CN114539600B - 一种高耐压三级结构的琼脂糖微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高耐压三级结构的琼脂糖微球及其制备方法，属于琼脂糖微球技术领域。本发明所述的三级结构的琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤，首先向改性的琼脂糖中加入致孔剂后先加热至90‑100℃、再降温至65‑75℃，得到水相；然后在保护气氛下，向所述的水相中加入油相材料、乳化剂、引发剂1000‑1400rpm搅拌反应20‑28h，后进行降温100‑120rpm搅拌3‑7min，得到改性琼脂糖微球；最后在碱性条件下，向所述的改性琼脂糖微球的溶液中加入交联剂，45‑65℃反应22‑32h，得到所述三级结构的琼脂糖微球。本发明所述的三级结构的琼脂糖微球有利于目标分子快速渗透琼脂糖微球，比以往琼脂糖微球具有更快的渗透速率。

Description

一种高耐压三级结构的琼脂糖微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及琼脂糖微球技术领域，尤其涉及一种高耐压三级结构的琼脂糖微球及其制备方法。
背景技术
琼脂糖Agarose是由1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链构成，琼脂糖微球是一种内部为空心网状结构的微米级球体，主要用于分离纯化病毒、蛋白质、酶、多肽等大分子生物活性物质，应用于生物医药、血液制品、疫苗、化妆品及保健品等行业，主要以大型的生物医药、血液制品和疫苗企业为主，在中小企业和科研院校等单位也有广泛的应用。琼脂糖微球由于其原材料的选择和成球工艺，技术要求高，工艺复杂，所以国内掌握核心成球技术的仅数家。目前琼脂糖微球在纯化免疫球蛋白IgG滞留时间长，耐压能力只有0.3Mpa问题。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中IgG滞留时间长，耐压能力低的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高耐压三级结构的琼脂糖微球及其制备方法。
本发明的第一个目的是提供一种三级结构的琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤，
S1、向改性的琼脂糖中加入致孔剂后先加热至90-100℃、再降温至65-75℃，得到水相；
S2、保护气氛下，向S1步骤所述的水相中加入油相材料、乳化剂和引发剂，1000-1400rpm搅拌反应20-28h，后进行降温100-120rpm搅拌3-7min，得到改性琼脂糖微球；
S3、碱性条件下，向S2步骤所述的改性琼脂糖微球的溶液中加入交联剂，45-65℃反应22-32h，得到所述三级结构的琼脂糖微球。
在本发明的一个实施例中，在S1步骤中，所述改性的琼脂糖的制备过程为：将琼脂糖的水溶液2-4次升温和降温，后降温至45-65℃加入功能单体和碱，150-300rpm搅拌6-10h，冷却分层，得到改性的琼脂糖；所述功能单体为甲基丙烯酸缩水甘油醚和/或乙烯基缩水甘油醚。琼脂糖是生物分离纯化过程中最常用的材料，虽然其具有良好的生物兼容性，但是在用于分离纯化柱时，面临高压环境条件下多次洗涤冲洗下其容易产生形变，甚至产生破裂，不利于纯化效果。因此对琼脂糖表面改性以提高其抗压能力非常重要。
在本发明的一个实施例中，在S1步骤中，所述致孔剂为聚乙二醇；所述聚乙二醇的分子量为10000-50000。
在本发明的一个实施例中，在S1步骤中，所述改性的琼脂糖和致孔剂的质量比为10：0.8-1.2。
在本发明的一个实施例中，在S2步骤中，所述油相材料为石蜡油、环己烷、植物油和正庚烷中的一种或多种；所述乳化剂为司班80、司班85、吐温20、吐温60和吐温80中的一种或多种；所述引发剂为过硫酸钾、过硫酸铵和偶氮二异丁脒盐酸盐中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，在S2步骤中，所述水相、油相材料、乳化剂和引发剂的质量比为10：28-32：0.8-1.2：0.1-0.3。
在本发明的一个实施例中，在S2步骤中，所述降温的速率为4-6℃/min；所述降温是降温至20-30℃。迅速降温为了保证琼脂糖可以形成凝胶，更有利于形成凝胶微球，可用于填充柱。
在本发明的一个实施例中，在S2步骤中，所述保护气氛的气体为氮气或氩气。
在本发明的一个实施例中，在S3步骤中，所述交联剂为1,4-二溴丙醇、环氧氯丙烷和环氧溴丙烷中的一种或多种。利用交联剂较长的有机物链对琼脂糖的空间结构进行稳定。
在本发明的一个实施例中，在S3步骤中，所述改性琼脂糖微球和交联剂的质量比为5：1.5-2.5。
本发明的第二个目的是提供一种所述的制备方法得到的三级结构的琼脂糖微球。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的改性的琼脂糖聚合后具有超强的刚性，可耐压3Mpa，聚合后的改性的琼脂糖微球的孔径在100nm左右(一级结构)。经降温凝固后改性的琼脂糖微球内部形成的孔径约6μm(二级结构)。改性的琼脂糖微球进一步交联形成的孔径约3-4μm(三级结构)。
(2)本发明所述的三级结构的琼脂糖微球有利于目标分子快速渗透琼脂糖微球，样品首先快速进入微球与微球之间的空隙，迅速扩散进入6μm的大孔，再进入3-4μm的中孔，最后进入100nm左右的小孔，比以往琼脂糖微球具有更快的渗透速率。
(3)本发明所述的三级结构的琼脂糖微球的基质具有更高和更强的刚性，使微球的刚性从原来的0.3Mpa升高到3Mpa，比原来的单纯交联琼脂糖强度提高10倍左右。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明测试例1的琼脂糖微球的电镜图。
图2为本发明测试例1的琼脂糖微球的显微镜图。
图3为本发明测试例2的不同流速下琼脂糖微球的耐压值。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
一种高耐压三级结构的琼脂糖微球及其制备方法，具体包括以下步骤：
(1)改性琼脂糖的制备：4.8g琼脂糖加入120g水，放入磁力搅拌器煮沸100℃，沸腾1min，取下冷却3min，再放入磁力搅拌器，沸腾1min，再取下瓶子，再冷却3min，再放入磁力搅拌器，沸腾1min，得到4％琼脂糖水溶液。取4％琼脂糖水溶液10mL，趁热加入到50℃的烧瓶中，然后将50℃的5g的甲基丙烯酸缩水甘油醚加入到烧瓶中，加入预先预热50℃的300μL45％NaOH溶液，机械搅拌转速200rpm，搅拌反应8h，待反应静置冷却分层，去掉上层透明溶液，得到固态甲基丙烯酸缩水甘油醚改性琼脂糖，聚合后的改性的琼脂糖微球的孔径在100nm左右。
(2)改性琼脂糖微球的制备：取上述甲基丙烯酸缩水甘油醚改性的琼脂糖10g加入0.9g聚乙二醇10000，0.3g氯化钾，加热至100℃得到4％的溶胶溶液，降温至70℃，倒入已搅拌30min的70℃的油相材料石蜡油30g，乳化剂司班851g的混合液中，1200rpm搅拌10min，同时加入引发剂KPS 0.2g，N2氛围反应24h，反应结束后，以5℃/min的速率迅速降温至25℃，同时转速降至110rpm，继续搅拌5min，得到甲基丙烯酸缩水甘油醚改性的琼脂糖微球，用乙醇和水交替抽滤冲洗，将微球洗净，经降温凝固后改性的琼脂糖微球内部形成的孔径约6μm。
(3)三级结构的琼脂糖微球的制备：取上述甲基丙烯酸缩水甘油醚改性的琼脂糖微球20g，加入10mL水，以33μL/min的速率加入2g 1,4-二溴丙醇和120μL/min 35％NaOH，40℃滴加，滴加完毕后继续反应24h，醇和水交替抽滤得到三级结构的琼脂糖微球，改性的琼脂糖微球进一步交联形成的孔径约3-4μm。
实施例2
一种高耐压三级结构的琼脂糖微球及其制备方法，具体包括以下步骤：
(1)改性琼脂糖的制备：4.8g琼脂糖加入120g水，放入磁力搅拌器煮沸100℃，沸腾1min，取下冷却3min，再放入磁力搅拌器，沸腾1min，再取下瓶子，再冷却3min，再放入磁力搅拌器，沸腾1min，得到4％琼脂糖水溶液。取4％琼脂糖水溶液10mL，趁热加入到50℃的烧瓶中，然后将50℃的5g的乙烯基缩水甘油醚加入到烧瓶中，加入预先预热50℃的300μL45％NaOH溶液，机械搅拌转速200rpm，搅拌反应8h，待反应静置冷却分层，去掉上层透明溶液，得到固态乙烯基缩水甘油醚改性琼脂糖，聚合后的改性的琼脂糖微球的孔径在100nm左右。
(2)改性琼脂糖微球的制备：取上述乙烯基缩水甘油醚改性的琼脂糖10g加入0.9g聚乙二醇10000，0.3g氯化钾，加热至100℃得到4％的溶胶溶液，降温至70℃，倒入已搅拌30min的70℃的油相材料环己烷30g，乳化剂吐温20 1g的混合液中，1200rpm搅拌10min，同时加入引发剂过硫酸铵0.2g，N2氛围反应24h，反应结束后，以5℃/min的速率迅速降温至25℃，同时转速降至110rpm，继续搅拌5min，得到乙烯基缩水甘油醚改性的琼脂糖微球，用乙醇和水交替抽滤冲洗，将微球洗净，经降温凝固后改性的琼脂糖微球内部形成的孔径约6μm。
(3)三级结构的琼脂糖微球的制备：取上述乙烯基缩水甘油醚改性的琼脂糖微球20g，加入10mL水，以33μL/min的速率加入2g环氧氯丙烷和120μL/min35％NaOH，40℃滴加，滴加完毕后继续反应24h，醇和水交替抽滤得到三级结构的琼脂糖微球，改性的琼脂糖微球进一步交联形成的孔径约3-4μm。
实施例3
一种高耐压三级结构的琼脂糖微球及其制备方法，具体包括以下步骤：
(1)改性琼脂糖的制备：4.8g琼脂糖加入120g水，放入磁力搅拌器煮沸100℃，沸腾1min，取下冷却3min，再放入磁力搅拌器，沸腾1min，再取下瓶子，再冷却3min，再放入磁力搅拌器，沸腾1min，得到4％琼脂糖水溶液。取4％琼脂糖水溶液10mL，趁热加入到50℃的烧瓶中，然后将50℃的5g的乙烯基缩水甘油醚加入到烧瓶中，加入预先预热50℃的300μL45％NaOH溶液，机械搅拌转速200rpm，搅拌反应8h，待反应静置冷却分层，去掉上层透明溶液，得到固态乙烯基缩水甘油醚改性琼脂糖，聚合后的改性的琼脂糖微球的孔径在100nm左右。
(2)改性琼脂糖微球的制备：取上述乙烯基缩水甘油醚改性的琼脂糖10g加入0.9g聚乙二醇10000，0.3g氯化钾，加热至100℃得到4％的溶胶溶液，降温至70℃，倒入已搅拌30min的70℃的油相材料正庚烷30g，乳化剂吐温80 1g的混合液中，1200rpm搅拌10min，同时加入引发剂偶氮二异丁脒盐酸盐0.2g，N2氛围反应24h，反应结束后，以5℃/min的速率迅速降温至25℃，同时转速降至110rpm，继续搅拌5min，得到乙烯基缩水甘油醚改性的琼脂糖微球，用乙醇和水交替抽滤冲洗，将微球洗净，经降温凝固后改性的琼脂糖微球内部形成的孔径约6μm。
(3)三级结构的琼脂糖微球的制备：取上述乙烯基缩水甘油醚改性的琼脂糖微球20g，加入10mL水，以33μL/min的速率加入2g环氧溴丙烷和120μL/min35％NaOH，40℃滴加，滴加完毕后继续反应24h，醇和水交替抽滤得到三级结构的琼脂糖微球，改性的琼脂糖微球进一步交联形成的孔径约3-4μm。
测试例1
对实施例1制备的三级结构的琼脂糖微球进行电镜测试和显微镜观测，结果如图1-2所示。从图1可以看出微球的形貌为球形且表面多突起结构是琼脂糖折叠形成的微结构。从图2可以看出在光学显微镜下琼脂糖微球的总体形貌，形貌基本均一，琼脂糖微球的总体大小在40-50μm之间。
测试例2
对实施例1制得的三级结构的琼脂糖微球和空柱、市购的琼脂糖微球进行耐压性能进行检测，以空柱为参照，取琼脂糖微球2.0g装2.5mL金属柱，不同流速下纯水测柱压，结果如表1所示：
表1不同流速下的琼脂糖微球耐压值(MPa)
流速 空柱 市购 实施例1
1mL/min 0 0.38 0
2mL/min 0.19 0.85 0.21
3mL/min 0.45 0.13 0.45
4mL/min 0.78 0.18 0.75
5mL/min 1.11 0.21 1.04
6mL/min 1.43 0.25 1.37
7mL/min 1.74 0.30 1.69
8mL/min 2.05 3.39 2.00
9mL/min 2.31 3.91 2.35
10mL/min 2.64 自动断连 2.99
11mL/min 自动断连 - 自动断连
通过不同流速的纯水测试琼脂糖微球住的耐压值，从表1和图1中可以看出，随着流速增加，柱内压力迅速升高，当流速达到10mL/min时，本实验中纯水在改性的琼脂糖柱中仍然持续流出，此时的压力达到2.99Mpa，其整体趋势与空柱压力保持一致，而对比市购琼脂糖微球，当流速在8mL/min时，柱内压力迅速升高，之后超过9mL/min时出现断流情况，说明微球出现破损，溶液在柱内堵住，无法流出。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种三级结构的琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1、向改性的琼脂糖中加入致孔剂后先加热至90-100℃、再降温至65-75℃，得到水相；所述改性的琼脂糖的制备过程为：将琼脂糖的水溶液2-4次升温和降温，后降温至45-65℃加入功能单体和碱，150-300rpm搅拌6-10h，冷却分层，得到改性的琼脂糖；所述功能单体为甲基丙烯酸缩水甘油醚和/或乙烯基缩水甘油醚；
S2、保护气氛下，向S1步骤所述的水相中加入油相材料、乳化剂和引发剂，1000-1400rpm搅拌反应20-28h，后进行降温100-120rpm搅拌3-7min，得到改性琼脂糖微球；
S3、碱性条件下，向S2步骤所述的改性琼脂糖微球的溶液中加入交联剂，45-65℃反应22-32h，得到所述三级结构的琼脂糖微球。
2.根据权利要求1所述的三级结构的琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，在S1步骤中，所述致孔剂为聚乙二醇；所述聚乙二醇的分子量为10000-50000。
3.根据权利要求1所述的三级结构的琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，在S1步骤中，所述改性的琼脂糖和致孔剂的质量比为10：0.8-1.2。
4.根据权利要求1所述的三级结构的琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，在S2步骤中，所述油相材料为石蜡油、环己烷、植物油和正庚烷中的一种或多种；所述乳化剂为司班80、司班85、吐温20、吐温60和吐温80中的一种或多种；所述引发剂为过硫酸钾、过硫酸铵和偶氮二异丁脒盐酸盐中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的三级结构的琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，在S2步骤中，所述水相、油相材料、乳化剂和引发剂的质量比为10：28-32：0.8-1.2：0.1-0.3。
6.根据权利要求1所述的三级结构的琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，在S2步骤中，所述降温的速率为4-6℃/min；所述降温是降温至20-30℃。
7.根据权利要求1所述的三级结构的琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，在S3步骤中，所述交联剂为1,4-二溴丙醇、环氧氯丙烷和环氧溴丙烷中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的三级结构的琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，在S3步骤中，所述改性琼脂糖微球和交联剂的质量比为5：1.5-2.5。
9.一种权利要求1-8任一项所述的制备方法得到的三级结构的琼脂糖微球。
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