CN109709322A

CN109709322A - 一种检测黄曲霉毒素b1的检测方法

Info

Publication number: CN109709322A
Application number: CN201910037557.5A
Authority: CN
Inventors: 吴龙; 徐歆; 陈小强; 祝琳; 周敏
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2019-01-15
Filing date: 2019-01-15
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2039-01-15
Also published as: CN109709322B

Abstract

本发明涉及化学测试分析技术领域，涉及一种可视化检测黄曲霉毒素B1的检测方法。将样品提取液加入到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒中反应后，所得的产物用洗涤液进行磁场清洗，然后加入A液和B液进行反应，再加入终止液停止反应；用所述检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒中黄曲霉素B1标准比色卡进行比对，得到待测样品黄曲霉素B1的含量或范围值。该检测工艺具有灵敏、简单、便携、可实时检测的优点，不仅可以通过肉眼来完成目标物的定性检测，还能通过酶标仪测试显色溶液的吸光值进行定量分析。

Description

一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法

技术领域

本发明涉及化学测试分析技术领域，具体的说，涉及一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法。

背景技术

黄曲霉毒素B1(AFB1)是由黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢产物，主要存在于土壤、动植物和坚果中。其中，最容易受黄曲霉毒素B1(AFB1)污染的食品有花生、玉米、稻米、大豆、小麦等。黄曲霉毒素B1(AFB1)在已知的霉菌毒素中毒性最大，是已知的化学物质中致癌性最强的一种，它对人类健康的危害十分严重，可引发人类肝癌和食道癌。黄曲霉毒素B1(AFB1)对人和动物都具有强烈的毒性，主要表现对肝脏的损害，微量持续摄入，可造成慢性中毒，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。国家质检总局规定黄曲霉毒素B1(AFB1)是大部分食品的必检项目之一，随着市场监管范围的扩大以及检测指标限量值的降低，对检测技术的要求也越来越高。因此，发展简便快速的方法检测食品中的黄曲霉毒素B1(AFB1)以满足市场需求显得十分迫切。

目前，检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱/质谱联用法、免疫层析法、荧光光度法和酶联免疫分析法等。高效液相色谱法和液相色谱/质谱联用法能够获得较高的检测准确度，但是其检测周期长，仪器成本高，并且需要培养专业的操作人员，因此不适合进行现场的快速分析检测。免疫层析法具有快速、简单、成本低等优点，但该方法最大的缺点是灵敏度低，精密度较差，并且只能使用抗体-抗原识别模式进行检测，不适合黄曲霉毒素B1(AFB1)这类小分子的分析检测。荧光光度法的灵敏度比较高，其灵敏度可以达到pM水平，但由于该方法容易受溶液中离子和其他物质的干扰，其特异性和准确度还有待提高。酶联免疫(ELISA)法具有特异性强、操作方法简单、易于商品化和自动化等优点，它在食品、生物和环境等相关分析领域备受研究者的青睐。

传统的酶联免疫(ELISA)法具有操作过程繁琐、试剂盒成本高、检测周期长、易出现假阳性等缺点，这极大地限制了它在市场上的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒的检测方法。该检测工艺具有灵敏、简单、便携、可实时检测的优点，不仅可以通过肉眼来完成目标物的定性检测，还能通过酶标仪测试显色溶液的吸光值进行定量分析。

本发明提供的技术方案如下：

一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，包括：

步骤50、将样品提取液加入到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒中反应后，所得的产物用洗涤液进行磁场清洗，然后加入A液和B液进行反应，再加入终止液停止反应；

步骤51、用所述检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒中黄曲霉素B1标准比色卡进行比对，得到待测样品黄曲霉素B1的含量或范围值。

优选地，在所述步骤50中，所述的将样品提取液加入到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒中反应时间为40～60min，优选为40min；所述的用洗涤液进行磁场清洗次数至少为3次，优选为3次；所述的加入所述A液和所述B液进行反应时间为10～40min，优选为10min；

进一步，优选地，所述样品提取液、所述洗涤液、所述A液、所述B液和所述终止液体积比为1：2～4：1：1：1。

优选地，在所述步骤50之前还包括：

步骤01、固体样品去皮粉碎，加入甲醇和石油醚，静置分层，下层为所述固体样品的样品提取液。

或；

步骤02、在液体样品中，加入三氯甲烷，静置分层，下层为三氯甲烷层，过滤，重复上述步骤，收集三氯甲烷层，通风挥干冷却后，用甲醇溶解得液体样品的样品提取液。

进一步，优选地，所述步骤01具体包括：步骤011、将固体样品去皮粉碎，加入甲醇水溶液和石油醚，振荡，用滤纸过滤于分液漏斗中，静置分层，下层为固体样品的提取液；

或，

所述步骤02具体包括：步骤021、称取液体样品于小烧杯中，用蒸馏水转移到分液漏斗中，加入三氯甲烷，加塞轻轻振摇，静置分层，然后放出下层三氯甲烷层，经盛有约预先用三氯甲烷湿润的无水Na₂SO₄的快速定性滤纸过滤于蒸发皿中，再加三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，水溶通风挥干；挥干冷却后，用甲醇溶解得液体样品的提取液。

再进一步，优选地，所述步骤011中所述甲醇水溶液为7体积甲醇和3体积纯水配成的均匀水溶液；所述样品与甲醇水溶液的质量体积比为1g/5mL；所述样品与石油醚的质量体积比为1g/4mL；所述加入甲醇水和石油醚之后振荡时间为10min；

或，

所述步骤021中所述液体样品、蒸馏水与三氯甲烷的体积比为1：1：4，所述用来重复振摇提取的三氯甲烷与液体样品体积比为1：1，所述预先用三氯甲烷湿润的无水Na₂SO₄的快速定性滤纸与液体样品的质量体积比为1g/mL，所述水溶通风挥干温度为65℃，所述液体样品与甲醇的体积比为1：1。

优选地，在所述步骤50之前还包括：

步骤03、称取磷酸二氢钾，十二水合磷酸氢二钠，氯化钠和氯化钾，将称量的药品倒入烧杯中加水溶解，然后加入吐温20，将配制的溶液转移至容量瓶中，加蒸馏水定容后得到所述洗涤液；

步骤04、称取醋酸钠、柠檬酸，然后加入双氧水定容，则得到所述A液；

步骤05、取3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶于二甲基亚砜，后加入乙二胺四乙酸二钠，柠檬酸和甘油定容，用超纯水或蒸馏水或去离子水得到所述B液；

步骤06、量取蒸馏水于试剂瓶中，缓慢加入浓硫酸，静置超声混匀，得到所述终止液。

进一步，在所述步骤03中，磷酸二氢钾在所述洗涤液中的质量体积比优选为0.2g/L；十二水合磷酸氢二钠在所述洗涤液中的质量体积比为2.9g/L；氯化钠在所述洗涤液中的质量体积比为8.0g/L；氯化钾在所述洗涤液中的质量体积比为0.2g/L；吐温20与所述洗涤液的体积比为1：2000。

在所述步骤04中，醋酸钠在所述A液中的质量体积比为5.44g/200mL；柠檬酸在所述A液中的质量体积比为0.64g/200mL；所述双氧水的浓度为30％；

在所述步骤05中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺与所述B液的质量体积比为0.06g/200mL；乙二胺四乙酸二钠与所述B液的质量体积比为0.08g/200mL；柠檬酸与所述B液的质量体积比为0.38g/200mL；甘油、二甲基亚砜与所述B液体积比为1：0.03：10；

在所述步骤06中，浓硫酸的浓度为98％，浓硫酸与所述终止液的体积比为108.5：1000；所述静置的时间为30min；所述超声的时间为10min。

优选地，检测方法中使用的试剂盒包括；

黄曲霉素标准比色卡，用于确定样品黄曲霉素B1的含量或范围；

反应板，用于存放铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂的混合液；

盒子，装配在所述反应板底部；

磁铁，放置于所述盒子内部。

本技术方案中，试剂盒中采用磁力吸附可以有效改善非特异性吸附和吸附不牢靠，提高ELISA的检测性能。

优选地，试剂盒中制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签包括：

步骤10：将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后加入硼氢化钠溶液搅拌后获得金纳米粒子，将所述金纳米粒子离心洗涤后分散在水中，得到金纳米粒子溶液；

步骤11：将三乙胺加入水搅拌后，加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸，正硅酸乙酯反应后，再加入盐酸甲醇溶液反应，取以上配置而成的部分溶液加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌后得到氨基化二氧化硅纳米微球，将所述氨基化二氧化硅纳米微球离心清洗取沉淀后分散在水中，得到氨基化二氧化硅纳米微球溶液；

步骤12：将所述氨基化二氧化硅纳米微球加入所述金纳米粒子溶液，超声搅拌反应，得到红色的金二氧化硅纳米微球；

步骤13：将所述红色的金二氧化硅纳米微球离心洗涤后分散在水中，得到红色的金二氧化硅纳米微球溶液，在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液中加入氯铂酸后搅拌再加入硼氢化钠溶液反应，获得铂金二氧化硅纳米微球，分散到水中，得到铂金二氧化硅纳米微球溶液；

步骤14：取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液孵育，将反应所得的溶液离心洗涤，分散到水中，得到戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液，再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并搅拌，获得所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签。

进一步，优选地，所述步骤10具体包括：步骤101、将四氯金酸加入柠檬酸三钠用去离子水定容后，在不断搅拌的条件下加入冰浴过后的硼氢化钠溶液，搅拌后获得金纳米粒子，将所述金纳米粒子离心洗涤后分散在水中，得到金纳米粒子溶液；

所述步骤11具体包括：步骤111、将三乙胺加入水磁力搅拌后，加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸反应，再加入正硅酸乙酯反应，取出冷却后离心清洗取沉淀，然后加入盐酸甲醇溶液反应后，取出冷却后离心清洗取沉淀分散于乙醇中，取以上配置而成的溶液加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在室温下搅拌后，离心清洗取沉淀分散于水中，得到氨基化二氧化硅纳米微球溶液；

所述步骤13具体包括：步骤131、将所述红色的金二氧化硅纳米微球离心洗涤后分散在水中，得到红色的金二氧化硅纳米微球溶液，在不断搅拌的条件下加入氯铂酸搅拌后，加入现配冰浴过的硼氢化钠溶液，反应所得的溶液离心洗涤获得铂金二氧化硅纳米微球；

所述步骤14具体包括：步骤141、取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液中并在室温下孵育，反应所得的戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中，然后加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并在室温下搅拌反应，适配体互补链序列为：5'－ACACGTGCCCAACAAA AAA－3'。反应所得的溶液离心洗涤获得所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签，分散到水中，得到铂金二氧化硅纳米微球信号标签溶液。

进一步，优选地，在所述步骤10或101中，所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后所得的溶液中，四氯金酸的浓度为2.5ⅹ10^-2mmol/L，柠檬酸三钠的浓度为73.535mg/L；所述的加入硼氢化钠溶液与所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用水定容后所得的溶液与硼氢化钠溶液的体积比为3：100，并且该溶液中硼氢化钠的浓度为3ⅹ10^-3mol/L，所述的搅拌时间优选为10～15min，最优选为15min；所述的金纳米粒子溶液的浓度为4～4.9mg/L，最佳优选浓度为4.9mg/L；

在所述步骤11或111中，所述的将三乙胺加入水，所得的三乙胺水溶液浓度为2.7～2.76g/L，最优选为2.72g/L，所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸与三乙胺的质量比为8：1～4：1.4～1.5，最优选为8：2：1.48，正硅酸乙酯、盐酸甲醇溶液、乙醇与三乙胺水溶液的体积比为4：25：4：25；所述的由以上配置而成的部分溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为120：1，所述的在室温下搅拌的时间为5～6h，最优选为6h；

其中，所述的将三乙胺加入水搅拌为磁力搅拌，温度为80℃，时间至少为0.5h，最优选为0.5h；所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸和正硅酸乙酯反应温度为80℃，时间至少为1h，最优选为1h；所述的盐酸甲醇溶液中盐酸：甲醇体积比为1：9～11，最优选为1：10，所述的加入盐酸甲醇溶液的反应温度为60～80℃，最优选为60℃；所述的氨基化二氧化硅纳米微球溶液的浓度为86～100mg/L，最佳优选浓度为86mg/L；

在所述步骤12中，氨基化二氧化硅纳米微球与所述金纳米粒子溶液体积比小于1：5，最优选为1：6；所述超声搅拌反应时间至少为10min，最优选为15min；

在所述步骤13或131中，所述的红色的金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为19.4mg/L，所述的在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液溶液中加入氯铂酸后所得到的溶液中，氯铂酸的浓度为0.47mol/L，所述的加入硼氢化钠溶液后所得的溶液中，硼氢化钠的浓度为4.8ⅹ10^-5mol/L，所述铂金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为18.2～31.2mg/L，最佳优选浓度为18.2mg/L；

所述的加入氯铂酸搅拌的时间至少为10min，最优选为10min；

在所述步骤14或141中，戊二醛原液和所述铂金二氧化硅纳米微球溶液体积比为1：5；所述的取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min，最优选为30min；所述的戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA互补链的浓度为0.46～0.60nmol/mL，最佳优选浓度为0.46nmol/mL；

所述的加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并在室温下搅拌反应时间至少为30min，最优选为30min；所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签的浓度为0.19～0.30mg/L，最佳优选浓度为0.19mg/L。

本技术方案中铂金二氧化硅纳米微球的引入在很大程度上解决了自然酶存在分离纯化难、合成成本高、耐酸碱性差等缺点。本发明中适配体的对于小分子的结合力强，空间位阻小，很适合对小分子进行检测。

优选地，制备所述四氧化三铁纳米微球捕获剂具体包括：

步骤20、取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育；反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应，适配体DNA链序列为：5'－GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTTCTCGTGCCCTTCGCTAG GCCC－3'得到的溶液用磁场洗涤获得四氧化三铁纳米微球捕获剂。

进一步，优选地，在所述步骤20中，所述的四氧化三铁纳米微球溶液浓度为1～1.6ⅹ10^-9mol/L，最优选为1ⅹ10^-9mol/L；所述的取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min，最优选为30min；戊二醛原液与四氧化三铁纳米微球溶液的体积比为1：5；所述的加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应时间至少为30min，最优选为30min。所述的反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA链的浓度为2.45nmol/ml；所述四氧化三铁纳米微球捕获剂的浓度为1～1.6ⅹ10^-9mol/L，最佳优选浓度为1ⅹ10^-9mol/L。

优选地，在所述步骤50之前还包括：

步骤30、制备铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂。

步骤31、将制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中，然后超声、加热得到产物；

步骤32、将所述产物反复用磁场清洗，分散到水中得到产物溶液；

步骤33、再将所述产物溶液滴入反应板的各个反应孔内，则得到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒。

与现有技术相比，本发明提供的一种可视化检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其检测方法具有以下有益效果：

1、该检测工艺具有灵敏、简单、便携、可实时检测的优点，不仅可以通过肉眼来完成目标物的定性检测，还能通过便携式分光光度计测试显色溶液的吸光值进行定量分析。

2、本发明中纳米酶也就是铂金二氧化硅纳米微球的引入在很大程度上解决了自然酶存在分离纯化难、合成成本高、耐酸碱性差等缺点。

3、试剂盒中采用磁力吸附可以有效改善非特异性吸附和吸附不牢靠，提高ELISA的检测性能。

4、本发明中适配体对小分子的结合力强，空间位阻小，很适合对小分子进行检测。

附图说明

下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。

图1为检测黄曲霉素试剂盒的原理图；

图2是不同浓度黄曲霉素B1的溶液颜色图片；

图3是不同浓度黄曲霉素B1的OD450值；

图4是将样品提取液在黄曲霉素B1的试剂盒中孵育时间与吸光度的柱状图。

图5是捕获DNA和信号标签反应时间与吸光度的柱状图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。

本发明黄曲霉毒素B1的试剂盒的检测通过以下手段对进行结构表征：采用马尔文Zeta电位粒径测定仪测定所制备样品的粒径；采用透射电镜观察所制备样品的孔径；采用酶标仪检测显色后溶液的吸光度和试剂盒灵敏度。

实施例1

本发明的快速检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，包括：

步骤30、制备铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂；

步骤31、取1mL粒径为900nm，浓度为0.19mg/L的铂金二氧化硅纳米微球信号标签和1mL粒径为400nm，浓度为1ⅹ10^-9mol/L的四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中20min后超声5min，后加热至95℃持续10min，得到产物；

步骤32、将步骤31反应所得的产物反复用磁场清洗，分散到2mL水中；

步骤33、将步骤32反应所得的产物溶液各取10μL滴入96孔反应板的各个反应孔内，则得到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒。

步骤50、取50μL上述样品提取液加入到上述试剂盒中，反应40min后所得的产物用磁场清洗3次，后加入50μLA液和50μLB液，室温反应10min后，加入50μL终止液显色。

用酶标仪检测溶液的吸光值。

本试剂盒显色原理，如图1所示，当没有黄曲霉素B1(AFB1)存在时，捕获DNA(AFB1aptamer)和互补DNA(cDNA)结合，从而引入铂金二氧化硅纳米微球信号标签(APS)催化A液(H₂O₂溶液)分解，导致B液(TMB)产生可溶性蓝色产物，此时的吸光值较高，记作A0；当待测物存在时，黄曲霉毒素B1(AFB1)会与适配体特异性结合，从而竞争cDNA导致APS脱落，被洗脱后，导致TMB产生可溶性蓝色产物较少，此时的吸光值较低，记作A1。当待测物浓度不断增大时，竞争cDNA会导致APS信号标签越多被清洗，TMB产生可溶性蓝色产物较少，因此显色后溶液的吸光值就越低。吸光值的改变量(ΔA＝A0-A1)和待测物浓度在一定范围内成正比例关系，通过该数量关系式可以对待测物进行定量检测，如图3所示。

实施例1的磁力清洗显色后溶液的吸光值结果如表1和图5所示，表明步骤31中铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应20min吸光值较高，表明两者结合数大。

实施例1的吸光值如表2所示，表明步骤50中，加入50μLA液和50μLB液后室温反应十分钟即存在明显的吸光值，可用于检测。

对照组1

步骤31中取1mL粒径为900nm，浓度为0.19mg/L的铂金二氧化硅纳米微球信号标签和1mL粒径为400nm，浓度为1ⅹ10^-9mol/L的四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应5～30min，其余步骤如实施例1，用酶标仪检测其磁力清洗显色后溶液的吸光值，实验结果的柱状图如图5，数值结果如表1所示：

表1

由表1可知，铂金二氧化硅纳米微球信号标签通过适配体与cDNA双链互补结合四氧化三铁纳米微球捕获剂的在20min时吸光值高，表明两者的结合数大，20min之后吸光值趋于平稳，故选取20min为最佳反应时间。

对照组2

步骤50中，所述的将样品提取液加入到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒中反应是指在室温下反应，反应时间为10～60min，其余步骤与实施例1相同，结果如图4所示。

由图4可知，反应时间在40～60min吸光度开始趋近于平稳，故此处选取40min为最佳反应时间。

对照组3

步骤50中，所述的加入所述A液和所述B液进行反应时间分别为20min，30min，40min后，其余步骤与实施例1相同，结果如表2所示。

时间	吸光值
		10min	0.342
20min	0.570
		30min	0.642
40min	0.879

表2

由表2可知，反应10min后存在明显吸光值可以用于检测，反应40min后吸光值在合理范围内，可以用于定量的检测，为此我们选取10～40min。

实施例2

制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签具体包括以下步骤：

步骤101、取1.04mL浓度为24mmol/L的四氯金酸，加入7.3535mg柠檬酸三钠后定容至100mL，在不断搅拌的条件下加入3mL冰浴过浓度为0.1mol/L的硼氢化钠溶液，搅拌10min后获得金纳米粒子，将金纳米粒子离心洗涤后分散在100mL水中备用。

步骤111、取68mg三乙胺加入25mL水，80℃下磁力搅拌0.5h后，加入368mg十六烷基三甲基溴化铵和92mg水杨酸80℃下反应1h后，加入4mL正硅酸乙酯80℃下反应1h后，取出冷却后离心清洗取沉淀，后加入25mL盐酸甲醇溶液，盐酸甲醇溶液体积比为1：10，在60℃下反应，后取出冷却后离心清洗取沉淀分散于25mL乙醇中；取其中5mL加入600μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷在室温下搅拌6h，后离心清洗取沉淀分散于30mL水中得氨基化二氧化硅纳米微球。

步骤121、取浓度为1ⅹ10^-9mol/L氨基化二氧化硅纳米微球1mL，加入6mL所述金纳米粒子溶液后，超声搅拌反应15min，得到红色的金二氧化硅纳米微球。

步骤131、将红色的金二氧化硅纳米微球离心洗涤后分散在8mL水中，在搅拌条件下加入200μL浓度为19.3mmol/L氯铂酸，搅拌15min后加入1mL现配冰浴过浓度为0.439mmol/L的硼氢化钠，反应所得的溶液离心洗涤获得铂金二氧化硅纳米微球，分散到1mL水中备用。

步骤141、取1mL戊二醛原液加入到5mL铂金二氧化硅纳米微球溶液中并在室温下孵育1h。将反应所得的戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液离心洗涤，分散到5mL水中；然后加入0.5mL浓度为5.1nmol/mL氨基化修饰的适配体DNA互补链并在室温下搅拌反应1h，适配体互补链序列为：5'－ACACGTGCCCAACAAAAAA－3'。将反应所得的溶液离心洗涤获得铂金二氧化硅纳米微球信号标签分散到5mL水中备用。

用马尔文Zeta电位粒径测定仪测定实施例2所制备的样品的粒径，用透射电镜观察实施例2所制备样品的孔径大小，结果如表3所示。

由表3可知，实施例2所制备的样品粒径200nm，孔径大。

对照组4

步骤111中取68mg三乙胺加入25mL水，80℃下磁力搅拌0.5h后，加入368mg十六烷基三甲基溴化铵和46mg水杨酸，其余操作步骤如实施例2。

另，步骤111中取68mg三乙胺加入25mL水，80℃下磁力搅拌0.5h后，加入368mg十六烷基三甲基溴化铵和184mg水杨酸，其余操作步骤如实施例2。

用马尔文Zeta电位粒径测定仪和透射电镜分别测得对照组所制备样品的粒径和孔径结果如表3所示。

表3

由表3可知，加入368mg十六烷基三甲基溴化铵和184mg水杨酸用于合成多孔二氧化硅孔径与其他时间相比相对较大，多孔二氧化硅用于负载纳米金及纳米铂，孔径越大意味着可以搭载更多的铂金纳米颗粒，使后续的显色效果更强，为此我们选取368mg十六烷基三甲基溴化铵和92mg水杨酸为最优工艺。

对照组5

步骤111中，加入4mL正硅酸乙酯80℃下分别反应1h，2h，3h后，其余步骤如实施例2，结果如表4所示。

时间	粒径	孔径大小
			1h	100nm	大
2h	200nm	大
			3h	400nm	大

表4

由表3可知，反应1h后多孔二氧化硅粒径最小，孔径与其他时间相比并无明显变化，多孔二氧化硅用于负载纳米金及纳米铂，粒径越小意味着检测体系越稳定，为此我们选取1h为最优工艺。

实施例3

步骤01、固体样品去皮粉碎，取5.0g样品，加入25.0mL甲醇水(7+3)溶液和20mL石油醚，振荡10分钟，用滤纸过滤于分液漏斗中，静置分层，然后放出下层甲醇水提取液，此液为所述固体样品的样品提取液。

步骤02、称取5.0g液体样品于25mL小烧杯中，用5mL蒸馏水将试样转移到125mL分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层，然后放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na₂SO₄的快速定性滤纸过滤于100mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水溶通风挥干；挥干冷却后，用5mL甲醇溶解得液体样品的样品提取液。

步骤03、用称量纸分别称取0.2g磷酸二氢钾，2.9g十二水合磷酸氢二钠，8.0g氯化钠和0.2g氯化钾，将称量的药品倒入烧杯中加水溶解，然后加入0.5mL吐温20，将配制的溶液转移至1L的容量瓶中，加蒸馏水定容后待用。

步骤04、用称量纸分别称取5.44g醋酸钠，0.64g柠檬酸溶于0.12mL浓度为30％的双氧水，再用双氧水定容至200mL。

步骤05、取0.06g3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶于0.6mL二甲基亚砜，后加入0.08g乙二胺四乙酸二钠，0.38g柠檬酸和20mL甘油，加蒸馏水定容至200mL。

步骤06、量取蒸馏水178.3mL于一试剂瓶中，缓慢加入21.7mL的浓硫酸(98％)，静置一段时间后超声混匀。

步骤50、取样品提取液加入到试剂盒中，反应10min后所得的产物用洗涤液进行磁场清洗3次后，加入50μLA液和50μLB液，室温反应10min后，加入50μL终止液。用黄曲霉素B1标准比色卡进行比对，得到待测样品黄曲霉素B1的含量或范围。

配制摩尔浓度分别为a)0ng/mL；b)1ng/mL；c)10ng/mL；d)50ng/mL；e)100ng/mL；f)500ng/mL；g)1000ng/mL和h)5000ng/mL的黄曲霉素B1标准溶液，然后加入到检测盒中，孵育30min后磁力洗涤，后加入50μLA液和50μLB液，室温反应10min后，加入50μL终止液。

检测结果溶液的颜色由图2所示，黄曲霉素B1的标准溶液摩尔浓度越高，溶液颜色越浅。

如图3所示，酶标仪检测结果表明吸光度和黄曲霉素B1浓度的对数值呈线性相关，检出下限为10ng。

实施例4

用四种不同公司所生产的ELISA试剂盒检测同一体积样品的黄曲霉素B1的含量，采用酶标仪测定试剂盒的灵敏度，其检测灵敏度如表4所示，结果表明本试剂盒的检测灵敏度最高。

表4

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，包括：

步骤50、将样品提取液加入到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒中反应后，所得的产物用洗涤液进行磁场清洗，然后加入A液和B液进行反应，再加入终止液停止反应；步骤51、用所述检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒中黄曲霉素B1标准比色卡进行比对，得到待测样品黄曲霉素B1的含量或范围值。

2.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于：

所述步骤50中，所述的将样品提取液加入到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒中反应是指在室温下反应，其反应时间为40～60min；所述的磁场清洗次数至少为3次；所述的加入所述A液和所述B液进行反应的反应时间为10～40min。

3.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，在所述步骤50之前还包括：

步骤011、将固体样品去皮粉碎，加入甲醇水溶液和石油醚，振荡，用滤纸过滤于分液漏斗中，静置分层，下层为固体样品的样品提取液；

或，

步骤021、称取液体样品于小烧杯中，用蒸馏水转移到分液漏斗中，加入三氯甲烷，加塞轻轻振摇，静置分层，然后放出下层三氯甲烷层，经盛有约预先用三氯甲烷湿润的无水Na₂SO₄的快速定性滤纸过滤于蒸发皿中，再加三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，水溶通风挥干；挥干冷却后，用甲醇溶解得液体样品的样品提取液。

4.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，在所述步骤50之前还包括：

步骤05、取3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶于二甲基亚砜，后加入乙二胺四乙酸二钠，柠檬酸和甘油，用超纯水或蒸馏水或去离子水定容得到所述B液；

5.如权利要求4所述的一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于：

在所述步骤03中，磷酸二氢钾在所述洗涤液中的质量体积比为0.2g/L；十二水合磷酸氢二钠在所述洗涤液中的质量体积比为2.9g/L；氯化钠在所述洗涤液中的质量体积比为8.0g/L；氯化钾在所述洗涤液中的质量体积比为0.2g/L；吐温20与所述洗涤液的体积比为1：2000；

6.如权利要求1～5中任意一项所述的一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，所述试剂盒包括：

盒子，装配在所述反应板底部；

磁铁，放置于所述盒子内部。

7.如权利要求6所述的一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签包括：

步骤10、将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后加入硼氢化钠溶液搅拌后获得金纳米粒子，将所述金纳米粒子离心洗涤后分散在水中，得到金纳米粒子溶液；

步骤11、将三乙胺加入水搅拌后，加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸，正硅酸乙酯反应后，再加入盐酸甲醇溶液反应，取以上配置而成的部分溶液加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌后得到氨基化二氧化硅纳米微球，将所述氨基化二氧化硅纳米微球离心清洗取沉淀后分散在水中，得到氨基化二氧化硅纳米微球溶液；

步骤12、将所述氨基化二氧化硅纳米微球加入所述金纳米粒子溶液，超声搅拌反应，得到红色的金二氧化硅纳米微球；

步骤13、将所述红色的金二氧化硅纳米微球离心洗涤后分散在水中，得到红色的金二氧化硅纳米微球溶液，在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液中加入氯铂酸后搅拌再加入硼氢化钠溶液反应，获得铂金二氧化硅纳米微球，分散到水中，得到铂金二氧化硅纳米微球溶液；

步骤14、取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液孵育，将反应所得的溶液离心洗涤，分散到水中，得到戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液，再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并搅拌，获得所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签。

8.如权利要求7所述的一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于：

在所述步骤10中，所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后所得的溶液中，四氯金酸的浓度为2.5ⅹ10^-2mmol/L，柠檬酸三钠的浓度为73.5mg/L；所述的加入硼氢化钠溶液与所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用水定容后所得的溶液与硼氢化钠溶液的体积比为3：100，并且该溶液中硼氢化钠的浓度为3ⅹ10^-3mol/L，所述的搅拌时间为10～15min；所述的金纳米粒子溶液的浓度为4～4.9mg/L；

在所述步骤11中，所述的将三乙胺加入水，所得的三乙胺水溶液浓度为2.7～2.76g/L，所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸与三乙胺的质量比为8：1～4：1.4～1.5，正硅酸乙酯、盐酸甲醇溶液、乙醇与三乙胺水溶液的体积比为4：25：4：25；所述的以上配置而成的部分溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为120：1，所述的在室温下搅拌的时间为5～6h；

其中，所述的将三乙胺加入水搅拌为磁力搅拌，温度为80℃，时间至少为0.5h；所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸，正硅酸乙酯反应温度为80℃，时间至少为1h；所述的盐酸甲醇溶液中盐酸：甲醇体积比为1：9～11，所述的加入盐酸甲醇溶液的反应温度为60～80℃；所述的氨基化二氧化硅纳米微球溶液的浓度为86～100mg/L；

在所述步骤12中，氨基化二氧化硅纳米微球与所述金纳米粒子溶液体积比小于1：5；所述超声搅拌反应时间至少为10min；

在所述步骤13中，所述的红色的金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为19.4mg/L，所述的在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液溶液中加入氯铂酸后所得到的溶液中，氯铂酸的浓度为0.47mol/L，所述的加入硼氢化钠溶液后所得的溶液中，硼氢化钠的浓度为4.8ⅹ10^- ⁵mol/L，所述铂金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为18.2～31.2mg/L；

所述的加入氯铂酸搅拌的时间至少为10min；

在所述步骤14中，戊二醛原液和所述铂金二氧化硅纳米微球溶液体积比为1：5；所述的取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min；所述的戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA互补链的浓度为0.46～0.60nmol/mL；

所述的加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并在室温下搅拌反应时间至少为30min；所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签的浓度为0.19～0.30mg/L。

9.如权利要求6所述的一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，制备所述四氧化三铁纳米微球捕获剂具体包括：

步骤20、取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育；反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应，得到的溶液用磁场洗涤获得所述四氧化三铁纳米微球捕获剂。

10.如权利要求9所述的一种检测黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于：

在所述步骤20中，所述的四氧化三铁纳米微球溶液浓度为10^-9mol/L；所述的取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min；戊二醛原液与四氧化三铁纳米微球溶液的体积比为1：5；所述的加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应时间至少为30min；所述的反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA链的浓度为2.45nmol/ml；所述四氧化三铁纳米微球捕获剂的浓度为1～1.6ⅹ10^-9mol/L。