WO2015029790A1 - 多孔性セルロース粒子の製造方法および多孔性セルロース粒子 - Google Patents

多孔性セルロース粒子の製造方法および多孔性セルロース粒子 Download PDF

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WO2015029790A1
WO2015029790A1 PCT/JP2014/071394 JP2014071394W WO2015029790A1 WO 2015029790 A1 WO2015029790 A1 WO 2015029790A1 JP 2014071394 W JP2014071394 W JP 2014071394W WO 2015029790 A1 WO2015029790 A1 WO 2015029790A1
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particles
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cellulose diacetate
porous cellulose
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PCT/JP2014/071394
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徹 倉林
茂之 青山
昭博 内田
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Jnc株式会社
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    • C08J2301/12—Cellulose acetate

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing porous cellulose particles and porous cellulose particles that can be produced by the method.
  • Porous cellulose particles are resistant to acidic and basic solvents, and various substituents can be added by modification. Therefore, it is used as an adsorbent for various substances in a wide range of fields such as separation, purification, and desalting of various substances.
  • a gel filtration method (a method of separating a substance by a difference in molecular size) can be mentioned.
  • the gel filtration method can be applied to both aqueous solutions and organic solvents, and can be applied to any molecular weight compound. Therefore, it is widely used not only in a laboratory but also on an industrial scale (Patent Document 1).
  • porous cellulose particles have excellent adsorption characteristics and relatively high mechanical strength, they can be used for adsorbents for purifying antibody drugs (Patent Document 2) and virus adsorbents such as influenza (patents).
  • Patent Document 2 adsorbents for purifying antibody drugs
  • virus adsorbents such as influenza
  • Application to the literature 3 is also attracting attention.
  • crystalline cellulose or cellulose triacetate As the raw material for producing porous cellulose particles, crystalline cellulose or cellulose triacetate is generally used. However, since the solvent which can dissolve these raw materials is limited, when preparing a cellulose solution in the production process, it is necessary to use a highly harmful solvent.
  • a crystalline cellulose solvent includes calcium thiocyanate aqueous solution (Patent Document 4), and a cellulose triacetate solvent includes chlorinated hydrocarbons (Patent Document 5), both of which are harmful. Is expensive.
  • Patent Document 6 a method of using an ionic liquid or the like as a solvent for raw material cellulose has been recently reported (Patent Document 6).
  • Patent Document 5 the manufacturing method which uses a cellulose diacetate as a raw material cellulose is also reported (patent document 5, 7, 8).
  • Patent Document 5 uses a highly harmful substance as a solvent for cellulose acetate.
  • the method described in Patent Document 7 requires special equipment and special conditions.
  • the method described in Patent Document 8 also melts a filament made of cellulose ester at a very high temperature and requires special equipment.
  • the conventional method has problems in terms of cost and environmental load.
  • JP-A-56-24430 International Publication No. 08/146906 JP 2011-220992 A JP 55-44312 A JP-A-6-254373 JP 2012-87202 A JP-A-1-277570 Japanese Patent Laid-Open No. 55-40618
  • the present invention is as follows. [1] (a) dissolving cellulose diacetate in a solvent to prepare a cellulose diacetate solution; (B) dispersing the cellulose diacetate solution in a medium immiscible with the cellulose diacetate solution to obtain a dispersion; (C) cooling the dispersion; (D) precipitating cellulose diacetate particles by adding a poor solvent to the cooled dispersion; (E) A method for producing porous cellulose particles, comprising saponifying the cellulose diacetate particles.
  • the solvent of the cellulose diacetate solution comprises an aqueous solution such as aqueous acetic acid solution, acetone, dimethylformamide, dimethylsulfoxide; an organic solvent such as cyclohexanone, ethyl acetate, butyl acetate; and a mixture thereof.
  • the solvent of the cellulose diacetate solution is an acetic acid aqueous solution, and the content of acetic acid in the acetic acid aqueous solution is 80 to 95% by weight with respect to the acetic acid aqueous solution.
  • the poor solvent is water, alcohols, glycols or a mixture thereof.
  • the solvent of the cellulose diacetate solution is an organic solvent such as cyclohexanone, ethyl acetate, and butyl acetate.
  • the medium immiscible with the cellulose diacetate solution is water.
  • the method for producing porous cellulose particles according to [5], which is an aqueous medium such as [7] The method for producing porous cellulose particles according to any one of [1] to [6-2], wherein the cellulose diacetate in (a) has an acetylation degree of 45 to 57%.
  • the cellulose diacetate content in the cellulose diacetate solution is 3 to 20% by weight with respect to the cellulose diacetate solution, and the porous material according to any one of [1] to [7] For producing functional cellulose particles.
  • the method for producing porous cellulose particles according to [9] wherein in (a), the cellulose diacetate is dissolved in the solvent at a temperature of 40 ° C. to 100 ° C.
  • the Kav value measured using PEG having a molecular weight of 8000 is 0.01 or more and 0.52 or less
  • the Kav value measured using PEG having a molecular weight of 12000 is 0.001 or more and 0.
  • a chromatographic filler comprising the porous cellulose particles according to [12] or [13] or the modified porous cellulose particles.
  • the chromatographic packing material according to [14] or [14-1] which is used for separating and purifying virus particles.
  • Influenza virus particles or type B comprising modified porous cellulose particles modified with a sulfate group or a sulfonic acid group-containing group and having an S content of 800 to 5000 ⁇ g / g with respect to the modified porous cellulose particles
  • [16-1] (a) dissolving cellulose diacetate in a solvent to prepare a cellulose diacetate solution; (B) dispersing the cellulose diacetate solution in a medium immiscible with the cellulose diacetate solution to obtain a dispersion; (C) cooling the dispersion; (D) precipitating cellulose diacetate particles by adding a poor solvent to the cooled dispersion; (E) saponifying the cellulose diacetate particles to obtain porous cellulose particles; (F) The method for producing a chromatography filler according to [16], comprising modifying the porous cellulose particles with a sulfate group or a sulfonate group-containing group.
  • porous cellulose particles can be obtained by a simpler method without using a harmful solvent. Moreover, according to the method of the present invention, the particle size and pore size of the porous cellulose particles can be easily controlled.
  • FIG. 1 is a graph showing the Kav values of the porous cellulose particles obtained in Examples 1 to 3.
  • FIG. 2 is a diagram showing the Kav values of the porous cellulose particles obtained in Examples 6 to 9.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the cooling temperature and the particle size of the porous cellulose particles.
  • FIG. 4 is a diagram showing Kav values of the porous cellulose particles obtained in Examples 2, 6, 8 and 9.
  • FIG. 5 is a diagram showing the Kav values of the porous cellulose particles obtained in Example 2 and Comparative Examples 1 and 2.
  • the method for producing porous cellulose of the present invention includes the following steps (a) to (e) in this order: (A) dissolving cellulose diacetate in a solvent to prepare a cellulose diacetate solution; (B) dispersing the cellulose diacetate solution in a medium immiscible with the cellulose diacetate solution to obtain a dispersion; (C) cooling the dispersion; (D) precipitating cellulose acetate particles by adding a poor solvent to the cooled dispersion; and (e) saponifying the cellulose acetate particles.
  • each said process is demonstrated in order.
  • Step (a) a raw material cellulose diacetate is dissolved in a solvent to prepare a cellulose diacetate solution.
  • Cellulose acetate is a semisynthetic polymer obtained by subjecting cellulose, which is a natural polymer, to acetate esterification.
  • Cellulose acetate widely used in industry is roughly divided into two types, cellulose diacetate and cellulose triacetate, and their general acetylation degrees are about 50-57% and about 60-62%, respectively. .
  • cellulose diacetate is used as a raw material.
  • the cellulose diacetate used in the present invention is not particularly limited as long as it can be generally defined as cellulose diacetate, but the acetylation degree is preferably 45 to 57%, and preferably 53 to 56%. It is more preferable. By using cellulose diacetate having an acetylation degree of 45 to 57%, it can be dissolved in more kinds of solvents.
  • cellulose diacetate obtained by acetylating linter pulp, wood pulp or the like with acetic acid and / or acetic anhydride and further partially saponifying it can be used.
  • the degree of esterification can be adjusted as appropriate so that the degree of acetylation falls within the above range. For example, see JP-A-62-2000501.
  • the solvent for dissolving cellulose diacetate is not particularly limited as long as it can dissolve cellulose diacetate, but a solvent having low toxicity is preferable. Unlike cellulose triacetate, cellulose diacetate has a wide range of solvents that can be used, and a solvent with low toxicity can be selected and used.
  • a solvent may be used individually by 1 type, or may mix and use 2 or more types of solvents. Specific examples include aqueous solvents such as aqueous acetic acid, acetone, dimethylformamide, and dimethyl sulfoxide; organic solvents such as cyclohexanone, ethyl acetate, and butyl acetate; and mixtures thereof. Among these, an aqueous acetic acid solution or cyclohexanone is particularly preferred for reasons such as easy availability and handling.
  • the acetic acid content is preferably 80 to 95% by weight based on the aqueous acetic acid solution. Setting the concentration of the acetic acid aqueous solution in the above range is preferable in terms of solubility and temperature control during operation. That is, by setting the concentration of the acetic acid aqueous solution within the above range, cellulose diacetate can be successfully dissolved.
  • the amount of cellulose diacetate in the cellulose diacetate solution is determined according to the desired particle size, pore size and strength of the porous cellulose particles as the final product.
  • the desired particle size, pore size and strength vary depending on the application of the porous cellulose particles.
  • the amount of cellulose diacetate is preferably 3 to 20% by weight, more preferably 4 to 15% by weight, and more preferably 4 to 12% by weight with respect to 100% by weight of the cellulose diacetate solution. Is particularly preferred.
  • the content of cellulose diacetate is too high, the viscosity may be too high and the operability may be deteriorated, or flaky cellulose particles may be precipitated instead of being spherical.
  • the content of cellulose diacetate is too low, cellulose may not precipitate as particles or the mechanical strength of cellulose particles may be reduced.
  • cellulose diacetate is preferably dissolved in a solvent at a temperature of 25 to 100 ° C., more preferably 40 to 100 ° C., and particularly preferably 40 to 90 ° C.
  • a temperature of 25 to 100 ° C. more preferably 40 to 100 ° C., and particularly preferably 40 to 90 ° C.
  • cellulose diacetate can be rapidly dissolved in a solvent.
  • it exceeds 100 ° C. it becomes close to the boiling point of the solvent, which may not be preferable depending on the solvent used.
  • the operation temperature to 25 to 100 ° C., there is an advantage that the particle size and pore size of the porous cellulose particles can be easily controlled.
  • Step (b) the cellulose diacetate solution obtained in (a) is added to a medium immiscible with the cellulose diacetate solution (hereinafter also referred to as a dispersion medium) and stirred. Thereby, a dispersion system in which droplets of the cellulose diacetate solution are dispersed in the dispersion medium is obtained.
  • a dispersion medium a medium immiscible with the cellulose diacetate solution
  • any medium can be used as long as it can disperse the cellulose diacetate solution without being mixed with the cellulose diacetate solution obtained in (a).
  • the dispersion medium that can be used depends on the solvent for cellulose diacetate used in (a). That is, when an aqueous solvent (for example, acetic acid aqueous solution) is used as a solvent for cellulose diacetate, an organic medium immiscible with this is used as a dispersion medium.
  • the organic medium here include toluene, o-dichlorobenzene, xylene, and the like, and toluene or o-dichlorobenzene is preferable. Toluene and o-dichlorobenzene are easily available, and spherical particles can be easily obtained by using these media as a dispersion medium. Two or more kinds of organic media can be mixed and used.
  • an aqueous medium that is immiscible with this is used as a dispersion medium.
  • the aqueous medium include water, and an aqueous solution containing polyvinyl alcohol or the like can also be used for the purpose of adjusting the viscosity of the dispersion medium.
  • These aqueous media are easy to obtain and are preferable from the viewpoint of environmental load. Two or more kinds of aqueous media can be mixed and used.
  • the temperature of the dispersion medium is preferably 40 to 100 ° C., more preferably 60 to 95 ° C.
  • the above temperature range is preferable from the viewpoint of dispersibility in the dispersion medium of the cellulose diacetate solution. Moreover, by setting it as the said temperature range, since the form of the cellulose diacetate solution in a dispersion medium can be hold
  • a surfactant may optionally be added.
  • the surfactant By adding the surfactant, the droplets of the cellulose diacetate solution can be kept more spherical, and the particle size can be controlled.
  • Any surfactant can be used without any particular limitation, but nonionic surfactants and silicone surfactants are preferred.
  • nonionic surfactants and silicone surfactants are preferred.
  • sorbitan monooleate, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, alkylglycoside, polyoxyethylene-methylpolysiloxane copolymer and the like can be mentioned.
  • the droplet size of the cellulose diacetate solution can be controlled by the type and / or amount of the surfactant used.
  • sorbitan monooleate is preferably added.
  • a polyoxyethylene-methylpolysiloxane copolymer is added. Is preferably added.
  • the addition amount of the surfactant is preferably 0.03 to 3.0% by weight, more preferably 0.05 to 1.0% by weight, more preferably 0.06 to 0% with respect to the medium. Particularly preferred is .6% by weight.
  • reduce the amount of surfactant added and if you want to reduce the droplet size, increase the amount of surfactant added. Good.
  • Step (c) In (c), the dispersion obtained in (b) is cooled. By cooling, the pore size and particle size of the cellulose particles obtained can be controlled.
  • the cooling temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which cellulose diacetate is precipitated by adding a poor solvent in (d) described below.
  • the cooling temperature is preferably 40 ° C. or lower. Further, it is more preferably 0 to 40 ° C., and particularly preferably 0 to 30 ° C. When cooled to a temperature lower than 0 ° C., the entire dispersion system may freeze.
  • Step (d) In (d), a poor solvent is added to the dispersion cooled in (c) above. Thereby, cellulose diacetate particles can be deposited.
  • the poor solvent used here is not particularly limited as long as it is a solvent that has low solubility in cellulose diacetate and precipitates cellulose diacetate particles when added.
  • water, alcohols, glycols, and a mixed solution thereof can be used.
  • the alcohols lower alcohols are preferable, and alcohols having 1 to 3 carbon atoms are more preferable.
  • Specific examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol and the like.
  • glycols include ethylene glycol, propylene glycol, diethylene glycol, trimethylene glycol and the like.
  • a mixed solution of water and alcohols or a mixed solution of water and glycols is preferable.
  • a mixed liquid of water and alcohols is more preferable, and a mixed liquid of water and methanol, a mixed liquid of water and ethanol, or a mixed liquid of water and 2-propanol is particularly preferable.
  • the precipitated cellulose diacetate particles are separated by any method well known to those skilled in the art, and are subjected to the following (e). Separation can be performed, for example, by filtration or the like.
  • Step (e) In (e), the cellulose diacetate particles precipitated in (d) are saponified. Thereby, the ester part of a cellulose diacetate hydrolyzes and a cellulose particle is obtained.
  • the cellulose particles obtained here are porous.
  • Saponification can be carried out by methods well known to those skilled in the art, and can be carried out using, for example, alkali and alcohol.
  • alkali for example, an aqueous solution of sodium hydroxide, potassium hydroxide or the like is preferably used.
  • alcohol a lower alcohol is preferable, for example, methanol, ethanol, etc. are more preferable.
  • saponification can be performed by stirring the cellulose diacetate particles obtained in (d) for a certain time in a mixed solution of an alkali and an alcohol, for example.
  • cleaning will not be specifically limited if it is a solution which can wash
  • methanol, water, etc. can be used.
  • porous cellulose particles can be produced by a method that is safer and that is preferable from the viewpoint of environmental protection. Moreover, since it is not necessary to use special equipment or special conditions, porous cellulose particles can be produced more easily and at low cost. Furthermore, according to the method according to the embodiment of the present invention, since the particle size and pore size of the obtained porous cellulose particles can be easily controlled, the cellulose particles having the optimum particle size and pore size for each application Can be obtained. According to the method according to the embodiment of the present invention, porous cellulose particles having a wide particle size range and pore size can be obtained. That is, it is possible to obtain porous cellulose particles having a particle size and a pore size in any size region of small size, intermediate size, and large size.
  • the particle size and pore size of the porous cellulose particles can be easily controlled by changing various conditions in the method of the present invention. For example, it can be controlled by the operation temperature of each step, the amount of the cellulose diacetate raw material to be used, the type of solvent and poor solvent to be used, the type and addition amount of the surfactant, and the like.
  • the higher the cellulose diacetate concentration in the cellulose solution the larger the particle size of the resulting porous cellulose particles and the smaller the pore size.
  • an aqueous solvent such as an aqueous acetic acid solution
  • the particle size of the obtained porous cellulose particles tends to increase.
  • an organic solvent is used as a solvent for dissolving cellulose diacetate, the particle diameter and pore diameter of the resulting porous cellulose particles tend to be small.
  • the particle size of the obtained porous cellulose particles tends to be smaller as the viscosity of the dispersion obtained in (b) is higher. However, the viscosity of the dispersion does not significantly affect the pore size of the porous cellulose particles.
  • the amount of the surfactant used is increased, the particle size of the obtained porous cellulose particles is decreased. Conversely, when the amount of the surfactant is decreased, the particle size of the obtained porous cellulose particles is increased. Tend to be.
  • the type of the poor solvent does not significantly affect the particle size of the porous cellulose particles. From these facts, the pore diameter tends to decrease by rapidly crystallizing cellulose diacetate, and the pore diameter tends to increase by slowly crystallizing.
  • porous cellulose particles or modified porous cellulose particles that can be produced by the above production method are provided.
  • the porous cellulose particles can be used in the separation and purification of various substances. For example, it can be used to separate substances having different molecular sizes in gel filtration methods such as size exclusion chromatography.
  • the porous cellulose particles obtained according to the present invention may be applied as they are, or may be further modified with a substituent or applied in a cross-linked reaction.
  • an adsorbent capable of adsorbing various substances can be easily obtained by adding a ligand to at least a part of the reactive functional group of the porous cellulose particle of the present invention.
  • it can be used in virus adsorbents for influenza virus, hepatitis B, etc., antibody drug purification adsorbents, LDL cholesterol adsorbents, and the like.
  • the particle size and the pore size of the porous cellulose particles can be easily controlled in a wide range, so that an adsorbent having excellent adsorption characteristics and low nonspecific adsorption is obtained. It is possible to manufacture appropriately according to a use.
  • hydroxyl groups of the porous cellulose particles of the present invention is subjected to sulfation treatment, and sulfate groups (—OSO 3 H) are introduced into the porous cellulose particles, whereby lysozyme, immunoglobulins are introduced.
  • sulfate groups —OSO 3 H
  • the method for introducing a sulfate group into the porous cellulose particles of the present invention is not particularly limited, and can be performed, for example, as follows.
  • a sulfating agent is prepared in a reaction vessel.
  • the sulfating agent used in the present invention is not particularly limited as long as it can react with a hydroxyl group in cellulose particles to introduce a sulfate group into porous cellulose particles. Examples of such a sulfating agent include chlorinating agent.
  • Examples include sulfonic acid-pyridine complex, piperidine-N-sulfuric acid, anhydrous sulfuric acid-dimethylformamide complex, sulfur trioxide-pyridine complex, sulfur trioxide-trimethylamine complex, and sulfuric acid-trimethylamine complex.
  • the amount of the sulfating agent used may be arbitrarily selected depending on the intended introduction rate of the sulfate group and the reaction conditions. For example, it is appropriate to use 0.001 to 1 equivalent with respect to the hydroxyl group in the porous cellulose particle. It is.
  • the dried porous cellulose particles are added to a sulfating agent, and a sulfation reaction is performed.
  • the reaction temperature and reaction time vary depending on the type of solvent and sulfating agent, but are usually 0 to 100 ° C., preferably 20 to 85 ° C., preferably 0.5 to 24 hours, more preferably in an inert gas. For 0.5 to 10 hours.
  • the reaction mixture may be neutralized by adding an aqueous alkali solution such as an aqueous sodium hydroxide solution. Thereafter, the resulting reaction mixture is filtered or centrifuged to recover the product and washed with water until neutral, thereby obtaining the desired sulfated porous cellulose particles.
  • the amount of sulfate groups introduced into the sulfated porous cellulose particles can be adjusted by changing the amount of the sulfating agent used, and may be appropriately determined according to the application of the chromatography filler.
  • the sulfonic acid group-containing group that can be introduced into the porous cellulose particles of the present invention is not particularly limited as long as it is a hydrocarbon group containing a sulfonic acid group (—SO 3 H), and is included in the sulfonic acid-containing group.
  • the hydrogen atom may be further substituted with a substituent such as a hydroxyl group, a halogen atom, or an epoxy.
  • the sulfonic acid group-containing group to be introduced is preferably a C 1-5 sulfoalkyl group which may have a substituent.
  • the method for introducing a sulfonic acid group-containing group into the porous cellulose particles of the present invention is not particularly limited as long as it is generally used for the sulfonation treatment of polysaccharides.
  • the porous cellulose particles of the present invention may be obtained by using haloalkane sulfonates such as sodium 3-chloro-2-hydroxypropanesulfonate, sodium 3-bromopropanesulfonate, 1,4-butane sultone, 1,3-propane sultone.
  • a treatment method using a sulfonating agent such as a sulfonic acid having an epoxide such as 1,2-epoxyethanesulfonic acid can be used.
  • the amount of the sulfonic acid group-containing group introduced into the sulfonated porous cellulose particles can be adjusted by changing the amount of the sulfonating agent or alkali used, and is appropriately determined according to the use of the chromatography filler. do it.
  • the sulfonation treatment of the porous cellulose particles can be performed with reference to JP-A No. 2001-302702 or JP-A No. 9-235301. By changing the design of the experimental conditions as appropriate, the target sulfonic acid group-containing group can be introduced in the target amount.
  • a chromatography filler or adsorbent containing the porous cellulose particles obtained by the present invention or the modified porous cellulose particles.
  • the chromatographic filler or adsorbent according to the present invention can be used particularly for separating and purifying proteins such as lysozyme, immunoglobulin, blood coagulation factor, and virus particles such as influenza virus and hepatitis B.
  • the average particle size of the porous cellulose particles is preferably 1 ⁇ m to 2 mm, more preferably 20 ⁇ m to 1 mm, and more preferably 35 ⁇ m to 600 ⁇ m. Particularly preferred. However, it is not limited to these.
  • the average particle diameter was calculated by measuring the median diameter using a particle size distribution measuring apparatus: Laser Scattering Particle Size distribution Analyzer Partica LA-950 manufactured by HORIBA.
  • Example 1 To 352.5 g of an 85 wt% acetic acid aqueous solution, 48.1 g of cellulose diacetate (Wako Pure Chemical Industries, acetylation degree: 53 to 56%) was added and stirred. Furthermore, it heated up and stirred at 60 degreeC for 1 hour, the cellulose diacetate was melt
  • o-dichlorobenzene To 352.5 g of an 85 wt% acetic acid aqueous solution, 48.1 g of cellulose diacetate (Wako Pure Chemical Industries, acetylation degree: 53 to 56%) was added and stirred. Furthermore, it heated up and stirred
  • this dispersion was cooled, and when it reached 30 ° C., 620 ml of pure water as a poor solvent was dropped. As a result, cellulose diacetate was precipitated, and spherical cellulose diacetate particles were obtained. Thereafter, the obtained cellulose diacetate particles were sufficiently washed with a large amount of methanol and then with water. Then, the washed cellulose diacetate spherical particles were classified using a sieve having an opening of 600 ⁇ m.
  • the cellulose diacetate particles that passed through the sieve were saponified by stirring at 35 ° C. for 20 hours in a mixed solution of 360 ml of a 55% aqueous methanol solution and 177 g of a 20 wt% aqueous sodium hydroxide solution. As a result, porous cellulose particles as the final product were obtained.
  • Test Example 1 Measurement of particle size distribution
  • the apparatus used for the measurement is as follows.
  • An adapter was connected to the upper part of the reservoir, and ultrapure water was fed with a pump.
  • a pressure gauge was connected in the middle of the liquid feed line to monitor the pressure. The flow rate was increased until the pressure reached 0.3 MPa, and then filling was performed while flowing ultrapure water for 30 minutes. When filling was completed, the pump was stopped, and the adapter and reservoir cover were removed. Next, the ultrapure water in the reservoir was sucked out with a pipette. The reservoir was removed, the cellulose particles protruding from the column were removed, and an end fitting was connected.
  • Kav measuring device (trade name) System: SCL-10APVP (SHIMAZU) Workstation: CLASS-VP (SHIMAZU) RI detector: RID-10A (SHIMAZU) Pump: LC-10AT (SHIMAZU) Autoinjector: SIL-10ADVP (SHIMAZU)
  • Kav measurement sample (trade name) The Kav measurement sample shown in Table A below was used. These Kav measurement samples were dissolved in pure water to give a solution having a concentration of 50 mg / mL and used for the measurement.
  • Kav measurement A column packed with cellulose particles was set in a Kav measuring device. Ultrapure water was passed for 60 minutes at a flow rate of 0.4 mL / min. 10 ⁇ L of Kav measurement sample was applied to the column, and ultrapure water was passed through for 45 minutes. Detection of the Kav measurement sample was performed using an RI detector, and a measurement chart was recorded. These operations were performed for each Kav measurement sample. The obtained measurement chart (vertical axis: RI detection intensity, horizontal axis: time) showed a normal distribution. The time at which the RI detection intensity was maximized was recorded.
  • Kav (Ve ⁇ V 0 ) / (Vt ⁇ V 0 )
  • Ve sample holding capacity
  • Vt empty column volume
  • V 0 dextran T2000 holding capacity
  • the molecular weight at which the Kav value becomes zero when the vertical axis is plotted as the Kav value and the horizontal axis is plotted as the molecular weight is the exclusion limit molecular weight.
  • Example 2 Porous cellulose particles were produced in the same manner as in Example 1, except that the cellulose diacetate concentration in the cellulose diacetate solution was 10 wt% (Example 2) and 4 wt% (Example 3). The particle size distribution and Kav value of the obtained porous cellulose particles were measured in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 1 shows the Kav values of the porous cellulose particles obtained in Examples 1 to 3. From FIG. 1, it can be said that the higher the cellulose diacetate concentration, the smaller the Kav value of the resulting porous cellulose particles, that is, the smaller the pore diameter.
  • the exclusion limit molecular weight of the cellulose particles obtained in Examples 1 to 3 was 100,000 Da or less.
  • Example 4 Porous cellulose particles were produced in the same manner as in Example 1 except that the concentration of cellulose diacetate in the cellulose diacetate solution was 10% by weight and that 620 mL of a 50% methanol aqueous solution was used as the poor solvent. The particle size distribution and Kav value of the obtained porous cellulose particles were measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 5 Porous cellulose particles were produced in the same manner as in Example 4 except that the concentration of cellulose diacetate in the cellulose diacetate solution was 6% by weight. The particle size distribution and Kav value of the obtained porous cellulose particles were measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 6 39.2 g of cellulose diacetate (Wako Pure Chemical Industries, degree of acetylation: 53 to 56%) was added to 352.5 g of an 85 wt% acetic acid aqueous solution and stirred. Furthermore, it heated up and stirred at 60 degreeC for 1 hour, the cellulose diacetate was melt
  • o-dichlorobenzene at 100 ° C. containing 1.97 g of the surfactant sorbitan monooleate and stirred for 10 minutes at a rotation speed of 400 rpm to obtain a dispersion.
  • this dispersion was cooled to 0 ° C. and stirred as it was at 0 ° C. for 1 hour, and then 620 ml of pure water of 5 ° C. or less as a poor solvent was dropped. As a result, cellulose diacetate was precipitated, and spherical cellulose diacetate particles were obtained. Subsequent washing and saponification steps were performed in the same manner as in Example 1. The particle size distribution and Kav value of the obtained porous cellulose particles were measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 7 Porous in the same manner as in Example 6 except that the cellulose diacetate concentration in the cellulose diacetate solution was 8 wt% (Example 7), 6 wt% (Example 8), and 4 wt% (Example 9). Cellulose particles were produced. The particle size distribution and Kav value of the obtained porous cellulose particles were measured in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 2 shows the Kav values of the porous cellulose particles obtained in Examples 6 to 9. From FIG. 2, it can be said that the higher the cellulose diacetate concentration, the lower the Kav value of the obtained porous cellulose particles, that is, the smaller the pore diameter.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the cooling temperature and the particle size of the porous cellulose particles. For the cases of Example 2 (cooling temperature 30 ° C.) and Example 6 (cooling temperature 0 ° C.), the particle size distribution of the porous cellulose particles is compared. From FIG. 3, it can be said that the lower the cooling temperature, the smaller the particle size of the porous cellulose particles.
  • FIG. 4 is a diagram showing the Kav values of the porous cellulose particles obtained in Examples 2, 6, 8 and 9. Comparing the results of Example 2 (cooling temperature 30 ° C.) and Example 6 (cooling temperature 0 ° C.) in FIG. 4, the lower the cooling temperature, the larger the Kav value of the obtained porous cellulose particles, that is, It can be said that the pore diameter tends to increase.
  • Example 10 To 352.5 g of cyclohexanone, 39.2 g of cellulose diacetate (Wako Pure Chemical Industries, acetylation degree: 53 to 56%) was added and stirred. Furthermore, it heated up and stirred at 90 degreeC for 1 hour, the cellulose diacetate was melt
  • cellulose diacetate Waako Pure Chemical Industries, acetylation degree: 53 to 56%) was added and stirred. Furthermore, it heated up and stirred at 90 degreeC for 1 hour, the cellulose diacetate was melt
  • Example 11 In the same manner as in Example 10, a cellulose diacetate dispersion was prepared. Thereafter, this dispersion was cooled to 0 ° C. and stirred as it was at 0 ° C. for 1 hour, and then 620 ml of cold methanol as a poor solvent was added dropwise. As a result, cellulose diacetate was precipitated, and spherical cellulose diacetate particles were obtained. Subsequent washing and saponification steps were performed in the same manner as in Example 1. The particle size distribution and Kav value of the obtained porous cellulose particles were measured in the same manner as in Example 1.
  • the average particle diameter of the cellulose particles of Examples 1 to 9 using an aqueous solvent (acetic acid aqueous solution) as the solvent for cellulose diacetate used the organic solvent (cyclohexanone). It can be said that there is a tendency to be larger than those of Examples 10 and 11. Further, when an organic solvent is used (Examples 10 and 11), it can be said that the Kav value tends to decrease, that is, the pore diameter tends to decrease.
  • Comparative Example 1 Commercially available cellulose sulfate (manufactured by JNC, S content 950 ⁇ g / g) manufactured using cellulose triacetate as a raw material was used as a comparative example. The particle size distribution and Kav value of the product were measured in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the Kav values of the porous cellulose particles obtained in Example 2 and Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 5 shows that according to one embodiment of the present invention, porous cellulose particles having an intermediate Kav value (that is, an intermediate pore diameter) can be obtained.
  • Example 12 Use as a packing material for chromatography
  • Example 12 Use as a packing material for chromatography
  • Example 12 Use as a packing material for chromatography
  • the Example regarding the filler for chromatography which is one of the preferable usage forms of the porous cellulose particle of this invention is shown.
  • the elution time time from injection to the maximum value of the elution peak
  • This measurement was performed in the same manner as the measurement of the gel partition coefficient Kav described above, except that 0.05 M phosphoric acid pH 8.0 + 0.5 M NaCl was used as the mobile phase and the sample solvent.
  • Sample 1 Human ⁇ globulin, serum-derived (manufactured by Wako Pure Chemical Industries); molecular weight 16.0 ⁇ 10 4 Sample 2.
  • Bovine serum albumin derived from bovine serum (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); molecular weight 6.6 ⁇ 10 4 Sample 3. Lysozyme, derived from chicken egg white (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); molecular weight 1.43 ⁇ 10 4
  • the elution time of each sample was 16.9 minutes for sample 1, 17.1 minutes for sample 2, and 20.6 minutes for sample 3. From this result, it became clear that proteins having different molecular weights can be separated by the difference in elution time by using the porous cellulose particles according to the embodiment of the present invention. Therefore, it can be said that the porous cellulose particles of the present invention can be used as, for example, a column filler for size exclusion chromatography.
  • Example 13 Use as an adsorbent
  • Example 13 Use as an adsorbent
  • the porous cellulose particles obtained in Example 2, Example 6, and Comparative Example 2 were passed through a sieve having an opening of 125 ⁇ m and an opening of 53 ⁇ m, and cellulose particles having a particle size of 125 to 53 ⁇ m were collected.
  • the obtained cellulose particles were reacted with 1 mol equivalent of chlorosulfonic acid at 65 ° C. to obtain sulfated cellulose particles (hereinafter referred to as Example 2A, Example 6A, and Comparative Example 2A).
  • Example 2A 14000 ⁇ g / g
  • Example 6A It was 18000 ⁇ g / g.
  • porous cellulose particles could not be used because the particles collapsed when an attempt was made to sulphate the porous cellulose particles by the above method.
  • the S content can be determined by ion chromatography. Specifically, it was determined by the method described below. The sample vacuum-dried at 60 ° C. for 16-20 hours was ground in a mortar and further dried at 105 ° C. for 2 hours. To 0.05 g of this dried sample, 2.5 ml of 2M hydrochloric acid was added and hydrolyzed at 110 ° C. for 16 hours. After cooling with ice, 1 ml of the supernatant was collected, neutralized with 2M aqueous sodium hydroxide solution, and made up to 25 ml.
  • Yokogawa Electric's ICS-A-23 was used for the column, the oven temperature was 40 ° C., the eluent was 3 mM Na 2 CO 3 solution, and the removal solution was 15 mM sulfuric acid at a flow rate of 1 ml / min. Analysis was performed using an IC7000 ion chromatograph analyzer manufactured by Denki Co., Ltd., and the SO 4 concentration was determined based on a calibration curve prepared from a standard solution described later. The blank value was a value when the same operation was performed without adding a dry sample.
  • a 2 ⁇ g / ml solution of SO 4 standard solution (anion mixed standard solution IV manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) was used as a standard solution for this measurement method, and this was further serially diluted with an ion chromatograph analyzer under the same conditions.
  • a calibration curve was created. The sulfur content was determined by the following formula.
  • X sample and X blank are concentrations ( ⁇ 10 ⁇ 4 %) determined from a calibration curve using SO 4 standard solution.
  • Sulfur content ( ⁇ 10 -4 %) (X sample-X blank) ⁇ 25 ⁇ 2.5 ⁇ 0.3333 / 0.05 Based on the sulfur content ratio calculated by the above formula, the sulfur content (weight) per 1 g of dry weight of the modified cellulose particles (for example, sulfated cellulose particles or sulfonated cellulose particles) was calculated.
  • Example 2A, Example 6A, Comparative Example 2A Using the sulfated cellulose particles (Example 2A, Example 6A, Comparative Example 2A) prepared above and the cellulose particles of Comparative Example 1 (commercially available product), the amount of protein adsorbed was measured. Each cellulose particle was thoroughly washed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9.5). 650 mg of the protein to be measured was prepared and dissolved in 130 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9.5) to prepare a protein solution. The following were used as proteins. (1) Human gamma globulin derived from serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (2) Lysozyme, derived from chicken egg white (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Example 14 Virus adsorption test (influenza virus)] Reference: Microbiol Immunol 2012; 56: 490-495, an influenza virus adsorption test was performed according to the following procedure. (Preparation of inactivated virus-containing solution) Influenza virus A / duck / Hokkaido / Vac-2 / 2004 (H7N7) strain was grown using growing chicken eggs. The urine fluid was collected and centrifuged, and the supernatant was collected. To this, ⁇ -propiolactone was added to a final concentration of 0.1% to inactivate the virus. This inactivated virus solution was filtered through a membrane filter made of cellulose acetate having a pore size of 0.45 ⁇ m, and used as a test solution containing inactivated virus.
  • Influenza virus A / duck / Hokkaido / Vac-2 / 2004 (H7N7) strain was grown using growing chicken eggs. The urine fluid was collected and centrifuged, and the supernatant was collected. To this, ⁇ -
  • Example 2A 14000 ⁇ g / g
  • Example 6A 18000 ⁇ g / g
  • Example 10A 1400 ⁇ g / g
  • Example 10B 4000 ⁇ g / g.
  • Each of the sulfated cellulose particles obtained above was dispersed in water and deaerated while being stirred under reduced pressure. Each degassed dispersion was packed into a glass column ( ⁇ 3 ⁇ 50 mm). This column was connected to a chromatography system and equilibrated with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.4). The following liquid flow was performed at a flow rate of 0.47 ml / min, and 1 mL of the effluent was collected. First, 15 mL of the virus-containing solution prepared above was passed, and then the non-adsorbed portion was washed with a buffer solution (pH 7.0) containing 0.01 M phosphate and 0.15 M sodium chloride.
  • a buffer solution pH 7.0
  • the concentration of the sodium chloride aqueous solution was increased to 1.5 M with a linear gradient, and the elution fraction was collected.
  • the HA value of each collected fraction was measured and the 10% dynamic adsorption amount (DBC) was determined.
  • 10% DBC was defined as the virus activity of the virus adsorbed up to the fraction before the outflow of 1/10 or more of the strength of the activity of the virus-containing solution used.
  • the measurement of virus activity (HA titer) was performed as follows.
  • influenza virus can be adsorbed by sulfating the porous cellulose particles according to the embodiment of the present invention.
  • the sulfated cellulose particles of Example 2 with a high S content (S content 14000 ⁇ g / g) and the sulfated cellulose particles of Example 6 (S content 18000 ⁇ g / g) show a low dynamic adsorption amount of influenza virus. ing. From this, it is considered that there is an introduction amount of sulfate groups suitable for virus adsorption.
  • the porous cellulose particles are modified with a sulfate group or a sulfonic acid group-containing group, and the S content with respect to the modified porous cellulose particles (that is, the sulfur content with respect to 1 g of the modified porous cellulose particles) is 800 to 5000 ⁇ g / g is preferable, 800 to 4000 ⁇ g / g is more preferable, and 800 to 2000 ⁇ g / g is particularly preferable. It has been demonstrated that when the S content with respect to the porous cellulose particles is 700 ⁇ g / g or less, a sufficient amount of virus adsorption cannot be obtained. Therefore, a sufficient amount of virus adsorption can be obtained by modifying the porous cellulose particles so that the S content falls within the above range.
  • Example 15 Virus adsorption test (hepatitis B virus)] (Preparation of virus-containing liquid) Hepatitis B virus HBsAg-XT (Beacle Inc.) was suspended in a buffer used for equilibration of the chromatography column shown below so as to have a concentration of 150 ⁇ g / ml. (Evaluation of virus adsorption capacity) The sulfated cellulose particles (Examples 10A and 10B) prepared in Example 14 were used.
  • Example 10A S content: 1400 ⁇ g / g
  • Example 10B S content: 4000 ⁇ g / g
  • Each degassed dispersion was packed into a glass column ( ⁇ 3 ⁇ 50 mm). The column was connected to a chromatography system and equilibrated with 0.02 M phosphate buffer (pH 7.0) and 0.05 M citrate buffer (pH 5.0), respectively. 2 ml of the virus-containing solution prepared above was passed through the equilibrated column.
  • the liquid flow was performed at a flow rate of 0.25 ml / min, and 1 mL of the effluent was collected.
  • the buffer solution used for equilibration was passed to wash away non-adsorbed components.
  • the concentration of the sodium chloride aqueous solution was increased to 1.5 M with a linear gradient, and the solution was passed through to collect the eluted fraction (adsorbed fraction).
  • 1 mL of each fraction was collected, and the amount of virus recovered (that is, the amount of adsorption) was determined by measuring the protein concentration in each fraction by BCA assay. This BCA assay was performed using BSA as a standard according to the manual of Thermo.
  • virus load means the amount of virus contained in the virus-containing solution passed through the column.
  • the “amount of virus in the effluent” means the amount of virus (non-adsorbed) contained in the effluent after the passage of the virus-containing solution and the buffer solution, and the ratio (%) It means the ratio of the amount of non-adsorbed virus to the viral load.
  • “Amount of virus in the eluted fraction” means the amount of virus contained in the eluted fraction collected by passing sodium chloride aqueous solution (adsorbed fraction), and the ratio (%) is the viral load. It means the ratio of the amount of adsorbed virus to the amount.
  • the content of cellulose diacetate in the cellulose diacetate solution is 6 to 12% by weight based on the cellulose diacetate solution, and the cooling is performed by cooling to a temperature of 0 to 30 ° C., and the molecular weight is 8000.
  • a porous cellulose particle having a Kav value measured using PEG of 0.52 or less and a Kav value measured using PEG having a molecular weight of 12000 is 0.45 or less is preferable.
  • Proteins, viruses, and the like have their own molecular weights and sizes, and it is generally considered that the relationship between them and the size of the pore size (Kav value) of cellulose particles affects the amount of adsorption.
  • Porous cellulose particles having the above characteristics include, in particular, proteins such as lysozyme, immunoglobulin, blood coagulation factor, and influenza virus, type B It is suitable as a chromatographic filler or adsorbent for separating and purifying viruses such as hepatitis.

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Abstract

　一実施形態によると、　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、ニ酢酸セルロース溶液を調製することと、　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、　（ｃ）前記分散系を冷却することと、　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、ニ酢酸セルロース粒子を析出させることと　（ｅ）前記二酢酸セルロース粒子を鹸化することと を含む、多孔性セルロース粒子の製造方法が提供される。

Description

多孔性セルロース粒子の製造方法および多孔性セルロース粒子
　本発明は、多孔性セルロース粒子の製造方法および該方法により製造され得る多孔性セルロース粒子に関する。
　多孔性セルロース粒子は、酸性溶媒および塩基性溶媒に耐性があり、また、修飾することで様々な置換基を付加させることができる。そのため、様々な物質に対する吸着体として、各種物質の分離、精製、脱塩等の広い分野で利用されている。多孔性セルロース粒子の利用分野として、例えば、ゲル濾過法（分子サイズの差によって物質を分別する方法）が挙げられる。ゲル濾過法は、水溶液および有機溶媒のいずれに対しても応用でき、また、どのような分子量の化合物に対しても適用できる。そのため、実験室的のみならず工業的規模でも広く利用されている（特許文献１）。
　また、多孔性セルロース粒子は、吸着特性に優れ、機械的強度が比較的大きいことから、工業的に利用可能な抗体医薬品精製用吸着体（特許文献２）や、インフルエンザなどのウイルス吸着体（特許文献３）への応用も注目されている。
　多孔性セルロース粒子を製造する際の原料としては、結晶性セルロースまたは三酢酸セルロースが使用されるのが一般的である。しかしながら、これら原料を溶解できる溶媒は限られるため、製造工程においてセルロース溶液を調製する際、有害性の高い溶媒を使用せざるを得ないのが現状である。例えば、結晶性セルロースの溶媒としてはチオシアン酸カルシウム水溶液が挙げられ（特許文献４）、三酢酸セルロースの溶媒としては塩素化炭化水素が挙げられるが（特許文献５）、これら溶媒はいずれも有害性が高い。
　このような状況に鑑み、近年、原料セルロースの溶媒としてイオン性液体などを使用する方法も報告されている（特許文献６）。しかしながら、新たに提案されている溶媒は、高価であり、取り扱いも困難である。
　さらに、原料セルロースとして二酢酸セルロースを使用した製造方法も報告されている（特許文献５、７、８）。しかしながら、特許文献５に記載の方法は、酢酸セルロースの溶媒として有害性の高い物質を使用している。特許文献７に記載の方法は、特殊な設備や特殊な条件を必要とする。また、特許文献８に記載の方法も、セルロースエステルで作られたフィラメントを非常に高い温度で溶融しており、特殊な設備を必要とする。このように、従来の方法は、コストや環境負荷の点で問題を有するため、設備化が容易ではないのが現状である。
特開昭５６－２４４３０号公報 国際公開第０８／１４６９０６号 特開２０１１－２２０９９２号公報 特開昭５５－４４３１２号公報 特開平６－２５４３７３号公報 特開２０１２－８７２０２号公報 特開平１－２７７５７０号公報 特開昭５５－４０６１８号公報
　上記のような背景のもと、有害な溶媒を使用することなく、より簡便に多孔性セルロース粒子を製造することができる方法が求められている。さらに、様々な物質に対して適用可能な吸着体を得るためには、多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を容易に制御し得る方法であることが望ましい。
　本発明は、例えば以下の通りである。
［１］　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製することと、
　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、
　（ｃ）前記分散系を冷却することと、
　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、二酢酸セルロース粒子を析出させることと、
　（ｅ）前記二酢酸セルロース粒子を鹸化することと
を含む、多孔性セルロース粒子の製造方法。
［２］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、酢酸水溶液、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の水性溶媒；シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル等の有機溶媒；およびこれらの混合物からなる群より選択される［１］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［２－１］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、酢酸水溶液またはシクロヘキサノンである［２］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［３］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は酢酸水溶液であり、前記酢酸水溶液における酢酸の含量は、前記酢酸水溶液に対して８０～９５重量％である［２－１］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［４］　（ｄ）において、前記貧溶媒は、水、アルコール類、グリコール類またはこれらの混合液である、［１］～［３］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［５］　（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は、水または有機媒質である［１］～［４］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［６］　（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は有機媒質であり、前記有機媒質は、トルエンまたはｏ－ジクロロベンゼンである［５］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［６－１］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、酢酸水溶液、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の水性溶媒であり、（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は、トルエン、ｏ－ジクロロベンゼン、キシレン等の有機媒質である［５］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［６－２］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル等の有機溶媒であり、（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は、水等の水性媒質である［５］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［７］　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、酢化度が４５～５７％である［１］～［６－２］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［８］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液における二酢酸セルロースの含量は、前記二酢酸セルロース溶液に対して３～２０重量％である［１］～［７］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［９］　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、２５℃～１００℃の温度で前記溶媒に溶解される、［１］～［８］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［１０］　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、４０℃～１００℃の温度で前記溶媒に溶解される、［９］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［１０－１］　（ｂ）において、前記分散媒の温度は４０～１００℃である、［１］～［１０］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［１１］　（ｃ）において、前記冷却は、０～４０℃の温度に冷却することにより行う［１］～［１０－１］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［１２］　［１］～［１１］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法により製造され得る多孔性セルロース粒子。
［１３］　（ａ）における前記二酢酸セルロース溶液中の二酢酸セルロースの含量は、前記二酢酸セルロース溶液に対して６～１２重量％であり、（ｃ）における前記冷却は、０～３０℃の温度に冷却することにより行われ、分子量８０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．０１以上０．５２以下であり、かつ分子量１２０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．００１以上０．４５以下である［１２］に記載の多孔性セルロース粒子。
［１４］　［１２］または［１３］に記載の多孔性セルロース粒子または修飾された前記多孔性セルロース粒子を含む、クロマトグラフィー用充填剤。
［１４－１］　前記修飾は、硫酸基またはスルホン酸基含有基によって行われる［１４］に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［１５］　ウイルス粒子を分離精製するために使用される、［１４］または［１４－１］に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［１６］　硫酸基またはスルホン酸基含有基によって修飾され、且つ修飾された多孔性セルロース粒子に対するＳ含量が８００～５０００μｇ／ｇである修飾された多孔性セルロース粒子を含む、インフルエンザウイルス粒子またはＢ型肝炎ウイルス粒子の分離精製用の［１５］に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［１６－１］　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製することと、
　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、
　（ｃ）前記分散系を冷却することと、
　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、二酢酸セルロース粒子を析出させることと、
　（ｅ）前記二酢酸セルロース粒子を鹸化して多孔性セルロース粒子を得ることと、
　（ｆ）前記多孔性セルロース粒子を硫酸基またはスルホン酸基含有基によって修飾することと
を含む、［１６］に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
　本発明によれば、多孔性セルロース粒子を、有害な溶媒を使用することなく、より簡便な方法で得ることができる。また、本発明の方法によれば、多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を容易に制御することが可能である。
図１は、実施例１～３で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。 図２は、実施例６～９で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。 図３は、冷却温度と多孔性セルロース粒子の粒径との関係を示す図である。 図４は、実施例２、６、８および９で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。 図５は、実施例２ならびに比較例１および２で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。　
　まず、本発明の１つの態様に係る多孔性セルロース粒子の製造方法について説明する。本発明の多孔性セルロースの製造方法は、以下の（ａ）～（ｅ）の工程を、この順で含む：
　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製することと、
　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、
　（ｃ）前記分散系を冷却することと、
　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、酢酸セルロース粒子を析出させることと
　（ｅ）前記酢酸セルロース粒子を鹸化すること。
　以下、上記各工程について順に説明する。
　［（ａ）の工程］
　（ａ）においては、原料の二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製する。酢酸セルロースは、天然の高分子であるセルロースを酢酸エステル化することにより得られる半合成高分子である。工業的に広く使用されている酢酸セルロースは、二酢酸セルロースと三酢酸セルロースの２種類に大きく分けられ、その一般的な酢化度は、それぞれ約５０～５７％および約６０～６２％である。本発明の方法では、原料として、二酢酸セルロースを使用する。本発明において使用される二酢酸セルロースは、一般的に二酢酸セルロースと定義され得るものであれば特に限定されないが、酢化度が４５～５７％であることが好ましく、５３～５６％であることがより好ましい。酢化度が４５～５７％である二酢酸セルロースを使用することにより、より多くの種類の溶剤に溶解させることができる。
　具体的には、リンターパルプ、木材パルプ等を酢酸および／または無水酢酸で酢化し、さらに部分鹸化することにより得られる二酢酸セルロースを使用することができる。この場合、酢化度が上記範囲になるよう、エステル化の程度を適宜調節することができる。例えば、特開昭６２－０００５０１号公報を参照されたい。
　二酢酸セルロースを溶解する溶媒としては、二酢酸セルロースを溶解できるものであれば特に限定されないが、有害性の低い溶媒が好ましい。二酢酸セルロースは、三酢酸セルロースと異なり、使用可能な溶媒の範囲が広く、その中から有害性の低い溶媒を選択して使用することができる。溶媒は、１種類を単独で使用しても、２種類以上の溶媒を混合して使用してもよい。具体的には、酢酸水溶液、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の水性溶媒；シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル等の有機溶媒；およびこれらの混合物を挙げることができる。中でも、入手のし易さおよび取扱い易さ等の理由により、酢酸水溶液またはシクロヘキサノンが特に好ましい。
　二酢酸セルロースの溶媒として酢酸水溶液を使用する場合、酢酸の含量は、酢酸水溶液に対して８０～９５重量％であることが好ましい。酢酸水溶液の濃度を上記範囲にすることは、溶解性および作業時の温度管理などの点で好ましい。すなわち、酢酸水溶液の濃度を上記範囲とすることにより、二酢酸セルロースを首尾よく溶解することができる。
　上記のように、本発明によると、有害性の低い溶媒を使用することが可能であるため、より安全に多孔性セルロース粒子を製造することができる。また、有害性の低い溶媒を使用することは、環境保護の観点からも好ましいと言える。
　ニ酢酸セルロース溶液における二酢酸セルロースの量は、最終生成物である多孔性セルロース粒子の所望の粒径、細孔径および強度に応じて決定される。所望の粒径、細孔径および強度は、多孔性セルロース粒子の用途によって異なる。例えば、ニ酢酸セルロース溶液１００重量％に対して、二酢酸セルロースの量が３～２０重量％であることが好ましく、４～１５重量％であることがより好ましく、４～１２重量％であることが特に好ましい。二酢酸セルロースの含量を上記範囲にすることにより、機械的強度があり、多孔性を有した粒子を得ることができる。また、球状粒子を得られやすい。
　二酢酸セルロース溶液中の二酢酸セルロースの量が多いほど、溶液の粘度は高くなるが、固形分含量および得られるセルロース粒子の強度は高くなる。しかしながら、二酢酸セルロースの含量が高すぎると、粘度が高くなりすぎて操作性が悪化したり、球状ではなくフレーク状のセルロース粒子が析出したりする問題が生じ得る。一方、二酢酸セルロースの含量が低すぎると、セルロースが粒子として析出しなかったり、セルロース粒子の機械的強度が小さくなる場合がある。
　（ａ）において、二酢酸セルロースは、２５～１００℃の温度で溶媒に溶解されることが好ましく、より好ましくは４０～１００℃であり、特に好ましくは４０～９０℃である。２５℃以上とすることにより、二酢酸セルロースを溶媒に迅速に溶解することができる。一方、１００℃を超えると、溶媒の沸点に近くなってしまうため、使用する溶媒によっては好ましくない場合がある。また、操作温度を２５～１００℃にすることにより、多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を制御しやすいという利点もある。
　［（ｂ）の工程］
　（ｂ）においては、（ａ）で得られたニ酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質（以下、分散媒とも称する）中に加え、撹拌する。それにより、分散媒中に二酢酸セルロース溶液の液滴が分散した分散系が得られる。
　分散媒としては、（ａ）で得られたニ酢酸セルロース溶液と混和することなく、ニ酢酸セルロース溶液を分散させることができる媒質であれば、いずれの媒質も使用することができる。使用可能な分散媒は、（ａ）で使用される二酢酸セルロースに対する溶媒によって左右される。すなわち、二酢酸セルロースに対する溶媒として水性溶媒（例えば、酢酸水溶液）を使用した場合には、これと混和しない有機媒質を分散媒として使用する。ここでの有機媒質としては、例えば、トルエン、ｏ－ジクロロベンゼン、キシレン、などを挙げることができ、トルエンまたはｏ－ジクロロベンゼンであることが好ましい。トルエンおよびｏ－ジクロロベンゼンは入手しやすく、また、分散媒としてこれら媒質を使用することにより球状粒子を得やすくなる。２種類以上の有機媒質を混合して使用することもできる。
　一方、二酢酸セルロースに対する溶媒として有機溶媒（例えば、シクロヘキサノン）を使用した場合には、これと混和しない媒質である水性媒質を分散媒として使用する。水性媒質としては、水等を挙げることができ、また分散媒の粘度調節などの目的からポリビニルアルコールなどを含む水溶液を使用することもできる。これらの水性媒質は、入手が容易であり、環境負荷の点からも好ましい。２種類以上の水性媒質を混合して使用することもできる。
　分散媒の温度は、４０～１００℃であることが好ましく、６０～９５℃であることがより好ましい。上記温度範囲とすることが、ニ酢酸セルロース溶液の分散媒中での分散性の観点から好ましい。また、上記温度範囲とすることにより、分散媒中におけるニ酢酸セルロース溶液の形態を球形に保持できるため、好ましい。一方、操作温度が１００℃を超えると、分散媒の沸点近くになってしまうため、使用する分散媒によっては好ましくない場合がある。
　（ｂ）において、任意に、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することにより、ニ酢酸セルロース溶液の液滴をより球形に維持することができ、また粒径を制御することが出来る。界面活性剤であれば、特に制限なく使用することができるが、非イオン性界面活性剤、シリコーン系界面活性剤であることが好ましい。例えば、ソルビタンモノオレエート、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、アルキルグリコシド、ポリオキシエチレン－メチルポリシロキサン共重合体等が挙げられる。
　使用する界面活性剤の種類および／または量により、ニ酢酸セルロース溶液の液滴のサイズを制御することもできる。例えば、ニ酢酸セルロース溶液の液滴のサイズを小さくしたい場合には、ソルビタンモノオレエートを添加することが好ましく、液滴のサイズを大きくしたい場合には、ポリオキシエチレン－メチルポリシロキサン共重合体を添加することが好ましい。また、界面活性剤の添加量は、媒質に対して０．０３～３．０重量％であることが好ましく、０．０５～１．０重量％であることがより好ましく、０．０６～０．６重量％であることが特に好ましい。ここで、二酢酸セルロース溶液の液滴のサイズを大きくしたい場合には、界面活性剤の添加量を少なくし、液滴のサイズを小さくしたい場合には、界面活性剤の添加量を多くすればよい。
　［（ｃ）の工程］
　（ｃ）においては、上記（ｂ）で得られた分散系を冷却する。冷却することにより、得られるセルロース粒子の細孔径および粒径を制御することができる。
　冷却温度は、以下に説明する（ｄ）において貧溶媒を添加することにより、二酢酸セルロースが析出する温度であれば特に限定されない。しかし、最終生成物である多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を制御しやすいという観点から、冷却温度は４０℃以下であることが好ましい。また、０～４０℃であることがより好ましく、０～３０℃であることが特に好ましい。０℃より低い温度まで冷却した場合、分散系全体が凍結してしまう可能性がある。
　［（ｄ）の工程］
　（ｄ）においては、上記（ｃ）で冷却した分散系に貧溶媒を添加する。それにより、ニ酢酸セルロース粒子を析出させることができる。
　ここで使用される貧溶媒は、二酢酸セルロースに対する溶解性が低く、添加することによりニ酢酸セルロース粒子が析出する溶媒であれば、特に限定されない。具体的には、例えば、水、アルコール類、グリコール類およびこれらの混合液を使用することができる。アルコール類としては、低級アルコール類が好ましく、炭素数１～３のアルコール類がより好ましい。具体的には、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール等が挙げられる。グリコール類としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、トリメチレングリコール等が挙げられる。
　貧溶媒として混合溶媒を使用する場合、水とアルコール類との混合液または水とグリコール類との混合液であることが好ましい。より好ましくは、水とアルコール類との混合液であり、特に好ましくは、水とメタノールとの混合液、水とエタノールとの混合液、または水と２－プロパノールとの混合液である。
　析出したニ酢酸セルロース粒子は、当業者に周知のいずれかの方法により分離され、次の（ｅ）に供される。分離は、例えば、ろ過等により行うことができる。
　［（ｅ）の工程］
　（ｅ）においては、上記（ｄ）で析出させたニ酢酸セルロース粒子を鹸化する。それにより、ニ酢酸セルロースのエステル部分が加水分解して、セルロース粒子が得られる。ここで得られるセルロース粒子は、多孔性を有する。
　鹸化は、当業者に周知の方法により行うことができるが、例えば、アルカリおよびアルコールを用いて行うことができる。アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液を用いることが好ましい。また、アルコールとしては、低級アルコールが好ましく、例えば、メタノール、エタノールなどがより好ましい。具体的には、（ｄ）で得られたニ酢酸セルロース粒子を、例えばアルカリとアルコールとの混合液中で一定時間撹拌することにより、鹸化を行うことができる。
　鹸化の前に、（ｄ）で得られたニ酢酸セルロース粒子を洗浄することが望ましい。洗浄に使用する溶液は、ニ酢酸セルロース粒子の構造を破壊することなく洗浄できる溶液であれば特に限定されないが、例えば、メタノール、水等を使用することができる。
　本発明の方法は、原料として二酢酸セルロースを使用するため、セルロース溶液を調製する際の溶媒として有害性の低いものを選択することが可能である。従って、より安全であり、環境保護の観点においても好ましい方法で多孔性セルロース粒子を製造することができる。また、特殊な設備や特殊な条件を使用する必要がないため、より簡便に、低コストで多孔性セルロース粒子を製造することもできる。さらに、本発明の実施形態に係る方法によれば、得られる多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を容易に制御することができるため、各用途に最適な粒径および細孔径を有するセルロース粒子を得ることができる。本発明の実施形態に係る方法によると、広いサイズ範囲の粒径および細孔径を有する多孔性セルロース粒子を得ることができる。すなわち、小さいサイズ、中間のサイズ、大きいサイズのいずれのサイズ領域の粒径および細孔径を有する多孔性セルロース粒子であっても、得ることが可能である。
　多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径は、本発明の方法における種々の条件を変化させることにより、容易に制御することができる。例えば、各工程の操作温度、使用する二酢酸セルロース原料の量、使用する溶媒および貧溶媒の種類、界面活性剤の種類および添加量等によって制御することができる。
　具体的には、（ａ）において、セルロース溶液における二酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は大きく、細孔径は小さくなる傾向にある。
　また、二酢酸セルロースを溶解する溶媒として酢酸水溶液等の水性溶媒を使用した場合、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は大きくなる傾向にある。一方、二酢酸セルロースを溶解する溶媒として有機溶媒を使用した場合、得られる多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径は、小さくなる傾向にある。
　また、（ｂ）において得られる分散系の粘度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は小さくなる傾向にある。しかしながら、分散系の粘度は、多孔性セルロース粒子の細孔径には影響をさほど及ぼさない。
　また、使用する界面活性剤の添加量を多くすると、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は小さくなり、逆に界面活性剤の量を少なくすれば、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は大きくなる傾向にある。また、使用する界面活性剤の種類を変更することで、得られる多孔性セルロース粒子の粒径分布を変えることが可能である。ただし、界面活性剤の量や種類を変えても、多孔性セルロース粒子の細孔径には影響をさほど及ぼさない。
　さらに、（ｃ）における冷却温度が低いほど、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は小さくなる傾向にあり、細孔径は大きくなる傾向にある。反対に、冷却温度が相対的に高い場合は、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は大きくなる傾向にあり、細孔径は小さくなる傾向にある。
　また、（ｄ）で添加する貧溶媒の二酢酸セルロースに対する溶解性が低いほど、得られる多孔性セルロース粒子の細孔径は大きくなる傾向にある。しかしながら、貧溶媒の種類は、多孔性セルロース粒子の粒径にはさほど影響を及ぼさない。これらのことより、ニ酢酸セルロースを急激に結晶化することにより細孔径は小さくなり、ゆっくりと結晶化することにより細孔径は大きくなる傾向にある。
［多孔性セルロース粒子または修飾された多孔性セルロース粒子］
　本発明の１つの実施形態によると、上記製造方法により製造され得る多孔性セルロース粒子が提供される。この多孔性セルロース粒子は、各種物質の分離精製において使用することができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー等のゲル濾過法において、分子サイズの異なる物質を分別するために使用することができる。この際、本発明により得られる多孔性セルロース粒子をそのまま適用してもよいし、さらに置換基により修飾したり、架橋反応させた形態で適用してもよい。
　また、本発明の多孔性セルロース粒子の反応性官能基の少なくとも一部にリガンドを付加することによって、種々の物質を吸着可能な吸着剤を容易に得ることができる。例えば、インフルエンザウイルスやＢ型肝炎などに対するウイルス吸着体、抗体医薬品精製用吸着体、ＬＤＬコレステロール吸着体等において利用され得る。本発明の実施形態に係る方法によると、上記の通り、多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を広い範囲で容易に制御できるため、吸着特性に優れ且つ非特異的吸着の少ない吸着剤を、用途に応じて適切に製造することが可能である。
　具体的には、本発明の多孔性セルロース粒子が有する水酸基の少なくとも一部を硫酸化処理して、該多孔性セルロース粒子に硫酸基（－ＯＳＯ３Ｈ）を導入することにより、リゾチーム、免疫グロブリン、血液凝固因子などのタンパク質の分離または精製に好適なクロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。
　本発明の多孔性セルロース粒子に硫酸基を導入する方法、すなわち、硫酸化多孔性セルロース粒子を得る方法は、特に限定されるものではないが、例えば、次のようにして行うことができる。
　まず、反応容器に硫酸化剤を準備する。本発明に用いる硫酸化剤は、セルロース粒子中の水酸基と反応して、多孔性セルロース粒子に硫酸基を導入できるものであれば特に限定されなく、そのような硫酸化剤としては、例えば、クロルスルホン酸－ピリジン錯体、ピペリジン－Ｎ－硫酸、無水硫酸－ジメチルホルムアミド錯体、三酸化硫黄－ピリジン錯体、三酸化硫黄－トリメチルアミン錯体、硫酸－トリメチルアミン複合体等を挙げることができる。硫酸化剤の使用量は、目的とする硫酸基の導入率及び反応条件によって任意に選択すればよく、例えば、多孔性セルロース粒子中の水酸基に対し、０．００１～１当量を用いるのが適当である。
　次に、乾燥させた多孔性セルロース粒子を硫酸化剤中に加え、硫酸化反応を行う。反応温度及び反応時間は、溶媒や硫酸化剤の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、通常０～１００℃、好ましくは２０～８５℃で、好ましくは０．５～２４時間、より好ましくは０．５～１０時間行う。
　反応終了後、反応混合物にアルカリ水溶液、例えば水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和してもよい。
　その後、得られた反応混合物を濾過または遠心分離することにより、生成物を回収し、水で中性になるまで洗浄して、目的の硫酸化多孔性セルロース粒子を得ることができる。硫酸化多孔性セルロース粒子中の硫酸基の導入量は、硫酸化剤の使用量を変更することなどによって調整することができ、クロマトグラフィー充填剤の用途などに応じて適宜決定すればよい。
　また、本発明の多孔性セルロース粒子中の水酸基の少なくとも一部をスルホン化処理して、該粒子中にスルホン酸基含有基を導入することにより、免疫グロブリン、リゾチームなどのタンパク質の分離または精製に好適な強カチオンイオン交換クロマトグラフィー用充填剤も提供することができる。
　本発明の多孔性セルロース粒子中に導入することができるスルホン酸基含有基は、スルホン酸基（－ＳＯ３Ｈ）を含有する炭化水素基であれば特に制限されなく、スルホン酸含有基に含まれる水素原子が、水酸基、ハロゲン原子、エポキシなどの置換基で更に置換されていてもよい。中でも、導入されるスルホン酸基含有基としては、置換基を有していてもよい炭素数１～５のスルホアルキル基であることが好適である。
　本発明の多孔性セルロース粒子中にスルホン酸基含有基を導入する方法は、多糖類のスルホン化処理に一般に用いられるものであれば特に制限されない。例えば、本発明の多孔性セルロース粒子を、３－クロロ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム、３－ブロモプロパンスルホン酸ナトリウムなどのハロアルカンスルホン酸塩、あるいは１，４－ブタンスルトン、１，３－プロパンスルトンまたは１，２－エポキシエタンスルホン酸などのエポキシドを有するスルホン酸などのスルホン化剤を用いて処理する方法が挙げられる。
　スルホン酸化多孔性セルロース粒子中のスルホン酸基含有基の導入量は、スルホン化剤やアルカリの使用量を変更することなどによって調整することができ、クロマトグラフィー充填剤の用途などに応じて適宜決定すればよい。
　多孔性セルロース粒子のスルホン化処理は、特開２００１－３０２７０２号公報または特開平９－２３５３０１号公報などを参照して行うことができる。実験条件を適宜設計変更することにより、目的のスルホン酸基含有基を目的の量だけ導入することができる。
　上記のように、本発明の一態様によると、本発明により得られる多孔性セルロース粒子または修飾された前記多孔性セルロース粒子を含むクロマトグラフィー用充填剤または吸着剤が提供される。本発明によるクロマトグラフィー用充填剤または吸着剤は、特に、リゾチーム、免疫グロブリン、血液凝固因子等のタンパク質、およびインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎等のウイルス粒子を分離精製するために使用することができる。
　様々な物質の吸着体として利用できるという観点からは、多孔性セルロース粒子の平均粒径は、１μｍ～２ｍｍであることが好ましく、２０μｍ～１ｍｍであることがより好ましく、３５μｍ～６００μｍであることが特に好ましい。しかしながら、これらに限定されるものではない。なお、平均粒径は、粒度分布測定装置：ＨＯＲＩＢＡ製　Laser　Scattering　Particle　Size　distribution　Analyzer　Partica　ＬＡ－９５０を使用してメジアン径を測定することにより算出した。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。また、以下の実施例において「％」は、特段の説明が無い限り「重量％」を意味するものとする。
［実施例１］
　８５重量％酢酸水溶液３５２．５ｇに、二酢酸セルロース４８．１ｇ（和光純薬試薬、酢化度：５３～５６％）を加えて攪拌した。さらに、昇温して６０℃で１時間撹拌することにより二酢酸セルロースを溶解し、ニ酢酸セルロース濃度が１２重量％である透明な溶液を得た。該溶液を、界面活性剤ソルビタンモノオレート１．９７ｇを含む、１００℃のｏ－ジクロロベンゼン１．５Ｌ中に素早く注ぎ、回転数４００ｒｐｍにて１０分間攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を冷却し、３０℃になったところで、貧溶媒である純水６２０ｍｌを滴下した。その結果、ニ酢酸セルロースが析出し、球状の二酢酸セルロース粒子が得られた。その後、得られたニ酢酸セルロース粒子を大量のメタノール、次いで水で十分に洗浄した。そして、洗浄後のニ酢酸セルロース球状粒子を、目開き６００μｍの篩を用いて分級した。
　篩を通過したニ酢酸セルロース粒子を、５５％メタノール水溶液３６０ｍｌと２０重量％水酸化ナトリウム水溶液１７７ｇとの混合液中、３５℃で、２０時間撹拌することにより、鹸化した。その結果、最終生成物である多孔性セルロース粒子が得られた。
　（試験例１：粒度分布の測定）
　上記実施例１で得られた多孔性セルロース粒子について、粒度分布を測定し、平均粒径を求めた。測定に使用した装置は、以下の通りである。
　装置：Laser Scattering Particle Size distribution Analyzer Partica　ＬＡ－９５０（ＨＯＲＩＢＡ製）
　上記装置を使用してメジアン径を測定することにより、平均粒径を算出した。
　（試験例２：ゲル分配係数Ｋａｖの測定）
　上記実施例１で得られた多孔性セルロース粒子について、Ｋａｖ値を測定した。測定方法は、以下の通りである。
　（１）使用機器及び試薬
　カラム：エンプティカラム１／４×４．０ｍｍ　Ｉ．Ｄ×３００ｍｍ、１０Ｆ（東ソー）
　リザーバー：パッカ・３/８（東ソー）
　ポンプ：ＰＯＭＰ　Ｐ－５００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
　圧力計：ＡＰ－５３Ａ（ＫＥＹＥＮＣＥ）
　（２）カラム充填法
　カラムとリザーバーとを接続し、カラム下部にエンドフィッティングを接続した。Ｋａｖを測定するセルロース粒子を減圧濾過した湿ゲルの状態で１５ｇ計りとり、５０ｍＬビーカーへ入れた。そこへ超純水２０ｍＬを加えて軽く攪拌した。これを、セルロース粒子が超純水に分散した状態でリザーバーの壁を伝わるようにカラムにゆっくりと加えた。ビーカーに残ったセルロース粒子を少量の超純水ですすぎ、ゆっくりとカラムに加えた。その後、リザーバーの上部ぎりぎりまで超純水を加え、リザーバーの蓋をした。リザーバーの上部にアダプターを接続し、ポンプで超純水を送液した。送液ラインの途中には、圧力計を接続しておき、圧力をモニターした。圧力が０．３ＭＰａになるまで流速を上げ、その後３０分間超純水を流しながら充填した。充填が終わったらポンプを止め、アダプターとリザーバーの蓋を外した。次に、リザーバーの中の超純水をピペットで吸い出した。リザーバーを外し、カラムからはみ出したセルロース粒子を除いて、エンドフィッティングを接続した。
　（３）Ｋａｖ測定装置（商品名）
　システム　　　　　　　：　ＳＣＬ－１０ＡＰＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　ワークステーション　　：　ＣＬＡＳＳ－ＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　ＲＩ検出器　　　　　　：　ＲＩＤ－１０Ａ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　ポンプ　　　　　　　　：　ＬＣ－１０ＡＴ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　オートインジェクター　：　ＳＩＬ－１０ＡＤＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　（４）Ｋａｖ測定サンプル（商品名）
　以下の表Ａに示すＫａｖ測定サンプルを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　これらのＫａｖ測定サンプルを純水に溶解して、濃度５０ｍｇ／ｍＬの溶液としたものを測定に使用した。
　（５）Ｋａｖ測定
　セルロース粒子を充填したカラムをＫａｖ測定装置にセットした。流量０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で６０分間、超純水を通液した。Ｋａｖ測定サンプル１０μＬをカラムにアプライして、４５分間超純水を通液した。Ｋａｖ測定サンプルの検出はＲＩ検出器を用いて行い、測定チャートを記録した。これらの操作を各Ｋａｖ測定サンプルごとに実施した。得られた測定チャート（縦軸：ＲＩ検出強度、横軸：時間）は、正規分布を示した。ＲＩ検出強度が極大になるような時間を記録した。
　（６）Ｋａｖ導出式
　Ｋａｖ測定で得られた、ＲＩ検出強度が極大になるような時間と、そのときの通液量から、Ｋａｖ測定サンプルの保持容量（ｍＬ）を算出した。
　Ｋａｖは、以下の式にて算出した。
　Ｋａｖ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／（Ｖｔ－Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）、Ｖ０はデキストランＴ２０００保持容量（ｍＬ）である。］
　縦軸をＫａｖ値、横軸を分子量としてプロットしたときに、Ｋａｖ値がゼロになる分子量が排除限界分子量である。
［実施例２および３］
　二酢酸セルロース溶液における二酢酸セルロース濃度を１０重量％（実施例２）および４重量％（実施例３）としたことを除き、実施例１と同様にして多孔性セルロース粒子を製造した。得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。
　実施例１～３の結果を、以下の表１に示す。表１に示すＫａｖ値は、ＰＥＧ４１２０（ＰＯＬＹＭＥＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）の場合の値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　表１から、ニ酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子の平均粒径は大きくなる傾向にあると言える。図１に、実施例１～３で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す。図１より、ニ酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子のＫａｖ値が小さくなる傾向、すなわち細孔径が小さくなる傾向にあると言える。また、実施例１～３で得られたセルロース粒子の排除限界分子量は、１０万Ｄａ以下であった。
［実施例４］
　ニ酢酸セルロース溶液におけるニ酢酸セルロース濃度を１０重量％としたこと、および貧溶媒として５０％メタノール水溶液６２０ｍＬを使用したことを除き、実施例１と同様にして多孔性セルロース粒子を製造した。得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。
［実施例５］
　ニ酢酸セルロース溶液におけるニ酢酸セルロース濃度を６重量％としたことを除き、実施例４と同様にして多孔性セルロース粒子を製造した。得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。
　実施例４および５の結果を、以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
［実施例６］
　８５重量％酢酸水溶液３５２．５ｇに、二酢酸セルロース３９．２ｇ（和光純薬試薬、酢化度：５３～５６％）を加えて攪拌した。さらに、昇温して６０℃で１時間撹拌することにより二酢酸セルロースを溶解し、ニ酢酸セルロース濃度が１０重量％である透明な溶液を得た。該溶液を、界面活性剤ソルビタンモノオレート１．９７ｇを含む、１００℃のｏ－ジクロロベンゼン１．５Ｌ中に素早く注ぎ、回転数４００ｒｐｍにて１０分間攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を０℃まで冷却し、そのまま０℃で１時間撹拌した後、貧溶媒である５℃以下の純水６２０ｍｌを滴下した。その結果、ニ酢酸セルロースが析出し、球状のニ酢酸セルロース粒子が得られた。その後の洗浄および鹸化の工程は、実施例１と同様に行った。
　得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。
［実施例７～９］
　ニ酢酸セルロース溶液におけるニ酢酸セルロース濃度を８重量％（実施例７）、６重量％（実施例８）および４重量％（実施例９）としたことを除き、実施例６と同様にして多孔性セルロース粒子を製造した。得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。
　実施例６～９の結果を、以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　表３より、ニ酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子の平均粒径は大きくなる傾向にあると言える。また、図２に、実施例６～９で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す。図２より、ニ酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子のＫａｖ値が低くなる傾向、すなわち細孔径が小さくなる傾向にあると言える。
　図３は、冷却温度と多孔性セルロース粒子の粒径との関係を示す図である。実施例２（冷却温度３０℃）および実施例６（冷却温度０℃）の場合について、多孔性セルロース粒子の粒度分布を比較している。図３より、冷却温度が低い方が、多孔性セルロース粒子の粒径は小さくなる傾向があると言える。
　図４は、実施例２、６、８および９で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。図４の実施例２（冷却温度３０℃）と実施例６（冷却温度０℃）の結果を比較すると、冷却温度が低い方が、得られる多孔性セルロース粒子のＫａｖ値が大きくなる傾向、すなわち細孔径が大きくなる傾向にあると言える。
［実施例１０］
　シクロヘキサノン３５２．５ｇに、二酢酸セルロース３９．２ｇ（和光純薬試薬、酢化度：５３～５６％）を加えて攪拌した。さらに、昇温して９０℃で１時間撹拌することにより二酢酸セルロースを溶解し、二酢酸セルロース濃度が１０重量％である透明な溶液を得た。該溶液を、界面活性剤ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム１．９７ｇを含む、９０℃の水１．５Ｌ中に素早く注ぎ、回転数４００ｒｐｍにて１０分間攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を冷却し、３０℃になったところで、貧溶媒であるメタノール６２０ｍｌを滴下した。その結果、ニ酢酸セルロースが析出し、球状のニ酢酸セルロース粒子が得られた。その後の洗浄および鹸化の工程は、実施例１と同様に行った。
　得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。
［実施例１１］
　実施例１０と同様に、ニ酢酸セルロース分散系を調製した。その後、この分散系を０℃まで冷却し、そのまま０℃で１時間撹拌した後、貧溶媒である冷メタノール６２０ｍｌを滴下した。その結果、ニ酢酸セルロースが析出し、球状のニ酢酸セルロース粒子が得られた。その後の洗浄および鹸化の工程は、実施例１と同様に行った。
　得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。
　実施例１０および１１の結果を、以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　表１～３と表４とを比較すると、二酢酸セルロースに対する溶媒として水性溶媒（酢酸水溶液）を使用した実施例１～９のセルロース粒子の平均粒径の方が、有機溶媒（シクロヘキサノン）を使用した実施例１０および１１よりも大きい傾向があると言える。また、有機溶媒を使用した場合（実施例１０および１１）は、Ｋａｖ値が小さくなる傾向、すなわち細孔径が小さくなる傾向にあると言える。
［比較例１］
　三酢酸セルロースを原料に用いて製造されている市販セルファインサルフェート（ＪＮＣ社製、Ｓ含量９５０μｇ／ｇ）を比較例に用いた。該品の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。
［比較例２］
　６０重量％チオシアン酸カルシウム水溶液に、結晶性セルロース（旭化成：セオラスＰＨ－１０１）を加えて１１０℃で撹拌し、セルロース濃度６重量％の溶液を調製した。該溶液を、界面活性剤ソルビタンモノオレエートを含む１３０℃のｏ－ジクロロベンゼン１．５Ｌ中に撹拌しながら注ぎ、分散系を得た。続いて、この分散系を冷却し、４０℃になったところで、貧溶媒であるメタノールを滴下した。その結果、セルロースが析出し、球状のセルロース粒子が得られた。その後、多量のメタノールおよび水で洗浄を行った。
　得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。
　比較例１および２の結果を、以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　図５は、実施例２ならびに比較例１および２で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。図５から、本発明の一態様によると、中間のＫａｖ値（すなわち中間の細孔径）を有する多孔性セルロース粒子が得られることが分かる。
［実施例１２：クロマトグラフィー用充填剤としての使用］
　以下に、本発明の多孔性セルロース粒子の好ましい使用形態の一つであるクロマトグラフィー用充填剤に関する実施例を示す。
　実施例６で製造した多孔性セルロース粒子を用い、以下の試料１～３のそれぞれの溶出時間（インジェクションから溶出ピークの最大値までの時間）を測定した。この測定は、移動相及び試料の溶剤として０．０５Ｍリン酸ｐＨ８．０＋０．５ＭＮａＣｌを用いた以外は、前述のゲル分配係数Ｋａｖの測定と同様に行った。
　試料１．ヒトγグロブリン、血清由来（和光純薬社製）；分子量１６．０×１０４
　試料２．ウシ血清アルブミン、ウシ血清由来（和光純薬社製）；分子量６．６×１０４
　試料３．リゾチーム、鶏卵白由来（和光純薬社製）；分子量１．４３×１０４
　各試料の溶出時間は、試料１が１６．９分であり、試料２が１７．１分であり、試料３が２０．６分であった。この結果から、本発明の実施形態に係る多孔性セルロース粒子を使用することにより、異なる分子量を有するタンパク質を溶出時間の差によって分離することが可能であることが明らかとなった。従って、本発明の多孔性セルロース粒子は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー用のカラム充填剤として利用できると言える。
［実施例１３：吸着剤としての使用］
　以下に、本発明の多孔性セルロース粒子の好ましい使用形態の一つである吸着剤に関する実施例を示す。
　実施例２、実施例６、および比較例２により得られた多孔性セルロース粒子を、目開き１２５μｍ、目開き５３μｍの篩に通し、粒径１２５～５３μｍのセルロース粒子を分取した。得られたセルロース粒子を１ｍｏｌ当量のクロロスルホン酸と６５℃で反応させ、硫酸化セルロース粒子を得た（以下、実施例２Ａ、実施例６Ａ、比較例２Ａとする）。各硫酸化セルロース粒子のＳ含量（すなわち、硫酸化セルロース粒子１ｇに対する硫黄含量）をイオンクロマトグラフィー法により求めたところ（詳細は以下の試験例３に示す）、実施例２Ａ：１４０００μｇ／ｇ、実施例６Ａ：１８０００μｇ／ｇであった。比較例２Ａについては、多孔性セルロース粒子を上記方法により硫酸化しようとしたところ粒子が崩壊してしまったため、使用できなかった。
　（試験例３：Ｓ含量の分析）
　Ｓ含量は、イオンクロマトグラフィー法により求めることが出来る。具体的には、以下に記載の方法によって求めた。６０℃で１６～２０時間真空乾燥したサンプルを乳鉢ですりつぶし、更に、１０５℃にて２時間乾燥した。この乾燥試料０．０５gに２Ｍの塩酸２．５ｍｌを加え、１１０℃にて１６時間加水分解した。氷冷後、上澄液を１ｍｌ採取し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で中和し、２５ｍｌにメスアップした。カラムに横河電機社製ＩＣＳ－Ａ－２３を用い、オーブン温度４０℃、溶離液に３ｍＭ　Ｎａ２ＣＯ３溶液、除去液に１５ｍＭ硫酸をそれぞれ１ｍｌ／ｍｉｎの流量の条件で使用し、横河電機社製ＩＣ７０００イオンクロマトアナライザーを用いて分析し、さらに後述の標準溶液から作成した検量線をもとにＳＯ４濃度を求めた。ブランク値は乾燥試料を加えずに同様に操作した時の値とした。ＳＯ４標準液（関東化学社製　陰イオン混合標準液ＩＶ）の２μｇ／ｍｌ液を本測定法の標準溶液とし、これを更に段階希釈したものを同様の条件でイオンクロマトアナライザーにて分析し、検量線を作成した。硫黄含有割合は下記式にて求めた。なお、Ｘ試料、ＸブランクはＳＯ４標準溶液による検量線から求めた濃度（×１０－４％）である。
　　硫黄含有割合（×１０－４％）＝
　　　　　（Ｘ試料－Ｘブランク）×２５×２．５×０．３３３３／０．０５
　上記式により算出した硫黄含有割合に基づいて、修飾されたセルロース粒子（例えば、硫酸化セルロース粒子またはスルホン酸化セルロース粒子）の乾燥重量１ｇ当りの硫黄含量（重量）を算出した。
　上記で作製した硫酸化セルロース粒子（実施例２Ａ、実施例６Ａ、比較例２Ａ）および比較例１のセルロース粒子（市販品）を用いて、タンパク質の吸着量を測定した。
　各セルロース粒子を、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５）で十分に洗浄した。測定対象であるタンパク質を６５０ｍｇ用意し、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５）１３０ｍＬに溶解してタンパク質溶液を調製した。タンパク質としては、以下のものを使用した。
　（１）ヒトγグロブリン、血清由来（和光純薬社製）
　（２）リゾチーム、鶏卵白由来（和光純薬社製）
　セルロース粒子１ｍＬに対し、上記で調製したタンパク質溶液１００ｍＬを２時間かけて通液した。セルロース粒子に吸着されたタンパク質量を求めるために、回収された液を波長２８０ｎｍの吸光度測定に供し、未吸着のタンパク質量を求めた。使用したタンパク質溶液中のタンパク質量から、回収液中に存在する未吸着のタンパク質量を差し引くことで、セルロース粒子に吸着されたタンパク質量を算出した。その結果を、以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　表６の結果の通り、本発明の実施形態に係る多孔性セルロース粒子に適切なリガンドを導入することで、市販品と同等以上の吸着量を有する吸着剤としての利用が可能であることが判った。
［実施例１４：ウイルス吸着試験（インフルエンザウイルス）］
　文献：Microbiol Immunol 2012;56: 490-495を参考に、以下の手順で、インフルエンザウイルス吸着試験を行った。
　（不活化ウイルス含有液の調製）
　インフルエンザウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-2/2004(H7N7)株を、発育鶏卵を用いて増殖させた。しょう尿液を回収して遠心し、上清を回収した。これに終濃度０．１％となるようβ-プロピオラクトンを加え、ウイルスを不活性化した。この不活性化ウイルス液を孔径０．４５μｍセルロースアセテート製メンブレンフィルターでろ過し、不活化ウイルス含有液として試験に供した。
　（ウイルス吸着能の評価）
　実施例２、６および１０により得られた多孔性セルロース粒子を、目開き１２５μｍ、目開き５３μｍの篩に通し、粒径１２５～５３μｍのセルロース粒子を分取した。得られたセルロース粒子を１ｍｏｌ当量のクロロスルホン酸と６５℃で反応させ、硫酸化セルロース粒子を得た（以下、実施例２Ａ、実施例６Ａ、実施例１０Ａとする）。また、実施例１０により得られた多孔性セルロース粒子を１ｍｏｌ当量のクロロスルホン酸と７５℃で反応させ硫酸化セルロース粒子を得た（以下、実施例１０Ｂとする）。各硫酸化セルロース粒子のＳ含量（すなわち、硫酸化セルロース粒子１ｇに対する硫黄含量）をイオンクロマトグラフィー法により求めたところ、実施例２Ａ：１４０００μｇ／ｇ、実施例６Ａ：１８０００μｇ／ｇ、実施例１０Ａ：１４００μｇ／ｇ、実施例１０Ｂ：４０００μｇ／ｇであった。
　上記で得られた硫酸化セルロース粒子の各々を水に分散させ、減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した各々の分散液を、ガラスカラム（Φ３×５０ｍｍ）に充填した。このカラムをクロマトグラフィーシステムに接続し、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した。以下の通液は流速０．４７ｍｌ／ｍｉｎの速度で行い、流出液は１ｍＬずつ回収した。まず、上記で調製したウイルス含有液１５ｍＬを通液し、その後０．０１Ｍのリン酸塩と０．１５Ｍの塩化ナトリウムとを含む緩衝液（ｐＨ７．０）で非吸着分を洗浄した。続いて、塩化ナトリウム水溶液の濃度を１．５Ｍまで直線勾配であげて通液し、溶出画分を回収した。回収した各フラクションのＨＡ価を測定し、１０％動的吸着量（ＤＢＣ）を求めた。１０％ＤＢＣは、使用したウイルス含有液の活性の強さの１／１０以上が流出した手前のフラクションまでに吸着されたウイルスのウイルス活性とした。なお、ウイルス活性（ＨＡ価）の測定は、以下のように行った。
　（ウイルス活性の測定）
　丸底９６ウェルプレートの各ウェルに生理食塩水５０μＬを加え、縦１列目に評価サンプル（すなわち、上記で得られた溶出画分および参照としての不活化ウイルス含有液）５０μＬを加えてよく混合した。この２倍希釈されたサンプルのうち５０μＬを横隣のウェルに加えよく混合した。同様の操作を繰り返し、１２番目のウェルまで２～４０９６倍の希釈サンプルを調製した。各サンプルに０．５％鶏赤血球浮遊液５０μｍＬを加えて混合した後、室温で３０分間放置した。３０分後、血球が凝集して底に沈殿していないものをウイルス活性有りとし、活性が認められなくなる一つ前までの希釈倍率をサンプル５０μＬあたりのＨＡ価（ＨＡＵ／５０μＬ）とした。また、ネガティブコントロールには生理食塩水を用いた。
　結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　上記結果より、本発明の実施形態に係る多孔性セルロース粒子を硫酸化することによりインフルエンザウイルスを吸着できることが確認された。ただし、Ｓ含量の多い実施例２の硫酸化セルロース粒子（Ｓ含量１４０００μｇ／ｇ）および実施例６の硫酸化セルロース粒子（Ｓ含量１８０００μｇ／ｇ）はインフルエンザウイルスの動的吸着量が低い結果を示している。このことよりウイルス吸着に適した硫酸基の導入量があると考えられる。
　例えば、多孔性セルロース粒子が硫酸基またはスルホン酸基含有基によって修飾され、且つ修飾された多孔性セルロース粒子に対するＳ含量（すなわち、修飾された多孔性セルロース粒子１ｇに対する硫黄含量）が８００～５０００μｇ／ｇであることが好ましく、８００～４０００μｇ／ｇであることがより好ましく、８００～２０００μｇ／ｇであることが特に好ましい。多孔性セルロース粒子に対するＳ含量が７００μｇ／ｇ以下の場合には、十分なウイルス吸着量を得られないことが実証されている。従って、Ｓ含量が上記範囲となるように多孔性セルロース粒子を修飾することにより、十分なウイルス吸着量を得られる。
［実施例１５：ウイルス吸着試験（Ｂ型肝炎ウイルス）］
　（ウイルス含有液の調製）
　Ｂ型肝炎ウイルスＨＢｓＡｇ－ＸＴ（Ｂｅａｃｌｅ　Ｉｎｃ．）を、１５０μｇ／ｍｌとなるよう、以下に示すクロマトグラフィーカラムの平衡化に用いる緩衝液に懸濁した。
　（ウイルス吸着能の評価）
　実施例１４で調製した硫酸化セルロース粒子（実施例１０Ａおよび１０Ｂ）を使用した。実施例１０Ａの硫酸化セルロース粒子（Ｓ含量：１４００μｇ/ｇ）、および実施例１０Ｂの硫酸化セルロース粒子（Ｓ含量：４０００μｇ/ｇ）の各々を水に分散させ、減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した各々の分散液を、ガラスカラム（Φ３×５０ｍｍ）に充填した。このカラムをクロマトグラフィーシステムに接続し、それぞれ０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）および０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した。平衡化したカラムに、上記で調製したウイルス含有液を２ｍｌ通液した。通液は０．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速で行い、流出液は１ｍＬずつ回収した。ウイルス含有液の通液後は、平衡化で用いた緩衝液を通液して非吸着分を洗浄した。続いて塩化ナトリウム水溶液の濃度を１．５Ｍまで直線勾配で上げて通液し、溶出画分を回収した（吸着分）。各フラクションは１ｍＬずつ回収し、ＢＣＡアッセイ法で各フラクションにおけるタンパク質濃度を測定することで、ウイルスの回収量（すなわち吸着量）を求めた。なおこのＢＣＡアッセイは、Ｔｈｅｒｍｏ社マニュアルに従い、ＢＳＡを標準として行った。
　結果を以下の表８に示す。表８において、「ウイルス負荷」は、カラムに通液したウイルス含有液中に含まれるウイルスの量を意味する。「流出液中のウイルス量」は、ウイルス含有液の通液後および緩衝液の通液後の流出液中に含まれるウイルスの量（非吸着分）を意味し、その割合（％）は、ウイルス負荷量に対する非吸着ウイルス量の割合を意味する。「溶出画分中のウイルス量」は、塩化ナトリウム水溶液を通液することにより回収された溶出画分中に含まれるウイルスの量（吸着分）を意味し、その割合（％）は、ウイルス負荷量に対する吸着ウイルス量の割合を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　表８より、硫酸化セルロース粒子は、ｐＨ５．０の条件で、６２．２％という高いＢ型肝炎ウイルスに対する吸着および回収能を示したことが分かる。また、中性域のｐＨ７．０の条件下でも、３０％以上のＢ型肝炎ウイルスに対する吸着および回収能を示した。
　本発明において、例えば、ニ酢酸セルロース溶液中の二酢酸セルロースの含量がニ酢酸セルロース溶液に対して６～１２重量％であり、冷却は０～３０℃の温度に冷却することにより行い、分子量８０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．５２以下であり、かつ分子量１２０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．４５以下である多孔性セルロース粒子が好ましい。タンパク質、ウイルス等は、それぞれ固有の分子量や大きさを持っており、それらとセルロース粒子の細孔径（Ｋａｖ値）の大きさとの関係が吸着量に影響すると一般的に考えられる。上記の特性（製造方法およびＫａｖ値）を有する多孔性セルロース粒子（または上記セルロース粒子をリガンドで修飾したもの）は、特に、リゾチーム、免疫グロブリン、血液凝固因子等のタンパク質、およびインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎等のウイルスを分離および精製するためのクロマトグラフィー用充填剤または吸着剤として好適である。
　本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
 
 

Claims (16)

  1. 　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製することと、
    　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、
    　（ｃ）前記分散系を冷却することと、
    　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、二酢酸セルロース粒子を析出させることと、
    　（ｅ）前記二酢酸セルロース粒子を鹸化することと
    を含む、多孔性セルロース粒子の製造方法。
  2. 　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、酢酸水溶液またはシクロヘキサノンである請求項１に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  3. 　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は酢酸水溶液であり、前記酢酸水溶液における酢酸の含量は、前記酢酸水溶液に対して８０～９５重量％である請求項２に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  4. 　（ｄ）において、前記貧溶媒は、水、アルコール類、グリコール類またはこれらの混合液である、請求項１～３のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  5. 　（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は、水または有機媒質である請求項１～４のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  6. 　（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は有機媒質であり、前記有機媒質は、トルエンまたはｏ－ジクロロベンゼンである請求項５に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  7. 　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、酢化度が４５～５７％である請求項１～６のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  8. 　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液における二酢酸セルロースの含量は、前記二酢酸セルロース溶液に対して３～２０重量％である請求項１～７のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  9. 　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、２５℃～１００℃の温度で前記溶媒に溶解される、請求項１～８のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  10. 　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、４０℃～１００℃の温度で前記溶媒に溶解される、請求項９に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  11. 　（ｃ）において、前記冷却は、０～４０℃の温度に冷却することにより行う請求項１～１０のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法により製造され得る多孔性セルロース粒子。
  13. 　（ａ）における前記二酢酸セルロース溶液中の二酢酸セルロースの含量は、前記二酢酸セルロース溶液に対して６～１２重量％であり、（ｃ）における前記冷却は、０～３０℃の温度に冷却することにより行われ、分子量８０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．０１以上０．５２以下であり、かつ分子量１２０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．００１以上０．４５以下である請求項１２に記載の多孔性セルロース粒子。
  14. 　請求項１２または１３に記載の多孔性セルロース粒子または修飾された前記多孔性セルロース粒子を含む、クロマトグラフィー用充填剤。
  15. 　ウイルス粒子を分離精製するために使用される、請求項１４に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
  16. 　硫酸基またはスルホン酸基含有基によって修飾され、且つ修飾された多孔性セルロース粒子に対するＳ含量が８００～５０００μｇ／ｇである修飾された多孔性セルロース粒子を含む、インフルエンザウイルス粒子またはＢ型肝炎ウイルス粒子の分離精製用の請求項１５に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
     
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