CN105112397B - 一种聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，步骤如下：在乙腈溶液中加入三乙胺，随后逐滴加入4‑乙烯基苄氯，搅拌加入乙酸乙酯，抽滤、干燥；将功能单体溶于甲醇中，然后加入交联剂、引发剂；水浴50℃～80℃引发聚合、洗涤、真空干燥；在Tris‑HCl缓冲液中结合蛋白酶，结合完成后的溶液进行离心，离心后的材料用去离子水洗涤后，即得聚季铵盐离子液体酶反应器。本方法制得的酶反应器生物相容性好，分散性好，酶解效率高，提高酶的利用效率，性能稳定，可以实现重复利用，可以重复利用至少三次，在4℃的环境中放置60天后，仍能用于对蛋白的酶解。

Description

一种聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法

技术领域

本发明属于酶反应器技术领域，尤其是一种聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法。

背景技术

蛋白质组学作为一个多学科的研究，集蛋白质及肽段分离技术、质谱定性及定量分析技术和生物信息学于一体，对复杂多样的蛋白质的动态变化、结构功能及相互作用进行深入研究。在目前蛋白质组学的研究中，常用的鉴定方法主要为基于质谱的“鸟枪法(shotgun)”。将目标蛋白质酶解后，采用多维液相色谱-质谱联用技术，对酶解生成的多肽混合物进行分离和质谱分析，并将所产生的数据与其理论蛋白质数据库进行匹配，从而实现对蛋白质的鉴定。由此可见，蛋白质的规模化鉴定首先需要对样品进行酶解处理，因此高效快速的蛋白质酶解方法显得尤为重要，其酶解效率也将成为影响后续蛋白质组及其蛋白质序列深度覆盖的重要一环。

由于胰蛋白酶、胃蛋白酶是蛋白质组学研究中最常用的蛋白酶，因此被广泛用于制作酶反应器。已有的研究已经将蛋白酶固定到微型颗粒，膜类载体，整体材料和石英毛细管等多种载体上制作成固定化的酶反应器来提高传统的溶液酶解效率以及提高酶的利用率。此类酶反应器具有如下优点：(1)单位体积的酶浓度较高，可以缩短酶切时间，提高酶解效率；(2)酶固定在载体上，可以重复利用，降低实验成本；(3)能够减少后续质谱鉴定中酶自解产物造成的干扰；(4)可将酶切反应器与分析系统在线连接，实现通量化和自动化。但是，目前，这类酶反应器基质材料的生物相容性差、分散性差，难以重复利用。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种生物相容性好、可重复利用且分散性较好的聚季铵盐离子液体酶反应器，该酶反应器可用于对蛋白溶液的酶解，且可以缩短酶解时间、提高酶解效率。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，步骤如下：

⑴在乙腈溶液中加入三乙胺，随后逐滴加入4-乙烯基苄氯，室温磁力搅拌2-8小时后，向反应体系中加入乙酸乙酯即可析出白色产物，溶液抽滤后，产物真空干燥后，即得到制备聚离子季铵盐离子液体酶反应器的功能单体；

其中，所述乙腈溶液与三乙胺的体积比为1:1～4:1，三乙胺与4-乙烯基苄氯的物质的量的比为1:1～1.2:1，所述乙腈溶液与乙酸乙酯的体积比为1：1～1：4；

⑵将步骤⑴的功能单体溶于甲醇中，甲醇做溶剂，然后加入交联剂、引发剂，功能单体的重量终浓度为1.0％～11.5％，交联剂的重量终浓度3.5％～30％，引发剂的重量终浓度为0.1％～1.5％，在上述混合后的甲醇液中通入氮气除氧；

⑶水浴50℃～80℃引发聚合12h～24h后得到固体材料，将固体材料用甲醇洗涤，真空干燥24h，得到白色聚季铵盐离子液体；

⑷上述步骤⑶得到聚季铵盐离子液体在Tris-HCl缓冲液中结合蛋白酶，结合完成后的溶液进行离心，离心后的材料用去离子水洗涤后，即得聚季铵盐离子液体酶反应器。

而且，所述步骤⑴或⑵的功能单体为N-4-乙烯基苄三乙氨基氯盐；或者，所述真空干燥的时间为24h。

而且，所述步骤⑵的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈。

而且，所述步骤⑶的甲醇洗涤次数为5次；或者，所述真空干燥的时间为24h。

而且，所述步骤⑷的Tris-HCl缓冲液的pH为6～8。

而且，所述步骤⑷的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或木瓜蛋白酶。

而且，所述步骤⑷的去离子水洗涤的次数为3～5次。

而且，用Tris-HCl缓冲液配制0.4mg/mL的蛋白酶溶液，投入白色聚季铵盐离子液体对胰蛋白酶吸附12h～24h后，得负载蛋白酶的聚离子液体材料，吸附后的溶液离心4000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，产物用去离子水洗涤，即得聚离子季铵盐离子液体酶反应器。

本发明的优点和积极效果是：

1、本方法制得的酶反应器生物相容性好，分散性好，酶解效率高，提高酶的利用效率，性能稳定，可以实现重复利用，可以重复利用至少三次，在4℃的环境中放置60天后，仍能用于对蛋白的酶解。

2、本发明方法合成过程简单，条件易于控制，材料具有较好的热稳定性，较强的生物相容性，可以用于蛋白的酶解，该酶反应器大大降低了酶解所需时间，提高了酶利用率以及酶解效率，实现了对蛋白更加高效简便的酶解。

3、本发明方法制得的聚合物单体的合成过程简单，减少了后续质谱鉴定过程中的杂质干扰，而且采用聚离子液体为基质材料来负载酶，将离子液体的强分散性等优点和聚合物的热稳定性结合起来，可以更好的将材料进行优化后投入应用，具有很广的应用前景。

4、本发明方法的聚季铵盐离子液体单体的制备仅需一步反应即可得到，在pH6～8的Tris-HCl缓冲液中负载了蛋白酶后，该酶反应器可以代替传统溶液酶解法重复用于对蛋白的酶解。

附图说明

图1和图2为本发明聚离子液体材料的扫描电镜图，其中，图1为放大5000倍的聚离子液体材料的扫描电镜图；图2为放大10000倍的聚离子液体材料的扫描电镜图；从图中可以看出该聚合物的颗粒较为均匀；

图3至图10为本发明聚季铵盐类离子液体酶反应器对β-酪蛋白溶液的酶解MOLDI-TOF结果图；图3为酶反应器对1mg/mL的β-酪蛋白溶液的在4小时后的酶解效果图，图4为与材料负载的酶等量的传统溶液酶解法对β-酪蛋白溶液在4小时后的酶解效果图；图5至图10依次为相同条件下的酶解8、12、16小时后的结果图；其中，图5为酶反应器对1mg/mL的β-酪蛋白溶液的在8小时后的酶解效果图，图6为与材料负载的酶等量的传统溶液酶解法对β-酪蛋白溶液在8小时后的酶解效果图；图7为酶反应器对1mg/mL的β-酪蛋白溶液的在12小时后的酶解效果图，图8为与材料负载的酶等量的传统溶液酶解法对β-酪蛋白溶液在12小时后的酶解效果图；图9为酶反应器对1mg/mL的β-酪蛋白溶液的在16小时后的酶解效果图，图10为与材料负载的酶等量的传统溶液酶解法对β-酪蛋白溶液在16小时后的酶解效果图；

从图2可以分析得到，在相同的4小时的酶解条件下，酶反应器酶解蛋白后的序列覆盖度可以达到56％，远远高于传统溶液酶解法的结果。随着酶解时间的增长，两种方法的结果趋于相同，原因在于大部分的蛋白随着时间的增长都已经被酶解，所以两种酶解方法的差别变小。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，步骤如下：

(1)在3mL乙腈溶液中加入1.94mL的三乙胺，常温在磁力搅拌的条件下，逐滴加入2mL的4-乙烯基苄氯(三乙胺与4-乙烯基苄氯的物质的量比为1：1)，反应4小时后结束，接着在反应体系中加入10mL乙酸乙酯即可析出白色产物(采用乙酸乙酯将得到的季铵盐离子液体析出)，溶液抽滤后，产物真空干燥24h后即可得到制备聚离子季铵盐离子液体酶反应器的单体产物。

(2)将单体溶于60mL甲醇做溶剂，EGDMA为交联剂，AIBN为引发剂，在混合后的甲醇液中通入氮气除氧，水浴60℃引发聚合24h后得到白色聚合物，产物用甲醇抽滤洗涤5次，真空干燥24h，得到白色聚季铵盐离子液体。

(3)用pH6.8的Tris-Hcl缓冲液配制0.4mg/mL的胰蛋白酶溶液，投入5mg聚合物材料对胰蛋白酶吸附12h后即得负载胰蛋白酶的聚离子液体材料。吸附后的溶液溶液4000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，产物用3mL去离子水洗涤3次，得到聚离子季铵盐离子液体酶反应器，即可用于对蛋白的酶解。

实施例2

一种聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，步骤如下：

(1)在3mL乙腈溶液中加入1.94mL的三乙胺，常温在磁力搅拌的条件下，逐滴加入2mL的4-乙烯基苄氯(三乙胺与4-乙烯基苄氯的物质的量比为1：1)，反应4小时后结束，接着在反应体系中加入10mL乙酸乙酯即可析出白色产物，溶液抽滤后，产物真空干燥24h后得到白色4-乙烯基苄氯季铵盐离子液体单体。

(2)单体的聚合：采用沉淀聚合方法，40-60mL甲醇做溶剂，EGDMA为交联剂，AIBN为引发剂，水浴80℃引发聚合12h后得到白色聚合物。产物用甲醇抽滤洗涤5次，真空干燥24h，得到白色聚季铵盐离子液体。

(3)用pH6.8的Tris-Hcl缓冲液配制0.4mg/mL的胰蛋白酶溶液，投入5mg聚合物材料对胰蛋白酶吸附24h后即得负载胰蛋白酶的聚离子液体材料。吸附后的溶液4000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，产物用3mL去离子水洗涤5次，得到聚离子季铵盐离子液体酶反应器，可用于对蛋白的酶解。

实施例3

一种聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，步骤如下：

⑴在乙腈溶液中加入三乙胺，随后逐滴加入4-乙烯基苄氯，室温磁力搅拌2-8小时后，向反应体系中加入乙酸乙酯即可析出白色产物，溶液抽滤后，产物真空干燥后，即得到制备聚离子季铵盐离子液体酶反应器的功能单体；

其中，所述乙腈与三乙胺的体积比为1:1～4:1，三乙胺与4-乙烯基苄氯的物质的量的比为1:1～1.2:1

⑵将步骤⑴的功能单体溶于甲醇中，甲醇做溶剂，然后加入交联剂、引发剂，功能单体的重量终浓度为1.0％～11.5％，交联剂的重量终浓度3.5％～30％，引发剂的重量终浓度为0.1％～1.5％，在上述混合后的甲醇液中通入氮气除氧；

⑶水浴50℃～80℃引发聚合12h～24h后得到固体材料，将固体材料用甲醇洗涤，真空干燥，得到白色聚季铵盐离子液体；

⑷上述步骤⑶得到聚季铵盐离子液体在Tris-Hcl缓冲液中结合蛋白酶，蛋白酶可以为胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或木瓜蛋白酶,结合完成后的溶液进行离心，离心后的材料用去离子水洗涤后，即得聚季铵盐离子液体酶反应器。

本发明方法制得的聚季铵盐离子液体酶反应器的相关检测结果：

所有酶解结果采用MOLDI-TOF质谱检测法进行分析，具体结果见图1和图2：

从图1中可以看出该聚合物的颗粒较为均匀，从图2可以分析得到，在相同的4小时的酶解条件下，酶反应器酶解蛋白后的序列覆盖度可以达到56％，远远高于传统溶液酶解法的结果。随着酶解时间的增长，两种方法的结果趋于相同，原因在于大部分的蛋白随着时间的增长都已经被酶解，所以两种酶解方法的差别变小。

同时，经检测，本方法制得的酶反应器生物相容性好，分散性好，酶解效率高，提高酶的利用效率，性能稳定，可以实现重复利用，可以重复利用至少三次，在4℃的环境中放置60天后，仍能用于对蛋白的酶解。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术方案作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，其特征在于：步骤如下：

⑴在乙腈溶液中加入三乙胺，随后逐滴加入4-乙烯基苄氯，室温磁力搅拌2-8小时后，向反应体系中加入乙酸乙酯即可析出白色产物，溶液抽滤后，产物真空干燥后，即得到制备聚离子季铵盐离子液体酶反应器的功能单体；

其中，所述乙腈溶液与三乙胺的体积比为1:1～4:1，三乙胺与4-乙烯基苄氯的物质的量的比为1:1～1.2:1，所述乙腈溶液与乙酸乙酯的体积比为1:1～1:4；

⑵将步骤⑴的功能单体溶于甲醇中，甲醇做溶剂，然后加入交联剂、引发剂，功能单体的重量终浓度为1.0％～11.5％，交联剂的重量终浓度3.5％～30％，引发剂的重量终浓度为0.1％～1.5％，在上述混合后的甲醇液中通入氮气除氧；

⑶水浴50℃～80℃引发聚合12小时～24小时后得到固体材料，将固体材料用甲醇洗涤，真空干燥，得到白色聚季铵盐离子液体；

⑷上述步骤⑶得到聚季铵盐离子液体在Tris-HCl缓冲液中结合蛋白酶，结合完成后的溶液进行离心，离心后的材料用去离子水洗涤后，即得聚季铵盐离子液体酶反应器。

2.根据权利要求1中所述的聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴或⑵的功能单体为N-4-乙烯基苄三乙氨基氯盐，所述步骤⑴中真空干燥的时间为24小时。

3.根据权利要求1中所述的聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈。

4.根据权利要求1中所述的聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤⑶的甲醇洗涤次数为5次，所述真空干燥的时间为24小时。

5.根据权利要求1中所述的聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤⑷的Tris-HCl缓冲液的pH为6～8。

6.根据权利要求1中所述的聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤⑷的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或木瓜蛋白酶。

7.根据权利要求1中所述的聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤⑷的去离子水洗涤的次数为3～5次。

8.根据权利要求1至7任一项中所述的聚季铵盐离子液体酶反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤⑷的具体步骤如下：

用Tris-HCl缓冲液配制0.4mg/mL的蛋白酶溶液，投入白色聚季铵盐离子液体对蛋白酶吸附12小时～24小时后，得负载蛋白酶的聚离子液体材料，吸附后的溶液4000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，产物用去离子水洗涤，即得聚离子季铵盐离子液体酶反应器。