CN116063726B - 一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球、制备方法及应用 - Google Patents

一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球、制备方法及应用，本发明基于液液分散理论，立足于底层技术的创新，提出用粘度较低的醋酸纤维素溶液制备高性能的纤维素多孔凝胶微球。本发明绿色环保，对设备要求低，成本低廉，容易扩大生产应用；使用低粘度的醋酸纤维素为原料，制得的纤维素多孔凝胶微球球形度高、粒径均一、微球孔径适中、机械强度高、压力/流速性能优异，适用于各种配基的修饰，修饰后适用于各种生物大分子各种模式的分离纯化。本发明可以与与琼脂糖多孔凝胶微球竞争，在层析中可以实现生物大分子的高效分离。

Description

一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球、制备方法及应用
技术领域
本发明属于微球制备技术领域，涉及层析介质，尤其是涉及一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球、制备方法及应用。
背景技术
层析技术由于具有分离精度高、分离条件温和、操作简单且重复性高等特点，已成为大规模生物产品生产过程中最常用的一种分离纯化手段。层析介质则是生物分离的核心基础材料。基于琼脂糖、纤维素等天然高分子的多孔凝胶微球因溶出物少、生物安全性高、功能配基修饰容易和非特异性吸附弱等特点，是工业上使用最广泛的生物分离用层析介质。琼脂糖用于制备多孔凝胶微球的优势在于水溶性好、凝胶化温度适宜、凝胶强度大和孔结构易调，目前琼脂糖多孔凝胶微球在市场中占据主导地位。
与琼脂糖相比，纤维素原料的价格低，纤维素分子链可形成结晶结构，骨架强度更高。1990年代以来出现了N-甲基吗啉氧化物、离子液体和碱/脲溶液为代表的新型溶剂，纤维素的溶解问题得到一定程度的解决。近年来纤维素多孔凝胶微球的发展速度快于琼脂糖多孔凝胶微球，WO1999031141A2、WO2012033223A1和WO2017141910A1等专利公开了基于上述新型纤维素溶剂的多孔凝胶微球制备方法，避免了早期用到的硫氰酸盐、二硫化碳等毒性溶剂，纤维素多孔凝胶微球得到了较大的发展，但是，仍存在体系粘度大、溶剂价格昂贵、设备要求高、所得微球球形度差等挑战。
相较纤维素，纤维素衍生物因可选择的溶剂选择更广，也可作为纤维素多孔凝胶微球的原料。WO2016013568A1、WO2015029790A1等专利公开了以醋酸纤维素为原料制备纤维素多孔凝胶微球的方法，但是，所得微球很难同时满足均一的粒径、高刚性、高流速和高载量等生物分离的新要求。
发明内容
本发明第一个目的在于，针对上述存在的不足，提供一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法。
为此，本发明的上述目的通过如下技术方案实现：
一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：
S1、将醋酸纤维素溶解在有机溶剂-水的混合溶剂中作为水相：
将7～14份醋酸纤维素溶解于100份的有机溶剂-水的混合溶剂形成粘度适中的醋酸纤维素溶液，溶解温度在60～90℃，以满足在溶解温度下溶解醋酸纤维素且降温后能够形成半固体状物质；所述有机溶剂为醋酸纤维素的良溶剂，且可以与水互溶。
S2、反相乳化法制备醋酸纤维素凝胶微球：
将溶解醋酸纤维素的水相倒入加热至60～90℃的油相中，机械搅拌乳化(优选为搅拌乳化10～30分钟)，使得水相被分散成所需粒径的液滴，降温(优选为降低至20℃以下)乳液使水相液滴形成半固状物质，经过清洗后得到醋酸纤维素凝胶微球；
所述油相为包含惰性溶剂和乳化剂，所述惰性溶剂与步骤S1中有机溶剂、水不互溶；
所述乳化剂为非离子型表面活性剂；所述乳化剂为HLB值在3～8的单一乳化剂或者复配乳化剂，油相中乳化剂与惰性溶剂的比例为0.1～5w/v％，水相和油相的体积比为1：(2～5)；
S3、醋酸纤维素凝胶微球的皂化与交联：
在碱性条件下将醋酸纤维素凝胶微球皂化成纤维素凝胶微球，并用环氧氯丙烷交联，环氧氯丙烷的体积用量为微球体积的1～20％，得到交联的纤维素多孔凝胶微球。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：
作为本发明的一种优选技术方案：所述醋酸纤维素的取代度优选为0.5～2.5，醋酸纤维素形成溶液后，可以通过加入己二胺等碱性物质调节醋酸纤维素的取代度和分子量。
作为本发明的一种优选技术方案：所述有机溶剂-水的混合溶剂中有机溶剂为丙酮、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。
作为本发明的一种优选技术方案：所述惰性溶剂为环己烷或者液体石蜡中的至少一种。
作为本发明的一种优选技术方案：所述乳化剂为司班85、司班80、司班60中的至少一种。
作为本发明的一种优选技术方案：所述乳化剂以吐温80调节HLB。
作为本发明的一种优选技术方案：油相中乳化剂与惰性溶剂的比例优选为0.1～1w/v％。
作为本发明的一种优选技术方案：所述环氧氯丙烷的体积用量优选为纤维素多孔凝胶体积的5～15％。
作为本发明的一种优选技术方案：步骤S3中，添加NaOH实现碱性条件。
本发明第二个目的在于，提供一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球，所述粒径均一的纤维素多孔凝胶微球由前文所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法所制备得到。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：
作为本发明的一种优选技术方案：所述醋酸纤维素中存在结晶结构，且结晶结构为纤维素Ⅱ型。
本发明第三个目的在于，提供一种具有粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的层析介质，所述层析介质由前文所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球经配基修饰得到。
本发明还有一个目的在于，提供前文所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球在生物大分子分离纯化方面的应用，将前文所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球经配基修饰后，作为层析介质，用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化。
所述生物大分子的分离纯化的模式并无特别限制，可为亲和、疏水相互作用、离子交换、凝胶过滤和混合模式等常见的层析方式。
本发明提供一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球、制备方法及应用，本发明基于液液分散理论，立足于底层技术的创新，提出用粘度较低的醋酸纤维素溶液制备高性能的纤维素多孔凝胶微球，本发明所得到的纤维素多孔凝胶微球接近正球型，粒径为45～165μm，粒径分布系数Span值小于0.90；纤维素多孔凝胶微球呈多孔状，孔隙率大于90％，以分子量为102K的葡聚糖作为标记物的凝胶分配系数为0.35～0.55，固含量为5～12％；纤维素多孔凝胶微球的耐压大于0.2MPa，最大稳定流速大于1500cm/h。本发明绿色环保，对设备要求低，成本低廉，容易扩大生产应用；使用低粘度的醋酸纤维素为原料，制得的纤维素多孔凝胶微球球形度高、粒径均一、微球孔径适中、机械强度高、压力/流速性能优异，适用于各种配基的修饰，修饰后适用于各种生物大分子各种模式的分离纯化。本发明可以与与琼脂糖多孔凝胶微球竞争，在层析中可以实现生物大分子的高效分离。
附图说明
图1为本发明所提供的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的显微镜照片。
图2为本发明所提供的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的粒径分布图。
图3为本发明所提供的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的压力/流速特性曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的关键原料是醋酸纤维素，而醋酸纤维素溶液的粘度是控制所得纤维素多孔凝胶微球粒径均一性的重要影响因素，控制醋酸纤维素溶液粘度的简单方式为控制醋酸纤维素的用量和分子量，分子量通过加入碱性物质(例如：采用己二胺)来调节。
以下实施例中，醋酸纤维素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为C106244，取代度为2.5，通过加入己二胺来实现取代度和分子量的调节。
实施例1
粒径均一的纤维素多孔凝胶微球方法，包括如下步骤：
S1、将醋酸纤维素溶解在有机溶剂-水的混合溶剂中作为水相：
称取10.0g醋酸纤维素溶于30.0g二甲基亚砜中，搅拌下升温至80℃，向溶液中滴加14.0g浓度为30％的己二胺水溶液，搅拌120min后加入54.0g水，继续搅拌30min备用，同时降低醋酸纤维素的取代度和分子量，使得水相适合用于反相乳化；
S2、反相乳化法制备醋酸纤维素凝胶微球：
在500mL三口圆底烧瓶中加入0.2g司班80乳化剂，200ml液体石蜡，加热至80℃，作为油相备用。将步骤1中的水相加入到油相中进行乳化，乳化转速为500rpm，乳化温度为80℃，乳化时间20min，乳化结束后按2℃/min的速度将乳液降至20℃以下形成凝胶微球，清洗后得50mL凝胶微球。
S3、醋酸纤维素凝胶微球的皂化与交联：
向步骤S2中的微球加入乙醇，使乙醇的体积占比为40％，滴加200ml含0.4％的NaOH的乙醇水溶液，15℃下皂化过夜，清洗后得到纤维素微球；取50.0g纤维素微球，依次加入37.5mL浓度为2.5M的Na2SO4、1.0mL质量分数为45％的NaOH和0.075g的NaBH4，50℃下搅拌1h后，每隔15min加入0.6mL质量分数为45％的NaOH和0.625mL环氧氯丙烷，共滴加8次。滴加完毕后，升温至60℃，继续反应16h，结束后用去离子水清洗得交联的纤维素多孔凝胶微球。
纤维素多孔凝胶微球的粒径测试
用欧美克LS-POP(9)型激光粒度仪测试所得交联的纤维素多孔凝胶微球的粒径及其分布。所得参数有D10、D50、D90和粒径分布系数Span值，其中D10、D50、D90分布表示小于该直径的所有微球体积占全部微球总体积的10％、50％和90％，粒径分布系数则为 以D50代表微球的平均粒径，Span值代表粒径分布的均一性，在本发明中Span值大于1.50定义为粒径分布宽，粒径分布的均一性差，Span值在1.20～1.50定义为粒径分布较宽，Span值在0.90～1.20定义为粒径分布较窄，Span值小于0.90定义为粒径分布窄粒径分布的均一性好。
纤维素多孔凝胶微球的固含量测试
将10g左右的湿球置于重力柱中滤干，准确称取3g左右的湿球于105℃烘箱中干燥至质量恒重，干燥之后的质量与湿球质量之比即为固含量。
纤维素多孔凝胶微球的压力/流速特性测试
仪器：SCG-100蛋白层析系统蛋白纯化仪
层析柱：cytiva Tricorn 10/100Column
流动相：纯水
测试：将8mL交联的纤维素多孔凝胶微球装于上述层析柱，流速从0.5mL/min开始，检测压力；每隔5min逐步升高流速，直到系统压力急剧升高至3MPa，表明样品坍塌，流速无法继续升高，结束测试。流速的升高顺序依次为0.5、1.0、1.5、2.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0……66.0mL/min。体积流速转化成线速度：V＝(60×V_v)/S，V为线速度(cm/h)，V_v为体积流速(mL/min)，S为层析柱横截面积0.785cm2。压力急剧上升前最后一段压力稳定的流速和柱压定义为多孔凝胶微球的最大流速和耐压。
纤维素多孔凝胶微球的凝胶分配系数Kav测试
仪器：SCG-100蛋白层析系统蛋白纯化仪
层析柱：Cytiva Tricorn 10/200Column
流动相：纯水，0.8mL/min
进样：将交联纤维素多孔凝胶微球装柱后，依次进样20μL浓度为3mg/mL蓝色葡聚糖、10mg/mL分子量为102K的葡聚糖标准品、8mg/mL分子量为64K的葡聚糖标准品、8mg/mL分子量为13K的葡聚糖标准品、2％丙酮。不同分子量葡聚糖的Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)，式中Ve不同分子量葡聚糖标准品的保留体积(ml)，Vt为丙酮的保留体积(ml)，V0为蓝色葡聚糖的保留体积(ml)。
实施例1所得交联纤维素多孔凝胶微球未经筛分的D10、D50、D90分别为38μm、72μm、112μm，Span值为1.03。经过筛分后的D10、D50、D90分别为51μm、85μm、120μm，Span值为0.81，显微镜照片如图1所示，粒径分布如图2所示。微球的固含量为8.0％。经过筛分后，微球的最大流速为1070cm/h，耐压为0.16MPa，压力/流速特性曲线如图3所示。分子量为102K、64K、13K的葡聚糖的Kav值分别为0.45、0.53、0.81。
实施例2
纤维素多孔凝胶微球的制备，将实施例1中步骤1改为如下条件，步骤2中乳化转速改为400rpm，其余步骤中试剂用量按比例改变，温度、反应时间等实验条件不变；
S1、将醋酸纤维素溶解在有机溶剂-水的混合溶剂中作为水相：
称取4.0g乙酰基含量为40％的醋酸纤维素溶于15.0g二甲基亚砜中，搅拌下升温至80℃，向溶液中滴加6.0g浓度为30％的己二胺水溶液，搅拌120min后加入29.0g水，继续搅拌30min备用，同时降低醋酸纤维素的取代度和分子量，使得水相适合用于反相乳化。
实施例2所得交联纤维素多孔凝胶微球未经筛分的D10、D50、D90分别为40μm、81μm、133μm，Span值为1.15。实施例2所得到的交联纤维素多孔凝胶微球强度较弱，不适合压力/流速测试。
实施例3
纤维素多孔凝胶微球的制备，将实施例1中步骤1改为如下条件，步骤2中乳化转速改为440rpm，其余条件不变：
S1、将醋酸纤维素溶解在有机溶剂-水的混合溶剂中作为水相：
称取11.0g乙酰基含量为40％的醋酸纤维素溶于30.0g二甲基亚砜中，搅拌下升温至80℃，向溶液中滴加14.0g浓度为30％的己二胺水溶液，搅拌60min后加入水，继续搅拌30min，同时降低醋酸纤维素的取代度和分子量，使得水相适合用于反相乳化。
实施例3所得交联纤维素多孔凝胶微球未经筛分的D10、D50、D90分别为62μm、102μm、155μm，Span值为0.92，无需筛分；微球的固含量为8.8％，微球的最大流速为1700cm/h，耐压为0.26MPa，压力流速曲线如图3所示。
实施例4
纤维素多孔凝胶微球的制备，将实施例1中步骤1改为如下条件，步骤2中乳化转速改为440rpm，其余条件不变：
S1、将醋酸纤维素溶解在有机溶剂-水的混合溶剂中作为水相：
称取12.0g乙酰基含量为40％的醋酸纤维素溶于30.0g二甲基亚砜中，搅拌下升温至80℃，向溶液中滴加14.0g浓度为30％的己二胺水溶液，搅拌60min后加入水，继续搅拌30min，同时降低醋酸纤维素的取代度和分子量，使得水相适合用于反相乳化。
实施例4所得交联纤维素多孔凝胶微球未经筛分的D10、D50、D90分别为81μm、134μm、210μm，Span值为0.96。经过筛分后的D10、D50、D90分别为68μm、106μm、152μm，Span值为0.79。微球的固含量为9.0％。经过筛分后，微球的最大流速为2000cm/h，耐压为0.29MPa，压力流速曲线如图3所示。分子量为102K、64K、13K的葡聚糖的Kav值分别为0.47、0.55、0.83。
实施例5
纤维素多孔凝胶微球的制备，将实施例3中步骤2的油相改为160mL液体石蜡和40mL环己烷的混合溶剂，乳化转速改为560rpm，其余条件不变。
实施例5所得交联纤维素多孔凝胶微球未经筛分的D10、D50、D90分别为52μm、93μm、147μm，Span值为1.02。
实施例6
纤维素多孔凝胶微球的应用，将实施例1所得交联纤维素微球进行镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)配基修饰，作为亲和层析介质，包括如下步骤：
1)、烯丙基化修饰。称取10g重力柱中滤干的交联纤维素多孔凝胶微球，加入3mL浓度为2.5mol/L的Na2SO4溶液，2mL浓度为30wt％的NaOH溶液，25mg NaBH4，45℃搅拌下缓慢加入2.5mL烯丙基缩水甘油醚，反应16小时。
2)、溴水活化。在烯丙基修饰的纤维素多孔凝胶微球中加入3.5mL纯化水，2.0g醋酸钠，常温搅拌下逐滴加入新制溴水进行活化，直至1min内黄色不退去，再加入0.04g甲酸钠除去剩余的溴水。
3)、IDA修饰及Ni负载。在溴化后产物中加入10mL亚氨基二乙酸钠溶液(15wt％，用50％NaOH溶液调节pH＝11.5)，50℃条件下反应18小时。IDA修饰后，用50mmol/L的NiSO4溶液将Ni负载在琼脂糖/纤维素纳米复合多孔凝胶微球中，得到配基为Ni-IDA的层析介质。
Ni-IDA层析介质的动态结合载量测试
仪器：AKTA explorer 100蛋白纯化系统
层析柱：cytiva Tricorn 5/100Column
装柱：取2.0mL的Ni-IDA层析介质装于上述层析柱中，用缓冲液A平衡3CV(柱体积)，用2mg/mL带His标签的蛋白A溶液上样(0.33mL/min)，达到10％流穿时停止上样，用缓冲液A平衡3CV后，用缓冲液B洗脱。按以下公式计算动态结合载量为：DBC10％＝(V10％-V0)C0/Vc，V10％为10％流穿时的上样体积，V0为检测系统管路死体积(2.33ml)，Vc为柱内微球体积(2.0ml)。
缓冲液A的组成为16.2mmol/L的十二水合磷酸氢二钠、3.8mmol/L的二水磷酸二氢钠、20mmol/L的氯化钠，pH＝7.4。
缓冲液B的组成为16.2mmol/L的十二水合磷酸氢二钠、3.8mmol/L的二水磷酸二氢钠、20mmol/L的氯化钠、500mmol/L的咪唑，pH＝7.6。
实施例6中纤维素多孔凝胶微球经Ni-IDA修饰后，其蛋白A的动态结合载量为43.1mg/mL。
实施例7
纤维素多孔凝胶微球的应用，将实施例3所得交联纤维素微球进行2-乙氨基氯乙烷(DEAE)配基修饰，作为离子交换层析介质，包括如下步骤：
称取10g重力柱中滤干的交联纤维素多孔凝胶微球，加入4.0g浓度为6M的NaOH溶液，在摇床50℃下震荡活化1h后，加入6.0ml浓度为3M的2-乙氨基氯乙烷盐酸溶液，继续在摇床50℃下震荡反应3h，结束后用去离子水清洗至中性，得到DEAE修饰的交联纤维素微球。
离子交换容量测试
取1ml纤维素DEAE微球于直径为7mm的重力柱中，用5.0ml浓度为0.1mol/L的HCl标准溶液洗，使其缓慢流过，再用去离子水洗至中性。用5.0ml浓度为0.1mol/L的NaOH标准溶液洗，使其缓慢流过，再用去离子水洗至中性。用5.0ml浓度为0.1mol/L的HCl标准溶液浸泡柱子20min，再让其缓慢流出，收集流出液，用约15ml的去离子水洗并收集流出液，与前面的流出液合并，滴入两滴酚酞指示剂。用浓度为0.1mol/L的NaOH标准溶液滴定至溶液变色且15s不褪色即为滴定终点，得消耗NaOH体积VNaOH，离子交换容量式中VHCl为标准HCl溶液体积(mL)，MHCl为标准HCl溶液摩尔浓度(mol/L)，VNaOH为标准NaOH体积(mL)，MNaOH为标准NaOH摩尔浓度(mol/L)，V微球为纤维素DEAE微球的体积(mL)。
DEAE层析介质动态结合载量测试
仪器：AKTA explorer 100蛋白纯化系统
层析柱：cytiva Tricorn 5/50Column
装柱：取1.0mL的Ni-IDA层析介质装于上述层析柱中，用缓冲液A平衡3CV(柱体积)，用1mg/mL的牛血清蛋白溶液上样(0.50mL/min)，达到10％流穿时停止上样，用缓冲液A平衡10CV后，用缓冲液B线性梯度洗脱，10CV达到100％缓冲液B。按以下公式计算动态结合载量为：DBC10％＝(V10％-V0)C0/Vc，V10％为10％流穿时的上样体积，V0为检测系统管路死体积(2.33ml)，Vc为柱内微球体积(1.0ml)。
缓冲液A的组成为50mmol/L Tris-HCl(pH＝8.5)。
缓冲液B的组成为50mmol/L Tris-HCl、2mol/L NaCl(pH＝8.5)。
实施例7中纤维素多孔凝胶微球经DEAE修饰后，其离子交换容量为181μmol/L，牛血清蛋白的动态结合载量为109.5mg/mL。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：
S1、将醋酸纤维素溶解在有机溶剂-水的混合溶剂中作为水相：
将7～14份醋酸纤维素溶解于100份的有机溶剂-水的混合溶剂形成粘度适中的醋酸纤维素溶液，溶解温度在60～90℃，以满足在溶解温度下溶解醋酸纤维素且降温后能够形成半固体状物质；
醋酸纤维素溶液中添加浓度为30%的己二胺水溶液；
S2、反相乳化法制备醋酸纤维素凝胶微球：
将溶解醋酸纤维素的水相倒入加热至60～90℃的油相中，机械搅拌乳化，使得水相被分散成所需粒径的液滴，降温乳液使水相液滴形成半固状物质，经过清洗后得到醋酸纤维素凝胶微球；
所述油相为包含惰性溶剂和乳化剂，所述惰性溶剂与步骤S1中有机溶剂、水不互溶；
所述乳化剂为非离子型表面活性剂；所述乳化剂为HLB值在3～8的单一乳化剂或者复配乳化剂，油相中乳化剂的质量占油相体积的0.1%～5%，水相和油相的体积比为1：（2～5）；
S3、醋酸纤维素凝胶微球的皂化与交联：
在碱性条件下将醋酸纤维素凝胶微球皂化成纤维素凝胶微球，并用环氧氯丙烷交联，环氧氯丙烷的体积用量为微球体积的1～20%，得到交联的纤维素多孔凝胶微球。
2.根据权利要求1所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述醋酸纤维素的取代度为0.5～2.5。
3.根据权利要求1所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂-水的混合溶剂中有机溶剂为丙酮、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述惰性溶剂为环己烷或者液体石蜡中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述乳化剂为司班85、司班80、司班60中的至少一种。
6.根据权利要求1或5所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述乳化剂以吐温80调节HLB。
7.根据权利要求1所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述环氧氯丙烷的体积用量为纤维素多孔凝胶体积的5～15%。
8.粒径均一的纤维素多孔凝胶微球，其特征在于：所述粒径均一的纤维素多孔凝胶微球由权利要求1-7中任意一项所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的制备方法所制备得到。
9.一种具有粒径均一的纤维素多孔凝胶微球的层析介质，其特征在于：所述层析介质由权利要求8所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球经配基修饰得到。
10.根据权利要求8所述的粒径均一的纤维素多孔凝胶微球在生物大分子分离纯化方面的应用。
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