JP6743322B2 - 生体試料中の(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法、(1→3)−β−D−グルカン分析用キット、及び(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法に使用するための生体試料用アルカリ前処理液 - Google Patents
生体試料中の(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法、(1→3)−β−D−グルカン分析用キット、及び(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法に使用するための生体試料用アルカリ前処理液 Download PDFInfo
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Description
具体的に、本発明は以下のとおりである。
<1>アルカリ溶液を用いて生体試料を前処理する工程と
抗(1→3)−β−D−グルカンモノクローナル抗体を用いて、前記生体試料中の(1→3)−β−D−グルカンを分析する工程と
を含む、生体試料中の(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法、
<2>前記生体試料が、血液、血漿、又は血清である、<1>に記載の免疫学的分析方法、
<3>前記アルカリ溶液のpHが11以上である、<1>又は<2>に記載の免疫学的分析方法、
<4>ELISAを用いる、<1>〜<3>のいずれかに記載の免疫学的分析方法、
<5>以下の(a)及び(b)を含む、生体試料中の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット
(a)第1の抗(1→3)−β−D−グルカンモノクローナル抗体を固定化した固相、及び
(b)生体試料用アルカリ前処理液、
<6>前記生体試料が、血液、血漿、又は血清である、<5>に記載の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット、
<7>前記(b)生体試料用アルカリ前処理液のpHが、11以上である、<5>又は<6>に記載の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット、
<8>(c)前記生体試料用アルカリ前処理液の中和用溶液をさらに含む、<5>〜<7>のいずれかに記載の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット、
<9>(d)標識物質で標識された第2の抗(1→3)−β−D−グルカンモノクローナル抗体をさらに含む、<5>〜<8>のいずれかに記載の生体試料中の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット、
<10>抗(1→3)−β−D−グルカンモノクローナル抗体を使用する生体試料中の(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法に使用するための、生体試料用アルカリ前処理液、並びに
<11>pHが11以上である、<10>に記載の生体試料用アルカリ前処理液。
(生体試料)
本発明における「生体試料」としては、主に生体(生物)由来の固形組織及び体液を挙げることができ、体液を用いることが好ましい。本発明における生体試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液であり、さらに好ましくは血液、血清又は血漿であり、さらに好ましくは深在性真菌症に罹患している疑いのある対象の血液、血清又は血漿であり、最も好ましくはCandida属及び/又はAspergillus属を原因菌とする深在性真菌症に罹患している疑いのある対象の血液、血清又は血漿である。生体又は対象は、ヒト又は動物(例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ラット、ハムスター、ウマ、ウシ、ブタ、鳥類、及び魚類)を含み、好ましくはヒトである。
本発明の免疫学的分析方法は、アルカリ溶液を用いて生体試料を前処理する工程を含む。前処理を行う時間は特に限定されず、例えば、30秒以内、1分以内、3分以内、又は5分以内である。前処理を5分以上行ってもよい。アルカリ溶液による前処理の前又は後に、本発明の効果が得られる限りにおいて、熱処理などを行うこともできる。なお、「アルカリ溶液を用いて生体試料を前処理する」とは、アルカリ溶液と生体試料とを接触させることを意味する。
本発明における前処理工程において使用されるアルカリ溶液は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属の水酸化物を用いることができる。水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化カリウム(KOH)、又は水酸化リチウム(LiOH)が特に好ましい。
本発明における前処理工程において使用されるアルカリ溶液の温度は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されるものではない。具体的には、例えば、下限として0℃以上、4℃以上、10℃以上、又は20℃以上であることができ、上限としては、70℃以下、60℃以下、50℃以下、40℃以下、又は37℃以下であることができる。具体的な範囲としては、0〜70℃が好ましく、4〜60℃がより好ましく、4〜50℃がさらに好ましく、4〜40℃が最も好ましい。
アルカリ溶液を用いて生体試料を処理した後、アルカリ溶液を中和することが好ましい。アルカリ溶液の中和に使用する溶液としては、本発明の効果が得られる限りにおいて限定されることはないが、例えば、Tris/HCl等が挙げられる。中和後のpHは、使用する抗体及び生体試料に応じて適宜調整することができるが、pH6〜9、pH6.5〜8.5、又はpH7〜8の間に調整することが例示できる。
本明細書において、「(1→3)−β−D−グルカン」及び「BG」は、グルコースの1位の炭素と他のグルコースの3位の炭素とがβ型の結合様式により結合したグルカンを意味する。BGは、3重らせん構造という独特の構造を有する。本明細書において、「(1→3)−β−D−グルカン」及び「BG」は、この3重らせん構造の外側の側鎖に(1→6)様式でグルコースが結合した、ラミナリン、レンチナン等の(1→3)(1→6)−β−D−グルカンを含むこともできる。また、本明細書において、「(1→3)−β−D−グルカン」及び「BG」は、(1→3)結合様式に加えて(1→4)の結合様式を含む、オオムギ由来βグルカン、リケナン等の(1→3)(1→4)−β−D−グルカンを含むこともできる。
本発明において使用される抗(1→3)−β−D−グルカンモノクローナル抗体及び「抗BGモノクローナル抗体」は、BGと特異的に反応する。「BGと特異的に反応する」とは、BGとは反応するが、類似した構造を有する物質とは実質的に反応しないことを意味する。「実質的に反応しない」の意味は後述する。本発明において使用される抗BGモノクローナル抗体の具体例としては、モノクローナル抗体86202R、86207、及び86208が挙げられる。
前記のようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などを挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、先述した抗血清からの抗体の精製法、例えばDEAE陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、PEG分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
本発明の免疫学的分析方法としては、ELISA、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、及び高速液体クロマトグラフィー法(HPLC法)等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の免疫学的分析方法としては、ELISAを用いることが好ましい。ELISAの中でも、固相に固定した第1の抗BGモノクローナル抗体と標識した第2の抗BGモノクローナル抗体とを使用するサンドイッチELISAが好ましい。この場合、第1の抗BGモノクローナル抗体として、86207抗体を用い、第2の抗BGモノクローナル抗体として、86202R抗体を用いることができる。なお、第1の抗BGモノクローナル抗体と第2の抗BGモノクローナル抗体は同一の抗体を用いてもよい。さらに固相に固相化する抗体、あるいは標識抗体は、それぞれ複数の抗体を混合してもよい。標識抗体に対する標識物質としては、ビオチン又はHRPを使用することが好ましい。
本発明の免疫学的分析方法の分析結果に基づき、対象が深在性真菌症に罹患しているか否かを診断することができ、又は診断の補助とすることができる。従来の抗体を利用した免疫学的分析方法では感度が不足しており、罹患早期の深在性真菌症患者では、陰性と判断されてしまう恐れがあった。深在性真菌症は早期発見及び早期治療が重要となる。本発明の高感度な免疫学的分析方法を使用すれば、深在性真菌症の早期発見及び早期治療を実現できるものである。
また、本発明の免疫学的分析方法を行った後、必要に応じて、生体試料中のBGを分析する工程の結果に基づき、他の深在性真菌症分析方法の患者への実施、及び/又は深在性真菌症治療薬の患者への投与を実施してもよい。
本発明により提供されるキットは、(a)第1の抗BG抗体を固定化したプレートなどの固相、及び(b)生体試料用アルカリ前処理液を含み、好ましくは(d)標識物質で標識された第2の抗BGモノクローナル抗体を含む。第1の抗BGモノクローナル抗体を固定化した固相は、生体試料中のBGを捕捉して、BG−抗体複合体を形成する。標識物質で標識された第2の抗BGモノクローナル抗体は、このBG−抗体複合体に反応してサンドイッチを形成する。標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中のBGを測定することができる。第1の抗BGモノクローナル抗体の固相への固定化の方法、第2の抗BGモノクローナル抗体の標識物質での標識の方法など、キットを構成する上での具体的な方法は本明細書中に記載された方法のほか、当業者に周知の方法を制限なく使用することができる。
1.免疫用抗原の調製
グルコース7個が直鎖状に重合した構造を有するBGであるラミナリヘプタオース(生化学バイオビジネス社製)を免疫用抗原として使用した。ラミナリヘプタオース−トランスフェリンコンジュゲートを非特許文献1に記載の調製方法と同じ方法で調製し、免疫用抗原として使用した。
調製したラミナリヘプタオース−トランスフェリンコンジュゲートの溶液(1mg/mL)100μl、0.1MPBS(pH7.2)0.25mL及びフロイントのアジュバント(完全アジュバントまたは完全アジュバント)0.25mLからなる懸濁液の全量をBALB/cマウス(雌)及びF344/Jc1ラット(雌)の背部皮下又は腹腔にそれぞれ計3−6回投与した。投与間隔は2週間で、最初の投与はフロイントの完全アジュバントを、後の4回はフロイントの不完全アジュバントを用いた。5回目の投与の1週間後にマウス及びラットを開腹してそれらの脾臓をとり、ピペッティングにより単細胞を得た。
実施例1では、ヒト血漿検体を用いてサンドイッチELISAを行い、アルカリによる前処理、酸による前処理、又は熱による前処理がBG測定感度に与える影響を検討した。
固相用抗体として86207抗体を使用し、液相抗体として、ビオチン標識86202R抗体を使用した。
ヒト血漿検体44μLにアルカリ前処理液77.4μL(150mM KOH:水酸化カリウム)を添加し、37℃で15分間インキュベートした。その後、アルカリ前処理液に1M Tris/HCl(pH7.5)を98.6μL添加し、アルカリ前処理液を中和した(合計220μL, 検体5倍希釈, 中和後のpHは7.9未満)。これをアルカリ前処理検体とした。
また、アルカリ前処理液77.4μLにあらかじめ1M Tris/HCl(pH7.5)を98.6μL添加して中和した。その後にヒト血漿検体44μLを加え、同じ溶液組成でアルカリ前処理をしていない検体を得た。
ヒト血漿検体80μLに2.5%過塩素酸80μLを添加し、37℃で15分間インキュベートした(白色の沈殿物が生じた)。その後、インキュベートした検体を遠心し(14000rpm, 15分, 4℃)、上清88μLを回収し、1M Tris/Cl(pH7.5)を138μL添加して過塩素酸を中和した(合計220μL, 検体5倍希釈,中和後のpHは7.4未満)。検体を室温に戻したのち、酸前処理検体として使用した。
2.5%過塩素酸44μLに1M Tris/Cl(pH7.5)を138μL加えてあらかじめ中和した。その後にヒト血漿検体44μLを添加し、同じ溶液組成で過塩素酸前処理をしていない検体を得た。
ヒト血漿検体44μLにPBS176μLを添加し(合計220μL, 検体5倍希釈)、75℃で15分間インキュベートした。インキュベートした検体を室温に戻したのち、熱前処理検体として使用した。
希釈したヒト血漿検体を室温(20〜25℃)で15分間インキュベートし、同じ溶液組成で熱処理をしていない検体を得た。
いずれの検体に関しても2測定分(220μL分, 1測定は100μL使用)の検体量を作製し、サンドイッチELISAに用いた。
86202R抗体を2mg/mL(13.7μM, PBSで希釈)に調整し、20倍量(274μM)のEZ−Link Sulfo−NHS−LC−Biotin(Thermo Fisher Scientific社製)と反応させた。反応は氷上で2時間行った。
PBSで透析することにより、未反応のEZ−Link Sulfo−NHS−LC−Biotinを除いた。透析は4℃, 100倍量で2回行った(Slide−A−Lyzer Dialysis cas・BR>唐・狽狽・10k(Thermo Fisher Scientific社製)を使用)。
透析後、分光光度計を用いて吸光度より抗体濃度を決定し、ビオチン標識86202R抗体を得た。
96穴プレート(nuncイムノプレート, 品番442404, Thermo Fisher Scientific社製)の各ウェルに固相用の86207抗体(5μg/mL, 100μL, PBSで希釈)を分注し、4℃で一晩静置した。
各ウェルの液を除いた後、8連ピペットマンを用いて、各プレートウェルにPBST 200μLを2回分注した(合計400μL)。添加したPBSTを除き、これらの操作を洗浄操作1回分とした。上記操作を3回行った(PBST 400μLで3回洗浄, 以下の操作においても洗浄は同様の手順で行った)。
洗浄後、各ウェルにブロッキング液200μLを分注し、室温で1時間以上静置した。ブロッキング液を捨てた後、各前処理を行った検体100μLを各ウェルに添加し、2時間反応させた。
反応後、各ウェルの液を除き、PBST 400μLで3回洗浄した。
1−5で作製したビオチン標識86202R抗体(1μg/mL, 100μL, ブロッキング液で希釈)を各ウェルに分注し、2時間反応させた。
反応後、各ウェルの液を除き、PBST400μLで3回洗浄した。
ブロッキング液で0.5μg/mLに希釈したStreptavidin Protein HRP conjugate 100μL (品番21126, Thermo Fisher Scientific社製)を各ウェルに分注し、1時間静置した。
発色液100μLを各ウェルに分注し、室温で10分間反応させた。
反応停止液100μLを各ウェルに添加した。
マイクロプレートリーダー(iMark, Bio−Rad社製を使用)で490nmの吸光度を測定した。
BGを35.0pg/mL含む検体(β-グルカン テストワコー:和光純薬工業株式会社製のリムルス試薬により測定)の測定結果を図1に示す。BGを178.4pg/mL含む検体(β-グルカン テストワコーにより測定)の測定結果を図2に示す。
BGを35.0pg/mL又は178.4pg/mL含むいずれの検体においても、アルカリの前処理を行った検体では、他の2種類の前処理(酸及び熱)を行った検体と比較して測定感度が著しく向上した。
実施例2では、種々のpHを有するアルカリ溶液を用いてヒト血清検体の前処理を行った。真菌由来のBGを含まない陰性血清にCMパキマン(カルボキシメチルパキマン:BGの一種、Megazyme社製)を添加した検体を用いて、ヒト血清検体中のBG測定の感度に対して、pHの値が与える影響を検討した。リムルス試薬(β-グルカン テストワコー:和光純薬工業株式会社製)を用いた場合に、CMパキマンを添加した検体は、真菌由来のBGを含む実検体に近い反応性を示す。CMパキマンを6ng/mL添加した検体の吸光度は、真菌由来のBGを174pg/mL含む実検体の吸光度に相当する。アルカリ溶液による前処理操作、使用した固相用及び液相抗体、抗体へのビオチン標識並びにサンドイッチELISAの手順は実施例1と同じである。使用した前処理用KOH溶液濃度、前処理時のpH、中和後のpH、及び測定した吸光度の値(ブランク値を引いた後の吸光度)は、以下の表1のとおりである。また、処理時のpHと吸光度の関係を図3に示す。
実施例3では、アルカリ溶液による検体の前処理時間がBG測定の感度に与える影響を検討した。前処理時間を種々の時間に変更したこと及びCMパキマンを添加したヒト血清検体を用いたこと以外の前処理手順は、実施例1のアルカリによる前処理と同じである。抗体へのビオチン標識並びにサンドイッチELISAの手順は、実施例1と同じである。表2及び図4に結果を示す。測定した吸光度の値は、ブランク値を引いた後の吸光度を表す。
実施例4では、アルカリ前処理時の温度がBG測定の感度に与える影響を検討した。前処理時の温度を種々の温度に変更したこと及びCMパキマンを添加したヒト血清検体を用いたこと以外の前処理手順は、実施例1のアルカリ前処理と同じである。抗体へのビオチン標識並びにサンドイッチELISAの手順は、実施例1と同じである。表3及び図5に結果を示す。
実施例5では、実検体を用いて、サンドイッチELISAの検出下限を検討した。固相用抗体として86207抗体を使用し、液相抗体として、ビオチン標識86202R抗体を使用した。
実検体(真菌由来のBGを421.2pg/mL含むヒト血漿、β-グルカン テストワコーにより測定)を、BG陰性検体12種を混合した希釈用プール血漿を用いて段階的に希釈し、希釈系列を調製した。当該検体1020μLにアルカリ処理液168μL(800mM KOH:水酸化カリウム)を添加し、37℃で15分間インキュベートした。その後、800mM HCl、100mM MOPS(pH7.5)を168μLずつ添加し、アルカリ処理液を中和した(合計1356μL, 検体3/4倍希釈,12測定分)。これらをアルカリ前処理検体とした。
実施例1と同様の手順で抗体のビオチン標識を行った。
実施例1と同様の手順でサンドイッチELISAを行った。ただし、ビオチン標識抗体の濃度は4μg/mLとした。各試料はn=12測定を行った。
結果を下記の表4及び図6に示す。表4の吸光度はn=12測定の平均値を表し、SDは標準偏差を示す。
実施例6では、サンドイッチELISAによる測定値とリムルス試薬による測定値との相関を、ヒト血漿試料(n=39)を用いて検討した。固相用抗体として86207抗体を使用し、液相抗体として、HRP標識86202R抗体を使用した。
ヒト血漿を用いたこと以外は、実施例1と同様の手順で行った。
HRP標識キット(同人化学社製, Peroxidase Labeling Kit−SH, LK09)を使用して86202R抗体のHRP標識を行った。
標識後のタンパク質定量は、BCA法により行った(キット名:Micro BCA protein assay kit, Thermo Scientific社製, 品番:23235)。
96穴プレート(nuncイムノプレート, 品番442404, Thermo Fisher Scientific社製)の各ウェルに固相用の86207抗体(5μg/mL, 100μL, PBSで希釈)を分注し、4℃で一晩静置した。
各ウェルの液を除いた後、8連ピペットマンを用いて、各プレートウェルにPBST 200μLを2回分注した(合計400μL)。添加したPBSTを除き、これらの操作を洗浄操作1回分とした。上記操作を3回行った(PBST400μLで3回洗浄, 以下の操作においても洗浄は同様の手順で行った)。
洗浄後、各ウェルにブロッキング液200μLを分注し、室温で1時間以上静置した。
ブロッキング液を捨てた後、各前処理を行った検体100μLを各ウェルに添加し、90分反応させた。
反応後、各ウェルの液を除き、PBST400μLで3回洗浄した。
6−2で作製したHRP標識86202R抗体(0.5μg/mL, 100μL, ブロッキング液で希釈)を各ウェルに分注し、30分間反応させた。
反応後、各ウェルの液を除き、PBST400μLで3回洗浄した。
発色液100μLを各ウェルに分注し、室温で10分間反応させた。
反応停止液100μLを各ウェルに添加した。
マイクロプレートリーダー(Multiskan FC, thermo scientific社製を使用)で492nmの吸光度を測定した。
リムルス試薬(商品名:β−グルカンテストワコー、和光純薬工業株式会社製)の添付文書に記載のプロトコルに従ってBGの測定を行った。
リムルス試薬の測定値とELISAによる吸光度との相関を図7に示す。
本発明の免疫学的分析方法の一実施形態のサンドイッチELISAによる吸光度測定値は、リムルス試薬による測定値と相関を示した。
Claims (11)
- アルカリ溶液を用いて生体試料を前処理する工程と
前記生体試料を中和する工程と
抗(1→3)−β−D−グルカンモノクローナル抗体を用いて、前記生体試料中の(1→3)−β−D−グルカンを分析する工程と
を含む、生体試料中の(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法。 - 前記生体試料が、血液、血漿、又は血清である、請求項1に記載の免疫学的分析方法。
- 前記アルカリ溶液のpHが11以上である、請求項1又は2に記載の免疫学的分析方法。
- ELISAを用いる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の免疫学的分析方法。
- 以下の(a)及び(b)を含む、生体試料中の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット
(a)第1の抗(1→3)−β−D−グルカンモノクローナル抗体を固定化した固相、及び
(b)生体試料用アルカリ前処理液。 - 前記生体試料が、血液、血漿、又は血清である、請求項5に記載の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット。
- 前記(b)生体試料用アルカリ前処理液のpHが、11以上である、請求項5又は6に記載の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット。
- (c)前記生体試料用アルカリ前処理液の中和用溶液をさらに含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット。
- (d)標識物質で標識された第2の抗(1→3)−β−D−グルカンモノクローナル抗体をさらに含む、請求項5〜8のいずれか一項に記載の生体試料中の(1→3)−β−D−グルカン分析用キット。
- 抗(1→3)−β−D−グルカンモノクローナル抗体を使用する生体試料中の(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法に使用するための、生体試料用アルカリ前処理液。
- pHが11以上である、請求項10に記載の生体試料用アルカリ前処理液。
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