PL177453B1 - Niederywatyzowany, rozpuszczalny w wodzie beta (1-3) glukan, sposób wytwarzania niederywatyzowanego,rozpuszczalnego w wodzie beta(1-3) glukanu i kompozycja zawierająca niederywatyzowany, rozpuszczalny w wodzie beta(1-3) glukan - Google Patents

Abstract

1. Niederywatyzowany, rozpuszczalny w wodzie ß (1-3)glukan, pochodzacy z drozdzy lub z calych czastek glukanu pochodza- cych z drozdzy, o konformacji potrójnego heliksu, majacy wlasciwosci immunostymulujace, i ciezar czasteczkowy od 30 000 do 500.000. 2 K om pozycja m ajaca wlasciwosci immunostymulacyjne, znam ienna tym , ze zawiera niederywatyzowany, rozpuszczal- ny w wodzie ß ( 1 -3)glukan (pochodzacy z drozdzy lub z calych czastek glukanu pochodzacych z drozdzy) o konformacji po- trójnego heliksu i fizjologicznie dopuszczalny nosnik, gdzie niede- rywatyzowany rozpuszczalny w wodzie ß ( 1-3)glukan konformacji potrójnego heliksu ma ciezar czasteczkowy od 30.000 do 500.000, korzystnie 30.000 do 300.000 dla glukanu z drozdzy lub calych czastek glukanu pochodzacych z drozdzy 5. Sposób wytwarzania niederywatyzowanego, rozpuszczal- nego w w'odzie ß ( 1-3)glukanu o ciezarze czasteczkowym od 30.000 do 500 000 o konformacji potrójnego heliksu, z n a - mienny tym , ze a) na zawiesine nierozpuszczalnego glukanu (pochodzace- go z drozdzy lub z calych czastek glukanu pochodzacych z drozdzy), dziala sie kwasem organicznym w celu rozpuszczenia czesci glukanu rozpuszczalnej w wodzie; b) na glukan rozpuszczalny w kwasie dziala sie alkaliami aby denaturowac natywna konformacje rozpuszczalnego glukanu; c) zobojetnia sie roztwór zawierajacy denaturowany roz- puszczalny glukan aby reasocjowac rozpuszczalny glukan; i d) oczyszcza sie reasocjowany rozpuszczalny glukan, otrzymujac niederywatyzowany, rozpuszczalny w wodzie ß (1- 3)glukan o konformacji potrójnego heliksu FIG. 1 PL PL PL

Description

We wczesnych latach 1960-tych zauważono, że zymosan, surowy, nierozpuszczalny ekstrakt z drożdży, otrzymany przez gotowanie drożdży przed i po obróbce trypsyną, wywołuje znaczną hiperplazję i pobudzenie funkcjonalne układu siateczkowo-śródbłonkowego u królików. W badaniach na zwierzętach wykazano, że preparaty zymosanu inaktywują komponent C3 dopełniacza, zwiększając produkcję przeciwciał, sprzyjając przeżyciom po napromieniowaniu, zwiększając odporność na zakażenia bakteryjne i hamując wywołaną dietą, hipercholsterolemię i cholesterolozę. Wykazano, że zymosan składa się z polisacharydów, białek, tłuszczów i pierwiastków nieorganicznych; jednakże późniejsze badania zidentyfikowały składniki czynne ścianki komórki drożdży jako czysty polisacharyd, w szczególności β-glukan. W konwencjonalnej nomenklaturze β-glukan jest znany jako poli-(1-6)-p-O-glukopiranozylo(1-3)-e-D-glukopiranoza (PGG). Powtórzenie badań biologicznych z β-glukanem wykazało, że większość z powyższych czynności funkcjonalnych zidentyfikowanych dla zymosanu jest utrzymana przez oczyszczony preparat β-glukanu.

Właściwości β-glukanu są podobne do właściwości endotoksyn jeśli chodzi o zwiększanie nieswoistej odporności immunologicznej i odporności na zakażenie. Właściwości β-glukanu jako adiuwanta immunologicznego i stymulatora hemopoetycznego są porównywalne z właściwościami bardziej złożonych modyfikatorów odpowiedzi biologicznej (BRMS), takich jak bacillus Calmette-Guerin (BCG) i Corynebacterium parvum. Czynności funkcjonalne drożdżowego β-glukanu są porównywalne również z właściwościami podobnych strukturalnie polimerów węglowodanowych wyizolowanych z grzybów i roślin. Te (1-3)-β-D-glukany o wyższym ciężarze cząsteczkowym, takie jak schizophyllan, lentinan, krestin, grifolan i pachyman wykazują podobne właściwości immunomodulujące. Wspólny mechanizm wszystkich tych preparatów β-glukanu polega na stymulowaniu przez nie cytokin, takich jak interleukina-1 (IL-1) i czynnik martwicy nowotworu (TNF). Badano szeroko właściwości przeciwnowotworowe lentinanu, zarówno na modelach zwierzęcych w dawce 1 mg/kg przez 10 dni jak i w badaniach klinicznych, przeprowadzonych w późnych latach 1970-tych w Japonii na zaawansowanym lub nawracającym chłoniaku złośliwym oraz rakach okrężnicy, sutka, płuc i żołądka. W chemioterapii raka lentinan podawano domięśniowo (i.m.) lub dożylnie (i.v.) w dawce 0,5-5 mg/dzień, dwa lub trzy razy w tygodniu pojedynczo lub w kombinacji z lekami przeciwnowotworowymi. Badania sugerowały, że oprócz czynności przypisywanych glukanom drożdżowym lentinan działa jako immunopotencjator komórek T, indukując czynności cytotoksyczne, w tym produkcję interleukin 1 i 3 i czynników stymulujących kolonizację (CSF). (Chihara i współpr., 1989, Int. J. Immunotherapy, 4:145-154; Hamuro i Chihara, w: Lentinan, An Immunopotentiator).

Na modelach zwierzęcych badano w celu ustalenia czynności biologicznych różne preparaty β-glukanów zarówno cząstkowych jak i rozpuszczalnych. Na modelach zwierzęcych wykazano, że zastosowanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych β-glukanów pojedynczo lub jako adiuwantów szczepionek znacznie zwiększa oporność na wiele zakażeń bakteryjnych, grzybicznych, pierwotniakowych i wirusowych. Działania krwiotwórcze β-glukanu skorelowano ze zwiększoną liczbą leukocytów krwi obwodowej oraz ze zwiększoną liczbą komórek szpiku kostnego i śledziony, odzwierciedlającą zwiększoną liczbę komórekprzodków granulocytów-makrofagów, wieloróżnicujących się komórek macierzystych śledziony i czerwonawych komórek macierzystych, jak również zwiększony poziom we krwi czynnika stymulującego kolonizację granulocytów-monocytów (GM-CSF). Ponadto działanie krwiotwórcze i anty-infekcyjne β-glukanu były widoczne u zwierząt z odpornością immunologiczną obniżoną cyklofosfamidem. Wykazano korzystne działanie β-glukanu w zwierzęcych modelach urazu, gojenia ran i nowotworzenia. Jednakże różne nierozpuszczalne i rozpuszczalne preparaty β-glukanu różniły się znacznie specyficznością biologiczną i siłą działania, zaś dawki efektywne w modelach zabezpieczania przed zakażeniem i hemopoezy zawarte były w zakresie od 25 do 500 mg/kg dożylnie lub dootrzewnowo (i.p.). Preparaty nierozpuszczalne wykazywały niepożądane właściwości toksykologiczne, manifestujące się powiększeniem wątroby i śledziony oraz tworzeniem się ziarniniaka. Zainteresowanie kliniczne skupiło się na rozpuszczalnym preparacie glukanu, który zatrzymałby czynność biologiczną mając jednakże zaniedby walną toksyczność przy podawaniu systemicznym. Przewlekłe systemiczne

177 453 podawanie rozpuszczalnego, fosforylowanego glukanu w szerokim zakresie dawek (401000 mg/kg) dawało zaniedbywalną toksyczność u zwierząt (DiLuzio i współpr., 1979, Int. J. of Cancer, 24:773-779: DiLuzio, patent USA 4739046).

Mechanizm molekularny działania β-głukanu udowodniono przez wykazanie obecności specyficznych miejsc wiążących receptora β-glukanu na błonach komórkowych ludzkich neutrofili i makrofagów. Mannany, galaktany, α(1-4)-połączone polimery glukozy i β(1-4)połączone polimery glukozy nie mają powinowactwa do tego receptora. Te miejsca wiążące β-glukan są opsonino-niezależnymi receptorami fagocytowymi dla szczególnych aktywatorów alternatywnej ścieżki dopełniacza, podobnie jak lipopolisacharydy Escherichia coli (LPS) i niektóre zwierzęce czerwone krwinki. Ligand wiążąc się z receptorem β-glukanu, w nieobecności przeciwciał, powoduje aktywację dopełniacza, fagocytozę, uwalnianie enzymu lizosomalnego i tworzenie prostaglandyn, tromboksanu i leukotrienu, zwiększając w ten sposób nieswoistą odporność na zakażenie. Jednakże rozpuszczalne preparaty β-glukanu opisane w stanie techniki powodują stymulację cytokin. In vivo obserwowano, oprócz wzrostu poziomu TNF, wzrost poziomów w osoczu i śledzionie interleukin 1 i 2 (IL-1, IL-2), korespondujący z indukcją syntezy tych cytokin in vitro. (Patrz Sherwood i współpr., 1987, Int. J. Immunopharmac., 9:261-267 (wzrost poziomów IL-1 i IL-2 u szczurów po iniekcji rozpuszczalnego glukanu); Williams i współpr., 1988, Int. J. Immunopharmac., 10:405-414 (systemiczne podawanie rozpuszczalnego glukanu pacjentom chorym na AIDS zwiększało poziomy IL-1 i IL-2, czemu towarzyszyły dreszcze i gorączka); Browder i współpr., 1990, Ann. Surg., 211:605-613 (podawanie glukanu pacjentom po urazie zwiększało poziomy IL-1 w osoczu, ale nie zwiększało poziomów TNF); Adachi i współpr., 1990, Chem. Pharm. Buli., 38:988-992 (sieciowane chemicznie P(1-3)glukany indukowały wytwarzanie IL-1 u myszy).

Interleukina-1 jest podstawowym mediatorem immunologicznym, biorącym udział w komórkowych mechanizmach obronnych. Przeprowadzono wiele badań nad zastosowaniem IL-1 do zwiększania nieswoistej odporności na zakażenia w wielu stanach klinicznych (Pomposelli i współpr., J. Parent. Ent. Nutr. 12(2):212-218, (1988)). Głównym problemem związanym z nadmierną stymulacją lub egzogennym podawaniem IL-1 i innych mediatorów komórkowych u ludzi jest toksyczność i działania uboczne wynikające z zerwania delikatnej równowagi sieci immunoregulacyjnej (Fauci i współpr., Ann. Int. Med., 106:421-433 (1987)). IL-1 jest cytokiną zapalną, która wpływa szkodliwie na wiele tkanek i narządów. Wykazano na przykład, że rekombinacyjna IL-1 powoduje śmierć, wstrząs hipotensyjny, leukopenię, trombocytopenię, anemię i kwasicę mleczanową. Ponadto IL-1 indukuje wydalanie sodu, anoreksję, sen wolnofalowy, resorpcję kości, zmniejsza poziom odczuwania bólu i ekspresję wielu cytokin związanych ze stanem zapalnym. Jest ona również toksyczna dla wydzielających insulinę trzustkowych komórek beta. Pacjenci cierpiący na wiele chorób zapalnych mają podwyższone układowe poziomy IL-1. Podawanie środków dodatkowo zwiększających produkcję IL-1 tylko pogarsza te stany zapalne.

W zakażenie, stany zapalne i raka zaangażowany jest także czynnik martwicy nowotworu. Małe ilości TNF uwalniają czynniki wzrostu, natomiast w większych ilościach TNF może powodować wstrząs septyczny, bóle, gorączkę, krzepnięcie krwi, degradację kości i stymulację białych krwinek oraz innych obronnych odpowiedzi immunologicznych.

Wynalazek dotyczy obojętnych, rozpuszczalnych β-glukanów, które zwiększają obronne mechanizmy immunologiczne organizmu, ale nie indukują odpowiedzi zapalnej, preparatów zawierających obojętne, rozpuszczalne β-glukany, oraz nowych sposobów ich wytwarzania. W sposobie według wynalazku rozpuszczalny glukan, który indukuje produkcję cytokin, przetwarza się na drodze serii specjalnych etapów obróbki kwasowej, alkalicznej i obojętnej, otrzymując konformacyjnie czysty, obojętny, rozpuszczalny preparat glukanu o szczególnych właściwościach biologicznych. Obojętny, rozpuszczalny preparat glukanu zatrzymuje specyficznych podzbiór właściwości immunologicznych właściwy dla β-glukanów, ale wyjątkowo nie indukuje produkcji IL-1 i TNF in vitro lub in vivo. W opisie niniejszym, jeśli nie wskazano inaczej, określenia „obojętny, rozpuszczalny glukan” i „obojętny, rozpuszczalny β-glukan” odnoszą się do kompozycji otrzymanych w sposób opisany w przykładzie I.

ΠΊ 453

Rozpuszczalny, obojętny preparat glukanu wytwarza się przez działanie na nierozpuszczalny glukan kwasem z wytworzeniem glukanu rozpuszczalnego w wodzie, dysocjację konformacji natywnych rozpuszczalnego glukanu w pH alkalicznym, oczyszczenie frakcji o pożądanym ciężarze cząsteczkowym przy pH alkalicznym, re-asocjację zdysocjowanej frakcji glukanu w kontrolowanych warunkach czasu, temperatury i pH z utworzeniem specyficznej konformacji potrójnego heliksu, a następnie oczyszczanie w obojętnym pH w celu usunięcia pojedynczego heliksu i materiałów zagregowanych, z wytworzeniem konformacyjnie czystego, obojętnego, rozpuszczalnego w wodzie niederywatyzowanego glukanu, który ma specyficzny profil biologiczny.

Rozpuszczalny, obojętny preparat glukanu ma wysokie powinowactwo do receptora β-glukanu monocytów ludzkich i zatrzymuje dwie podstawowe czynności biologiczne, (1) zwiększanie czynności mikrobiologicznej komórek fagocytarnych, i (2) czynności krwiotwórczej monocytów, krwinek białych obojętnochłonnych i płytek. W przeciwieństwie do nierozpuszczalnych glukanów opisanych w stanie techniki, rozpuszczalny, obojętny glukan według wynalazku ani nie indukuje zwiększania produkcji IL-1 i TNF in vitro i in vivo, ani nie wpływa na zwiększanie produkcji przez komórki monojądrzaste.

Niederewatyzowany, rozpuszczalny w wodzie β(1-3) glukan, pochodzący z drożdży lub z całych cząstek glukanu pochodzących z drożdży według wynalazku, ma konformację potrójnego heliksu i właściwości immunostymulujące oraz ciężar cząsteczkowy od 30.000 do 500.000.

Rozpuszczalny, obojętny preparat glukanu jest odpowiedni do podawania pozajelitowego (na przykład dożylnego, dootrzewnowego, podskórnego), miejscowego, doustnego lub donosowego ludziom i zwierzętom jako środek anty-infekcyjny do zwalczania infekcji związanych z poparzeniami, operacjami chirurgicznymi, chemioterapią, zaburzeniami szpiku kostnego i innymi stanami, w których może być obniżona odporność immunologiczna. Rozpuszczalny, obojętny glukan otrzymywany sposobem według wynalazku może być utrzymywany w klarownym roztworze i równowagowany w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku. Bezpieczne i skuteczne preparaty rozpuszczalnego, obojętnego glukanu według wynalazku mogą być stosowane w terapii i/lub profilaktyce ludzi i zwierząt do zwiększania ich odpowiedzi immunologicznej, bez stymulowania produkcji niektórych mediatorów biochemicznych (na przykład IL-1 i TNF), które mogą być przyczyną, szkodliwych działań ubocznych, takich jak gorączka i stan zapalny.

Kompozycje według wynalazku, mają właściwości immunostymulacyjne ponieważ zawieraj aniedeiywytyzowanyr rozpuszczalyy w wodeie β(1 -3)gHiaan o^0co°dzący zdrżżżyy lub z całych cząsteczek glukanu pochodzących z drożdży o konformacji potrójnego heliksu i ciężarze cząsteczkowym od -0.000 do 500.000, korzystnie od -0.000 do 300.000 i fizjologicznie dopuszczalny nośnik.

Krótki opis figur

Figura 1 przedstawia ogólną strukturę rozpuszczalnego, obojętnego glukanu jako liniowego e(1-3)-połączonego polimeru glukozy, mającego periodyczne rozgałęzienia poprzez pojedyncze e(1-3)-połącz.one ugrupowania glukozy.

Figura 2 przedstawia chromatogram żelowy (pH 7) rozpuszczalnego glukanu, nieoczyszczonego przez dysocjację alkaliczną i re-asocjację. Chromatogram pokazuje trzy rodzaje cząsteczek, określane jako agregat wysokocząsteczkowy (Ag), Pik A i Pik B (glukan z pojedynczym heliksem).

Figura 3 jest chromatogramem otrzymanym dla obojętnego, rozpuszczalnego glukanu za pomocą chromatografii żelowej. Linia ciągła przedstawia obojętny, rozpuszczalny glukan przy pH 7, a linia przerywana przedstawia obojętny, rozpuszczalny glukan przy pH 1-.

Figura 4 jest chromatogramem otrzymanym dla β-glukanu z pojedynczym heliksem (Pik B) przez chromatografię żelową. Linia ciągła przedstawia Pik B przy pH 7, a linia przerywana przedstawia Pik B przy pH 1-.

Figura 5 pokazuje zmianę poziomów IL-1 w czasie w osoczu pobranym od pacjentów, którym dożylnie podawano infuizję z placebo (linia przerywana) lub obojętnego, rozpuszczalnego glukanu (linia stała).

177 453

Figura 6 przedstawia zmianę poziomów TNF w czasie w osoczu pobranym od pacjentów, którym dożylnie podawano infUzję placebo (linia przerywana) łub obojętnego, rozpuszczalnego glukanu (linia stała).

Figura 7 jest wykresem, przedstawiającym analizę krwi obwodowej napromieniowanych myszy po podaniu obojętnego, rozpuszczalnego glukanu.

Figura 8 jest wykresem, przedstawiającym analizę krwi obwodowej myszy leczonych cis-plaayną.po podaniu obojętnego, rozpuszczalnego glukanu.

Wynalazek dotyczy obojętnego, rozpuszczalnego polimeru β-glukanu, który może wiązać się z receptorem β-glukanu i aktywuje tylko pożądany podzestaw odpowiedzi immunologicznych. Określenia „obojętny, rozpuszczalny β-glukan” i „obojętny, rozpuszczalny glukan”, jeśli nie podano inaczej, odnoszą się do kompozycji otrzymanej w sposób opisany w przykładzie I.

Wykazano, że ten „obojętny, rozpuszczalny β-glukan” zwiększa liczbę krwinek białych obojętnochłonnych i monocytów, jak również ich zdolność bezpośredniego zwalczania zakażenia (fagocytoza i zabijanie mikroorganizmów·). Jednakże obojętny, rozpuszczalny β-glukan nie stymuluje produkcji mediatorów biochemicznych, takich jak IL-1 i TNF, które mogą powodować szkodliwe działania uboczne, takie jak wysoka gorączka, stan zapalny, wyniszczenie i niewydolność narządów. Te korzystne właściwości sprawiają, że obojętne, rozpuszczalne preparaty β-glukanu według wynalazku są użyteczne w zapobieganiu i leczeniu zakażeń, ponieważ selektywnie aktywują tylko te składniki układu immunologicznego, które są odpowiedzialne za początkową odpowiedź na zakażenie, bez stymulowania uwalniania niektórych mediatorów biochemicznych, które mogą powodować szkodliwe działania uboczne. Roztwór zawierający obojętny, rozpuszczalny β-glukan nie ma także toksyczności, wspólnej wielu środkom immunomodulującym.

Obojętne, rozpuszczalne β-glukany według wynalazku składają się z monomerów glukozy zorganizowanych w postaci β(1-3)-związanego szkieletu glukopiranozy z okresowymi odgałęzieniami poprzez wiązania glikozydowe β(1-6). Obojętne, rozpuszczalne preparaty glukanu zawierają glukany, które nie zostały w znaczącym stopniu zmodyfikowane przez podstawienie grupami funkcyjnymi (na przykład naładowanymi) lub innymi kowalencyjnymi podstawnikami. Ogólna struktura obojętnego, rozpuszczalnego glukanu jest przedstawiona na fig. 1. Czynny biologicznie preparat według wynalazku jest konformacyjnie oczyszczoną postacią β-glukanu, wytworzoną przez dysocjację natywnych konformacji β-glukanu i reasocjację oraz oczyszczanie uzyskanej specyficznej konformacji potrójnego heliksu. Specyficzna konformacja obojętnego, rozpuszczalnego glukanu przyczynia się do zdolności glukanu do selektywnej aktywacji układu immunologicznego bez stymulowania produkcji szkodliwych mediatorów biochemicznych.

Obojętne, rozpuszczalne preparaty glukanu według wynalazku wytwarza się z nierozpuszczalnych cząstek glukanu, korzystnie z cząstek pochodzących z organizmów drożdży. Ogólna procedura otrzymywania nierozpuszczalnych glukanów drożdżowych, patrz Manners i współpr., Biochem. J., 135: 19-30 (1973). Cząstkami glukanu szczególnie użytecznymi jako materiały wyjściowe w wynalazku są całe cząstki glukanu (WGP), opisane przez Jamasa i współpr. w opisach patentowych USA o nr 4810646, 4992540, 5082936 i 5028703. Źródłem całych cząstek glukanu może być szerokie spektrum organizmów drożdży zawierających glukan, które zawierają β-glukan w ścianach komórkowych. Szczególnie użyteczne są całe cząstki glukanu otrzymane ze szczepów Saccharomyces cerevisiae R4 (NRRL Y-15903: depozyt złożony w związku z patentem USA nr 4810646) i R4 Ad (ATCC nr 74181). Do innych szczepów drożdży, które mogą być stosowane należą Saccharomyces delbruecki, Saccharomyces rosei, Saccharomyces microellipsodes, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces polysporus, Candida albicans, Candida colacae, Candida tropicalis, Candida utilis, Hansenula wingeri, Hansenula arni, Hansenula henricii, Hansenula americana.

Procedura ekstrakcji całych cząstek glukanu została opisana przez Jamasa i współpr. w opisach patentowych USA nr 4810646, 4992540, 5082936 i 5028703. Dla celów mniejszego wynalazku nie jest konieczne przeprowadzenie etapów końcowej ekstrakcji organicznej i przemywania, opisanych przez Jamasa i współpr.

177 453

W sposobie według wynalazku całe cząstki glukanu zawiesza się w roztworze kwaśnym w warunkach wystarczających do rozpuszczenia rozpuszczalnej w kwasie części glukanu. Dla większości glukanów wystarczający jest roztwór kwasu o pH od około 1 do około 5 i temperatura od około 20 do około 100°C. Jako kwas stosuje się kwas organiczny, zdolny do rozpuszczania rozpuszczalnej w kwasie części glukanu. Szczególnie użyteczne do tego celu są kwas octowy, w stężeniach od około 0,1 do około 5 M lub kwas mrówkowy w stężeniach od około 50% do 98% (w/v). Czas działania może zmieniać się od 10 minut do około 20 godzin, zależnie od stężenia kwasu, temperatury i źródła całych cząstek glukanu. Na przykład glukany modyfikowane, mające więcej rozgałęzień β(1-6) niż glukany naturalne lub glukany typu dzikiego wymagają ostrzejszych warunków, to jest dłuższych czasów ekspozycji i wyższych temperatur. Etap działania kwasem może być powtarzany w warunkach podobnych lub zmienionych. Jeden z preferowanych sposobów obróbki opisany jest w przykładzie przy użyciu glukanu pochodzącego ze szczepu R4 Ad S. cerevisiae. W innej odmianie sposobu według wynalazku stosuje się całe cząstki glukanu pochodzące ze szczepu S. cerevisiae R4, mające wyższy poziom rozgałęzienia β(1-6) niż glukan naturalny, a działanie kwasem prowadzi się stosując 90% (w/v) kwas mrówkowy w 20°C przez około 20 minut, a następnie w 85°C przez około 30 minut.

Następnie nierozpuszczalne cząstki glukanu oddziela się od roztworu za pomocą odpowiedniej techniki separacji, na przykład wirowania lub filtracji. pH uzyskanej zawiesiny ustawia się za pomocą związku zasadowego, takiego jak wodorotlenek sodu, na pH około 7 do około 14. Precypitat zbiera się przez wirowanie i gotuje się w oczyszczonej wodzie (na przykład według USP) przez 3 godziny. Następnie zawiesinę ponownie zawiesza się w gorącej zasadzie, mającej stężenie wystarczające do solubilizacji polimerów glukanu. Do związków zasadowych, które mogą być stosowane w tym etapie należą wodorotlenki metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, takie jak wodorotlenek sodu lub wodorotlenek potasu, mające stężenie od około 0,01 do około 10 N. Etap ten może być prowadzony w temperaturze od około 4°C do około 121°C, korzystnie od około 20°C do około 100°C. W jednej z odmian sposobu stosuje się warunki: 1 M roztwór wodorotlenku sodu w temperaturze około 80-100°C i czas kontaktu około 1-2 godziny. Uzyskana mieszanina zawiera solubilizowane cząsteczki glukanu i pozostałość cząstkowego glukanu i na ogół ma ciemnobrązowy kolor, spowodowany utlenieniem zanieczyszczających białek i cukrów. Cząstkową pozostałość usuwa się z mieszaniny za pomocą dowolnej odpowiedniej techniki, na przykład wirowania i/lub filtracji. W innej odmianie sposobu rozpuszczalne w kwasie glukany wytrąca się po uprzedniej reakcji hydrolizy przez dodanie około 1,5 objętości etanolu. Mieszaninę chłodzi się do około 4°C przez dwie (2) godziny, a uzyskany precypitat oddziela się przez wirowanie lub filtrację i przemywa wodą. Następnie peletkę ponownie zawiesza się w wodzie i miesza przez trzy (3) do 12 (dwunastu) godzin w temperaturze między około 20°C a 100°C. W tym punkcie pH ustawia się na około 10 do 13 za pomocą zasady, takiej jak wodorotlenek sodu.

Uzyskany roztwór zawiera zdysocjowane, rozpuszczalne cząsteczki glukanu. Roztwór ten następnie oczyszcza się w celu usunięcia śladów nierozpuszczalnego glukanu i wysokocząsteczkowych rozpuszczalnych glukanów, które mogą powodować agregację. Ten etap może być prowadzony za pomocą odpowiedniej techniki oczyszczania, na przykład za pomocą ultrafiltracji z wykorzystaniem membran o nominalnych poziomach ciężarów cząsteczkowych (NMW) lub cut-off w zakresie od około 1.000 do 100.000. Odkryto, że w celu zapobieżenia stopniowej agregacji lub precypitacji polimerów glukanu korzystna membrana dla tego etapu ma nominalny ciężar cząsteczkowy lub cut-off około 100.000. Następnie rozpuszczalny glukan oczyszcza się dodatkowo przy pH zasadowym w celu usunięcia materiałów o niskim ciężarze cząsteczkowym. Ten etap może być prowadzony za pomocą dowolnej techniki oczyszczania, na przykład za pomocą ultrafiltracji, przy wykorzystaniu membran o nominalnych ciężarach cząsteczkowych lub cut-off w zakresie 1.000 do 30.000.

Uzyskany zdysocjowany rozpuszczalny glukan poddaje się re-asocjacji w warunkach kontrolowanego czasu (na przykład od około 10 do około 120 minut), temperatury (na przykład od około 50 do około 70°C) i pH. pH roztworu ustawia się w zakresie około 3,5-11 (korzystnie 6-8) za pomocą kwasu, takiego jak kwas chlorowodorowy. Celem tego etapu re8

177 453 asocjacji jest spowodowanie ponownej zmiany konformacji rozpuszczalnego glukanu z konformacji pojedynczego heliksu do nowej konformacji potrójnego heliksu. Następnie roztwór re-asocjowanego glukanu frakcjonuje się według wielkości, na przykład stosując ultrafiltry membranowe o cut-off 30.000-70.000 nMw i 100.000-500.000 NMW w celu selektywnego usunięcia wysoko- i niskocząsteczkowych rozpuszczalnych glukanów¹.

W celu otrzymania glukanów o odpowiedniej masie cząsteczkowej, po etapie reasocjacji (etap c w sposobie wg. wynalazku), oczyszcza się reasocjowany rozpuszczalny glukan (etap d w sposobie wg. wynalazku), stosując przeponowy ultrafiltr odcinający dla nominalnej masy cząsteczkowej 30.000 do 100.000 i przeponowy ultrafiltr odcinający dla nominalnej masy cząsteczkowej 150.000 do 500.000. Przed rozdziałem według wielkości rozpuszczalne glukany istnieją w postaci mieszaniny konformacji, w tym statystycznych zwojów, matryc lub agregatów żelowych, potrójnych heliksów i pojedynczych heliksów. Celem etapu rozdziału według wielkości jest otrzymanie wzbogaconej frakcji reasocjowanej konformacji o szczególnym ciężarze cząsteczkowym. Kolejność stosowania ultrafiltrów jest sprawą preferencji.

Otrzymana zatężona frakcja jest wzbogacona w rozpuszczalny, biologicznie czynny obojętny rozpuszczalny glukan. Koncentrat glukanu oczyszcza się dodatkowo, na przykład przez diafiltrację przy użyciu membrany 10.000. Korzystne stężenie rozpuszczalnego glukanu po tym etapie wynosi od około 2 do około 10 mg/ml.

Zobojętniony roztwór może być następnie dodatkowo oczyszczany, na przykład przez diafiltrację przy użyciu dopuszczalnego farmaceutycznie medium (na przykład jałowa woda do iniekcji, solanka buforowana fosforanem (PBS), solanka izotoniczna, dekstroza) odpowiedniego do podawania pozajelitowego. Korzystną, membraną do tego etapu diafiltracji jest membrana a cut-off nominalnego ciężaru cząsteczkowego około 10.000. Końcowe stężenie roztworu glukanu reguluje się w zakresie od 0,5 do 10 mg/ml. Zgodnie ze standardami produkcji farmaceutycznej roztwór może być na końcu wyjaławiany przez filtrację poprzez filtr 0,22 gm. Obojętny, rozpuszczalny preparat glukanu otrzymany tym sposobem jest jałowy, nie-antygenny, zasadniczo pozbawiony pirogenów i może być przechowywany w wydłużonym czasie w temperaturze pokojowej (na przykład 15-30°C) bez degradacji. Sposób ten jest unikalny pod tym względem, że uzyskuje się obojętny roztwór wodny (pH 4,5 do 7,0) czynnego immunologicznie glukanu, nadający się do podawania pozajelitowego.

P r z y k ł a d. Wytwarzanie kompozycji farmaceutycznej do podawania pozajelitowego

Do rozpuszczalnego w wodzie p(1-3)glukanu (otrzymanego w procesie wytwarzania jako zatężona frakcja) o stężeniu od 0,5 do 10 mg dodaje się 1 ml dopuszczalnego farmaceutycznie medium np. solankę buforowaną fosforanem (PBS), w temperaturze około 20-25°C, przy pH od 5 do 7,5 uzyskując roztwór glukanu o stężeniu od 0,5 do 10 mg/ml.

Roztwór następnie wyjaławia się przez filtrację poprzez filtr 0,22 gm. Uzyskuje się w ten sposób kompozycję farmaceutyczną do podawania pozajelitowego, wyjałowioną, zasadniczo pozbawioną pirogenów i możliwą do przechowywania w temperaturze pokojowej od 15 do 30°C, przez dłuższy czas bez degradacji.

W razie potrzeby roztwór glukanu może być wysuszony i przechowywany w postaci stałej a następnie użyty do wytwarzania postaci np. tabletek z odpowiednimi dodatkowymi, znanymi składnikami jak to wskazano dalej w opisie. Obojętne, rozpuszczalne w wodzie glukany mogą być stosowane również pojedynczo albo jako adiuwanty, w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej u ludzi i u zwierząt.

Stosowana dawka zależy od choroby, sposobu podania, wagi i wieku leczonego pacjenta (co opisano bardzo szczegółowo w opisie).

Stosowana dawka np. przy stosowaniu miejscowym na rany wynosi od 0,001 mg/ml do około 2 mg/ml wagi ciała.

Przy średniej wadze pacjenta około 50 kg dawka wynosi od 100 mg/ml.

Dla celów niniejszego wynalazku określenie „rozpuszczalny”, stosowane do opisania glukanów otrzymanych za pomocą sposobu według wynalazku oznacza wizualnie przejrzysty roztwór, który może się utworzyć w medium wodnym, takim jak woda, PBS, solanka izotoniczna lub roztwór dekstrozy o pH obojętnym (na przykład od pH około 5 do około 7,5), w

177 453 temperaturze pokojowej (około 20-25°C) i w stężeniu do około 10 mg/ml. Określenie „medium wodne” odnosi się do wody i faz bogatych w wodę, zwłaszcza do dopuszczalnych farmaceutycznie cieczy wodnych, w tym roztworów PBS, solanki i dekstrozy. Wyrażenie „wizualnie przejrzysty” oznacza, że przy stężeniu 1 mg/ml absorpcja roztworu przy 530 nm jest mniej niż 0,01 OD większa od OD identycznego roztworu, ale pozbawionego składnika β-glukanowego.

Uzyskany roztwór jest zasadniczo pozbawiony zanieczyszczeń białkowych, jest nieantygenny, nie-pirogeniczny i jest dopuszczalny farmaceutycznie do podawania pozajelitowego zwierzętom i ludziom. Jednakże w razie potrzeby rozpuszczalny glukan może być wysuszony za pomocą odpowiedniej metody suszenia, takiej jak liofilizacja, i przechowywany w postaci suchej.

Obojętne, rozpuszczalne glukany według wynalazku mogą być stosowane jako bezpieczne, skuteczne środki profilaktyczne i lecznicze, albo pojedynczo albo jako adiuwanty, w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej u ludzi i zwierząt. Rozpuszczalne glukany wytwarzane sposobem według wynalazku selektywnie aktywują tylko te komponenty, które są odpowiedzialne za początkową odpowiedź na zakażenie, bez stymulowania układu immunologicznego do uwalniania niektórych mediatorów biochemicznych (na przykład IL-1, TNF, IL-6, IL-8 i GM-CSF), które mogą powodować niepożądane działania uboczne. Kompozycja rozpuszczalnego glukanu według wynalazku może być jako taka stosowana do zapobiegania lub leczenia chorób zakaźnych przy osłabionym układzie immunologicznym u pacjentów niedożywionych, pacjentów poddawanych operacjom chirurgicznym i przeszczepom szpiku kostnego, pacjentów poddawanych chemioterapii lub radioterapii, pacjentów z neutropenią, pacjentów zakażonych HIV, pacjentów po urazach, pacjentów po oparzeniach, pacjentów chorych na przewlekłe lub oporne infekcje takie jak infekcje będące wynikiem zespołu mielodysplazji oraz u osób starszych. Osoba o obniżonej odporności jest generalnie definiowana jako osoba, która wykazuje osłabioną lub zmniejszoną zdolność do normalnej komórkowej i/lub humoralnej odpowiedzi na prowokacje czynnikami zakaźnymi, takimi jak na przykład wirusy, bakterie, grzyby i pierwotniaki. Osoba źle odżywiona białkowo jest generalnie definiowana jako osoba, mająca poziom albuminy w osoczu krwi niższy od około 3,2 grama na decylitr (g/dl) i/lub niezamierzony spadek wagi ciała powyżej 10% zwykłej wagi ciała.

W szczególności kompozycja według wynalazku może być zastosowana do terapeutycznego lub profilaktycznego stosowania u zwierząt lub ludzi o zwiększonym ryzyku zakażenia, związanym z zagrażającą operacją chirurgiczną, urazem, chorobą, napromieniowaniem lub chemioterapią lub innym stanem, który szkodliwie wpływa na układ immunologiczny. Kompozycja jest użyteczna do leczenia pacjentów, mających zaburzenie lub chorobę, które powoduje zmniejszenie lub osłabienie normalnej metabolicznej odpowiedzi immunologicznej, takiej jak infekcja HIV (AIDS). Na przykład kompozycja może być wykorzystana do preinicjacji metabolicznej odpowiedzi immunologicznej u pacjentów poddawanych chemioterapii lub radioterapii, lub pacjentów o zwiększonym ryzyku rozwinięcia się zakażeń wtórnych lub komplikacji pooperacyjnych z powodu choroby, zaburzenia lub leczenia, powodującego zmniejszenie zdolności organizmu do mobilizacji normalnych metabolicznych odpowiedzi na zakażenie. Wykazano, że leczenie obojętnymi, rozpuszczalnymi glukanami jest szczególnie skuteczne do mobilizacji normalnych immunologicznych reakcji obronnych gospodarza, rodząc przez to miarę zabezpieczenia leczonego gospodarza przed zakażeniem.

Kompozycja według wynalazku jest generalnie podawana zwierzęciu lub człowiekowi w ilości wystarczającej do wzmocnienia układu immunologicznego. Sposób podawania obojętnego, rozpuszczalnego glukanu może być doustny, dojelitowy, pozajelitowy, dożylny, podskórny, dootrzewnowy, domięśniowy, miejscowy lub donosowy. Postać, w której kompozycja będzie podawana (na przykład proszek, tabletka, kapsułka, roztwór, emulsja) zależy od drogi podawania. Ilość podawanej kompozycji będzie ustalana indywidualnie i będzie uwzględniała co najmniej ciężkość zakażenia lub uszkodzenia ciała pacjenta, stan chorego lub jego zdrowie ogólne, wagę pacjenta oraz czas pozostały do operacji, chemioterapii lub innego leczenia obarczonego wysokim ryzykiem. Generalnie pojedyncza dawka będzie korzystnie zawierać około 0,01 do około 10 mg modyfikowanego glukanu na kilogram wagi ciała, a ko10

177 453 rzystnie od około 0,1 do 2,5 mg/kg. Dawka przy stosowaniu miejscowym będzie zależeć od rodzaju leczonej rany, stopnia zakażenia i ciężkości rany. Typowa dawka dla ran będzie wynosić od około 0,001 mg/ml do około 2 mg/ml, a korzystnie od około 0,01 do około 0,5 mg/ml.

Generalnie kompozycje według wynalazku mogą być podawane osobie okresowo, na ile potrzeba do stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Specjalista w zakresie medycyny będzie zdolny do ustalenia czasu podawania kompozycji oraz dawki, zależnie od stanu fizycznego pacjenta lub leczonej choroby. Jak stwierdzono powyżej, kompozycja może być również stosowana jako środek zapobiegawczy do pre-inicjacji normalnej obrony metabolicznej, mobilizowanej przez organizm przeciwko infekcji.

Obojętny, rozpuszczalny β-glukan może być stosowany do zapobiegania i leczenia infekcji spowodowanych przez szerokie spektrum patogenów bakteryjnych, wirusowych, grzybowych i pierwotniakowych. Profilaktyczne podawanie obojętnego, rozpuszczalnego β-glukanu osobie poddawanej operacji chirurgicznej, przedoperacyjnie, śródoperacyjnie i/lub pooperacyjnie zmniejsza częstość występowania i ciężkość zakażeń pooperacyjnych u pacjentów normalnego ryzyka jak i wysokiego ryzyka. Na przykład u pacjentów przechodzących operacje chirurgiczne sklasyfikowane jako zanieczyszczające lub potencjalnie zanieczyszczające (na przykład operacje układu żołądkowo-jelitowego, wycięcie macicy, cesarskie cięcie, prostatektomia przezcewkowa) i pacjentów, dla których zakażenie miejsca operacji stanowiłoby poważne ryzyko (na przykład operacja rekonstrukcyjna stawu, operacje sercowonaczyniowe), jednoczesne terapia początkowa za pomocą odpowiedniego środka przeciwbakteryjnego i obojętnego, rozpuszczalnego preparatu glukanu według wynalazku zmniejszy częstość i ciężkość komplikacji infekcyjnych.

U pacjentów o obniżonej odporności immunologicznej, nie tylko przez chorobę (na przykład rak, AIDS) ale także przez chemioterapię i/lub radioterapię profilaktyczne podawanie obojętnego, rozpuszczalnego preparatu glukanu według wynalazku zmniejszy częstość zakażeń powodowanych przez szerokie spektrum patogenów oportunistycznych, w tym wiele nietypowych bakterii, grzybów i wirusów. Terapia przy użyciu obojętnego, rozpuszczalnego preparatu β-glukanu wykazała znaczny efekt radioochronny związany z jego zdolnością do wzmagania i przedłużania funkcji i regeneracji makrofagów, skutkiem czego jest zwiększenie odporności na inwazje i infekcje mikroorganizmów.

U pacjentów wysokiego ryzyka (na przykład w wieku powyżej 65 lat, cukrzyków, chorych na raka, źle odżywionych, chorych na chorobę nerek, obrzęk, odwodnionych, mających ograniczoną mobilność, etc.) hospitalizacji często towarzyszy wysoka częstość poważnych infekcji szpitalnych. Dla zapobieżenia infekcjom zwykle towarzyszącym tym procedurom leczenie obojętnym, rozpuszczalnym β-glukanem można rozpocząć empirycznie przed kateteryzacją użyciem drenów, jednostek intensywnej terapii, dłuższą hospitalizacją, etc. Jednoczesna terapia środkami przeciwbakteryjnymi i obojętnymi, rozpuszczalnym β-glukanem jest wskazana przy leczeniu zakażeń przewlekłych, poważnych, opornych, złożonych i trudnych do leczenia.

Kompozycje podawane w sposobie według wynalazku mogą ewentualnie zawierać inne składniki oprócz obojętnego, rozpuszczalnego β-glukanu. Inne składniki, które może zawierać kompozycja są zdeterminowane przede wszystkim przez sposób podawania kompozycji. Na przykład kompozycja podawana doustnie w postaci tabletki może oprócz obojętnego, rozpuszczalnego β-glukanu zawierać wypełniacz (na przykład laktozę), środek wiążący (na przykład karboksymetylocelulozę, gumę arabską, żelatynę), adiuwant, środek smakowozapachowy, barwnik i materiał powlekający (na przykład wosk lub plastyfikator). Kompozycja podawana w formie ciekłej może zawierać obojętny, rozpuszczalny β-glukan i ewentualnie środek emulgujący, środek smakowo-zapachowy i/lub barwnik. Kompozycja do podawania pozajelitowego może być zmieszana, rozpuszczona lub zemulgowana w wodzie, jałowej solance, PBS, dekstrozie lub innym dopuszczalnym biologicznie nośniku. Kompozycja do podawania miejscowego może być formułowana w postać żelu, maści, lotionu, kremu lub inną postać, w której kompozycja jest zdolna do powlekania leczonego miejsca, na przykład rany.

Kompozycje zawierające obojętny, rozpuszczalny glukan mogą być również stosowane miejscowo na miejsce rany w celu stymulacji i wzmożenia gojenia i naprawy rany. Rany

177 453 spowodowane między innymi przez wrzody, trądzik, zakażenia wirusowe, zakażenia grzybicze lub parodontozę mogą być w celu przyspieszenia procesu gojenia leczone kompozycją według wynalazku. Alternatywnie, obojętny, rozpuszczalny β-glukan może być wstrzyknięty do rany lub porażonego obszaru. Oprócz leczenia ran, kompozycja może być stosowana do leczenia zakażeń związanych z raną lub spowodowanych raną. Kompozycja do podawania miejscowego może być formułowana w postać żelu, maści, lotionu, kremu lub innej formy, w której kompozycja jest zdolna do powlekania leczonego miejsca, na przykład miejsca zranionego. Dawka przy podawaniu miejscowym zależeć będzie od rodzaju leczonej rany, stopnia zakażenia i ciężkości rany. Typowa dawka dla ran będzie wynosić od około 0,01 mg/ml do około 2 mg/ml, a korzystnie od około 0,01 do około 0,5 mg/ml.

Następnym szczególnym zastosowaniem kompozycji według wynalazku jest leczenie zespołu mielodysplazji (MDS). MDS, często określana jako zespół przedbiałaczkowy, jest grupą klonalnych zaburzeń krwiotwórczej komórki macierzystej, charakteryzujących się nienormalnym różnicowaniem i dojrzewaniem komórek szpiku kostnego, prowadzącym do cytopenii obwodowej o wysokim prawdopodobieństwie ewentualnej konwersji do białaczki. MDS towarzyszą zwykle nawracające infekcje, krwotoki i terminalna infekcja powodująca śmierć. Tak więc w celu zmniejszenia ciężkości choroby i częstości infekcji pacjentowi z diagnozą MDS można przewlekle podawać kompozycje zawierające zmodyfikowany glukan, w celu swoistego zwiększenia zdolności zwalczania infekcji przez białe krwinki pacjenta. Mogą być leczone inne choroby szpiku kostnego, takie jak anemia aplastyczna (stan ilościowo zmniejszonej i nieprawidłowej hematopoezy), w celu zmniejszenia infekcji i krwotoków związanych z tymi stanami chorobowymi.

Obojętny rozpuszczalny glukan wytwarzany sposobem według wynalazku zwiększa nieswoistą obronę komórek monojądrzastych ssaków i znacznie zwiększa ich zdolność do odpowiadania na infekcję. Specyficzną cechą aktywacji makrofagów przez obojętny, rozpuszczalny glukan jest to, że nie powoduje on wzrostu temperatury ciała (to jest gorączki), jak jest dla wielu nieswoistych stymulatorów tej obrony. Ta krytyczna zaleta obojętnego, rozpuszczalnego glukanu może być związana z naturalnym profilem jego oddziaływania na białe krwinki. Wykazano, że obojętny, rozpuszczalny β-glukan według wynalazku selektywnie aktywuje odpowiedzi immunologiczne, ale nie stymuluje bezpośrednio ani nie wyzwala uwalniania cytokin (na przykład IL-1 i TNF) z komórek monojądrzastych, co odróżnia obojętny, rozpuszczalny glukan według wynalazku od innych preparatów glukanu (na przykład lentinan, kresem) i immunostymulatorów.

Ponadto wykazano, że obojętny, rozpuszczalny preparat glukanu według wynalazku posiada nieoczekiwaną czynność stymulowania płytek. Chociaż wiadomo jest, że glukany mają zdolność do stymulacji hematopoezy białych krwinek, to ujawniona właściwość stymulowania płytek nie była ujawniona ani przewidywana. Właściwość ta może być wykorzystana w schemacie terapeutycznym przy stosowaniu jako adiuwant równolegle z chemioterapią lub radioterapią. Wiadomo jest, że chemioterapia i radioterapia powodują neutropenię (zmniejszona liczba leukocytów wielojądrzastych (PMN)) i małopłytkowość (zmniejszoną liczbę płytek). Obecnie stany te leczy się przez podawanie czynników stymulujących kolonizację, takich jak GM-CSF i czynnik stymulujący kolonizację granulocytów (G-CSF). Takie czynniki są efektywne przy przezwyciężaniu neutropenii, ale nie mają wpływu na małopłytkowość. Tak więc właściwość stymulowania płytek przez obojętny, rozpuszczalny preparat glukanu według wynalazku może być wykorzystana na przykład jako środek do zapobiegania lub minimalizowania rozwoju małopłytkowości, która ogranicza dawkowanie promieniowania lub środka terapeutycznego stosowanego do leczenia raka.

Wynalazek zostanie następnie zilustrowany za pomocą poniższych przykładów.

Przykład I. Otrzymywanie obojętnego, rozpuszczalnego glukanu z S. cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae, szczep R4 Ad (nierekombinacyjna pochodna szczepu typu dzikiego A364A) namnażano w kulturze fermentacyjnej dużej skali, stosując podłoże minimalne z siarczanem amonu i glukozą. Kulturę fermentacyjną utrzymywano w warunkach limitacji glukozowej w trybie hodowli okresowej (New Brunswick MPP80). Po osiągnięciu przez rozrastającą się kulturę późnej fazy wzrostu logarytmicznego fermentację kończono, a

177 453 β-glukan stabilizowano przez ustawienie pH kultury na 12±0,5 za pomocą 10 M NaOH. Komórki drożdży zawierające β-glukan skaszano· przez wirowanie w przepływie ciągłym (Westfalia SA-1). Po wirowaniu komórki zbierano do naczynia ekstrakcyjnego ze stali nierdzewnej.

Pierwszym etapem w procesie ekstrakcji była ekstrakcja alkaliczna, prowadzona przez mieszanie komórek z 1 M wodorotlenkiem sodu (NaOH) w 90±5°C przez 1 godzinę. Po zakończeniu ekstrakcji alkalicznej β-glukan, który pozostawał w fazie stałej zbierano przez wirowanie ciągłe (Westfalia SA-1). Zebraną frakcję ścian komórkowych ekstrahowano drugi raz, stosując taką samą procedurę i takie same warunki. W wyniku działania alkaliami następowała hydroliza i solubilizacja białek komórkowych, kwasów nukleinowych, mannanów, rozpuszczalnych glukanów i polarnych lipidów do frakcji supematanta, a deacetylowanej chityny do chitozanu w ścianie komórkowej.

Drugim etapem procesu ekstrakcji była ekstrakcja przy pH 4,5±0,05 (ustawione stężonym HCl) w temperaturze 75±5°C przez 1 godzinę. Następnie prowadzono ekstrakcję 0,1 M kwasem octowym do całkowitego usunięcia glikogenu, chityny, chitozanu i pozostałych białek. Oddzielono substancje stałe i przemyto dwukrotnie wodą oczyszczaną według USP w celu usunięcia wszelkich resztek kwasu, jak również wszelkich produktów degradacji drożdży.

Trzecim etapem procesu ekstrakcji był komplet sześciu ekstrakcji organicznych. Pierwsze cztery ekstrakcje prowadzono w izopropanolu. Substancje stałe oddzielano przez wirowanie, po czym poddawano dwóm ekstrakcjom acetonem. W wyniku dwuetapowych ekstrakcji organicznych następowała eliminacja niepolarnych lipidów i białek hydrofobowych, które mogą zanieczyszczać substancję lekową. Uzyskany mokry osad suszono w suszarce próżniowej w 65±5°C przez 48-96 godzin, otrzymując sypki proszek.

Na tym etapie w wyniku procesu ekstrakcji otrzymywano stabilny, nierozpuszczalny półprodukt, składający się w przybliżeniu z 90% β-glukanu, zwany pełnymi cząstkami glukanu (RGP). Suchy półprodukt WGP przechowywano w 15-30°C aż do dalszego stosowania.

Proszek WGP zawieszano w 98% (w/v) kwasie mrówkowym w szklanym naczyniu reakcyjnym w temperaturze pokojowej. Uzyskaną mieszaninę ogrzewano do 85±5°C przez 20 minut. W tych warunkach WGP ulegały częściowej hydrolizie i solubilizacji z wytworzeniem pożądanego rozkładu ciężaru cząsteczkowego rozpuszczalnego β-glukanu, który następnie strącano przez dodanie 1,5 objętości etanolu. Po całkowitym zmieszaniu preparat wirowano w celu oddzielenia precypitatu β-glukanu. Wszelkie resztki kwasu mrówkowego usuwano przez gotowanie preparatu β-glukanu w wodzie oczyszczanej według USP przez trzy godziny.

Następnie z roztworu β-glukanu usunięto przez wirowanie wszelkie niezbydrolizowane WGP. pH β-glukanu podwyższono do 12,5±0,5 przez dodanie stężonego wodorotlenku sodu. Pozostałe etapy oczyszczania przeprowadzono przez ultrafiltrację.

Rozpuszczalny, alkaliczny preparat β-glukanu przepuszczono przez ultrafiltr membranowy (Amicon DC-10) z cut-off nominalnego ciężaru cząsteczkowego (NMW) 100000. W warunkach alkalicznych taki ultrafiltr membranowy usuwał nierozpuszczalny i wysokocząsteczkowy rozpuszczalny β-glukan. Następnie usuwano śladowe, niskocząsteczkowe produkty degradacji przez recyrkulację przez ultrafiltr membranowy o cut-off NMW 10000. Ultrafiltrację prowadzono przy stałej objętości przemywania za pomocą 0,1 M NaOH.

Roztwór β-glukanu poddawano re-asocjacji w warunkach kontrolowanych przez ustawienie pH na 7,0±0,5 za pomocą stężonego kwasu chlorowodorowego, ogrzewając do temperatury 60±10°C, którą utrzymywano przez 20 minut, po czym następnie ochłodzono. Następnie obojętny, re-asocjowany roztwór zatężono i przemyto chlorkiem sodu do iniekcji według USP w ultrafiltrze membranowym o cut-off 70000 nMw (Filtron Minisep) w celu wzbogacenia w re-asocjowany, obojętny rozpuszczalny glukan. Następnie materiał filtrowano przez ultrafiltr membranowy o cut-off 300000 NMW (Filtron-Minisep) w celu usunięcia cząsteczek glukanu o wysokim ciężarze cząsteczkowym i zagregowanych. W tym samym ultrafiltrze obojętny, rozpuszczalny materiał glukanu przemyto chlorkiem sodu do iniekcji według USP, stosując stałą objętość przemywania.

Obojętny, rozpuszczalny glukan zatężono następnie w ultrafiltrze membranowym o cutoff 10000 NMW. Proces zatężania kontynuowano aż do uzyskania stężenia co najmniej 1,0 mg/ml równoważnika heksozy.

1ΊΊ 453

Uzyskany rozpuszczalny glukan poddano następnie filtracji przez filtr usuwający pirogeny (Posidyne 0,1 mikrometra) i jałowy filtr (Millipak) 0,2 mikrometra w celu uzyskania jałowego, wolnego od pirogenów, obojętnego, rozpuszczalnego glukanu. Obojętny, rozpuszczalny roztwór glukanu przechowywano w kontrolowanej temperaturze pokojowej (15-30°C) do dalszego stosowania. Rozpuszczalność -w wodzie obojętnego, rozpuszczalnego glukanu w zakresie pH 4 do 8 wynosi około 100 mg/ml. Rozpuszczalność wzrastała przy wzroście pH i osiągała około 150 mg/ml przy pH 13.

Przykład II. Analiza obojętnego, rozpuszczalnego glukanu

A. Glukoza, mannoza i głukozamina

Analizę monosacharydów prowadzono w celu oznaczenia ilościowego w obojętnym, rozpuszczalnym glukanie względnych ilości β-glukanu (jako glukozy), mannanu lub fosfomannanu (jako mannozy) i chityny (jako N-acetyloglukozaminy). Próbkę Cydrolizowano do monosacharydów w 2 M kwasie trifluorooctowym przez 4 godziny w temperaturze 110°C, odparowano do sucha i ponownie rozpuszczono w wodzie. Monosacharydy rozdzielano na układzie Dionex HPLC, stosując kolumnę CarboPac PA100 (4 x 250 mm) za pomocą 5 M NaOH z szybkością 1 ml/min i oznaczano ilościowo stosując pulsowy detektor elektrochemiczny (Dionex Model PED-1). Czułość tej metody dla monosacharydów wynosi 0,1% (w/w).

Glukozę (czas retencji 16,6 min) zidentyfikowano jako jedyny składnik monosacharydowy obojętnego, rozpuszczalnego glukanu poza śladami produktów degradacji glukozy (z hydrolizy), anCydroglUkooy po 2,5 minuty i 5-hy0roksymetylwfiirfpralu po 4,3 minuty. Rezultaty potwierdzają, że obojętny, rozpuszczalny glukan składa się z >98% glukozy.

B. FTIR

W celu ustalenia struktury anomerycznej (a względnie p) i typu wiązania (β(1-3), β(1-6), β(1-4)) obecnego w obojętnym, rozpuszczalnym glukanie próbki liofilizowanego, obojętnego, rozpuszczalnego glukanu badano za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera metodą rozproszeniowo-odbiciową (FTIR, Matson Instruments, Polaris). Maksima absorpcji przy 890 cm'¹ identyfikowały wiązania β(1-3), a maksima przy 920 cm'¹ wiązania β(1-6). Nie wykryto obecności anomerów α-połączonych (na przykład glikogenu, 850 cm'¹) lub β(1-4)-połączonych polisacharydów (na przykład chityny, 930 cm'¹).

Przykład III. Analiza konformacyjna

Tożsamość składu roztworu β-glukanu nie przetwarzanego przez Zcso^^ alkaliczna i re-asocjację analizowano za pomocą chromatografii żelowej (pH 7), stwierdzając, że zawiera on złożone cząstki, określane tu jako agregat wysokocząsteczkowy (Ag), Pik A i Pik B (patrz figura 2). Obojętny, rozpuszczalny glukan otrzymany przez Zcso^^ alkaliczną i reasocjację w sposób opisany w przykładzie I jest obecny w postaci pojedynczego piku (patrz figura 3) o średnim ciężarze cząsteczkowym około 92660 przy pH 7. Różnicę konformacji między obojętnym, rozpuszczalnym glukanem a Pikiem B wykazano za pomocą chromatografii żelowej przy pH 7 i pH 13, stosując detektor refrakcyjny. Obojętny, rozpuszczalny glukan ulegał znacznemu przejściu konformacyjnemu od pH 7 do pH 13, co ilustruje całkowita dysocjacja wielokrotnego heliksu przy pH 7 do pojedynczego heliks przy pH 13 (patrz Fig. 3). W przeciwieństwie do tego, Pik B ulegał tylko niewielkiemu przesunięciu ciężaru cząsteczkowego od pH 7 do pH 13 (patrz Fig. 4). Ciężar cząsteczkowy obojętnego, rozpuszczalnego glukanu i glukanów piku B jako funkcja pH są pokazane w tabeli 1.

Tabela 1

Próbka	MW	Stosunek MW (pH 7/pH 13)
pH 7	pH 13
Obojętny, rozpuszczalny glukan	92666	18693	4,96
Pik B	8317	7168	1,16

Konformację obojętnego, rozpuszczalnego glukanu i Piku B ustalono także za pomocą kompleksowania błękitem anilinowym (Evans i współpr., 1984, carb. Pol., 4:215-230; Adachi i współpr., 1988, Carb. Res., 177:91-100), stosując curdlan, liniowy ββ^^^Μ jako kon14

177 453 trolę potrójnego heliksu i pustułan, e(1-6)glukan jako kontrolę postaci nieuporządkowanej konformacyjnie. Wyniki omówiono poniżej i przedstawiono w tabeli 2.

W wyniku skompleksowania curdlanu, stosowanego jako kontrola potrójnego heliksu uzyskano silną fluorescencję. Przy wzroście stężenia NaOH potrójny heliks curdlanu zaczynała nieznacznie dysocjować, ale do całkowitej dysocjacji curdlanu wymagane są stężenia NaOH > 0,25 M. Pustulan jako kontrola postaci nieuporządkowanej tworzył jedynie słaby kompleks z błękitem anilinowym, co dawało słabe pomiary fluorescencji, na które nie miało wpływu stężenie NaOH.

Obojętny, rozpuszczalny glukan kompleksowa! się efektywnie z błękitem anilinowym przy niskich stężeniach NaOH (25 mM NaOH), co dawało wysoką fluorescencję. Jednakże konformacja obojętnego, rozpuszczalnego glukanu dysocjowała znacząco (50%) przy stężeniach NaOH już 150 mM NaOH, co wskazuje, że występuje on w postaci specyficznej w porównaniu z β-glukanami występującymi naturalnie, takimi jak laminarin i curdlan, które wymagają do zajścia dysocjacji znacznie wyższych stężeń NaOH. Pik B tworzył słaby kompleks z błękitem anilinowym z powodu swojej konformacji pojedynczego heliksu.

Tabela 2

Analiza konformacyjna glukanów za pomocą kompleksowania błękitem anilinowym

Materiał badany	Fluorescencja
25 mM NaOH	100 mM NaOH	150 mM NaOH
Ślepa próba	0	2	0
Curdlan, p(1-3)glukan	53,5	41,6	36
Pustulan, e(1-6)glukan	9,8	8,3	8,0
Obojętny, rozpuszczalny glukan	40	25,6	20,2
Pik B	12,4	6,2	4,1

Przykład IV. Wpływ obojętnego, rozpuszczalnego glukanu na wytwarzanie TNFa przez monocyty ludzkie

Komórki monojądrzaste ludzkiej krwi obwodowej wyizolowano (Janusz i współpr., (1987), J. Immunol., 138:3897-3901) z normalnej krwi traktowanej cytrynianem i dekstranem, przemyto zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) pozbawionym wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej i oczyszczono przez wirowanie w gradiencie na podkładce Ficoll-Paque (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ). Komórki monojądrzaste zebrano do HBSS, przemyto dwukrotnie, ponownie zawieszono w pożywce RPMI 1640 (Gibco, Grand island, NY) zawierającej 1% inaktywowanej termicznie surowicy autologicznej (56°C przez 30 minut) i zliczano na liczniku Coultera.

W celu otrzymania monowarstw monocytów do studzienek 24-studzienkowych płytek do hodowli wysiano 1 ml zawiesiny komórek monojądrzastych o stężeniu 2,2 x 10⁶komórek/ml (Costar, Cambridge, MA), inkubowano przez 1 godzinę w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ i przemyto trzy razy RPMI w celu usunięcia komórek nieprzylegąjących. Do każdej studzienki położono warstwę drugiej porcji 1 ml zawiesiny komórek monojądrzastych o stężeniu 2,2 x 10⁶ komórek/ml i inkubowano przez 2 godziny w sposób opisany powyżej, po czym usunięto komórki nieprzylegąjące. Obliczona wizualnie za pomocą mikroskopu z odwróconymi fazami i kalibrowanej siatki liczba komórek przylegających dla 30 różnych donorów wynosiła 077±0,20 x 10⁶ na studzienkę (średnia ± SD). Za pomocą badania morfologii i wybarwiania niespecyficzną esterazą stwierdzono, że >95% komórek przylegających były monocytami.

Warstwy monocytów inkubowano w 37°C w komorze z CO2 przez 0 do 8 godzin z 0,5 ml RPMI, 1% inaktywowanej cieplnie surowicy autologicznej, 10 mM HEPES i 5 mM MgCL w nieobecności i obecności różnych preparatów glukanu. Supernatant hodowli usunięto, sklarowano przez wirowanie przy 14000 g przez 5 minut i przechowywano przed oznaczeniem TNFa w -70°C.

177 453

Stężenie TNFa w supernatantach monocytów mierzono za pomocą enzymatycznej techniki immunoadsorpcyjnej (ELISA) za pomocą zestawu testowego BIOKTNE TNF (T Celi Sciences, Cambridge, MA) o dolnej granicy wykrywalności 40 pg/ml. Dane przedstawiono w postaci pg na 10⁶ monocytów, obliczanego przez podzielenie ilości cytokin w 0,5 ml supernatanta przez liczbę monocytów w studzience.

W celu oznaczenia komórkowych poziomów TNFa przylegające komórki lizowano w 0,25 ml PBS przez trzy cykle zamrażania i rozmrażania, lizaty sklarowano od resztek komórkowych przez wirowanie przy 14000 g przez 5 minut w 4°C, a uzyskane supernatanty przechowywano w -70°C. Świeżo przygotowane warstwy monocytów nie zawierały wykrywalnych ilości wewnątrzcząsteczkowego TNFa.

Wyniki przedstawiono poniżej w tabelach 3 i 4.

Tabela 3

Synteza TNFa przez monocyty ludzkie stymulowane różnymi preparatami glukanu

Glukan	Stężenie	TNFa (pg/106 monocytów)
1	2	3	Średnia ± SD
Bufor kontrolny		36	39	2	26+21
Obojętny, rozpuszczalny	1 mg/ml	44	51	33	43±9
Laminarin	1 mg/ml	372	324	227	308+74
Całe cząstki glukanu	4 x 107/ml	2129	1478	1683	1763+33

Tabela 4

Stymulacja TNFa przez różne struktury konformacyjne rozpuszczalnego β-glukanu

Glukan	Stężenie	TNFa (pg/106 monocytów)
Bufor kontrolny	1 mg/ml	40
Laminarin	1 mg/ml	1312
Obojętny, rozpuszczalny glukan	1 mg/ml	16
Pik B	1 mg/ml	1341
Cząstki glukanu	4 x 107ml	2065

Tabela 3 pokazuje, że TNFa był stymulowany przez nierozpuszczalne cząstki glukanu i przez laminarin, rozpuszczalny β(1-6) i β(1-3) połączony glukan. Nie występowała stymulacja TNFa przez obojętny, rozpuszczalny glukan. Tabela 4 pokazuje podobne rezultaty, ale dodatkowo potwierdza, że stymulacja TNFa jest zależna od struktury konformacyjnej. Obojętny, rozpuszczalny glukan nie stymuluje TNFa, natomiast Pik B (konformacja pojedynczego heliksu) stymulował TNFa.

Przykład V. Powinowactwo obojętnego, rozpuszczalnego glukanu do receptora glukanu

Monowarstwy monocytów ludzkich, otrzymane na silikonozowanych szkiełkach przykrywkowych (Czop i współpr., 1978, J. Immunol., 120: 1132) inkubowano przez 18 minut w 37°C w inkubatorze w atmosferze nawilgoconego CO₂ albo z 0,25 ml bufora (RPMI-MgHEPES) lub -w zakresie stężeń (0,1-50 gg/ml) obojętnego, rozpuszczalnego glukanu. Następnie warstwy monocytów przemywano dwukrotnie 50 ml pożywki RPMI 1640 i nawarstwiano 0,25 ml zawiesiny cząstek zymosanu o stężeniu 4,8 x 10^!7ml (Czop i Austen, 1985, J. Immunol., 134:2588-2593). Po 30 minutach inkubacji w 37°C monowarstwy przemyto trzykrotnie 50 ml zrównoważonego roztworu soli Hank'a w celu usunięcia niewchłoniętych cząstek zymosanu. Następnie monowarstwy przytwierdzano i wybarwiano za pomocą Giemsa. Wchłonięcie cząstek zymosanu przez co najmniej 300 monocytów na warstwę potwierdzano za pomocą obserwacji wizualnej pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 1000Χ.

177 453

Monowarstwy monocytów po wstępnej obróbce buforem i obojętnym, rozpuszczalnym glukanem o stężeniu 50 lub 500 pg/ml w sposób opisany powyżej badano na zdolność wchłaniania erytrocytów owczych pokrytych IgG (EIgG). Po 18 minutach preinkubacji obojętnym, rozpuszczalnym glukanem monowarstwy inkubowano 0,25 ml EIgG o stężeniu 1 x 107ml przez 30 minut w 37°C, przemywano trzy razy 50 ml zrównoważonego roztworu soli Hanka, traktowano przez 4 minuty 0,84% NH₄Cl w celu lizy niewchłoniętego EIgG i przytwierdzano oraz wybarwiano w sposób opisany powyżej. Procent monocytów wchłaniających > 1 i > 3 EIgG oznaczano przez zliczanie co najmniej 300 monocytów na monowarstwę.

Procent hamowania wchłaniania monocytów ustalono przez odjęcie procentu monocytów wchłaniających cele po wstępnym traktowaniu obojętnym, rozpuszczalnym glukanem od procentu wchłoniętych celów po wstępnej obróbce buforem, podzielenie tej liczby przez procent wchłoniętych celów po wstępnej obróbce buforem i podzielenie przez 100. Dane przedstawiono jako średnią z dwóch eksperymentów i podano w tabeli 5.

Tabela 5

Zdolność wiązania się z receptorem glukanu różnych konformacji rozpuszczalnych β-glukanów

Materiał badany	Stężenie	% hamowania
Bufor	-	0%
Obojętny, rozpuszczalny glukan	50 pg/ml 500 pg/ml	74% 86%
Pik B	50 pg/ml	50%
500 pg/ml	56%

Oba badane powyżej preparaty β-glukanu hamowały wchłanianie cząstek zymosanu, wykazując zdolność do kompetycyjnego wiązania się z receptorem β-glukanu monocytów ludzkich. Obojętny, rozpuszczalny glukan wykazywał wyższą zdolność wiązania się z receptorem niż Pik B, na co wskazuje wyższy poziom hamowania, uzyskiwany zarówno przy 50 pg/ml jak i 500 pg/ml. Ta próba biologiczna wykazuje, że obojętny, rozpuszczalny β-glukan jest doskonałym ligandem dla receptora β-glukanu.

Przykład VI. Brak stymulacji in vitro IL-1 β i TNFa z monojądrzastych komórek ludzkich.

Komórki krwi żylnej pobrano od zdrowych ochotników płci męskiej, a komórki monojądrzaste frakcjonowano przez wirowanie Ficoll-Hypaque. Komórki monojądrzaste przemyto, ponownie zawieszono w pozbawionym endotoksyn podłożu hodowlanym RPMI 1640 (ultrafiltrowanym w celu usunięcia endotoksyn w sposób opisany przez Dinarello i współpr., w J. Clin. Microbiol., 25:1233-8, 1987) o stężeniu 5 x 10⁶ komórek/ml i rozdzielono równe podwielokrotności do 96-studzienkowych mikropłytek (Endres i współpr., 1989, N. E. J. Med. 320:265-271). Następnie komórki inkubowano albo z 1 ng/ml endotoksyny (lipopolisacharyd, E. coli 055:B5, Sigma, St. Louis) lub z 10 do 1000 ng/ml β-glukanu, w 37°C przez 24 godziny w 5% CO₂, po czym lizowano poprzez trzy cykle zamrażania-rozmrażania (Endres i współpr., N. E. J. Med. 320:265-271). Syntezę IL-β i TNFa oznaczano za pomocą swoistych technik radioimmunologicznych w sposób opisany przez Lisi i współpr., 1987, Lymph. Res. 6:229-244; Lonnemann i współpr., 1988, Lymph. Res. 7:75-84; Van der Meer i współpr., 1988, J. Leukocyte Biol. 43:216-223.

W celu ustalenia, czy obojętny rozpuszczalny glukan może działać jako czynnik starterowy dla syntezy cytokin z endotoksyną, znanym stymulatorem cytokin, komórki monojądrzaste pre-inkubowano z 1, 10 i 1000 ng/ml obojętnego rozpuszczalnego glukanu przez 3 godziny w 37°C w 5% CO₂. Komórki przemyto w celu usunięcia obojętnego, rozpuszczalnego glukanu, po czym inkubowano z 1 ng/ml endotoksyny w sposób opisany powyżej.

177 453

Wyniki zestawiono w tabeli 6. Obojętny, rozpuszczalny glukan, stosowany jako stymulant w dawkach 10-1000 ng/ml pojedynczo nie indukował zwiększonych poziomów syntezy IL-1-β TNFa w stosunku do komórek traktowanych buforem kontrolnym. Endotoksyna LPS, znany stymulant, powodowała znaczne zwiększenie poziomów obu cytokin. W drugiej fazie tego eksperymentu obojętny, rozpuszczalny glukan testowano na zdolność do działania jako czynnika wyzwalającego syntezę cytokin komórek monojądrzastych. Komórki od tych samych dawców preinkubowano z trzema dawkami obojętnego, rozpuszczalnego glukanu (101000 ng/ml), po czym poddawano działaniu endotoksyny jako ko-stymulatora. Obojętny, rozpuszczalny glukan nie powodował jakiejkolwiek amplifikacji poziomów IL-Ιβ i TNFa w porównaniu z samąendotoksyną.

Tabela 6

Synteza in vitro IL-1 β i TNFa przez komórki monojądrzaste ludzkiej krwi obwodowej

— Stymulator	IL-1P (ng/ml)	TNFa (ng/ml)
Same komórki		<0,10	0,14
Obojętny, rozpuszczalny glukan	10 ng/ml	0,13	0,16
	100 ng/ml	0,12	0,16
	1000 ng/ml	<0,10	0,14
LPS	1 ng/ml	2,62	2,22
LPS (1 ng/ml)+	10 ng/ml	2,62	2,25
Obojętny, rozpuszczalny glukan	100 ng/ml	2,57	2,07
	1000 ng/ml	2,85	2,27

¹ Wartości są średnią dla dwóch donorów

Przykład VII. Zabezpieczenie in vivo przed infekcjąu myszy

Opracowano model posocznicy u szczurów dla scharakteryzowania skuteczności β-glukanu jako środka zabezpieczającego gospodarza o nienaruszonej odporności na ciężkie zakażenia, takie jak zakażenia występujące typowo po operacjach na jamie brzusznej. Szczurzy model posocznicy wewnątrz-brzusznej jest dobrze opisany w literaturze naukowej (Onerdonk i współpr., 1974, Infect. Immun., 10:1256-1259).

Grupy szczurów otrzymywały domięśniowo obojętny, rozpuszczalny glukan (100 pg/0,2 ml) lub kontrolną solankę (0,2 ml) na 24 godziny lub 4 godziny przed zakażeniem. Zdefiniowaną zakaźną prowokację wielobakteryjną (posiew kątniczy) umieszczano w kapsułce żelatynowej, którą następnie implantowano chirurgicznie w jamie otrzewnowej uśpionych szczurów poprzez nacięcie dolnej linii środkowej. Wczesne zapalenie otrzewnej spowodowane tym eksperymentalnie wywołanym zakażeniem związane było z obecnością we krwi i jamie brzusznej organizmów gram-ujemnych, a jego kulminacją była śmierć. Posiew kątniczy zawierał zestaw dowolnie dobranych gatunków, takich jak E.coli oraz inne obowiązkowe beztlenowce (Streptococcus sp., Bacteroides sp., Clostridium sp., Clostridium perfringens, Clostridium ramosum, Peptostreptococcus magnus i productus, Proteus mirabilis). Zwierzęta obserwowano cztery razy na dzień przez pierwsze 48 godzin i następnie dwa razy na dzień. Wyniki opisano w tabeli 7.

177 453

Tabela 7

Wpływ obojętnego, rozpuszczalnego glukanu na umieralność w szczurzym modelu posocznicy brzusznej

Grupa	Umieralność (%)	p w stosunku do solanki
Solanka	12/20 (60)
Obojętny, rozpuszczalny glukan	2/10 (10)	<0,01

Wyniki te wykazują, że obojętny, rozpuszczalny glukan, który nie indukuje lLł-β i TNFa, zabezpiecza myszy przed śmiertelną infekcją bakteryjną..

Przykład VIII. Wykazanie bezpieczeństwa przy podawaniu ludziom Statystyczne, kontrolowane placebo badania kliniczne z podwójną ślepą próbą przeprowadzono na zdrowych mężczyznach w celu oceny bezpieczeństwa obojętnego, rozpuszczalnego glukanu (2,25 mg/kg), wstrzykiwanego przez infuzję dożylną, w porównaniu z kontrolą placebo. Nie zaobserwowano żadnych działań ubocznych. Nie zaobserwowano również podwyższenia IL-1, TNF, IL-6, IL-8 i GM-CSF. Pojedyncze podanie dożylne obojętnego, rozpuszczalnego glukanu spowodowało wzrost liczby monocytów i neutrofili oraz aktywności zabójczej tych komórek, co udowodniło, że obojętny, rozpuszczalny glukan zatrzymuje pożądane czynności immunologiczne u ludzi. Patrz poniższe tabele 8, 9 i 10. Jednakże, jak pokazano na figurach 5 i 6, nie wystąpiły żadne zmiany w surowicy IL-1 i TNF i żaden z pacjentów nie doświadczył gorączki ani reakcji zapalnych. Wyniki są zgodne z danymi in vitro, opisanymi we wcześniejszych przykładach.

Tabela 8

Zmiana absolutnej liczby neutrofili (x 1000/pl) po podawaniu obojętnego, rozpuszczalnego glukanu

Dawka	B	8 godzin	12 godzin	24 godz.
	Średnia	4,06	4,34	4,31	3,43
Solanka	SD	2,12	1,53	1,16	1,46
	N	6	6	6	6
2,5 mg/kg	Średnia	4,11	11,29	8,18	5,32
SD	1 15	4 39	3 80	1 75
Obojętny, rozpuszczalny glukan	N	6	6	6	6

B = pomiar linii podstawowej *p < 0,01

Tabela 9

Zmiana liczby monocytów (x 1000/pl) po podawaniu obojętnego, rozpuszczalnego glukanu

Dawka	B	8 godzin	12 godzin	24 godz.
	Średnia	0,33	0,44	0,59	0,33
Solanka	SD	0,09	0,10	0,22	0,12
	N	6	6	6	6
2,5 mg/kg Obojętny, rozpuszczalny glukan	Średnia	0,24	0,63	0,67	0,31
SD N	0,10 6	0,24 6	0,32 6	0,15 6

B = pomiar linii podstawowej •p < 0,01

177 453

Tabela 10

Pomiar czynności mikrobójczej ex vivo u zdrowych ochotników po podaniu obojętnego, rozpuszczalnego glukanu Średnia zmiana w % zabijania¹

Dawka	Godz. 3	Godz. 6	Godz. 24	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 6
Solanka	0	0	0	0	0	0
2,5 mg/kg obojętnego rozpuszczalnego glukanu Średnia	42,86	32,33	20,90	48,96	39,22	31,17
N	6	6	6	6	6	6
wartość p	0,062	0,036	0,300	0,045	0,085	0,026

¹ Znormalizowana w odniesieniu do solanki kontrolnej

Przykład IX. Wykazanie skuteczności in vivo jako środka przeciw-infekcyjnego dla ludzi

W tych badaniach klinicznych oceniano bezpieczeństwo, tolerancję i potencjalną skuteczność obojętnego, rozpuszczalnego β-glukanu u pacjentów poddawanych poważnym operacjom chirurgicznym piersiowo-brzusznym o wysokim ryzyku infekcji pooperacyjnej. Trzydzieści cztery osoby płci męskiej i żeńskiej poddawane operacjom otrzymywały 0,5 mg/kg preparatu obojętnego, rozpuszczalnego β-glukanu lub solanki jako placebo w postaci infuzji dożylnej 50 do 200 ml, podawanej co godzinę. Pacjenci otrzymywali wielokrotne, kolejne dawki obojętnego, rozpuszczalnego β-glukanu lub placebo na 12 do 24 godzin przed operacją, do 4 godzin przed operacją, 48 godzin przed operacją i 96 godzin po operacji.

Jako potencjalne parametry skuteczności klinicznej badano hospitalizację, infekcje i stosowanie antybiotyków. W porównaniu z pacjentami otrzymującymi infuzje solanki, pacjenci otrzymujący obojętny, rozpuszczalny β-glukan spędzali średnio o pięć dni mniej w szpitalu (12,3±6,1 dnia w porównaniu z 17,3±15,5 dnia) i trzy dni krócej w oddziale intensywnej terapii (0,1±0,4 w porównaniu z 3,3±6,3 dnia; p<0,03, jednostronna analiza wariancji).

Liczba przepisań leków przeciw-infekcyjnych na dzień badania po operacji była znacznie wyższa dla pacjentów kontrolnych niż dla pacjentów otrzymujących β-glukan. Przez okres czasu od operacji do wypisania ze szpitala pacjentom kontrolnym przepisywano średnio trzy razy większą ilość leków anty-infekcyjnych niż pacjentom przyjmującym β-glukan. Podczas fazy leczenia oraz następującej po leczeniu fazy obserwacji zidentyfikowano łącznie 22 potwierdzonych bakteriologicznie infekcji u 5 pacjentów kontrolnych i 8 infekcji u 5 pacjentów otrzymujących β-glukan (p<0,002).

Neutrofile (PMN) i monocyty/makrofagi (MO) oczyszczano z próbek krwi otrzymanych w czasie zerowym, dnia 1 i dnia 5 i badano je na podstawową i stymulowaną mirystynianooctanem forbolu czynność mikrobobójczzą przeciwko Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Leczenie obojętnym, rozpuszczalnym β-glukanem generalnie zwiększa czynność mikrobobójczą MO i PMN.

Przykład X. Wpływ obojętnych, rozpuszczalnych glukanów na gojenie ran

Badania gojenia ran prowadzono na modelu nagiej myszy z ranami pełnej grubości z zakażeniem lub bez zakażenia Staphylococcus aureus. Nagie myszy wsobne SKH-1 (w wieku 6-8 tygodni) usypiano eterem i dokonywano pełnego 3 cm nacięcia wzdłużnego ostrzem skalpela nr 10, otrzymując ranę pełnej grubości, nie przenikającą poniżej powięzi. Nacięcia zamykano za pomocą stalowych klipsów w odstępach 1 cm.

Preparaty obojętnego, rozpuszczalnego glukanu w solance buforowanej fosforanem podawano w 30 minut po zranieniu i ponownie co 24 godziny przez okres 7 dni po operacji. Nanoszono miejscowo dwa mikrogramy obojętnego, rozpuszczalnego glukanu/mysz na dzień. Rany badano codziennie i szeregowano je pod względem skuteczności preparatu w wizual20

177 453 nym gojeniu rany. Zamykanie ran oceniano w skali 0-5, gdzie 5 wskazuje najlepsze wygojenie. W jednej z grup zainfekowanych myszy ranę traktowano kulturą 10² Staphylococcus aureus w 30 minut po zranieniu i na 2 godziny przed podaniem preparatu obojętnego, rozpuszczalnego glukanu.

Przeprowadzono badanie histologiczne miejsca rany dla każdej z grup badanych. Skóra właściwa grupy kontrolnej (rana nieleczona) była silnie infiltrowana zarówno limfocytami jak i monocytami/makrofagami. Jednakże epitelializacja zachodząca w warstwie naskórkowej była niekompletna. Sekcja tkanki wykazała, że tkanka skórna była słaba, co objawiało się w tym, że integralność tkanki nie utrzymywała się podczas sekcji.

Histologia zranionej tkanki wyizolowanej od myszy leczonych trzy dni solanką buforowaną fosforanem zawierającą obojętny, rozpuszczalny glukan wykazała, że jest silna infiltracja makrofagów i limfocytów. Integralność tkanki była dobra.

Po miejscowym naniesieniu na ranę kompozycja obojętnego, rozpuszczalnego glukanu stymulowała napływ czerwonych krwinek i ich aktywność przy miejscu zranienia oraz przyspieszała gojenie rany wewnątrz warstwy skóry właściwej. Ponadto, kompozycja skutecznie eliminowała infekcję bakteryjną (S. aureus) i zapobiegała postępowi posocznicy. W ranach nieleczonych następował postęp posocznicy.

Przykład XI. Stymulacja proliferacji płytek przez obojętny, rozpuszczalny glukan

Działania obojętnego, rozpuszczalnego glukanu stymulujące proliferację płytek badano na modelu zwierzęcym po napromieniowaniu albo po podaniu środka chemioterapeutycznego cis-platyny. Eksperymenty te wykazały nieoczekiwany efekt stymulujący płytki.

W szczególności grupom 10 myszy podawano solankę albo obojętny, rozpuszczalny glukan, otrzymany w sposób opisany w przykładzie I, w postaci pojedynczego wlewu, 20 godzin przed ekspozycją na promieniowanie. Myszy poddawano dwustronnej ekspozycji całego ciała na promieniowanie 7,5 Gy. Czternaście dni po napromieniowaniu myszy zabito, a w próbkach pełnej krwi analizowano parametry krwi obwodowej. Jak pokazano na fig. 7, liczba komórek płytek u myszy leczonych obojętnym, rozpuszczalnym glukanem była w przybliżeniu 3 razy większa w porównaniu z myszami kontrolnymi, leczonymi solanką.

Oprócz testów na myszach napromieniowanych przeprowadzono także badania wpływu obojętnego, rozpuszczalnego glukanu na hematopoezę płytkową u myszy leczonych cisplatyną. Na godzinę przed wstrzyknięciem dnia 0 solanki albo obojętnego, rozpuszczalnego glukanu, przygotowanego w sposób opisany w przykładzie I, domięśniowo w pojedynczej dawce 0 (solanka) lub 2 mg/kg myszom Balb/c wstrzykiwano dożylnie cis-platynę w dawce 9,3 mg/kg poprzez żyłę szyjną. Liczbę płytek oznaczano przed leczeniem (dzień 0) i 2, 4, 6, i 10 dni po leczeniu. Wyniki tego eksperymentu pokazano na figurze 8. Każdy punkt oznacza średnią i błąd średni standardowy liczby płytek od 5 myszy. Zanotowano istotne statystycznie różnice (p<0,05) między solanka i obojętnym rozpuszczalnym glukanem (2 mg/kg).

Depozyt biologiczny

Szczep Saccharomyces cerevisiae R4 Ad zdeponowano 20 sierpnia 1992 w kolekcji American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, na mocy Porozumienia Budapeszteńskiego. Szczep uzyskał numer akcesyjny 74181.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Niederywatyzowany, rozpuszczalny w wodzie P(1-3)glukan, pochodzący z drożdży lub z całych cząstek glukanu pochodzących z drożdży, o konformacji potrójnego heliksu, mający właściwości immunostymulujące, i ciężar cząsteczkowy od 30.000 do 500.000.
2. 2. Kompozycja mająca właściwości immunostymulacyjne, znamienna tym, że zawiera niederywatyzowany, rozpuszczalny w wodzie P(1-3)glukan (pochodzący z drożdży lub z całych cząstek glukanu pochodzących z drożdży) o konformacji potrójnego heliksu i fizjologicznie dopuszczalny nośnik, gdzie niederywatyzowany rozpuszczalny w wodzie P(1-3)glukan konformacji potrójnego heliksu ma ciężar cząsteczkowy od 30.000 do 500.000, korzystnie 30.000 do 300.000 dla glukanu z drożdży lub całych cząstek glukanu pochodzących z drożdży.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jako dopuszczalny nośnik zawiera wodę, jałową solankę, solankę buforowaną fosforanem, solankę izotoniczną lub dekstrozę.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 2 albo 3, znamienna tym, że zawiera glukan w stężeniu w dopuszczalnym fizjologicznie nośniku od 0,5 do 100 mg/ml.
5. 5. Sposób wytwarzania niederywatyzowanego, rozpuszczalnego w wodzie p(1-3)glukanu o ciężarze cząsteczkowym od 30.000 do 500.000 o konformacji potrójnego heliksu, znamienny tym, że:

   a) na zawiesinę nierozpuszczalnego glukanu (pochodzącego z drożdży lub z całych cząstek glukanu pochodzących z drożdży), działa się kwasem organicznym w celu rozpuszczenia części glukanu rozpuszczalnej w wodzie;

   b) na glukan rozpuszczalny w kwasie działa się alkaliami aby denaturować natywną konformację rozpuszczalnego glukanu;

   c) zobojętnia się roztwór zawierający denaturowany rozpuszczalny glukan aby reasocjować rozpuszczalny glukan; i

   d) oczyszcza się reasocjowany rozpuszczalny glukan, otrzymując niederywatyzowany, rozpuszczalny w wodzie P(1-3)glukan o konformacji potrójnego heliksu.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap (a) przeprowadza się przy wartości pH od 1 do 5 i w temperaturze od 20°C do 100°C.
7. 7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że jako kwas stosuje się kwas octowy o stężeniu od 0,1 do 5 M, albo kwas mrówkowy o stężeniu od 50% do 98% (wag/objęt.).
8. 8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap (b) przeprowadza się przy wartości pH od 7 do 14 i w temperaturze od 4°C do 121 °C.
9. 9. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że przed etapem (c) przeprowadza się dodatkowy etap oczyszczania denaturowanego glukanu, w celu usunięcia z niego nierozpuszczalnych w wodzie glukanów i agregowanych rozpuszczalnych w wodzie glukanów korzystnie z zastosowaniem przeponowych ultrafiltrów odcinających dla nominalnej masy cząsteczkowej 1000 do 100.000.
10. 10. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap (c) przeprowadza się przy wartości pH od 6 do 8 i w temperaturze od 50°C do 70°C.
11. 11. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap (d) przeprowadza się stosując przeponowy ultrafiltr odcinający dla nominalnej masy cząsteczkowej 30.000 do 100.000 i przeponowy ultrafiltr odcinający dla nominalnej masy cząsteczkowej 150.000 do 500.000.