JP4979467B2 - 抗β−グルカン抗体測定方法と測定キット - Google Patents
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宿前利郎:b-グルカンの魅力,東洋医学舎,2000 Obayashi T., Yoshida M., Mori T., Goto H., Yasuoka A., Iwasaki H., Teshima H., Kohno S., Horiuchi A., Ito A., et al. : Plasma (1-->3)-beta-D-glucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes. Lancet, 345, 17-20, 1995. 大野尚仁:真菌b1,3-グルカン類の構造と宿主応答性,ドージンニュース,114,1-10,2004,http://www.dojindo.co.jp/news/index.html 宿前利郎:真菌b1,3-グルカンの構造と活性,薬学雑誌,120, 413-431, 2000 Ross GD, Cain JA, Myones BL, Newman SL, Lachmann PJ. Specificity of membrane complement receptor type three (CR3) for beta-glucans. Complement. 4(2):61-74, 1987. Zimmerman JW, Lindermuth J, Fish PA, Palace GP, Stevenson TT, DeMong DE. A novel carbohydrate-glycosphingolipid interaction between a beta-(1-3)-glucan immunomodulator, PGG-glucan, and lactosylceramide of human leukocytes. J Biol Chem. 273(34):22014-20, 1998. Brown GD, Gordon S. Immune recognition. A new receptor for beta-glucans. Nature. 413(6851):36-7, 2001. Masuzawa S., Yoshida M., Ishibsahi K., Saito N., Akashi M., Yoshikawa N., Suzuki T., Nameda S., Miura N. N., Adachi Y., Ohno N., Solubilized Candida cell wall b-glucan, CSBG, is an epitope of natural human antibody, Drug Develop. Res., 58, 179-189 (2003).
(1)酵母または真菌から精製したβ-グルカンを固相化した担体、
(2)標識化抗IgG二次抗体
を含むことを特徴とする抗β-グルカン抗体測定キットを提供する。
(1)固相抗原BGの調製
Zymosan A(Sigma)2gを0.1 MのNaOH溶液に懸濁し、NaClOを加え、4℃にて一昼夜酸化処理を行った。反応後、12000rpm、15分間遠心し、沈殿を回収した。不溶部をエタノール、アセトンで洗浄、乾燥し、不溶性画分を得た。この不溶性画分をDMSOに懸濁し、超音波処理し、遠心して得られた上清からZymosan A(Saccharomyces cerevisiae)由来BG(ZYMBG)を得た。
(2)抗BG抗体価の測定
96 well immune plate(Nunc)にbicarbonate buffer(pH9.0)を用いてZYMBGまたはCSBGを被覆し、4℃で一晩インキュベートした。PBSTで洗浄後、1% BPBSTで37℃、60分間ブロッキングした。PBSTで洗浄後、標準抗体(ヒトIgG抗体、Sigma, Product number I-4506)およびサンプル(50μL)を加え、37℃、60分間インキュベートした後、PBSTで洗浄した。二次抗体としてペルオキシダーゼ共益化抗ヒトIgG+M+A(Sigma)を50μL加え、再び37℃、60分間インキュベートした。PBSTで洗浄後、ペルオキシダーゼ基質(TMB microwell peroxidase sytem、KPL Inc.)を用いて発色させた。1 Nリン酸で反応を停止させた後、吸光度(OD 450/Ref.630)を測定した。
実施例1:ヒトグロブリン製剤中の抗BG抗体の測定
ヒトプール血清より調製されたヒトグロブリン製剤(ポリグロブリンN、BAYWER)、グロブリン試薬である human immunoglobulin G(Sigma)由来イムノグロブリンの抗BG抗体価を、希釈系列を作成し測定した。
実施例2:可溶性抗原添加による競合的ELISAでの結合抗体特異性の検討
ポリグロブリンN 4000倍希釈のZYMBG固相化プレートへの添加時に、可溶性抗原として、様々な標準多糖を同時に添加し、プレートと可溶性抗原間で抗体結合を競合させることにより、反応抗体の特異性を検討した。
実施例3:ヒト血清中の抗BG抗体の測定
健常ヒト血清(8例)において希釈系列を作成し、CSBG固相化プレートを用いて抗BG抗体力価を測定した。
実施例4:標準血清を用いた検量線の作成
ヒトグロブリン製剤より、酵母由来の水不溶性β-グルカンを担体として精製した抗体画分を標準抗体として用い、希釈系列を作成し、検量線を作成した。
実施例5:検量線を用いたヒト血清中の抗BG抗体力価の測定
健常ヒト血清(24例)における抗BG抗体力価を、実施例4で作成した検量線を用いて測定した。
実施例6:キノコ系機能性食品服用者における抗体力価の変化
β-グルカンはキノコの主要構成多糖成分であることが知られている。そこで、食用薬用・健康食品であるAgaricus brasiliensis抽出物(King Agaricus)を服用した健常者(年齢43±11、男性13名、女性14名)の抗BG抗体力価を測定した。対照としては、プラセボを服用した健常者(年齢45±9、男性12名、女性23名)について同様の測定を行った。なお、抗体力価には個体差が存在するため、服用前の抗BG抗体価(unit)に対する服用後の増加率で抗体力価の変化を評価した。
実施例7:抗BG抗体アイソタイプの検討
抗体にはいくつかのアイソタイプが存在する。抗BG抗体にもIgG、IgM、IgAクラスが存在することが明らかとなってきた。検出する二次抗体のロット間の安定性から特定のアイソタイプを測定することが望ましい。そこで、どのアイソタイプを測定するのが適切かを健常者77例における各抗BGアイソタイプ(IgG、IgM、IgA)抗体力価を比較検討した。
実施例8:唾液中抗BG抗体価の測定
Slivette(SARSTEDT社製)を口腔内で左右30回ずつ被験者に噛ませて唾液試料を採取し、2分間1000回転で遠心を行なった。上清を回収し、アジ化ナトリウム0.09%を含有する生理食塩水で2倍希釈し、-80℃で冷凍保存した。採取したヒト健常人唾液をサンプルNo. 1-4として希釈系列を作成し、CSBG固相化プレートを用いて唾液中抗BG抗体力価を測定した。その際にブロッキング剤としてどんな物質が適しているのかを検討するため、BPBSTとカゼインNaを用いて比較検討を行なった(図8)。
実施例9:可溶性抗原添加による競合ELISAによる結合抗体(測定抗体)特異性の検討
実施例8に記載したサンプルNo. 1-4の80倍希釈の唾液をCSBG固相化プレートへ添加する際に、可溶性抗原として様々な標準多糖を同時に添加し、固相と可溶性抗原間で抗体結合を競合させることにより反応抗体の特異性を検討した。
実施例10:ヒト唾液中抗BG抗体価の経時変化の検討
実施例8と同様のヒト唾液中抗BG抗体の測定法を用いて、一日の様々な時点で唾液を採取し、どのような日内変動が見られるのか検討した。なお唾液はブロッキング剤であるcaseinでそれぞれ10倍、20倍、40倍、100倍希釈し、実験に用いた。
実施例11:検体の唾液中抗BG抗体価の比較
実施例8と同様のヒト唾液中抗BG抗体の測定法を用いて、ヒト唾液(8例)において希釈系列を作成し、抗BG抗体力価を測定した。
Claims (9)
- 酵母または真菌から精製したβ-グルカンに被験者から単離した唾液を接触させ、β-グルカンに結合した唾液中の抗β-グルカン抗体量を検出することを特徴とする抗β-グルカン抗体測定方法。
- β-グルカンが、酵母(Saccharomyces cerevisiae)または真菌(Candida)から精製したβ-グルカンである請求項1の測定方法。
- 酵母(Saccharomyces cerevisiae)から精製したβ-グルカンが、Zymosan Aから精製したβ-グルカン(ZYMBG)である請求項2の測定方法。
- 真菌(Candida)から精製したβ-グルカンが、Candida細胞壁から精製したβ-グルカン(CSBG)である請求項2の測定方法。
- β-グルカンを固相化したプレートに唾液を接触させる請求項1の測定方法。
- 遠心分離した唾液上清を接触させる請求項1から5のいずれか1項の測定方法。
- 標識化抗IgG二次抗体によって抗β-グルカン抗体を検出する請求項1の測定方法。
- 被験者唾液中の抗β-グルカン抗体を測定するキットであって、少なくとも、
(1)酵母(Saccharomyces cerevisiae)から精製したβ-グルカンを固相化した担体、
(2)標識化抗IgG二次抗体
を含むことを特徴とする抗β-グルカン抗体測定キット。 - 酵母(Saccharomyces cerevisiae)から精製したβ-グルカンが、Zymosan Aから精製したβ-グルカン(ZYMBG)である請求項8の測定キット。
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