ml) e larvas de helmintos intestinais de maior tamanho para detecção seletiva e, flutuação-espontânea de impurezas para posterior eliminação de um segundo tubo contendo amostra fecal; e a3) eliminação de impurezas em (a2) com a adição de uma composição clarificante de acordo com descrição anterior.
b) enriquecimento parasitário de estruturas leves e pesadas com o uso de um único tubo de processamento.
Segue a descrição detalhada da presente invenção. 1a etapa: Técnica de enriquecimento parasitário com o uso de dois tubos de processamento compreende técnica de flutuação-espontânea para detecção de cistos, oocistos e esporos de protozoários e ovos de baixa e média densidade específica (<1,19 g/mL) e larvas de helmintos intestinais de menor tamanho; e técnica de sedimentação-espontânea de parasitos com flutuação-espontânea de impurezas fecais para a detecção de ovos de alta densidade específica (> 1,19 g/ml) e larvas de helmintos intestinais de maior tamanho.
a) Técnica de flutuação-espontânea para a detecção seletiva de cistos, oocistos e esporos de protozoários e ovos de baixa e média densidade específica (< 1,19 g/ml) e larvas de helmintos intestinais de menor tamanho. A seguir encontra-se descrito um exemplo preferencial de concretização da referida etapa onde são apresentadas as variáveis da técnica incluindo volume de cada uma das soluções envolvidas e tempo de espera.
1. Esta etapa tem início logo após o processamento laboratorial de centrífugo- sedimentação da técnica coproparasitológica, em que parte do sedimento fecal, no
presente exemplo de concretização utilizou-se metade do sedimento fecal de cerca de 300μΙ, é transferido do tubo de centrifugação [Fig. 1, (A)] para os dois tubos (A e B) de processamento [Fig. 1, (B)1 (C) e (D)], por meio de qualquer dispositivo como, por exemplo, uma pipeta plástica descartável;
2. No primeiro tubo (A), adiciona-se ao sedimento uma solução de sulfato de zinco com densidade específica de 1,19g/ml, preferencialmente 1 mL, conseqüente
homogeneização da suspensão [Fig. 1, (E)];
3. Em seguida, o tubo é completado com a mesma solução, de modo a formar um menisco na sua borda [Fig. 1, (F)];
4. Uma lâmina de microscopia é colocada sobre o menisco, de forma a ficar em contato com a suspensão [Fig. 1, (G)];
5. Um tempo de 15 minutos é aguardado [Fig. 1, (H)] e, logo após, a lâmina é retirada da borda do tubo, com um movimento brusco de inversão, e colocada em um local apropriado. Uma película de suspensão é formada na região central da lâmina após inversão;
6. Adiciona-se uma gota de solução corante, à base de Lugol, sobre esta película de suspensão. Logo após, é feito um esfregaço na lâmina, colocando uma lamínula sobre ela; e
7. Por fim, lâmina e lamínula são conduzidas ao microscópio de luz convencional ou qualquer outro sistema de análise para a primeira leitura [Fig. 1, (I)]. b) Técnica de sedimentação-espontânea de parasitos com flutuação-
espontânea de impurezas fecais para a detecção de ovos de alta densidade específica (>1,19 g/ml) e larvas de helmintos intestinais de maior tamanho. de 300μΙ, é transferida, por meio de qualquer dispositivo como, por exemplo, pipeta plástica descartável, para o segundo tubo de processamento [Fig.1, (B), (C) e (D)];
2. Em seguida, 10 gotas de uma composição clarificante, conforme descrito anteriormente, são adicionadas ao sedimento formando uma suspensão [Fig. 2, (A)]. Esta suspensão é homogeneizada e ficará em repouso por um tempo preferencialmente de 5 minutos, quando o material adquire uma cor clarificada [Fig. 2, (B)], sendo esta uma das etapas que garantem o aperfeiçoamento do
método ora proposto;
3. Logo após, neste meio, é adicionado uma solução preservadora e conservante selecionada do grupo que compreende formalina neutra e solução salina fisiológica. No caso do uso de formalina, o aperfeiçoamento consiste em garantir a neutralidade da mesma para que a mesma preserve a estrutura das estruturas.
No caso do uso de uma solução salina fisiológica a mesma deve ter o teor de 0,85% preferencialmente. O volume preferencial da solução preservadora e conservante é de 2,5 mL [Fig. 2, (C)]. Esta nova suspensão é homogeneizada e, em seguida, receberá a adição de 2,0 mL de acetato de etila P.A. Uma nova homogeneização é estabelecida, desta vez de forma vigorosa, por um tempo preferencial de 30 segundos;
4. O tubo de processamento, contendo toda a suspensão homogeneizada, ficará em repouso [Fig. 2, (D)], por um tempo preferencial de 15 minutos, até que grande parte das impurezas fecais venham a flutuar por diferença de densidade específica [Fig. 2, (E)], mantendo as estruturas parasitárias pesadas na parte
inferior do tubo, onde deve ficar localizado o material fecal sedimentado;
5. Uma decantação é aplicada ao sobrenadante, sempre de cima para baixo, de forma cuidadosa e com o uso de pipeta plástica descartável ou similar, de modo a deixar um volume preferencial de 0,5 mL da suspensão fecal no tubo; descartável ou similar, através de movimentos bruscos de sucção e ejeção do meio e, em seguida, duas gotas da suspensão são succionadas e conduzidas a uma lâmina de microscopia; 7. Na seqüência, sobre as gotas localizadas na lâmina de microscopia, é adicionada uma gota de solução corante, à base de Lugol. Logo após, é realizado um esfregaço de todo o material e, sobre este, é colocado uma lamínula; e 8. Por último, lâmina e lamínula são conduzidas ao microscópio de luz convencional ou qualquer outro sistema de análise para a segunda leitura [Fig. 2, (F)].
2a etapa: Técnica de enriquecimento parasitário com o uso de um único tubo de processamento.
1. Este procedimento tem início logo após o processamento laboratorial de centrífugo-sedimentação da técnica coproparasitológica conhecido do estado da
técnica onde todo o sedimento fecal, neste exemplo de concretização cerca de 600μΙ, é transferido do tubo de centrifugação [Fig. 1, (A)] para o tubo de processamento [Fig. 1, (C)], por meio de uma pipeta plástica descartável ou similar;
2. Em uma primeira etapa, preferencialmente 2 mL de solução de sulfato de zinco, com densidade 1,19g/ml, é adicionada ao tubo de processamento, e este
material é homogeneizado [Fig.1, (E)];
3. Em seguida, o tubo é completado com a mesma solução, de modo a formar um menisco na sua borda [Fig. 1, (F)];
4. Uma lâmina de microscopia é colocada sobre o menisco, na borda do tubo, de forma a ficar em contato com a suspensão [Fig.1, (G)];
5. Tubo e lâmina ficarão em repouso em uma estante apropriada por 15 minutos para a flutuação-espontânea de parasitos [Fig. 1, (H)]. Logo após, a lâmina é retirada da borda do tubo, com um movimento brusco de inversão, e colocada em técnica; 6. A segunda etapa tem início com a decantação de todo o sobrenadante obtido na primeira etapa de flutuação, que é praticada sempre de cima para baixo, de
forma cuidadosa e com o uso de pipeta plástica descartável ou similar, de modo a deixar preferencialmente 0,5 mL da suspensão fecal no tubo;
7. Duas gotas da suspensão são succionadas, através de movimentos bruscos de ejeção do meio (com o uso de pipeta), e conduzidas e sobrepostas sobre a lâmina obtida na etapa de flutuação (item 5).
8. Após o item 6 desta etapa, os procedimentos laboratoriais dos itens 2, 3, 4 e 5 da etapa de sedimentação-espontânea descrita na 1a etapa (b) serão executados para a eliminação de impurezas fecais por flutuação-espontânea [Fig. 2, (A), (B), (C), (D) e (E)], evidenciando o aprimoramento introduzido pelo item 2 no que se refere ao uso de uma composição clarificante contendo hipoclorito de sódio, hidróxido de sódio, cloreto de sódio e cloro ativo, são adicionadas ao sedimento formando uma suspensão.
9. Assim, após o item 5 [1a etapa (b)], com o uso de pipeta plástica descartável ou similar, a suspensão deve ser novamente homogeneizada, através de movimentos bruscos de sucção e ejeção do meio e, na seqüência, duas gotas da suspensão
são succionadas, conduzidas e sobrepostas sobre a lâmina obtida na etapa de flutuação;
10. Logo após, uma gota de solução corante (LugoI) é adicionada à lâmina e é realizado um esfregaço fecal, colocando uma lamínula sobre a lâmina [Fig. 2,(F)]; e
11. Por fim, lâmina e lamínula são conduzidas ao microscópio de luz convencional ou qualquer outros sistema de análise para leitura de imagens. Λ Vi 19/20 ,ν Γ)/
EXEMPLOS ^ r 'V^/
A seguir são descritos exemplos não Iimitativos da presente invenção. Exemplo 1: Giardia duodenalis:
Este exemplo comparativo mostra através de imagens, a diferença surpreendente da qualidade das amostras para análise de diagnóstico [Fig.3] mais especificamente imagem de esfregaço fecal com excesso de impurezas obtido conforme técnicas convencionais de preparo da amostra vistas do microscópio de luz convencional com especial atenção a um cisto de protozoário (Giardia duodenalis) onde (A) corresponde à uma lâmina obtida por técnica de Lutz / Hoffman1 Pons e Janer; (B) uma lâmina obtida por kit comercial Paratest® (Diagnostek Ind. Com. Prod. Cient.); (C) uma lâmina obtida por técnica convencional de TF-Tesf (PI -0104372-2) e, (D) uma lâmina obtida pelo método proposto pela presente invenção. É possível observar que o referido método proposto apresenta uma qualidade surpreendentemente melhor que os métodos existentes no estado da técnica.
Exemplo 2: Ascaris lumbricóides. Schistosoma mansoni. Giardia duodenalis. Stronavloides stercoralis. Hvmenolepis diminuta. Taenia spp.:
Os seguintes exemplos de concretização da presente invenção mostram o efeito do enriquecimento parasitário de lâminas preparadas pela atual invenção [Fig.4], em que: a imagem (A) demonstra a Iimpidez e a alta concentração parasitária por campo de imagem, com cerca de 36 ovos de Ascaris lumbricóides fértil obtidos pela técnica de flutuação-espontânea, em aumento microscópico de 40 vezes; a imagem (B) apresenta lâmina processada por sedimentação- espontânea, livre de impurezas e preservando a boa morfologia de um ovo de Schistosoma mansoni, com aumento microscópico de 400 vezes; a imagem (C) fazendo exibir lâmina processada por flutuação-espontânea com dois cistos inalterados de Giardia duodenalis, com aumento microscópico de 400 vezes; imagem (D) expõe lâmina processada por sedimentação-espontânea contendo r s 20/20 4
Ϊ r,
uma larva de tamanho grande de Strongyloides stercoralis, mostrando ótim; morfologia e aumento microscópico de 400 vezes; a imagem (E) mostra lâmina processada por flutuação-espontânea apresentando um ovo de Hymenolepis diminuta, com 400 vezes de aumento em microscopia; e, por fim, a imagem (F) ilustra lâmina processada por sedimentação-espontânea, com a presença de um ovo de Taenia spp. livre de impurezas fecais, com aumento microscópico de 400 vezes.
Exemplo 3: Schistosoma mansoni
Um exemplo comparativo de esfregaços fecais processados por três diferentes técnicas coproparasitológicas [Fig.5], com a presença de ovo de Schistosoma mansoni, em que (A) eqüivale uma lâmina obtida por técnica de TF- 7esi®; (B) lâmina obtida por técnica convencional de Kato-Katz; e (D) lâmina obtida pelo inovador método da atual invenção.
Claims (20)
1. - Método preparação de amostra coproparasitológica fecal caracterizado por compreender as etapas seqüenciais de: a) enriquecimento parasitário, em separado, de estruturas leves e de estruturas õpesadas com eliminação de impurezas fecais através do uso de dois tubos de processamento incluindo: a1) flutuação-espontânea de estruturas leves para a detecção seletiva incluindo cistos, oocistos e esporos de protozoários e ovos de baixa e média densidade específica e larvas de helmintos intestinais de menor tamanho em um primeiro tubo contendo amostra fecal; a2) sedimentação-espontânea de estruturas pesadas incluindo ovos de alta densidade específica e larvas de helmintos intestinais de maior tamanho para detecção seletiva e, flutuação-espontânea de impurezas para posterior eliminação de um segundo tubo contendo amostra fecal; e a3) eliminação de impurezas em (a2) com a adição de uma composição clarificante de acordo com descrição. b) enriquecimento parasitário de estruturas leves e pesadas com o uso de um único tubo de processamento.
2. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o enriquecimento parasitário compreende a flutuação-espontânea para detecção de cistos, oocistos e esporos de protozoários e ovos de baixa e média densidade específica menor do que 1,19 g/mL e larvas de helmintos intestinais de menor tamanho.
3. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o enriquecimento parasitário compreende a sedimentação-espontânea de parasitos com flutuação-espontânea de impurezas fecais para a detecção de ovos de alta densidade específica maior do que 1,19 g/ml e larvas de helmintos intestinais de maior tamanho.
4. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por uma composição clarificante que compreende solução com teor cloro ativo que varia entre 2 e 2,5% em peso contendo hipoclorito de sódio e pelo menos um sal selecionado dentre o grupo compreendendo hidróxido de sódio, cloreto de sódio e õbicarbonato de sódio.
5. - Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a mistura geradora de cloro ativo compreende um teor de hipoclorito de sódio que varia de 10 a 40% em peso e um teor de bicarbonato de sódio que varia de 5 a 20% em peso.
6. - Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o teor preferencial de hipoclorito de sódio é de 25% em peso e de carbonato de sódio é de 12,5% em peso.
7. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tempo de clarificação de uma amostra é de cerca de 5 minutos.
8. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que após a clarificação é adicionada uma solução preservadora e conservante selecionada do grupo que compreende formalina neutra e solução salina fisiológica.
9. - Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de 20que o volume adicionado de uma solução preservadora e conservante é de cerca de 2,5 ml_.
10. - Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a solução salina fisiológica possui um teor de 0,85%.
11. - Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende a adição de cerca de 2,0 ml_ de acetato de etila P.A. posteriormente à adição da solução preservadora e conservante.
12. - Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende um tempo de homogeneização de cerca de 30 segundos.
13. - Método, de acordo com as reivindicações 8 e 12, caracterizado pelo fato de que compreende um período de repouso da suspensão homogeneizada cerca de 15 minutos.
14. - Composição clarificante caracterizada por compreender um reagente gerador de cloro ativo selecionado dentre hipoclorito de sódio, hidróxido de sódio, cloreto de sódio e bicarbonato de sódio ou suas misturas para gerar um teor de cloro ativo de 2 a 2,5% pp.
15. - Composição clarificante, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende um teor de hipoclorito de sódio que IOvaria de 10 a 40% em peso.
16. - Composição clarificante, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o teor de hipoclorito de sódio é de cerca de 25%.
17. - Composição clarificante, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende um teor de bicarbonato de sódio de 5 a 20% em peso.
18. - Composição clarificante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o teor de bicarbonato de sódio é de cerca de 12,5%.
19. - Composição clarificante, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende a adição seqüencial de uma solução preservadora e conservante selecionada do grupo que compreende formalina neutra posteriormente à adição da solução geradora de cloro ativo.
20. - Composição clarificante, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende a adição de acetato de etila 25posteriormente à adição de uma solução preservadora e conservante.
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