JP2005264167A

JP2005264167A - 新規グルカン製剤

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Publication number: JP2005264167A
Application number: JP2005169984A
Authority: JP
Inventors: Spiros Jamas; ジャマススパイロス; Jr D Davidson Easson; イーソン，ジュニアディー．デイビッドソン; Gary R Ostroff; アール．オストロッフゲイリー
Original assignee: Alpha Beta Technology Inc
Current assignee: Alpha Beta Technology Inc
Priority date: 1992-08-21
Filing date: 2005-06-09
Publication date: 2005-09-29
Also published as: BR9307104A; PL307567A1; AU5086893A; KR950702834A; DE69331324D1; JPH06107702A; US20040116380A1; EP0655921A1; US20020032170A1; HU9500504D0; NZ255857A; US5817643A; PL177453B1; AU4095397A; AU679690B2; EP0655921B1; HUT72418A; FI950770A; ATE210450T1; FI950770A0

Abstract

【課題】
サイトカイン産生を刺激しないで強力かつ特異的な免疫作用を示す中性可溶性β−グルカン、すなわち免疫刺激特性を有するが、イン・ビトロにおいてＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激しない中性可溶性β−グルカンおよび該中性可溶性β−グルカンを含有する製剤、および新規な該製剤の製造方法を提供すること。
【解決手段】
３重らせん立体構造を有する、β（１−６）グリコシド結合により規則的に分枝している水溶性β（１−３）グルカンであって、イン・ビトロにおいて炎症性副作用を生じさせる生化学的メディエーター（１Ｌ−１およびＴＮＦ）の産生を刺激せずに免疫応答を増強可能なグルカン。
【選択図】なし

Description

本発明は、サイトカイン産生を刺激しないで強力かつ特異的な免疫作用を示す中性可溶性β−グルカン、該中性可溶性β−グルカンを含有する製剤、および新規な該製剤の製造方法に関する。

１９６０年代初期、トリプシン処理の前後に酵母を煮沸することによって調製した粗製不溶性酵母抽出物であるザイモサンがげっ歯類の細網内皮細胞系の顕著な過形成と機能刺激を引き起こすことが認められた。ザイモサン製剤は補体成分Ｃ３を不活化し、抗体形成を促進し、照射後の生存を延長し、細菌感染に対する抵抗性を強化し、腫瘍成長を阻害し、移植片拒絶を促進し、食事による高コレステロール血状態とコレステロール沈着を阻害することが動物実験で明らかになった。ザイモサンは多糖、タンパク質、脂肪及び無機成分よりなることが示されているが、その後の研究で酵母細胞壁の活性成分が純粋な多糖、具体的にはβ−グルカンであることが明らかとなった。β−グルカンの生物測定の反復によって、ザイモサンで見られた上記機能活性のほとんどは精製β−グルカン製剤でも保持されることがわかった。

β−グルカンの特性は、非特異的免疫および感染抵抗性を高める能力がエンドトキシンとかなり似ている。免疫アジュバントおよび造血刺激物質としてのβ−グルカンの活性は、カルメット−ゲラン杆菌（bacillus Calmette-Guerin: ＢＣＧ）やCorynebacterium parvumなどのより複雑な生体応答調節剤（ＢＲＭ）の活性に匹敵する。酵母β−グルカンの機能活性も真菌や植物から単離した構造的に類似の炭水化物ポリマーの活性に匹敵する。スキゾフィラン、レンチナン、クレスチン、グリフォラン、パキマンなど分子量の大きい（１−３）−β−Ｄ−グルカンは類似の免疫調節活性を示す。これらのβ−グルカン製剤すべてに共通する機構は、インターロイキン−１やＴＮＦなどのサイトカインを刺激することである。レンチナンは、用量１ｍｇ／ｋｇ、１０日間の投与を行う動物実験および１９７０年代後期以後日本で行われた進行性または再発性悪性リンパ腫、結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、胃ガンの臨床試験において抗腫瘍性に関する研究が行われている。ガンの化学療法では、レンチナンが毎週２〜３回、単独でまたは抗腫瘍剤と併用して０．５〜５ｍｇ／日の用量で筋肉内または静脈内に投与されている。レンチナンは酵母グルカンによる活性以外にも、Ｔ細胞免疫賦活剤として作用してＩＬ−１、ＣＳＦ、ＩＬ−３の産生などの細胞毒性活性を誘導することが複数の研究で示唆されている［例えば、非特許文献１または非特許文献２参照］。

粒状および可溶性β−グルカンの様々な製剤の生物活性が動物モデルで試験されている。可溶性β−グルカンおよび不溶性β−グルカンを単独でまたはウイルス抗原や細菌抗原のワクチンアジュバントとして使用すると、様々な細菌感染、真菌感染、原生動物感染、ウイルス感染に対する抵抗性を顕著に高めることが動物モデルで示されている。β−グルカンの造血作用は、抹消血白血球数の増加および骨髄と脾臓の細胞性との関係が指摘されており、顆粒球／マクロファージ始原細胞、脾臓多分化能性幹細胞、および赤芽球始原細胞の増加ならびに顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の血清濃度の上昇を反映している。さらに、β−グルカンの造血および感染防御作用はシクロホスファミド処理によって免疫を抑制した動物において高活性であった。β−グルカンは外傷、創傷治癒、および腫瘍発生に効果があることが動物モデルで示されている。しかし、様々な不溶性および可溶性のβ−グルカン製剤は生体特異性および活性が有意に異なり、感染防御および造血のモデルにおける有効用量は静脈内投与または腹腔内投与で２５〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲で変化する。不溶性製剤は、肝脾腫大および肉芽腫形成を発現する望ましくない毒性を示した。臨床的関心は、全身投与時に生理活性を維持ししかも毒性が無視できる可溶性グルカン製剤に向けられた。可溶性リン酸化グルカンを広範な用量（４０〜１，０００ｍｇ／ｋｇ）で長期的に全身投与した試験では、動物における毒性は無視できるものであった［例えば、非特許文献３またはジルジオ（DiLuzio ）、特許文献１参照］。

ヒト好中球およびマクロファージの細胞膜上の特定のβ−グルカン受容体結合部位を明らかにすることによってβ−グルカン作用の分子機構が解明されている。マンナン、ガラクタン、α（１−４）−結合グルコースポリマー、およびβ（１−４）−結合グルコースポリマーはこの受容体に対して親和性を有しない。これらのβ−グルカン結合部位は副経路の粒状活性化物質を受容するオプソニン非依存性食作用性受容体であり、大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）、イニュリン、およびある種の動物赤血球に類似している。抗体の非存在下でβ−グルカン受容体にリガンド結合を行うと、補体活性化、食作用、リソゾーム酵素放出、およびプロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンの産生が起こり、その結果、感染に対する非特異的抵抗性が増大する。しかしながら、従来の技術で記載されている可溶性β−グルカン製剤はいずれもサイトカイン刺激を示した。腫瘍壞死因子（ＴＮＦ）以外にもインターロイキン−１および２（ＩＬ−１、ＩＬ−２）の血漿中濃度と脾臓中濃度の上昇がイン・ビボで見られており、これらのサイトカインのイン・ビトロにおける合成誘導に対応している［例えば、非特許文献４（可溶性グルカン注射ラットにおけるＩＬ−１およびＩＬ−２濃度の上昇）、非特許文献５（エイズ患者に可溶性グルカンを全身投与すると、ＩＬ−１およびＩＬ−２濃度が上昇するとともに悪寒と発熱を引き起こした）、非特許文献６（外傷患者へのグルカン投与は血清ＩＬ−１濃度を上昇させたがＴＮＦ濃度は上昇させなかった）、または非特許文献７（化学架橋β（１−３）グルカンはマウスのＩＬ−１産生を誘導する）参照］。

インターロイキン−１（ＩＬ−１）は細胞防御機構に関与する主要な免疫媒介物質である。様々な臨床状態における非特異的感染抵抗性の強化を目的とするＩＬ−１の使用に関する数多くの研究が行われている［例えば、非特許文献８参照］。ヒトにおいてＩＬ−１およびその他の細胞性媒介物質の過剰刺激や体外投与は、免疫調節機構の微妙なバランスの破壊に起因する毒性と副作用があるという大きな問題がある［例えば、非特許文献９参照］。ＩＬ−１は様々な組織と器官に悪影響を及ぼすことがわかっている炎症性サイトカインの１種である。例えば、組換えＩＬ−１は、低血圧ショック、白血球減少、血小板減少、貧血、乳酸アシドーシスを引き起こすことがわかっている。また、ＩＬ−１はナトリウム排泄、無酸素症、徐波睡眠、骨吸収、疼痛しきい値低下、および多くの炎症関連サイトカインの発現を誘導する。また、ＩＬ−１はインシュリン分泌ベータ細胞に対して毒性を示す。多くの炎症性疾患の患者はすでに体内ＩＬ−１濃度が上昇している。ＩＬ−１産生をさらに強化する薬剤の投与はこれらの炎症状態を悪化させるだけである。したがって、免疫系を選択的に刺激するだけでＩＬ−１やＴＮＦを刺激しない薬剤の開発が有用である。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）も感染、炎症、およびガンに関与している。少量のＴＮＦは成長因子を放出させるが、大量になると敗血症ショック、疼痛、発熱、凝血を引き起こし、骨を劣化させ、白血球およびその他の免疫防御系を刺激する。特に免疫系が感染、自己免疫疾患、ガンによって活性化されている患者にとって、ＴＮＦ放出によって引き起こされるこれらの副作用を最小限にとどめる薬剤の開発が大いに望まれている。

チハラ（Chihara ）ら、1989年、Int. J. Immunotherapy, 4:145-154 ハムロ（Hamuro）およびチハラ（Chihara ）、In Lentinan, An Immunopotentiator ジルジオ（DiLuzio ）ら、1979年、Int. J. of Cancer,24:773-779 シャーウッド（Sherwood）ら、1987年、Int. J. Immunopharmac., 9:261-267 ウィリアムズ（Williams）ら、1988年、Int. J. Immunopharmac., 10:405-414 ブラウダー（Browder ）ら、1990年、Ann. Surg., 211:605-613 アダチ（Adachi）ら、1990年、Chem. Pharm. Bull., 38:988-992 ポンポセリ（Pomposelli）ら、1988年、J. Parent. Ent. Nutr., 12(2):212-218 ファウチ（Fauci ）ら、1987年、Anals. of Internal Medicine, 106:421-433 米国特許第4,739,046 号

従って、本発明の目的は、サイトカイン産生を刺激しないで強力かつ特異的な免疫作用を示す中性可溶性β−グルカン、すなわち免疫刺激特性を有するが、イン・ビトロにおいてＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激しない中性可溶性β−グルカンおよび該中性可溶性β−グルカンを含有する製剤、および新規な該製剤製造方法を提供することにある。

即ち、本発明は、
[１] 免疫刺激特性を有するが、イン・ビトロにおいてＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激しない中性可溶性β−グルカン；
[２] ３重らせん構造を有する[１]記載の中性可溶性β−グルカン；
[３] ヒト単球上のβ−グルカン受容体との結合能を有する[２]記載の中性可溶性β−グルカン；
[４] β−グルカンが食細胞の殺微生物活性を増強する能力を有する[２]記載の中性可溶性β−グルカン；
[５] β−グルカンが単球および好中球の造血活性を有する[２]記載の中性可溶性β−グルカン；
[６] ３重らせん構造を有し、イン・ビトロにおいてＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激または惹起しない中性可溶性β−グルカン；
[７] β−グルカンがヒト単球上のβ−グルカン受容体との結合能を有するが、イン・ビトロにおいてＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激しないものである、生理学上許容し得る担体に保持された中性可溶性β−グルカンよりなる組成物；
[８] β−グルカンが３重らせん構造を有する[７]記載の組成物；
[９] β−グルカンが食細胞の殺微生物活性を増強する能力を有する[８]記載の組成物；
[１０] β−グルカンが単球および好中球の造血活性を有する[８]記載の組成物；
[１１] 生理学上許容し得る担体が無菌食塩水である[７]記載の組成物；
[１２] β−グルカン受容体との結合能を有するが、ＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激または惹起しない中性可溶性β−グルカンを、哺乳動物の食作用活性の増加を引き起こすのに充分な量含有することを特徴とする、哺乳動物の免疫系応答を誘導化する免疫系治療剤；
[１３] 哺乳動物が創傷、免疫が損なわれている、または蛋白質栄養不良の状態にある、[１２]記載の免疫系治療剤；
[１４] β−グルカンが経口または非経口投与剤である、[１２]記載の免疫系治療剤；
[１５] その投与形態が、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与および腹腔内投与よりなる群から選ばれる非経口投与剤である、[１４]記載の免疫系治療剤；
[１６] β−グルカン受容体との結合能を有するが、ＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激または惹起しない中性可溶性β−グルカンを、食作用活性の増加を引き起こし、感染に対する宿主防御を改善するのに充分な量含有することを特徴とする、非経口投与により創傷、免疫が損なわれている、蛋白質栄養不良または高齢の個体の免疫応答を誘導化する免疫応答誘導剤；
[１７] β−グルカンが無菌状態の注射用製剤または静脈内点滴剤である[１６]記載の免疫応答誘導剤；
[１８] β−グルカン受容体との結合能を有するが、ＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激または惹起しない中性可溶性β−グルカンを、哺乳動物の食作用活性の増加を引き起こすのに充分な量含有することを特徴とする、非経口投与により、感染の恐れのある哺乳動物を感染症から防御する感染予防剤；
[１９] 哺乳動物が切迫手術に直面している、[１８]記載の感染予防剤；
[２０] 哺乳動物が化学療法、放射線療法または骨髄移植を受けているかその準備段階である、[１８]記載の感染予防剤；
[２１] 哺乳動物が腎臓透析、腹膜透析または血液透析を受けている、[１８]記載の感染予防剤；
[２２] 哺乳動物が免疫の低下による疾患に悩まされている、[１８]記載の感染予防剤；
[２３] 哺乳動物が免疫が損なわれているものである、[１８]記載の感染予防剤；
[２４] 哺乳動物が蛋白質栄養不良の状態にある、[１８]記載の感染予防剤；
[２５] 中性可溶性β−グルカンを、創傷の治癒を刺激するのに充分な量含有することを特徴とする、創傷部位に投与して創傷部位の修復および治癒を促進する創傷治療剤；
[２６] 中性可溶性β−グルカンを創傷部位に局所投与するか、創傷部位に注射することを特徴とする、[２５]記載の創傷治療剤；
[２７] 創傷部位の治癒を刺激するのに充分な量の中性可溶性β−グルカンを含有することを特徴とする、創傷部位に投与して創傷の治癒およびこれに関連する感染の治癒を促進する、創傷治療剤；
[２８] 中性可溶性β−グルカンを創傷部位に局所投与するか、創傷部位に注射することを特徴とする、[２７]記載の創傷治療剤；
[２９] 感染が、細菌、ウィルスまたは真菌により引き起こされるものである、請求項[２７]記載の創傷治療剤；
[３０] 感染の低減または防御に充分な量の中性可溶性β−グルカンを含有することを特徴とする、脊髄形成異常症候群の患者における感染の低減または防御を行う感染予防剤；
[３１] β−グルカンが経口または非経口投与剤である、[３０]記載の感染予防剤；
[３２] その投与形態が、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与および腹腔内投与よりなる群から選ばれる非経口投与剤である、[３１]記載の感染予防剤；
[３３] 感染が、細菌、ウィルスまたは真菌により引き起こされるものである、[３０]記載の感染予防剤；
[３４] 以下の工程からなる、免疫刺激特性を有するが、イン・ビトロにおいてＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激または惹起しない中性可溶性β−グルカンの製造方法；
ａ）グルカン中の酸可溶性部分を溶解するのに充分な条件下で、不溶性グルカンの溶液を酸処理して酸可溶性グルカンを得る工程、
ｂ）可溶性グルカンの本来の立体構造を解離させるのに充分な条件下で、該酸可溶性グルカンをアルカリ処理して解離した可溶性グルカンを得る工程、
ｃ）可溶性グルカンを再アニーリングするのに充分な条件下で該解離した可溶性グルカンを中和する工程、
ｄ）再アニーリングした可溶性グルカンを精製して、イン・ビトロにおいてＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激または惹起しない、３重らせん構造である中性可溶性グルカンを得る工程、
[３５] 工程ａ）がｐＨ約１〜約５、温度約２０℃〜約１００℃で行われるものである[３４]記載の製造方法；
[３６] 酸処理に用いる酸が酢酸またはギ酸である[３５]記載の製造方法；
[３７] 工程ｂ）がｐＨ約７〜約１４、温度約４０℃〜約１２１℃で行われるものである[３４]記載の製造方法；
[３８] 工程ｃ）の前に、不溶性グルカンおよびそれらが凝集した可溶性グルカンを除去するために、解離した可溶性グルカンを精製する工程をさらに有する[３４]記載の製造方法；
[３９] 精製する工程が１，０００〜１００，０００ダルトンの限外濾過膜を用いるものである[３８]記載の製造方法；
[４０] 工程ｃ）がｐＨ約６．０〜８．０、温度約５０〜７０℃で行われるものである[３４]記載の製造方法；
[４１] 工程ｄ）が３０，０００〜１００，０００ＮＭＷの限外濾過膜および１５０，０００〜５００，０００ＮＭＷの限外濾過膜を用いるものである[３４]記載の製造方法；ならびに
[４２] [３４]記載の製造方法により製造される、中性可溶性グルカン
に関する。

本発明によれば、サイトカイン産生を刺激しないで強力かつ特異的な免疫作用を示す中性可溶性β−グルカン、すなわち免疫刺激特性を有するが、イン・ビトロにおいてＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激しない中性可溶性β−グルカンおよび該中性可溶性β−グルカンを含有する製剤、および新規な該製剤製造方法を提供することが可能となる。

本発明は、サイトカイン産生を刺激しないで強力かつ特異的な免疫作用を示す中性可溶性β−グルカン、該中性可溶性β−グルカンを含有する製剤、および新規な該製剤の製造方法に関する。本発明の方法においては、サイトカイン産生を誘導する可溶性グルカンを一連の独自の酸、アルカリ、中性処理に付すことによって特有の生物活性を有する立体構造的（conformationally）に純粋な中性可溶性グルカン製剤を製造する。本発明の中性可溶性グルカン製剤はβ−グルカンに共通の特定の免疫特性サブセットを保持しているが、イン・ビトロまたはイン・ビボにおけるＩＬ−１やＴＮＦの産生を誘導しない。

本発明の中性可溶性グルカン製剤は、不溶性グルカンを酸処理して水溶性グルカンとし、該可溶性グルカンの本来の立体構造をアルカリ性ｐＨ下で解離させ、目的の分子量の画分をアルカリ性ｐＨ下で精製し、該解離グルカン画分を時間、温度、ｐＨを制御した条件下で再アニーリング（re-annealing）して特有の３重らせん立体構造（triple helical conformation)を作り、中性ｐＨ下でさらに精製して１重らせんおよび凝集物を除去することにより特有の生物活性を有する立体構造的に純粋で中性の水溶性非誘導体化グルカンを得ることによって製造する。

本発明の中性可溶性グルカン製剤はヒト単球のβ−グルカン受容体に対して高度の親和性を示すとともに、次の２つの主な生物活性を保持している。すなわち、（１）食細胞の殺微生物活性の強化と（２）単球および好中球の造血活性である。従来技術に述べられている可溶性グルカンと異なり、本発明の中性可溶性グルカンはイン・ビトロおよびイン・ビボにおけるＩＬ−１やＴＮＦの産生を誘導あるいは惹起しない。

本発明の中性可溶性グルカン製剤は、火傷、手術、化学療法、骨髄障害、およびその他免疫系が損なわれた状態に関連する感染に対抗することを目的とする抗感染症剤としてヒトおよび動物に対して非経口的（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内など）、局所的、経口的、または鼻腔内投与するのに適している。本発明の方法によって製造される中性可溶性グルカンは透明溶液状態で維持することができ、薬理学的に許容される担体中で平衡化することができる。本発明の中性可溶性グルカンは、発熱や炎症など好ましくない副作用を引き起こす可能性のある生化学的媒介物質（例えばＩＬ−１、ＴＮＦ、ロイコトリエンなど）の産生を刺激しないで免疫応答を強化する目的でヒトおよび動物の治療的および／または予防的処置に安全かつ効果的な製剤として使用できる。

本発明は、β−グルカン受容体に結合して目的の免疫応答サブセットだけを活性化することができる中性可溶性β−グルカンポリマーを見いだすことを目的とする。「中性可溶性β−グルカン」および「中性可溶性グルカン」とは、水溶性グルカンの変性と再アニーリングによって生じる特有の３重らせん立体構造を有する水溶性β−グルカンを意味する。

この中性可溶性β−グルカンは好中球と単球の数を増加させるとともにそれらが有する直接的な感染対抗活性（食作用と殺微生物活性）を強化させることがわかっているが、高熱、炎症、消耗疾患、臓器不全などの有害な副作用を引き起こす可能性のあるＩＬ−１、ＴＮＦ、ロイコトリエンなどの生化学的媒介物質の産生を刺激しない。これらの有利な性質を有する本発明の中性可溶性グルカン製剤は、好ましくない副作用を引き起こす可能性のある生化学的媒介物質の放出を刺激しないで感染に対する初期応答の役目を果たす免疫系成分だけを選択的に活性化するので、感染の予防と治療に有用である。本発明の中性可溶性β−グルカンを含有する溶液も多くの免疫調節物質に共通する毒性を有しない。

本発明の中性可溶性β−グルカンはβ（１−６）グリコシド結合により規則的に分枝しているβ（１−３）結合グルコピラノース骨格の構成を取るグルコースモノマーよりなる。中性可溶性グルカン製剤はグルカンを含有するが、該グルカンは官能基（例えば、荷電された基）や共有結合をもつ基によって、置換による実質的な修飾を受けていない。本発明の中性可溶性グルカンの一般構造を図１に示す。本発明の生物活性製剤は、本来のグルカン立体構造を解離させ、再アニーリングして得られた特有の３重らせん立体構造を精製することによって製造される立体構造的に純粋な形のβ−グルカンである。この中性可溶性グルカンの特有の立体構造が、有害な生化学的媒介物質の産生を刺激しないで免疫系を選択的に活性化する能力に寄与している。

本発明の中性可溶性グルカン製剤は不溶性グルカン粒子、好ましくは酵母微生物由来の不溶性グルカン粒子から調製する（不溶性酵母グルカンの一般的な調製方法についてはマナーズ（Manners ）ら、Biol. J., 135:19-30 (1973)参照。）。本発明において原料として特に有用なグルカン粒子は、ジャマス（Jamas ）らが米国特許第4,810,646 号、同4,992,540 号、同5,082,936 号、同5,028,703 号に記載している全グルカン粒子（ＷＧＰ）であり、これらの文献のいずれについてもその記述は引例として本明細書に含まれるものとする。全グルカン粒子の供給源は、細胞壁にβ−グルカンを含有する様々なグルカン含有真菌微生物であればよい。Saccharomyces cerevisiae Ｒ４（ＮＲＲＬＹ−１５９０３、米国特許第4,810,646 号に関連して寄託済み）およびＲ４Ａｄ（ＡＴＣＣ番号７４１８１）の菌株から得られる全グルカン粒子が特に有用である。使用することのできる他の酵母株としては、Saccharomyces delbrueckii 、Saccharomyces rosei 、Saccharomyces microellipsodes 、Saccharomyces carlsbergensis、Schizosaccharomyces pombe 、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Kluyveromyces polysporus、Candida albicans、Candida cloacae 、Candida tropicalis、Candida utilis、Hansenula wingeri 、Hansenula arni、Hansenula henricii、Hansenula americana などが挙げられる。

全グルカン粒子の抽出方法については、ジャマス（Jamas ）らが米国特許第4,810,646 号、同4,992,540 号、同5,082,936 号、同5,028,703 号に記載している。本発明の目的のためには、ジャマス（Jamas ）らが記載している最終的な有機抽出と洗浄工程を行う必要はない。

本発明の方法において、酸に可溶なグルカン部分を溶解させるのに十分な条件下で全グルカン粒子を酸溶液に懸濁させる。ほとんどのグルカンの場合、ｐＨが約１ないし約５、温度が約２０℃ないし約１００℃の酸溶液でよい。使用する酸は酸に可溶なグルカン部分を溶解させることのできる有機酸であることが好ましい。この場合、約０．１Ｍないし約５Ｍの濃度の酢酸または約５０〜９８％（ｗ／ｖ）の濃度のギ酸が有用である。処理時間は酸濃度、温度、および全グルカン粒子の供給源によって約１０分ないし約２０時間の範囲で変化する。例えば、天然型あるいは野生型グルカンより多くのβ（１−６）分枝を有する修飾グルカンはより苛酷な条件、すなわちより長期の曝露時間とより高い温度を要する。この酸処理工程は同条件で反復してもよいし、異なる条件で反復してもよい。好ましい処理方法の例が、S. cerevisiae R4Ad株由来のグルカンを使用した実施例で述べる。本発明の別の態様では、天然型グルカンより多くのβ（１−６）分枝を有するS. cerevisiae R4株由来の全グルカン粒子を使用し、９０％（重量比）ギ酸による処理を２０℃で約２０分間行い、次いで８５℃で約３０分間行う。

次に、例えば遠心分離や濾過などの適当な分離手段により不溶性グルカン粒子を溶液から分離する。生じたスラリーのｐＨを水酸化ナトリウムなどのアルカリ性化合物で約７ないし約１４に調整する。遠心分離により沈澱を集め、精製水（例えば米国薬局方のもの）で３時間煮沸する。次いで、グルカンポリマーを可溶化するのに十分な濃度の高温アルカリにスラリーを再懸濁する。この処理において使用可能なアルカリ性化合物としては、約０．０１Ｎないし約１０Ｎの濃度の水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物が挙げられる。このプロセスは、約４℃ないし約１２１℃、好ましくは約２０℃ないし約１００℃の温度で行うことができる。このプロセスの一つの態様においては、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を約８０℃ないし１００℃の温度で約１〜２時間接触させる条件を使用する。得られた混合物には可溶化グルカン粒子と粒状グルカン残渣が含まれており、不純物タンパク質と糖の酸化により暗褐色を呈するのが普通である。例えば遠心分離および／または濾過などの適当な分離手段により粒状残渣を混合物から除去する。本発明のプロセスの別の態様においては、約１．５倍容量のエタノールを加えてあらかじめ酸加水分解を行った後、酸可溶性グルカンを沈澱させる。混合物を約２時間約４℃で冷却し、得られた沈澱物を遠心分離または濾過によって集め、水で洗浄する。次いで、得られたペレットを水に再懸濁し、約２０℃ないし１００℃の温度で３〜１２時間攪拌する。この時点で、水酸化ナトリウムなどの塩基によってｐＨを約１０〜１３に調整する。

得られた溶液は解離した可溶性グルカン粒子を含んでいる。この溶液を精製して、凝集を引き起こす可能性のある微量の不溶性グルカンおよび高分子量可溶性グルカンを除去する。この段階は、例えば名目分子量レベル（ＮＭＷＬ）またはカットオフ値が約１，０００〜１００，０００ダルトンの範囲にある膜を利用した限外濾過などの適当な精製手段によって実施できる。グルカンポリマーの緩やかな凝集や沈澱を防止するためには、この段階に使われる膜は名目分子量カットオフ値が約１００，０００ダルトンであることが好ましいことがわかった。次いで、可溶性グルカンをアルカリ性ｐＨでさらに精製して低分子量物質を除去する。この段階は、例えば名目分子量レベルまたはカットオフ値が約１，０００〜３０，０００ダルトンの範囲にある膜を利用した限外濾過などの適当な精製手段によって実施できる。

得られた解離可溶性グルカンを時間（例えば約１０〜１２０分）と温度（例えば約５０〜７０℃）とｐＨを制御した条件下で再アニーリングする。塩酸などの酸を用いて溶液のｐＨを約６〜８の範囲に調整する。この再アニーリング段階の目的は、可溶性グルカンを１重らせん立体構造から新たな配列の３重らせん立体構造に再構成することである。次いで、再アニーリンググルカン溶液を３０，０００〜１００，０００ＮＭＷおよび１５０，０００〜５００，０００ＮＭＷのカットオフ値を有する限外濾過膜フィルターを利用してサイズ別に分画し、高分子量可溶性グルカンと低分子量可溶性グルカンを選択的に分離する。サイズ分けの前の時点では、可溶性グルカンはランダムコイル、ゲル基質またはゲル凝集物、３重らせん、および１重らせんなどの立体構造が混在した混合物として存在する。このサイズ分け段階の目的は、特定の分子量を有する再アニーリング立体構造の比率の高い画分を得ることである。限外濾過フィルターを使用する順序は担当者の好みによるが、同一の目的物が得られるものでなければならない。

この段階の終了後に得られる濃縮画分は生物学的に活性な中性可溶性グルカンである。例えば１０，０００ダルトンの膜で透析濾過することによってグルカン濃縮物をさらに精製する。この段階終了後の可溶性グルカンの好ましい濃度は約２ｍｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌである。

次いで、例えば薬理学的に許容される担体（例えば注射用滅菌水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、等張食塩水、デキストロース）を用いた透析濾過により中性化溶液をさらに精製する。この透析濾過段階に好ましい膜は名目分子量カットオフ値が約１０，０００ダルトンのものである。グルカン溶液の最終濃度を約０．５ｍｇ／ｍｌないし１０ｍｇ／ｍｌの範囲に調整する。この溶液は、最終的に非経口投与製剤の医薬品製造基準に従い、０．２２μｍのフィルターによる濾過で滅菌することができる。このプロセスで得られる中性可溶性グルカン製剤は無菌、非抗原性で、実質的に発熱物質を含まず、劣化を伴わないで室温（例えば１５〜３０℃）で長期間保存することができる。このプロセスは、非経口投与に適した免疫活性グルカンの中性水溶液（ｐＨ４．５〜７．０）が得られるという特徴がある。

本発明の目的において、本発明の方法によって得られるグルカンを表現するために本明細書中で使用する「可溶性」という用語は、水、ＰＢＳ、等張食塩水、中性ｐＨ（例えばｐＨ約５ないし約７．５）を有するデキストロース溶液などの水性媒体中で室温（約２０〜２５℃）で約１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度の肉眼的に澄明な溶液を作ることができることを意味する。「水性媒体」という用語は水および水分の豊富な相、特に薬理学的に許容される水性液体を指し、ＰＢＳ、食塩水、デキストロース溶液などが挙げられる。

得られる溶液は実質的にタンパク質不純物を含んでおらず、非抗原性であり、発熱物質を含まず、動物およびヒトへの非経口投与用として薬理学的に許容されるものであるが、必要であれば可溶性グルカンを凍結乾燥などの適当な乾燥手段によって乾燥させ、乾燥状態で保存することもできる。

本発明の中性可溶性グルカンは、ヒトおよび動物における免疫応答を強化する目的で単独でまたはアジュバントとして安全かつ効果的な治療剤および／または予防剤として使用することができる。本発明の方法によって得られる可溶性グルカンは、好ましくない副作用を引き起こす可能性のある生化学的媒介物質（例えばＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ）の放出を刺激したり惹起したりしないで、感染に対する初期応答の役目を果たす成分だけを選択的に活性化する。本発明の中性可溶性グルカン組成物はこのような性質を有するので、免疫系が弱っていると思われる人達、すなわち栄養不良患者、手術や骨髄移植を受けた患者、化学療法や放射線療法を受けている患者、好中球減少症患者、ＨＩＶ感染患者、外傷患者、火傷患者、脊髄形成異常症候群によるものなどの慢性または抵抗性感染の患者、および高齢者における感染症の予防や治療の目的で使用することができる。免疫が損なわれている（immunocompromised)個体とは、例えばウイルス、細菌、真菌、および原生動物などの感染源による攻撃（challenge ）に対する正常な細胞性あるいは体液性防御を行う能力が低下あるいは減少している者であると一般に定義される。タンパク質栄養不良の個体とは、１デシリットルあたり（ｇ／ｄｌ）約３．２グラム未満の血清アルブミン値および／または通常の体重の１０％以上の非意図的体重減少を示す者であると一般に定義される。

より詳しくは、本発明の方法は、切迫手術、傷害、疾病、放射線療法または化学療法、あるいはその他の免疫系に悪影響を及ぼす状態に起因する感染の危険性が高くなっている動物またはヒトを治療的または予防的に処置するために用いることができる。本発明の方法は、ＨＩＶ感染（エイズ）など正常な代謝免疫応答を低下または抑制させる疾患や障害を有する患者の治療に有用である。例えば、本発明の方法は化学療法または放射線療法を受けている患者や生体が感染に対して示す正常な代謝応答を起こさせる能力の低下をもたらす疾患、障害、あるいは処置に起因する二次感染や術後合併症の発現の危険性が高くなっている患者における代謝免疫応答をあらかじめ開始させるために用いることができる。本発明の中性可溶性グルカンによる処置は、宿主の正常な免疫防御を生じさせ、処置宿主における感染防御手段を強化する上で特に有効であることが示されている。

本発明の組成物は、一般に免疫系強化をもたらすのに十分な量で動物やヒトに投与される。中性可溶性グルカンの投与経路は、経口、腸溶、非経口、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所、または鼻腔内とすることができる。本発明の組成物を投与する形態（例えば粉末、錠剤、カプセル、溶液、乳剤）はそれを投与する経路に依存する。投与する組成物の量は個体ごとに決められ、少なくとも一部は患者における感染または傷害の程度、患者の状態あるいは全体的な健康状態、患者の体重、および手術前、化学療法、またはその他の高リスク処置を行う前の時間的余裕を考慮した上で決められる。一般に、単回投与では、体重１キログラムあたり約０．０１ｍｇないし約１０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２．５ｍｇ／ｋｇの修飾グルカンを含有することが好ましい。局所投与用の用量は治療対象の創傷、感染の程度、および創傷の程度に依存する。創傷の場合の代表的な用量は約０．００１ｍｇ／ｍｌないし約２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍｌないし約０．５ｍｇ／ｍｌである。

一般に、本発明の組成物は、個体の免疫応答を刺激するために必要に応じて定期的にその個体に投与することができる。医療分野に習熟した者であれば、患者の身体状態と処置対象の疾患または障害に応じて組成物の投与期間と用量を決めることができる。上記のように、本発明の組成物は、感染に対して生体が反応する正常な代謝防御をあらかじめ開始させるための予防処置として用いてもよい。

中性可溶性β−グルカンは、様々な細菌、真菌、ウイルス、および原性動物の病原体によって引き起こされる感染の予防と治療に使うことができる。術前、術中および／または術後の手術患者に中性可溶性β−グルカンを予防的に投与すると、正常患者と高リスク患者のいずれにおいても術後感染の発生率と重症度が下がる。例えば、汚染されているか汚染の可能性のあるものとして分類される手術（例えば胃腸手術、子宮切除術、帝王切開、経尿道的前立腺切除術）を受ける患者および手術部位に感染の危険性が高い患者（例えば補てつ関節形成術、心血管手術）においては、適当な抗菌剤と本発明の中性可溶性グルカン製剤の併用による初期治療を行うと、感染性合併症の発生率と重症度が下がる。

疾患（例えばガン、エイズ）によって引き起こされるものだけでなく化学療法および／または放射線療法の過程によって引き起こされる免疫抑制状態にある患者においては、本発明の可溶性グルカンを予防的に投与することによって、多くの非常在性の細菌、真菌、ウイルスをはじめとする様々な日和見病原体によって引き起こされる感染の発生率が低下する。中性可溶性β−グルカンを用いた療法は、マクロファージの機能と再生を強化および持続化させる能力によって有意な放射線防御作用を示し、その結果、微生物の侵入や感染に対する抵抗性を強化する。

高リスク患者（例えば６５歳以上の患者、糖尿病患者、ガン、栄養不良、腎臓疾患、気腫、脱水、運動機能障害などを有する患者）においては、入院が重大な院内感染の発生率の高さと関連していることが多い。カテーテル挿入や人工呼吸器、排出チューブ、集中治療室の使用や長期入院などの処置と関連していることが多い感染の予防を補助するために、経験的にこれらの処置に先立って中性可溶性β−グルカンによる治療を開始してもよい。抗微生物剤と本発明の中性可溶性β−グルカンの併用療法は慢性、重症性、難治性の複雑で治療困難な感染の治療の適用となっている。

本発明の方法において投与される組成物は、本発明の中性可溶性β−グルカン以外にも他の成分を任意に含有することができる。特定の組成物に含有させることができる他の成分は、主にその組成物の投与の仕方によって決定される。例えば、錠剤の形で経口的に投与される組成物は、中性可溶性β−グルカン以外にも充填剤（例えば乳糖）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、アラビアガム、ゼラチン）、アジュバント、着香剤、着色剤、およびコーティング剤（例えばワックスや可塑剤）を含有することができる。液剤の形で投与される組成物は、中性可溶性β−グルカン、および任意に乳化剤、着香剤および／または着色剤を含有することができる。非経口投与用組成物は、水、滅菌食塩水、ＰＢＳ、デキストロース、あるいはその他の生物学的に許容される担体中に混合、溶解、または乳化することができる。局所塗布用組成物は、組成物が例えば創傷部位などの治療部位を被覆することができるゲル、軟膏、ローション、クリーム、あるいはその他の剤型に処方することができる。

中性可溶性グルカンよりなる組成物は、創傷の治癒と修復を刺激および強化する目的で創傷部位に局所的に投与することもできる。とりわけ潰瘍、ざそう、ウイルス感染、真菌感染、あるいは歯周病による創傷は本発明の方法に従って処置することで治癒プロセスを促進することができる。あるいは、本発明の中性可溶性β−グルカンを創傷や罹患部分に注射してもよい。本発明の組成物は創傷の修復以外にも、創傷と関連する感染や創傷を引き起こす原因物質の処置にも使うことができる。局所投与用組成物は、組成物が例えば創傷部位などの治療部位を被覆することができるゲル、軟膏、ローション、クリーム、あるいはその他の剤型に処方することができる。局所投与用の用量は治療対象の創傷、感染の程度、および創傷の程度に依存する。創傷の場合の代表的な用量は約０．０１ｍｇ／ｍｌないし約２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍｌないし約０．５ｍｇ／ｍｌである。

本発明の組成物のもう一つの用途は脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）の治療である。ＭＤＳは前白血病症候群と呼ばれることが多く、最終的に白血病に変化する可能性の高い抹消血球減少症につながる骨髄の分化・成熟の異常を特徴とするクローン性造血幹細胞異常の総称である。ＭＤＳは感染再発、出血、および死亡に到る最終感染を伴うのが普通である。したがって、この疾患の程度と感染率を下げるためには、ＭＤＳであると診断された患者に対して修飾グルカンよりなる組成物を本発明の方法に従って長期的に投与することによって患者の白血球の感染防御活性を高めることができる。再生不良性貧血（造血機能が量的に低下して異常を来たしている状態）など他の骨髄障害を治療することによって、この病態に関連する感染と出血を抑えることができる。

本発明の方法によって製造される中性可溶性グルカンは哺乳類単球の非特異的防御を強化するとともに、感染攻撃に対する応答能力を有意に高める。中性可溶性グルカンのマクロファージ活性化作用は、これらの防御を刺激する多くの非特異的物質で報告されているような体温上昇（すなわち発熱）を引き起こさないという特徴がある。中性可溶性グルカンが有するこの重要な長所は、それが白血球中で媒介する応答の本来の性質によるものと思われる。本発明の中性可溶性β−グルカンは免疫応答を選択的に活性化するが単核球細胞からのサイトカイン（例えばＩＬ−１、ＴＮＦ）放出を直接刺激したり惹起したりしないことが示されているので、本発明の中性可溶性グルカンは他のグルカン製剤（例えばレンチナン、クレセイン）および免疫刺激物質と明確に異なる。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。

実施例１ S. cerevisiae からの中性可溶性グルカンの製造
限定グルコース・硫酸アンモニウム最小培地を用いる大規模発酵培養系中で、Saccharomyces cerevisiaeR4Ad菌株（野生型菌株Ａ３６４Ａの非組換え誘導体）を培養した。製造培養は、フィードバッチモード（ニュー・ブランズウィック社製ＭＰＰ８０）でグルコース制限下で行った。生育培養物が後期対数増殖期に入った時点で発酵を停止し、１０ＭのＮａＯＨで培養物のｐＨを１２±０．５に調整することによってＰＧＧを安定化させた。ＰＧＧを含有する酵母菌体を連続フロー式遠心分離（ウェストファリア社製ＳＡ−１）によって集めた。遠心分離後、菌体をステンレス製抽出容器に集めた。

抽出工程の第１の段階として、９０±５℃で１時間、菌体を１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）と混合することによりアルカリ抽出を行った。アルカリ抽出終了時点ではβ−グルカンは依然として固相状態にあったが、これを連続遠心分離（ウェストファリア社製ＳＡ−１）によって集めた。集めた細胞壁画分を上記と同じ手順と条件で再び抽出した。アルカリ処理によって細胞タンパク質、核酸、マンナン、可溶性グルカンおよび極性脂質が加水分解および可溶化されて上清画分が得られ、細胞壁中のキチンは脱アセチル化されてキトサンに変化した。

抽出工程の第２の段階として、ｐＨ４．５±０．０５（濃塩酸で調整）、温度７５±５℃で１時間の抽出を行った。次いで、０．１Ｍの酢酸による抽出を行ってグリコーゲン、キチン、キトサン、および残留タンパク質を完全に除去した。固形物を集め、米国薬局方精製水で２回洗浄し残留酸および酵母分解物をすべて除去した。

抽出工程の第３の段階として、有機溶媒による抽出を６回行った。最初の４回の抽出はイソプロパノール中で行った。遠心分離によって固形物を集めた後、２回のアセトン抽出を行った。この２段階有機溶媒抽出で非極性脂質および薬物と共に精製してもよい疎水性タンパク質を除去した。得られた湿潤固形物を真空オーブン中６５±５℃で４８〜９６時間乾燥させて自由流動性粉末を得た。

この段階で抽出工程によって、全グルカン粒子（ＷＧＰ）と呼ばれる約９０％のβ−グルカンよりなる安定な不溶性中間体が得られた。この乾燥ＷＧＰ中間体は、使用するまで１５〜３０℃で保存した。

ＷＧＰ粉末を室温でガラス反応容器中で９８％ギ酸に再懸濁した。得られた混合物を８５±５℃で２０分間加熱した。この条件下でＷＧＰを部分的に加水分解および可溶化し、目的の分子量分布を有する可溶性ＰＧＧを得、次いで１．５倍容量のエタノールを加えてこれを沈澱させた。完全に混合した後、製剤を遠心分離してβ−グルカン沈澱物を集めた。β−グルカン製剤を米国薬局方精製水中で３時間煮沸することによって残留ギ酸をすべて除去した。

次いで、遠心分離を行い、加水分解されなかったＷＧＰをβ−グルカン溶液から除去した。濃水酸化ナトリウムを加えてβ−グルカン溶液のｐＨを１２．５±０．５まで上げた。以後の精製工程は限外濾過によって行った。

このようにして得られた可溶性アルカリ性β−グルカン製剤を名目分子量カットオフ値（ＮＭＷ）１００，０００の膜フィルター（アミコン社製ＤＣ１０）に通した。アルカリ性条件下でこの限外濾過膜フィルターは不溶性β−グルカンおよび高分子量の可溶性β−グルカンを除去した。次いで、ＮＭＷカットオフ値１０，０００の限外濾過膜フィルターに再循環させて微量の低分子量分解物を除去した。限外濾過は一定容量の０．１ＭのＮａＯＨで洗浄することによって行った。

濃塩酸でｐＨを７．０±０．５に調整して６０±１０℃まで加熱し、２０分間保持してから冷却するという条件下でβ−グルカン溶液を再アニーリングした。次いで、この中性再アニーリング溶液を濃縮し、ＮＭＷカットオフ値７０，０００の限外濾過膜フィルター（フィルトロンミニセップ）中で米国薬局方塩化ナトリウム注射液で洗浄し、再アニーリング中性可溶性グルカンの濃度を高めた。また、この物質をＮＭＷカットオフ値３００，０００の限外濾過膜フィルター（フィルトロンミニセップ）で濾過して高分子量の凝集グルカン分子を除去した。同じ限外濾過膜フィルター中で中性可溶性グルカン物質を一定容量の米国薬局方塩化ナトリウム注射液で洗浄した。

この中性可溶性グルカンをＮＭＷカットオフ値１０，０００の限外濾過膜フィルター中で濃縮した。濃縮プロセスは、少なくとも１．０ｍｇ／ｍｌのヘキソース等量濃度が得られるまで続けた。

さらに、得られた中性可溶性グルカンを発熱物質除去用フィルター（０．１μｍのポシダイン）および滅菌０．２μｍのフィルター（ミリパック）で濾過して無菌で発熱物質を含まない中性可溶性グルカンを得た。この中性可溶性グルカン溶液は、使用するまで室温（１５〜３０℃）下に調節され保存した。ｐＨ範囲４〜８におけるこの中性可溶性グルカンの水溶解度は約１００ｍｇ／ｍｌである。溶解度はｐＨの上昇とともに上昇し、ｐＨ１３では約１５０ｍｇ／ｍｌに達した。

実施例２中性可溶性グルカンの分析
Ａ．グルコース、マンノース、およびグルコサミン
単糖分析を行って、中性可溶性グルカン中のβ−グルカン（グルコースとして）、マンナンまたはホスホマンナン（マンノースとして）、およびキチン（Ｎ−アセチルグルコサミンとして）の相対的含有量を測定した。試料を２Ｍのトリフルオロ酢酸中１１０℃で４時間加水分解して単糖を得、蒸発乾固させ、再び水に溶解させた。５ＭのＮａＯＨを１ｍｌ／分の流速で流すカルボパックＰＡ１００カラム（４×２５０ｍｍ）を用いたダイオネックスＨＰＬＣ装置で単糖を分離し、パルス化電気化学検出器（ダイオネックスＰＥＤ−１型）を用いて定量した。この単糖測定の感度は０．１％（ｗ／ｗ）であった。

グルコース（保持時間１６．６分）が中性可溶性グルカンの唯一の単糖成分であり、微量のグルコース分解物（加水分解によるもの）、すなわち無水グルカン（保持時間２．５分）と５−ヒドロキシメチルフルフラール（保持時間４．３分）が含まれていることがわかった。この結果から、中性可溶性グルカンは９８％以上のグルコースよりなることが確認された。

Ｂ．ＦＴＩＲ
凍結乾燥させた中性可溶性グルカン試料の拡散反射率をフーリエ変換赤外線分光測定（ＦＴＩＲ、マトソンインスツルメンツ社製、ポラリス）により行い、中性可溶性グルカン中に存在するアノマー構造（αまたはβ）と結合様式（β（１−３）、β（１−６）、β（１−４））を決定した。８９０ｃｍ^-1の最大吸収によりβ（１−３）結合が確認され、９２０ｃｍ^-1によりβ（１−６）結合が確認された。α結合アノマー（８５０ｃｍ^-1）（例えばグリコーゲン）やβ（１−４）結合多糖（例えばキチン、９３０ｃｍ^-1）は検出されなかった。

実施例３立体構造分析
アルカリ解離および再アニーリングによる処理を行っていないβ−グルカン溶液の組成をゲル濾過クロマトグラフィー（ｐＨ７）によって分析したところ、多くの物質が含まれていることがわかった。ここでこれらを高分子量凝集物（Ａｇ）、ピークＡ、ピークＢと称する（図２参照）。実施例１で述べたようにしてアルカリ解離および再アニーリングによって調製した中性可溶性グルカンは単一ピークとして存在し（図３参照）、ｐＨ７における平均分子量は９２，６６０ダルトンである。屈折率計を用いてｐＨ７およびｐＨ１３におけるゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を行ったところ、中性可溶性グルカンおよびピークＢの顕著な立体構造が明らかになった。中性可溶性グルカンはｐＨ７からｐＨ１３へ変化するのにともない有意な立体構造変化を示したが、これはｐＨ７で多重らせんであったものがｐＨ１３では１重らせん形態へと完全に解離したことを示している（図３参照）。一方、ピークＢはｐＨが７から１３に変化するのにともないわずかな分子量変化を示しただけであった（図４参照）。中性可溶性グルカンおよびピークＢの分子量とｐＨの関係を下記の表１に示した。

中性可溶性グルカンおよびピークＢグルカンの立体構造は、直鎖状β（１−３）グルカンであるカードランを３重らせん対照として、β（１−６）グルカンであるプスツラン（pustulan）を非定序立体構造対照（non-ordered conformational control）として用いるアニリンブルー複合体形成法［エバンス（Evans ）ら、1984年、Carb. Pol., 4:215-230 ；アダチ（Adachi）ら、1988年、Carb. Res., 177:91-100］によっても決定されている。結果を表２に示すとともに、以下で考察する。

カードラン３重らせん対照はアニリンブルーと複合体を形成し、高度の蛍光を発した。ＮａＯＨ濃度を上げるとカードラン３重らせんが少し解離しはじめたが、カードランを完全に解離させるためには０．２５Ｍを越えるＮａＯＨ濃度が必要であった。プスツラン非定序対照はアニリンブルーと弱い複合体を形成しただけであり、ＮａＯＨ濃度の影響を受けない低レベルの蛍光が測定された。

中性可溶性グルカンは低いＮａＯＨ濃度（２５ｍＭのＮａＯＨ）で効果的にアニリンブルーと複合体を形成し、高度の蛍光を発したが、中性可溶性グルカン立体構造は１５０ｍＭという低いＮａＯＨ濃度で有意に（５０％）解離した。このことは、中性可溶性グルカンがラミナリンやカードランなど解離が起きるためにはさらに有意に高いＮａＯＨ濃度を要する天然型β−グルカンと異なる特有の立体構造体として存在することを示すものである。ピークＢは１重らせん立体構造ゆえにアニリンブルーと弱い複合体を形成した。

実施例４中性可溶性グルカンがヒト単球によるＴＮＦαおよびＩＬ−１βの産生に及ぼす影響
クエン酸緩衝デキストラン処理正常血液からヒト抹消血単球を単離し［ジャヌス（Janusz）ら、1987年、J. Immunol., 138:3897-3901］、カルシウム、マグネシウム、およびフェノールレッドを除いたハンク液（Hank's Balanced Salts Solution: ＨＢＳＳ）で洗浄し、フィコール−パック（ファルマシアファインケミカルズ社製、アメリカ合衆国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）担体上の勾配遠心分離によって精製した。単核球細胞をＨＢＳＳに集め、２回洗浄し、１％の熱不活化自己血清（５６℃、３０分）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製、アメリカ合衆国、ニューヨーク州、グランドアイランド）に再懸濁し、コールターカウンターで計数した。

単球の単層を調製するために、１ｍｌの２．２ｘ１０⁶ 単核球細胞／ｍｌを２４穴組織培養プレート（コスター社製、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）に入れ、５％ＣＯ₂を含む加湿雰囲気中３７℃で１時間インキュベートし、ＲＰＭＩで３回洗浄して非付着性細胞を除去した。再び１ｍｌの２．２ｘ１０⁶ 単核球細胞／ｍｌを各穴に重層し、上記と同様にして２時間インキュベートした後、非付着性細胞を除去した。倒立位相差顕微鏡と校正網を用いて倍率４０倍で肉眼で数えたところ、３０名のドナーの付着性細胞の数は１穴当たり０．７７±０．２０ｘ１０⁶であった（平均値±標準偏差）。形態および非特異性エステラーゼ染色により、９５％を越える付着細胞が単球であることがわかった。

様々なグルカン製剤の存在下または非存在下で、単球の単層をＣＯ₂ チャンバー中３７℃で０．５ｍｌのＲＰＭＩ、１％の熱活性化自己血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および５ｍＭのＭｇＣｌ₂とともに０〜８時間インキュベートした。培養上清を分離し、４℃で１４，０００ｇ５分間遠心分離することによって清澄化し、サイトカイン測定まで−７０℃で保存した。

単球上清中のＴＮＦ−α濃度は、４０ｐｇ／ｍｌの検出限界を有するバイオカインＴＮＦ試験キット（Ｔセルサイエンシズ社製、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。データは、０．５ｍｌの上清に含まれるサイトカインの量を１穴あたりの単球数で割って求めた１０⁶単球あたりのｎｇ数で表した。

ＴＮＦ−αの細胞関連濃度を測定するために、凍結−解凍を３回繰り返して付着性単球を０．２５ｍｌのＰＢＳに溶出した。４℃で１４，０００ｇ、５分間の遠心分離を行い溶出物から残渣を除去し、得られた上清を−７０℃で保存した。新たに調製した単球の単層には検出可能な濃度の細胞内ＴＮＦ−αは含まれていなかった。
結果を下記の表３と表４に示した。

表３は、不溶性グルカン粒子および可溶性β（１−６）およびβ（１−３）結合グルカンであるラミナリンによってＴＮＦ−αが刺激されたことを示している。中性可溶性グルカンによるＴＮＦ−αの刺激は見られなかった。表４は同様の結果を示しているが、ＴＮＦ−αの刺激が立体構造に依存することをさらに明確に示している。中性可溶性グルカンはＴＮＦ−αを刺激しなかったが、ピークＢ（１重らせん立体構造）はＴＮＦ−αを刺激した。

実施例５グルカン受容体に対する中性可溶性グルカンの親和性
シリコン処理カバーガラス上にヒト単球の単層を調製し［クゾップ（Czop）ら、1978年、J. Immunol., 120:1132 ］、加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で０．２５ｍｌの緩衝液（ＲＰＭＩ−Ｍｇ−ＨＥＰＥＳ）または異なる濃度（０．１〜５０μｇ／ｍｌ）の中性可溶性グルカンとともに１８分間インキュベートした。次いで単球の単層を５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、０．２５ｍｌの４．８×１０⁶／ｍｌザイモサン粒子［クゾップ（Czop）とオーステン（Austen）、1985年、J. Immunol., 134:2588-2593］で重層した。３７℃で３０分間インキュベートした後、単層を５０ｍｌのハンク液で３回洗浄し、取り込まれなかったザイモサンを除去した。次いで、単層を固定し、ギムザ染色した。１単層あたり少なくとも３００個の単球によるザイモサン粒子取り込み量を倍率１，０００倍の光学顕微鏡観察によって測定した。

上記のようにして緩衝液または５０μｇ／ｍｌの中性可溶性グルカンであらかじめ処理した単球の単層について、ＩｇＧ結合ヒツジ赤血球（Ｅ^S ＩｇＧ）取り込み能力を試験した。あらかじめ中性可溶性グルカンとともに１８分間インキュベートした後、単層を０．２５ｍｌの１ｘ１０⁷／ｍｌのＥ^S ＩｇＧとともに３７℃で３０分間インキュベートし、５０ｍｌのハンク液で３回洗浄し、０．８４％のＮＨ₄ Ｃｌで４分間処理することで取り込まれなかったＥ^SＩｇＧを溶解し、上記のようにして固定および染色した。１単層あたり少なくとも３００個の単球を数えることによって≧１および≧３のＥ^S ＩｇＧを取り込んだ単球の比率を計算した。

緩衝液による前処理後の標的取り込み単球の比率から中性可溶性グルカンによる前処理後の標的取り込み単球の比率を引き、この数を緩衝液による前処理後の取り込み単球の比率で割り、さらに１００を掛けて単球取り込み阻害率を計算した。データは２回の実験の平均で表し、表５に示した。

上記で試験した２種類のβ−グルカン製剤はどちらも単球によるグルカン粒子の取り込みを阻害した。このことは、ヒト単球上でβ−グルカン受容体に対して競合的に結合する能力があることを示している。５０μｇ／ｍｌと５００μｇ／ｍｌのいずれにおいても阻害率が高かったことからわかるように、中性可溶性グルカンはピークＢより高い受容体結合能力を示した。この生物測定によって、中性可溶性グルカンはβ−グルカン受容体に対するリガンドとして優れていることがわかる。

実施例６ヒト単核球細胞由来のＩＬ−１とＴＮＦのイン・ビトロ刺激
健康な男性志願者から静脈血を採取し、フィコール−ハイパック遠心分離により単核球細胞を分画した。単核球細胞を洗浄し、常法により限外濾過でエンドトキシンを除去したＲＰＭＩ−１６４０培地［ジナレロ（Dinarello ）ら、1987年、J. Clin. Microbiol. 25:1233-8 ）に５×１０⁶ 個／ｍｌの濃度に再懸濁し、９６穴マイクロタイタープレート［オンドレ（Endres）ら、1989年、N.E. J. Med. 320:265-271］に分注した。次いで、細胞を１ｎｇ／ｍｌのエンドトキシン（リポ多糖、E. coli 055:B5、シグマ社製、セントルイス）または１０〜１，０００ｎｇ／ｍｌのＰＧＧとともに５％ＣＯ₂中３７℃で２４時間インキュベートした後、３回の凍結解凍サイクル［オンドレ（Endres）ら、1989年、N.E. J. Med.320:265-271 ］によって溶菌した。ＩＬ−１βとＴＮＦαの合成を常法に従い特異的ラジオイムノアッセイ法［リーシ（Lisi）ら、1987年、Lymph Res. 6:229-244；ローンマン（Lonnemann ）ら、1988年、Lymph. Res. 7:75-84 ；バンデルメール（Van der Meer）ら、1988年、J. Leukocycte Biol. 43:216-223］によって測定した。

中性可溶性グルカンが公知のサイトカイン刺激物質であるエンドトキシンとともにサイトカイン合成のプライミング剤として作用したかどうかを調べるために、単核球細胞をあらかじめ１、１０、および１，０００ｎｇ／ｍｌのＰＧＧとともに５％ＣＯ₂中３７℃で３時間インキュベートした。細胞を洗浄して中性可溶性グルカンを除去した後、上記のようにして１ｎｇ／ｍｌのエンドトキシンとともにインキュベートした。ＩＬ−１βおよびＴＮＦαを上記のようにして測定した。

結果を表６にまとめた。１０〜１，０００ｎｇ／ｍｌの用量で刺激物質として使用した中性可溶性グルカン単独では、対照の緩衝液処理細胞と比べてＩＬ−１βやＴＮＦαの合成を上昇させなかった。公知の刺激物質であるエンドトキシンＬＰＳは両方のサイトカインの濃度を有意に上昇させた。この実験の第２相において、中性可溶性グルカンがサイトカイン合成のプライミング剤として作用する能力を試験した。同じドナーから得た細胞を３種類の用量の中性可溶性グルカン（１０〜１，０００ｎｇ／ｍｌ）とともにあらかじめ保温し、次いで共存刺激物質としてのエンドトキシンを加えた。中性可溶性グルカンは、エンドトキシン単独の場合と比べてＩＬ−１βやＴＮＦαの濃度を全く上昇させなかった。

実施例７感染モデル
ラットで敗血症モデルを作成して、例えば腹部手術後によく見られる重大な感染から免疫的に健全な宿主を防御するＰＧＧグルカンの効果を調べた。腹部内敗血症のラットモデルについては学術文献に詳細な記述がある［オンダードンク（Onderdonk ）ら、1974年、Infect. Immun., 10:1256, 1259 ］。

群分けしたラットに対し、感染チャレンジ投与の２４時間および４時間前に中性可溶性グルカン（１００μｇ／０．２ｍｌ）または対照食塩水（０．２ｍｌ）を筋肉内投与した。構成の明確な複数の微生物からなる感染チャレンジ接種源（盲腸接種物）をゼラチンカプセルに入れ、このカプセルを麻酔したラットの腹腔に前正中線切開により外科的に埋め込んだ。この実験的に誘導した感染による早期腹膜炎は、血液および腹腔中にグラム陰性細菌が存在することに起因しており、死亡率を高める原因となっていた。盲腸接種物は、大腸菌や絶対嫌気性菌（Streptococcus sp., Bacteroides sp., Clostridium perfringens, Clostridium ramosum, Peptostreptococus magnusおよびproductus, Proteus mirabilis）などの通性種を含んでいた。動物は、最初の４８時間は毎日４回、その後は毎日２回観察した。結果を表７に示した。

これらの結果は、ＩＬ−１やＴＮＦを誘導しない中性可溶性グルカンは致死的細菌感染からマウスを防御すること示している。

実施例８ヒトへの中性可溶性グルカンの投与
静脈内点滴注射した中性可溶性グルカン（２．２５ｍｇ／ｋｇ）の安全性を偽薬対照と比較評価する目的で、健康な男性について無作為２重盲験偽薬対照臨床試験を行った。副作用は見られなかった。また、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧＭ−ＣＳＦの上昇も見られなかった。中性可溶性グルカンの単回静脈内投与は単球と好中球の増加およびこれらの細胞の殺活性の上昇を引き起こしたことから、中性可溶性グルカンはヒトにおいて望ましい免疫活性を保持するといえる（下記の表８、表９、表１０を参照）。しかし、図５と図６に示したように、ＩＬ−１やＴＮＦの血清中濃度は変化せず、どの患者も発熱や炎症反応を示さなかった。この結果は上記実施例で述べたイン・ビトロのデータと一致している。

実施例９中性可溶性グルカンの創傷治癒効果
完全な深さの創傷を有する無毛マウスモデルを使い、Staphylococcus aureus に感染しているものとしていないものについて創傷治癒試験を行った。

無毛ＳＫＨ−１近交系マウス（６〜８週齢）をエーテルで麻酔し、１０番メスで深さ３ｃｍの正中縦切開を行い、下部の筋膜に達しない完全な深さの創傷を作った。切開部は、１ｃｍ間隔で鋼クリップで閉鎖した。

リン酸緩衝食塩水に溶かした中性可溶性グルカン処方を創傷作成３０分後に塗布し、術後７日間にわたり２４時間間隔で塗布を繰り返した。毎日マウス１匹あたり２μｇの中性可溶性グルカンを局所塗布した。創傷を毎日観察し、肉眼観察による創傷治癒強化効果の等級分けを毎日行った。創傷は、閉塞状況に応じて５度を最高の治癒程度として０〜５の段階で点数化した。感染モデルとしたマウスの群では、創傷作成３０分後および中性可溶性グルカン処方処置の２時間前に１０⁷個のStaphylococcus aureus の培養物で創傷を処置した。

各試験群の創傷部位の組織学的評価を行った。対照群（未処理創傷）の真皮はリンパ球と単球／マクロファージの両方が深く侵入していたが、表皮層で見られた上皮化は不完全であった。組織切片を観察したところ、真皮組織は弱くなっており、断面を見ると組織統合性は維持されていなかった。

中性可溶性グルカンを含有するリン酸緩衝食塩水で３日間処理したマウスから単離した創傷組織の組織学的所見は、マクロファージとリンパ球の深い侵入を示していた。組織統合性は良好であった。

中性可溶性グルカン組成物を創傷に局所的に塗布したところ、創傷部位における白血球の侵入と活性を刺激し、創傷部の真皮層内の創傷治癒を促進した。さらに、この組成物は敗血症に進行した未処理創傷とは異なり、細菌（Staphylococcus aureus ）による感染を効果的に排除し、敗血症への進行を防止した。

生物寄託
Saccharomyces cerevisiaeR4Ad株は、1992年８月20日付けでブダペスト条約に基づきAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）（アメリカ合衆国、メリーランド州、ロックビルパーク、ローンドライブ）に寄託した。本菌株はＡＴＣＣ寄託番号７４１８１を付与されている。

均等物
当業者は、通常の実験を用いるだけで、本願中に述べられている特定の材料および成分と同等である多くの物質を認識するか、または確認し得るであろう。このような均等物は前記請求項の範囲に含まれるものとする。

発明の効果
本発明により、サイトカイン産生を刺激しないで強力かつ特異的な免疫作用を示す中性可溶性β−グルカン、すなわち免疫刺激特性を有するが、イン・ビトロにおいてＩＬ−１および／またはＴＮＦの産生を刺激しない中性可溶性β−グルカンおよび該中性可溶性β−グルカンを含有する製剤、および新規な該製剤製造方法を提供することが可能となった。

図１は、単一のβ（１−６）結合グルコース部分に規則的分枝を有する直鎖状β（１−３）結合グルコースポリマーである中性可溶性グルカンの一般構造を示す図である。図２は、アルカリ解離と再アニーリングによる精製をしていない可溶性グルカンのゲル濾過クロマトグラム（ｐＨ７）を示す図である。クロマトグラムは３種のものを示しており、それぞれ高分子量凝集物（Ａｇ）、ピークＡ、ピークＢ（１重らせんグルカン）とする。図３は、中性可溶性グルカンのゲル濾過クロマトグラムを示す図である。実線はｐＨ７における中性可溶性グルカンを示し、破線はｐＨ１３における中性可溶性グルカンを示す。図４は、１重らせんβ−グルカン（ピークＢ）のゲル濾過クロマトグラムを示す図である。実線はｐＨ７におけるピークＢを示し、破線はｐＨ１３におけるピークＢを示す。図５は、偽薬（破線）または中性可溶性グルカン（実線）を点滴した患者から得た血清ＩＬ−１値の経時変化を示す図である。図６は、偽薬（破線）または中性可溶性グルカン（実線）を点滴した患者から得た血清ＴＮＦ値の経時変化を示す図である。

Claims

３重らせん立体構造を有する、β（１−６）グリコシド結合により規則的に分枝している水溶性β（１−３）グルカンであって、イン・ビトロにおいて炎症性副作用を生じさせる生化学的メディエーター（ＩＬ−１およびＴＮＦ）の産生を刺激せずに免疫応答を増強可能なグルカン。
免疫刺激特性を有するが、イン・ビトロにおいてインターロイキン−１（ＩＬ−１）もしくは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）もしくは両者の産生を刺激または惹起しない請求項１記載の水溶性β（１−３）グルカン。
約３０，０００〜約３００，０００ダルトンまたは約３０，０００〜約５００，０００ダルトンの平均分子量を有する請求項１または２記載の水溶性β（１−３）グルカン。
該グルカンが酵母または酵母全グルカン粒子に由来するものである請求項１〜３いずれか記載の水溶性β（１−３）グルカン。
酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株である請求項４記載の水溶性β（１−３）グルカン。
生理学上許容し得る担体に保持された請求項１〜５いずれか記載の水溶性β（１−３）グルカンおよび任意の抗微生物剤を含有してなる医薬組成物。
（i）ヒト以外の哺乳動物に請求項１〜５いずれか記載の水溶性β（１−３）グルカンまたは請求項６記載のグルカン組成物を投与することを含む、感染リスクを有する該哺乳動物の感染を予防する；
（ii）有効量の前記水溶性β（１−３）グルカンまたはグルカン組成物を創傷部位に投与することを含む、ヒト以外の哺乳動物における創傷部位の修復および治癒を刺激する；
（iii）有効量の前記水溶性β（１−３）グルカンまたはグルカン組成物をヒト以外の哺乳動物に投与することにより、食細胞の殺微生物活性を増強する；
（iv）有効量の前記水溶性β（１−３）グルカンまたはグルカン組成物をヒト以外の哺乳動物に投与することにより、単球および好中球の増殖を刺激する；
（v）有効量の前記水溶性β（１−３）グルカンまたはグルカン組成物をヒト以外の哺乳動物に投与することにより、有害な副作用を生じさせる生化学的メディエーター（ＩＬ−１およびＴＮＦ）の産生を刺激せずに該哺乳動物の免疫応答を増強する
ための方法。