WO2020256088A1 - 多孔質セルロース媒体及びその製造方法 - Google Patents

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WO2020256088A1
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porous cellulose
logmw
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裕道 大倉
徹 柴田
由紀 平林
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株式会社ダイセル
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    • B01J20/3085—Chemical treatments not covered by groups B01J20/3007 - B01J20/3078

Definitions

  • the present disclosure relates to a porous cellulose medium and a method for producing the same.
  • porous cellulose medium itself can be an adsorbent, and by performing some chemical modification on the surface thereof, functions such as adsorption, separation, and catalyst can be imparted.
  • Patent Document 1 describes a) a step of mixing a low-temperature alkaline aqueous solution and cellulose to prepare a cellulose microdisperse, b) a step of adding a cross-linking agent to the cellulose microdisperse to prepare a mixture, c.
  • a method for producing a porous cellulose bead is disclosed, which comprises a step of dispersing the mixed solution in a dispersion medium to prepare an emulsion, and d) a step of bringing the emulsion into contact with a coagulation solvent. According to the method described in Patent Document 1, it is said that cellulose beads having an excellent adsorbing ability having a pore shape and a pore size distribution suitable for an adsorbent can be produced.
  • Patent Document 2 describes a method of dissolving cellulose in a mixed aqueous solution of 5 to 12% by weight of sodium hydroxide and 9 to 20% by weight urea or 3 to 8% by weight of thiourea, in the cellulose. After precooling the mixed aqueous solution to 10 to 15 ° C. using crystalline cellulose, or by dissolving the cellulose in the mixed aqueous solution at 10 to 15 ° C. without precooling, the dissolved crystalline cellulose is regenerated to be porous.
  • a method for producing porous cellulose which comprises producing sex cellulose, is disclosed.
  • the crystalline cellulose can be dissolved by a method having fewer steps or an inexpensive method as compared with the conventional method, and by regenerating the crystalline cellulose in such a solution. It is said that porous cellulose can be produced.
  • the porous cellulose medium can be used, for example, as a carrier for chromatography.
  • the size of the pore diameter of the carrier can be adjusted according to the size of the target molecule to be separated by the chromatography carrier and the pore volume of the pore diameter can be increased, the target molecule. Separation efficiency can be increased.
  • a porous cellulose medium is used as a carrier for chromatography, and a large molecule such as a protein (for example, a polymer having a weight average molecular weight of about 10 5.0 to 10 5.5 used as a standard sample for chromatography) is targeted as a target molecule.
  • a large molecule such as a protein (for example, a polymer having a weight average molecular weight of about 10 5.0 to 10 5.5 used as a standard sample for chromatography) is targeted as a target molecule.
  • a large molecule such as a protein (for example, a polymer having a weight average molecular weight of about 10 5.0 to 10 5.5 used as a standard sample for chromatography) is targeted as a target molecule.
  • a large molecule such as a protein (for example, a polymer having a weight average molecular weight of about 10 5.0 to 10 5.5 used as a standard sample for chromatography) is targeted as a target molecule.
  • the present disclosure is a novel porosity capable of efficiently separating a large target molecule having a large pore diameter and a large pore volume and a weight average molecular weight of about 10 5.0 to 10 5.5 of a standard sample.
  • the main purpose is to provide a quality cellulose medium.
  • the present inventors have conducted diligent studies to solve the above problems.
  • the atomization step of the method for producing a porous cellulose medium which comprises a fine particle step of spraying a cellulose solution into a space from a spray nozzle to form fine particles and a coagulation step of coagulating the fine particles in a coagulation phase.
  • the gas supplied to the space where the cellulose solution is sprayed to only the gas supplied from the spray nozzle together with the cellulose solution, the pore volume with a large pore diameter is large, and the weight average molecular weight of the standard sample is 10 5.0 or more. It has been found that a novel porous cellulose medium capable of efficiently separating a large target molecule of about 105.5 can be produced.
  • a porous cellulose medium containing porous cellulose particles having a molecular weight of 1 to 600 ⁇ m is classified by a sieve and sandwiched between sieves having a mesh size of 53 ⁇ m and 106 ⁇ m.
  • the obtained fraction was used as a carrier for size exclusion chromatography
  • pure water was used as a mobile phase
  • standard polyethylene oxide was subjected to size exclusion chromatography
  • Kav the weight average molecular weight Mw and gel partition coefficient Kav of the standard polyethylene oxide were obtained.
  • a porous cellulose medium satisfying the following relationships (A) and (B) is preferably produced. In 4.80 ⁇ logMw ⁇ 5.50, K av > -0.445 ⁇ logMw + 2.55 (A) At 5.75 ⁇ logMw, 0 ⁇ Kav ⁇ 0.19 (B)
  • the porous cellulose medium is classified by a sieve, the fraction sandwiched between the sieves having a mesh size of 53 ⁇ m and 106 ⁇ m is used as a carrier for size exclusion chromatography, pure water is used as a mobile phase, and standard polyethylene oxide is used for size exclusion chromatography.
  • a coagulation step of coagulating the fine particles in the coagulation phase comprising: A method for producing a porous cellulose medium, wherein in the micronization step, the gas supplied to the space for spraying the cellulose solution is controlled only by the gas supplied together with the cellulose solution from the spray nozzle.
  • the solvent of the cellulose solution is copper ethylenediamine solution, N-methylmorpholine oxide (NMMO) monohydrate, caustic alkali-urea aqueous solution, calcium thiocyanate aqueous solution, N, N'-dimethylacetamide solution of lithium chloride, lithium chloride.
  • Item 3. The method for producing a porous cellulose medium, which is at least one selected from the group consisting of a dimethylformamide solution, a dimethylimidazolium solution of lithium chloride, and a dimethylsulfoxide solution of lithium chloride.
  • Item 5. The method for producing a porous cellulose medium according to Item 3 or 4, wherein the solidified phase is composed of a component different from the solvent of the cellulose solution.
  • the solidification phase is at least one liquid phase selected from the group consisting of alcohol, ketone, ester, ether, water, inorganic acid, and inorganic salt aqueous solution, a vapor phase thereof, or a gas phase of an inert gas and the liquid.
  • Item 8. The method for producing a porous cellulose medium according to any one of Items 3 to 5, which is composed of a combination of a phase or a vapor phase.
  • a novel porous cellulose medium capable of efficiently separating a large target molecule having a large pore diameter and a large pore volume and a weight average molecular weight of about 10 5.0 to 10 5.5 of a standard sample.
  • the manufacturing method can be provided.
  • Porous cellulose medium (each, cellulose are different) of Examples 1-3 for a logarithm of the weight-average molecular weight of the standard polyethylene oxide (log MW), it is a graph showing the relationship between the gel distribution coefficient K av. Straight lines with default values 1 to 7 are also shown.
  • Porous cellulose media (each nozzle are different) of Example 1, 4 and 5 for a logarithm of the weight-average molecular weight of the standard polyethylene oxide (log MW), it is a graph showing the relationship between the gel distribution coefficient K av. Straight lines with default values 1 to 7 are also shown.
  • Porous cellulose medium (respectively, the coagulation bath composition is different) of Example 4 and 6 for a logarithm of the weight-average molecular weight of the standard polyethylene oxide (log MW), it is a graph showing the relationship between the gel distribution coefficient K av. Straight lines with default values 1 to 7 are also shown.
  • Porous cellulose medium (respectively, the cellulose solution is different) of Example 4 and 7 for a logarithm of the weight-average molecular weight of the standard polyethylene oxide (log MW), is a graph showing the relationship between the gel distribution coefficient K av. Straight lines with default values 1 to 7 are also shown.
  • the logarithm of the weight average molecular weight of the standard polyethylene oxide (log MW)
  • log MW the logarithm of the weight average molecular weight of the standard polyethylene oxide
  • the logarithm of the weight average molecular weight of the standard polyethylene oxide (log MW)
  • the logarithm of the weight average molecular weight of the standard polyethylene oxide is a graph showing the relationship between the gel distribution coefficient K av.
  • a straight line with a default value of 1-4 is also shown.
  • the porous cellulose medium of the present disclosure contains porous cellulose particles having a particle size of 1 to 600 ⁇ m. Further, in the porous cellulose medium of the present disclosure, the porous cellulose medium is classified by a sieve, and the fraction sandwiched between the sieves having a mesh size of 53 ⁇ m and 106 ⁇ m is used as a carrier for size exclusion chromatography to transfer pure water.
  • the weight average molecular weight Mw of the standard polyethylene oxide and the gel partition coefficient Kav satisfy the following relationships (A) and (B). It is a feature. Relationship (A): In 4.80 ⁇ logMw ⁇ 5.50, K av > -0.445 ⁇ logMw + 2.55 Relationship (B): In 5.75 ⁇ logMw, 0 ⁇ Kav ⁇ 0.19
  • the porous cellulose medium of the present disclosure that simultaneously satisfies the relationship (A) and the relationship (B) has a large pore volume with a large pore diameter and efficiently produces a large target molecule having a weight average molecular weight of about 10 5.0 to 10 5.5 as a standard sample. Can be separated.
  • porous cellulose medium that simultaneously satisfies the relationship (A) and the relationship (B) is a novel medium that has not been known so far.
  • the porous cellulose medium of the present disclosure having such characteristics is suitably produced by, for example, adopting the method described in the item of "2. Method for producing porous cellulose" described later. be able to.
  • the porous cellulose medium of the present disclosure contains porous cellulose particles having a particle size of 1 to 600 ⁇ m.
  • the porous cellulose medium of the present disclosure is an aggregate of particulate porous cellulose, and the porous cellulose medium of the present disclosure contains porous cellulose particles having a particle diameter of 1 to 600 ⁇ m.
  • it is preferably about 5 to 400 ⁇ m from the viewpoint of more efficiently separating large target molecules having a weight average molecular weight of about 10 5.0 to 10 5.5 in the standard sample.
  • porous cellulose particles having a particle size of about 10 to 250 ⁇ m contains porous cellulose particles having a particle size of about 10 to 250 ⁇ m.
  • the particle size of the porous cellulose particles is a value set by using a sieve. For example, when a porous cellulose medium is passed through a sieve having a mesh size of 250 ⁇ m and repeatedly washed with water on a sieve having a mesh size of 10 ⁇ m, the particles are porous. Porous cellulose particles having a particle size in the range of 10 to 250 ⁇ m can be extracted from the quality cellulose medium.
  • the porous cellulose medium of the present disclosure may contain porous cellulose particles having a particle size of less than 1 ⁇ m, or may contain porous cellulose particles having a particle size of more than 600 ⁇ m.
  • the lower limit of the particle size of the porous cellulose medium of the present disclosure is, for example, 1 ⁇ m or more and 5 ⁇ m or more, and the upper limit is, for example, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, 400 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less.
  • the proportion of the porous cellulose particles having a particle size of 10 to 250 ⁇ m in the porous cellulose medium of the present disclosure is preferably 80% by mass or more, more preferably 90% by mass or more, still more preferably 95% by mass or more. Particularly preferably, it may be 98% by mass or more, and further may be 100% by mass.
  • the porous cellulose medium of the present disclosure is classified by a sieve, the fraction sandwiched between the sieves having a mesh size of 53 ⁇ m and 106 ⁇ m is used as a carrier for size exclusion chromatography, and pure water is used as a mobile phase.
  • the weight average molecular weight Mw of the standard polyethylene oxide and the gel partition coefficient Kav satisfy the following relationships (A) and (B).
  • the measurement of gel distribution coefficient K av, the method for calculating the relationship between logMw are as follows.
  • the porous cellulose medium is classified by a sieve, the fraction sandwiched between the sieves having a mesh size of 53 ⁇ m and 106 ⁇ m is used as a carrier for size exclusion chromatography, pure water is used as a mobile phase, and standard polyethylene oxide is used for size exclusion chromatography.
  • the gel partition coefficient Kav is calculated. Specifically, the classified porous cellulose medium is filled in a column (for example, "Tricorn 10/100" manufactured by GE Healthcare Japan) so that the bed height is 8 cm or more. Connect to a high performance liquid chromatography system to perform size exclusion chromatography measurements.
  • polyethylene oxide for example, TSKgel standard polyethylene oxide SE kit manufactured by TOSOH
  • dextran for example, Blue dextran (for example, Blue Dextran 2000 manufactured by GE Healthcare)
  • TOSOH polyethylene oxide
  • dextran for example, Blue dextran (for example, Blue Dextran 2000 manufactured by GE Healthcare)
  • K av (V R -V 0 ) / (V t -V 0)
  • V R represents the passing amount of liquid to the peak from the injection of the marker solution is observed (mL)
  • V 0 is the peak after injection of dextran solution having a weight-average molecular weight 2 ⁇ 10 6 Indicates the amount of liquid flow (mL) until is observed
  • V t indicates the volume (mL) of beads in the column.
  • the weight average molecular weight Mw of the standard polyethylene oxide and the gel partition coefficient K It is preferable that av further satisfies the following relationship (C) in addition to the above relationships (A) and (B).
  • the weight average molecular weight Mw of the standard polyethylene oxide and gel partitioning are performed. It is more preferable that the coefficient Kav satisfies the following relationship (D), and further preferably the following relationship (E) is satisfied.
  • linear K av -0.521 ⁇ logMw + 2.97
  • the street is a straight line indicated as the default value 3 in FIGS. 1-6, for example.
  • the weight average molecular weight Mw of the standard polyethylene oxide and gel partitioning are performed. It is preferable that the coefficient Kav satisfies the following relationship (F), and it is more preferable that the coefficient Kav has the relationship (G).
  • the porous cellulose medium of the present disclosure is composed of cellulose, and may contain known components contained in the known porous cellulose medium as long as the effects of the present disclosure of the present disclosure are not impaired.
  • it can be a porous cellulose medium containing an unsubstituted cellulose and a polymer having a glucose unit excluding the unsubstituted cellulose, and as the polymer, carboxymethyl cellulose, cellulose phosphate and the like can be preferably used. it can.
  • Such a porous cellulose medium can be imparted with functionality (functionality provided by the polymer) that is not found in the porous cellulose itself composed of unsubstituted cellulose.
  • the porous cellulose medium of the present disclosure can usually be stored in a wet state.
  • porous cellulose medium of the present disclosure can be particularly preferably used for size exclusion chromatography. Furthermore, this can be done in a variety of ways other than size exclusion, by binding a suitable ligand to the porous cellulose medium, or by substituting or modifying a functional group on the surface with another functional group. It is shown that it can also be used for chromatographic separation according to the mode of. These include modes such as ion exchange, hydrophobicity, and affinity.
  • porous cellulose medium of the present disclosure can be used as a separating agent with further improved strength by cross-linking the cellulose chains by a covalent bond using a cross-linking agent.
  • An adsorbent can also be produced by immobilizing an affinity ligand on the porous cellulose medium of the present disclosure or a crosslinked porous cellulose medium. This adsorbent can also be used as a separating agent for affinity chromatography.
  • the method for producing a porous cellulose medium is not particularly limited as long as a method satisfying the above-mentioned particle size and the relationships (A) and (B) can be obtained, and the following "2. Porousness" is used. It can be suitably produced by the production method shown in "Method for producing quality cellulose medium”.
  • the method for producing a porous cellulose medium of the present disclosure is a step of atomizing a cellulose solution into fine particles by spraying it into a space from a spray nozzle and a step of coagulating the fine particles in a coagulation phase.
  • the gas supplied to the space for spraying the cellulose solution is controlled only by the gas supplied together with the cellulose solution from the spray nozzle.
  • miniaturization process In the miniaturization step, the cellulose solution is sprayed into the space from the spray nozzle to form fine particles. Further, in the micronization step, the gas supplied to the space for spraying the cellulose solution is controlled only to the gas supplied together with the cellulose solution from the spray nozzle.
  • the cellulose solution is not particularly limited as long as it is a liquid containing cellulose and is coagulated in the coagulation phase described later.
  • cellulose is dissolved in a solvent.
  • the solvent copper ethylenediamine solution, N-methylmorpholine oxide (NMMO) monohydrate, caustic alkali-urea aqueous solution, calcium thiocyanate aqueous solution, N, N'-dimethylacetamide solution of lithium chloride, dimethylform of lithium chloride Examples thereof include an amide solution, a dimethylimidazolium solution of lithium chloride, and a dimethyl sulfoxide solution of lithium chloride. Only one type of these solvents may be used, or two or more types may be mixed and used.
  • a caustic alkali-urea aqueous solution for example, a urea-alkali hydroxide aqueous solution containing urea, thiourea, etc.
  • a caustic alkali-urea aqueous solution for example, a urea-alkali hydroxide aqueous solution containing urea, thiourea, etc.
  • the cellulose solution refers to a liquid containing cellulose that exhibits fluidity and solidifies when it comes into contact with the coagulation phase, and whether the cellulose molecules are dispersed in the cellulose solution or not. It does not matter whether the sub-aggregates are left or the fine fibrous substances are merely dispersed (sometimes called a dispersion). That is, in the method for producing a porous cellulose medium of the present disclosure, the cellulose solution means a liquid containing cellulose, and the dispersion liquid in which cellulose is dispersed in the liquid and the cellulose are dissolved in the liquid. It is a concept that includes the solution. In the method for producing a porous cellulose medium of the present disclosure, it is sufficient that the cellulose solution contains cellulose, and the form thereof may be dispersed / dissolved or a mixed state thereof.
  • the alkali contained in the aqueous alkali hydroxide solution is preferably lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, or quaternary ammonium hydroxide, and sodium hydroxide is most preferable in terms of product safety, price, and good dissolution or dispersion. ..
  • the alkali concentration of the alkaline aqueous solution is not particularly limited, but is preferably 3 to 20% by mass. When the alkali concentration is in this range, the dispersibility, swelling property, and solubility of cellulose in an alkaline aqueous solution are high, which is preferable. A more preferable concentration of alkali is 5 to 15% by mass, and even more preferably 6 to 10% by mass.
  • Urea or thiourea is further added to the above alkaline aqueous solution.
  • concentration of urea or thiourea is preferably 10 to 15% by mass.
  • Three components cellulose, alkali hydroxide, urea or thiourea are added to the water, but the order of addition is chosen appropriately to optimize the dissolution state of cellulose. By cooling the slurry thus obtained under the conditions described later, a more transparent cellulose solution than immediately after adding all the components can be obtained.
  • Cellulose may be any solution as long as it becomes fine particles when sprayed from a spray nozzle as a cellulose solution in the fine particle forming step and solidifies when it comes into contact with the coagulation phase, but it has excellent solubility. From the viewpoint of low viscosity and easy handling, so-called microcrystalline cellulose to which mild acid hydrolysis has been added, regenerated cellulose acetate by deacetylation, rayon fiber and the like are preferable.
  • the molecular weight of cellulose is not particularly limited, but the degree of polymerization is preferably 1000 or less. When the degree of polymerization is 1000 or less, the dispersibility and swelling property in an alkaline aqueous solution are high, which is preferable. Further, when the degree of polymerization is 10 or more, the mechanical strength of the obtained cellulose beads is increased, which is preferable.
  • the range of the more preferable degree of polymerization is 50 or more and 500 or less, more preferably 100 or more and 400 or less, and particularly preferably 150 or more and 300 or less.
  • cellulose with improved solubility is dissolved pulp.
  • the mixing conditions of the alkaline aqueous solution and cellulose are not particularly limited as long as the cellulose solution is obtained.
  • cellulose may be added to an alkaline aqueous solution, or an alkaline aqueous solution may be added to cellulose.
  • Cellulose may be suspended in water before being mixed with an alkaline aqueous solution.
  • the concentration of cellulose in the cellulose solution is preferably 1 to 10% by mass. If it is 1% by mass or more, the mechanical strength of the obtained porous cellulose medium is increased, and preferably, if it is 10% by mass or less, the viscosity of the cellulose solution is low and the spray nozzle has a predetermined particle size. It is preferable because it is easy to spray from.
  • the concentration of cellulose in the cellulose solution is more preferably 2 to 6% by mass, still more preferably 3 to 5% by mass. The cellulose concentration in this cellulose solution does not include the portion that could not be completely dissolved, dispersed, and swollen and became uniform.
  • the temperature at which the cellulose solution is prepared is not particularly limited, but for example, cellulose and an alkaline aqueous solution containing urea or thiourea are mixed at room temperature, cooled to a low temperature with stirring, and then returned to a manageable temperature.
  • the cellulose solution is preferably formed.
  • Examples of the temperature for cooling to a low temperature include 0 ° C. to ⁇ 30 ° C., preferably ⁇ 5 ° C. to ⁇ 15 ° C.
  • the temperature of the cellulose solution sprayed from the spray nozzle from the viewpoint of more preferably producing the porous cellulose of the present disclosure which satisfies the above relationships (A) and (B) and has a predetermined particle size.
  • the temperature is preferably about 0 to 50 ° C, more preferably about 10 to 40 ° C. From the same viewpoint, the temperature of the space when the cellulose solution is sprayed into the space from the spray nozzle is preferably about 0 to 50 ° C, more preferably about 10 to 40 ° C.
  • the gas supplied to the space where the cellulose solution is sprayed is controlled only by the gas supplied together with the cellulose solution from the spray nozzle.
  • the space for spraying the cellulose solution can be connected through the exhaust port, but the gas supplied to the space together with the cellulose solution from the spray nozzle is controlled so as not to supply the external gas from the exhaust port. It is guided to the outside through the exhaust port (that is, in the atomization step, the space for spraying the cellulose solution is not on the negative pressure side with respect to the external space). That is, the space for spraying the cellulose solution is shielded from the external gas, and the concentration of the vapor of the solidification phase liquid is increased as compared with the open system.
  • the gas supplied from the spray nozzle to the space together with the cellulose solution is preferably an inert gas, for example, nitrogen gas, argon or the like. Further, it is preferable that the gas supplied from the spray nozzle and the gas in the space are the same.
  • the particle size of the cellulose solution sprayed from the spray nozzle is not particularly limited as long as the produced porous cellulose medium contains porous cellulose particles having a particle diameter of 1 to 600 ⁇ m, further 5 to 400 ⁇ m, and further 10 to 250 ⁇ m, but is preferably about 10 to 200 ⁇ m. Can be mentioned.
  • the spray nozzle is not particularly limited as long as it can spray a liquid with a particle size of about 10 to 200 ⁇ m, and a commercially available two-fluid nozzle, three-fluid nozzle, or the like can be used.
  • the cellulose solution is atomized by spraying the sprayed cellulose solution from above the solidification phase in the coagulation step described later so that the sprayed cellulose solution falls by gravity.
  • the height from the surface of the solidified phase to the tip of the spray nozzle from the viewpoint of more preferably producing the porous cellulose of the present disclosure which satisfies the above relationships (A) and (B) and has a predetermined particle size. It is preferably 0.1 m to 20 m, more preferably 1 m to 20 m.
  • the fine particles of the cellulose solution are coagulated in the coagulation phase, the fine particles of the cellulose solution are brought into contact with the coagulation phase as described above.
  • the coagulation phase those known as those for coagulating a cellulose solution can be used, and for example, at least one liquid selected from the group consisting of alcohol, ketone, ester, ether, water, inorganic acid, and aqueous inorganic salt solution. It can be composed of a phase or a vapor phase thereof, or a gas phase of an inert gas and the liquid phase or the vapor phase.
  • the components constituting the solidification phase may be one kind or two or more kinds.
  • the solidified phase is preferably composed of a component different from the solvent of the cellulose solution.
  • the solidification phase is preferably a liquid phase of water or alcohol, and particularly preferably a liquid phase of alcohol. It is also preferable to use a mixed solvent of water and alcohol (alcohol aqueous solution).
  • the alcohol is not particularly limited, but an alcohol having 6 or less carbon atoms is preferable, an alcohol having 4 or less carbon atoms is more preferable, and methanol is the most preferable.
  • the temperature of the solidification phase is preferably ⁇ 30 ° C. from the viewpoint of more preferably producing the porous cellulose of the present disclosure, which satisfies the above relationships (A) and (B) and has a predetermined particle size.
  • the temperature is about 50 ° C., preferably about -20 ° C. to 40 ° C.
  • the obtained porous cellulose medium can be washed with water, an appropriate method using alcohol such as methanol or ethanol, and normally stored in a wet state. As described above, when the porous cellulose medium is dried, an appropriate amount of sugar, glycerin, etc. is added. For long-term storage in water, add preservatives such as alcohol and sodium azide to prevent spoilage. It can also be dried with glycerin, sugar, urea and the like added.
  • Example 1 (Preparation of cellulose solution) Sodium hydroxide was dissolved in water in a flask, cooled to room temperature, and then powdered cellulose (Asahi Kasei Theoras PH101 degree of polymerization of about 200) was dispersed in the flask with stirring. After further adding urea to dissolve the solution, the solution was cooled to -15 ° C. over about 1 hour with stirring, and then warmed to room temperature using a water bath to obtain a nearly transparent solution. The amount of each reagent added was weighed and added so that sodium hydroxide was 7% by mass, powdered cellulose was 4% by mass, and urea was 12% by mass in the state of a cellulose solution.
  • the obtained cellulose solution (temperature 25 ° C.) is sprayed from a three-fluid nozzle together with nitrogen gas in the form of a mist from top to bottom in the vertical direction (the particle size of the sprayed cellulose solution is about 10 to 200 ⁇ m), and a liquid as a coagulation phase. It was dropped into methanol (temperature 25 ° C.).
  • the space for spraying is a closed space (filled with nitrogen gas having a temperature of 25 ° C.) other than the exhaust port for letting out the nitrogen gas flowing in from the nozzle, and liquid methanol is installed below the three-fluid nozzle.
  • a filter is installed at the exhaust port so that the sprayed cellulose does not leak from the spray space, and the spray space is designed so that the negative pressure does not become positive compared to the outside.
  • the fine powder obtained in liquid methanol was recovered. This fine powder was passed through a sieve having a mesh size of 250 ⁇ m and washed repeatedly with water on a sieve having a mesh size of 10 ⁇ m to obtain a porous cellulose medium (particle size 10 to 250 ⁇ m).
  • Example 2 A porous cellulose medium (particle size 10 to 250 ⁇ m) was prepared in the same procedure as in Example 1 except that the powdered cellulose in Example 1 was regenerated cellulose and the cellulose concentration at the time of the cellulose solution was 3% by mass.
  • Example 3 The porous cellulose medium in the same procedure as in Example 1 except that the powdered cellulose in Example 1 was Nippon Paper Industries KC Flock W-200 (degree of polymerization of about 250) and the cellulose concentration at the time of the cellulose solution was 3% by mass. (Particle size 10 to 250 ⁇ m) was prepared.
  • Example 4 A porous cellulose medium (particle diameter 10 to 250 ⁇ m) was prepared in the same procedure as in Example 1 except that the spray nozzle in Example 1 was a two-fluid nozzle.
  • Example 5 A porous cellulose medium (particle size 10 to 250 ⁇ m) was prepared in the same procedure as in Example 1 except that the spray nozzle in Example 1 was a two-fluid nozzle of a different type from that in Example 4.
  • Example 6 A porous cellulose medium (particle size 10 to 250 ⁇ m) was prepared in the same procedure as in Example 4 except that the composition of the liquid methanol placed below the nozzle in Example 4 was an equal amount mixture of water and methanol.
  • Example 7 Porous cellulose was prepared in the same procedure as in Example 4 except that the sodium hydroxide in Example 4 was lithium hydroxide, the lithium hydroxide concentration at the time of the cellulose solution was 8% by mass, and the urea concentration was 15% by mass. A medium (particle size 10 to 250 ⁇ m) was prepared.
  • the porous cellulose medium obtained in the examples was classified by a sieve, and the fraction sandwiched between the sieves having a mesh size of 53 ⁇ m and 106 ⁇ m was used as a carrier for size exclusion chromatography, and pure water was used as a mobile phase as a standard poly.
  • the ethylene oxide was subjected to size exclusion chromatography to determine the gel partition coefficient Kav .
  • the classified porous cellulose medium was filled in a column (“Tricorn 10/100” manufactured by GE Healthcare Japan) so that the bed height was 8 cm or more. It was connected to a high performance liquid chromatography system and size exclusion chromatography measurements were performed.
  • polyethylene oxide TKgel standard polyethylene oxide SE kit manufactured by TOSOH
  • dextran Blue Dextran 2000 manufactured by GE Healthcare
  • TSKgel standard polyethylene oxide SE kit manufactured by TOSOH
  • dextran Blue Dextran 2000 manufactured by GE Healthcare
  • a solution of Blue Dextran 2000) manufactured by Healthcare was injected, and the flow rate from the injection until the peak was observed on the RI monitor was determined.
  • the flow rate of each marker solution was determined in the same manner. The measured value was substituted into the following formula to calculate the value of Kav .
  • V R represents the passing amount of liquid to the peak from the injection of the marker solution is observed (mL)
  • V 0 is the peak after injection of dextran solution having a weight-average molecular weight 2 ⁇ 10 6 Indicates the amount of liquid flow (mL) until is observed
  • V t indicates the volume (mL) of beads in the column.

Abstract

大きな細孔径の細孔体積が大きく、標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子を効率的に分離することができる、新規な多孔質セルロース媒体を提供する。　粒子径が１～６００μｍの多孔質セルロース粒子を含む、多孔質セルロース媒体であって、　前記多孔質セルロース媒体を篩で分級し、目開き５３μｍと１０６μｍの篩の間に挟まれた画分をサイズ排除クロマトグラフィーの担体として用い、純水を移動相として、標準ポリエチレンオキシドをサイズ排除クロマトグラフィーに供した場合に、前記標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、以下の関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足する、多孔質セルロース媒体。 ４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５　（Ａ） ５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、０≦Ｋav＜０．１９　（Ｂ）

Description

多孔質セルロース媒体及びその製造方法
　本開示は、多孔質セルロース媒体及びその製造方法に関する。
　セルロースを代表とする多糖およびその誘導体は、さまざまな用途に利用されている。例えば、多孔質セルロース媒体は、それ自体が吸着剤となりうるし、またその表面に何らかの化学修飾を行うことにより、吸着や分離、触媒などの機能が付与できる。
　例えば、特許文献１には、ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する工程、ｂ）前記セルロース微分散液に架橋剤を加え混合液を作製する工程、ｃ）前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する工程、及びｄ）前記エマルションを凝固溶媒に接触させる工程を含むことを特徴とする、多孔質セルロースビーズの製造方法が開示されている。特許文献１に記載された方法によれば、吸着体に好適な細孔形状と細孔径分布を有する吸着能の優れたセルロースビーズを製造できるとされている。
　また、特許文献２には、５～１２重量％の水酸化ナトリウムと、９～２０重量％尿素又は３～８重量％チオ尿素との混合水溶液にセルロースを溶解させる方法であって、前記セルロースに結晶性セルロースを用い、前記混合水溶液を１０～１５℃に予冷した後、または予冷を行わずに１０～１５℃で前記混合水溶液に前記セルロースを溶解させ、溶解した結晶性セルロースを再生させて多孔性セルロースを製造することを特徴とする多孔性セルロースの製造方法が開示されている。特許文献２に記載された方法によれば、従来の方法に比べて、工程数が少なく又は安価な方法で結晶性セルロースを溶解することができ、このような溶液中の結晶性セルロースの再生によって多孔性セルロースを製造することができるとされている。
国際公開第２０１６／１６７２６８号 特開２０１１－２３１１５２号公報
　多孔質セルロース媒体は、例えば、クロマトグラフィーの担体などとして利用することができる。ここで、クロマトグラフィーの担体が分離対象とする標的分子の大きさに合わせて、担体の細孔径の大きさを調整し、かつ、当該細孔径の細孔体積を大きくすることができれば、標的分子の分離効率を高めることができる。
　例えば、多孔質セルロース媒体をクロマトグラフィーの担体などとして利用して、タンパク質などの大きな分子（例えば、クロマトグラフィーの標準サンプルとして用いる、重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の高分子）を標的分子とする場合、標的分子を効率的に分離するためには、多孔質セルロース媒体の細孔径を大きくし、かつ、当該細孔径の細孔体積を大きくすることが求められる。しかしながら、従来の多孔質セルロース媒体の製造方法では、大きな細孔径について、細孔体積を大きくすることは困難であり、例えば標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子を効率的に分離することができなかった。
　このような状況下、本開示は、大きな細孔径の細孔体積が大きく、標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子を効率的に分離することができる、新規な多孔質セルロース媒体を提供することを主な目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、セルロース溶液をスプレーノズルから空間中に噴霧して微粒子とする微粒子化工程と、微粒子を凝固相中で凝固させる凝固工程とを備える、多孔質セルロース媒体の製造方法の粒子化工程において、セルロース溶液を噴霧する空間に供給される気体を、スプレーノズルからセルロース溶液と共に供給される気体のみに制御することにより、大きな細孔径の細孔体積が大きく、標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子を効率的に分離することができる新規な多孔質セルロース媒体が製造できることを見出した。より具体的には、当該製造方法を採用することにより、粒子径が１～６００μｍの多孔質セルロース粒子を含み、多孔質セルロース媒体を篩で分級し、目開き５３μｍと１０６μｍの篩の間に挟まれた画分をサイズ排除クロマトグラフィーの担体として用い、純水を移動相として、標準ポリエチレンオキシドをサイズ排除クロマトグラフィーに供した場合に、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、以下の関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足する、多孔質セルロース媒体が好適に製造されることを見出した。
４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５　　（Ａ）
５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、０≦Ｋav＜０．１９　　（Ｂ）
　本開示は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
項１．　粒子径が１～６００μｍの多孔質セルロース粒子を含む、多孔質セルロース媒体であって、
　前記多孔質セルロース媒体を篩で分級し、目開き５３μｍと１０６μｍの篩の間に挟まれた画分をサイズ排除クロマトグラフィーの担体として用い、純水を移動相として、標準ポリエチレンオキシドをサイズ排除クロマトグラフィーに供した場合に、前記標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、以下の関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足する、多孔質セルロース媒体。
４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５　　（Ａ）
５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、０≦Ｋav＜０．１９　　（Ｂ）
項２．　前記標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、以下の関係（Ｃ）を充足する、項１に記載の多孔質セルロース媒体。
４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋３＞Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５　　（Ｃ）
項３．　セルロース溶液をスプレーノズルから空間中に噴霧して微粒子とする微粒子化工程と、
　前記微粒子を凝固相中で凝固させる凝固工程と、
を備える、多孔質セルロース媒体の製造方法であって、
　前記微粒子化工程において、前記セルロース溶液を噴霧する前記空間に供給される気体は、前記スプレーノズルから前記セルロース溶液と共に供給される気体のみに制御されている、多孔質セルロース媒体の製造方法。
項４．　前記セルロース溶液の溶媒が、銅エチレンジアミン液、Ｎ－メチルモルホリンオキシド（ＮＭＭＯ）一水和物、苛性アルカリ－尿素系水溶液、チオシアン酸カルシウム水溶液、塩化リチウムのＮ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド溶液、塩化リチウムのジメチルフォルムアミド溶液、塩化リチウムのジメチルイミダゾリウム溶液、及び塩化リチウムのジメチルスルホキシド溶液からなる群より選択される少なくとも１種である、項３に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
項５．　前記凝固相は、前記セルロース溶液の溶媒とは異なる成分で構成されている、項３又は４に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
項６．　前記凝固相は、アルコール、ケトン、エステル、エーテル、水、無機酸、及び無機塩水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液相もしくはその蒸気相、又は不活性気体の気相と前記液相もしくは蒸気相との組み合わせにより構成されている、項３～５のいずれか１項に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
　本開示によれば、大きな細孔径の細孔体積が大きく、標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子を効率的に分離することができる、新規な多孔質セルロース媒体及びその製造方法を提供することができる。
実施例１～３の多孔質セルロース媒体（それぞれ、セルロースが異なる）について、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量の対数値（ｌｏｇＭｗ）と、ゲル分配係数Ｋavとの関係を示すグラフである。既定値１～７の直線を併記してある。 実施例１，４，５の多孔質セルロース媒体（それぞれ、ノズルが異なる）について、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量の対数値（ｌｏｇＭｗ）と、ゲル分配係数Ｋavとの関係を示すグラフである。既定値１～７の直線を併記してある。 実施例４，６の多孔質セルロース媒体（それぞれ、凝固浴組成が異なる）について、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量の対数値（ｌｏｇＭｗ）と、ゲル分配係数Ｋavとの関係を示すグラフである。既定値１～７の直線を併記してある。 実施例４，７の多孔質セルロース媒体（それぞれ、セルロース溶解液が異なる）について、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量の対数値（ｌｏｇＭｗ）と、ゲル分配係数Ｋavとの関係を示すグラフである。既定値１～７の直線を併記してある。 比較参考例１～６の多孔質セルロース媒体について、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量の対数値（ｌｏｇＭｗ）と、ゲル分配係数Ｋavとの関係を示すグラフである。既定値１～４の直線を併記してある。 比較参考例７～１１の多孔質セルロース媒体について、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量の対数値（ｌｏｇＭｗ）と、ゲル分配係数Ｋavとの関係を示すグラフである。既定値１－４の直線を併記してある。
１．多孔質セルロース媒体
　本開示の多孔質セルロース媒体は、粒子径が１～６００μｍの多孔質セルロース粒子を含む。さらに、本開示の多孔質セルロース媒体は、多孔質セルロース媒体を篩で分級し、目開き５３μｍと１０６μｍの篩の間に挟まれた画分をサイズ排除クロマトグラフィーの担体として用い、純水を移動相として、標準ポリエチレンオキシドをサイズ排除クロマトグラフィーに供した場合に、前記標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、以下の関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足することを特徴としている。
　関係（Ａ）：４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５
　関係（Ｂ）：５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、０≦Ｋav＜０．１９
　以下、本開示の多孔質セルロース媒体について、詳述する。なお、後述するように、関係（Ａ）に関し、直線Ｋav＝－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５は、例えば図１～６で既定値１として示された直線である。また、関係（Ｂ）に関し、直線Ｋav＝０．１９は、例えば図１～６では、既定値２として示された直線である。関係（Ａ）及び関係（Ｂ）を同時に満たす本開示の多孔質セルロース媒体は、大きな細孔径の細孔体積が大きく、標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子を効率的に分離することができる。また、関係（Ａ）及び関係（Ｂ）を同時に満たす多孔質セルロース媒体は、従来知られていない新規なものである。後述のように、このような特徴を備える本開示の多孔質セルロース媒体は、例えば、後述の「２．多孔質セルロースの製造方法」の項目で説明する方法を採用することにより、好適に製造することができる。
　本開示の多孔質セルロース媒体は、粒子径が１～６００μｍの多孔質セルロース粒子を含んでいる。具体的には、本開示の多孔質セルロース媒体は、粒子状の多孔質セルロースの集合体であり、粒子径が１～６００μｍの多孔質セルロース粒子を含んでいる、本開示の多孔質セルロース媒体は、粒子径が当該範囲内の多孔質セルロース粒子を含んでおり、かつ、後述の関係（Ａ）及び（Ｂ）を測定できるもの（すなわち、目開き５３μｍと１０６μｍの篩の間に挟まれた画分を含んでいる）であれば、特に制限されないが、標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子をより一層効率的に分離する観点から、好ましくは５～４００μｍ程度、より好ましくは１０～２５０μｍ程度の粒子径の多孔質セルロース粒子を含んでいる。なお、多孔質セルロース粒子の粒子径は、篩を用いて設定される値であり、例えば、多孔質セルロース媒体を目開き２５０μｍの篩に通し、目開き１０μｍの篩の上で繰り返し水洗すると、多孔質セルロース媒体から、粒子径が１０～２５０μｍの範囲の多孔質セルロース粒子を抽出することができる。
　本開示の多孔質セルロース媒体には、粒子径が１μｍ未満の多孔質セルロース粒子が含まれていてもよいし、粒子径が６００μｍ超の多孔質セルロース粒子が含まれていてもよい。本開示の多孔質セルロース媒体の粒子径の下限については、例えば１μｍ以上、５μｍ以上が挙げられ、上限については、例えば６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下などが挙げられる。本開示の多孔質セルロース媒体における、粒子径が１０～２５０μｍの多孔質セルロース粒子の割合としては、好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上であり、特に好ましくは９８質量％以上、さらには１００質量％であってもよい。
　本開示の多孔質セルロース媒体は、多孔質セルロース媒体を篩で分級し、目開き５３μｍと１０６μｍの篩の間に挟まれた画分をサイズ排除クロマトグラフィーの担体として用い、純水を移動相として、標準ポリエチレンオキシドをサイズ排除クロマトグラフィーに供した場合に、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、以下の関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足する。ゲル分配係数Ｋavの測定と、ｌｏｇＭｗとの関係の算出方法は、以下の通りである。
　関係（Ａ）：４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５
　関係（Ｂ）５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、０≦Ｋav＜０．１９
＜ゲル分配係数Ｋavの測定と、ｌｏｇＭｗとの関係の算出＞
　多孔質セルロース媒体を篩で分級し、目開き５３μｍと１０６μｍの篩の間に挟まれた画分をサイズ排除クロマトグラフィーの担体として用い、純水を移動相として、標準ポリエチレンオキシドをサイズ排除クロマトグラフィーに供し、ゲル分配係数Ｋavを求める。具体的には、分級した多孔質セルロース媒体をカラム（例えば、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製「Ｔｒｉｃｏｒｎ　１０／１００」）にベッド高さが８ｃｍ以上となるように充填する。高速液体クロマトグラフィーシステムに接続し、サイズ排除クロマトグラフィーの測定を行う。マーカーとしては、ポリエチレンオキシド（例えば、ＴＯＳＯＨ社製　ＴＳＫｇｅｌ標準ポリエチレンオキシド　ＳＥキット）およびデキストラン（例えば、Ｂｌｕｅ　ｄｅｘｔｒａｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製　Ｂｌｕｅ　Ｄｅｘｔｒａｎ　２０００））を超純水に溶解して用いる。カラムに脱気した超純水を流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで通液しながら、先ず、カラム中のビーズ部分以外の体積を求めるために、重量平均分子量２×１０6のデキストラン（Ｂｌｕｅ　ｄｅｘｔｒａｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製　Ｂｌｕｅ　Ｄｅｘｔｒａｎ　２０００））の溶液を注入し、注入からＲＩモニターでピークが観測されるまでの通液量を求める。次いで、各マーカーの溶液でも同様に通液量を求める。測定値を下記式に代入し、Ｋavの値を算出する。
Ｋav＝（ＶR－Ｖ0）／（Ｖt－Ｖ0）
［式中、ＶRは各マーカー溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖ0は重量平均分子量２×１０6のデキストラン溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖtはカラム内のビーズの体積（ｍＬ）を示す。］
　本開示の多孔質セルロース媒体において、標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子をより一層効率的に分離する観点から、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、前記の関係（Ａ）及び（Ｂ）に加えて、さらに、以下の関係（Ｃ）を充足することが好ましい。
　関係（Ｃ）：４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋３＞Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５
　ここで、関係（Ｃ）に関し、直線Ｋav＝－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋３は、例えば図１～４で既定値５として示された直線である。すなわち、関係（Ｃ）は、４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０の範囲において、図１～４のグラフの既定値１の直線と、既定値５の直線で挟まれた範囲となる。
　また、本開示の多孔質セルロース媒体において、標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子をより一層効率的に分離する観点から、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとは、以下の関係（Ｄ）を充足していることがより好ましく、以下の関係（Ｅ）を充足していることがさらに好ましい。
　関係（Ｄ）：４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、－０．５２１×ｌｏｇＭｗ＋３．２＞Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５
　関係（Ｅ）：４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、－０．５２１×ｌｏｇＭｗ＋３．２＞Ｋav＞－０．５２１×ｌｏｇＭｗ＋２．９７
　関係（Ｄ）に関し、直線Ｋav＝－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５は、前記の通り、例えば図１～６で既定値１として示された直線である。また、関係（Ｄ）に関し、直線Ｋav＝－０．５２１×ｌｏｇＭｗ＋３．２は、例えば図１～６では、既定値７として示された直線である。すなわち、関係（Ｄ）は、４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０の範囲において、図１～６の既定値１の直線と既定値７の直線の間の範囲を示している。
　さらに、関係（Ｅ）に関し、直線Ｋav＝－０．５２１×ｌｏｇＭｗ＋２．９７は、前記の通り、例えば図１～６で既定値３として示された直線である。また、関係（Ｄ）に関し、直線Ｋav＝－０．５２１×ｌｏｇＭｗ＋３．２は、例えば図１～６では、既定値７として示された直線である。すなわち、関係（Ｅ）は、４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０の範囲において、図１～６の既定値３の直線と既定値７の直線の間の範囲を示している。
　また、本開示の多孔質セルロース媒体において、標準サンプルの重量平均分子量が１０5.0～１０5.5程度の大きな標的分子をより一層効率的に分離する観点から、標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、以下の関係（Ｆ）を充足していることが好ましく、関係（Ｇ）を有していることがさらに好ましい。
　関係（Ｆ）：５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、０≦Ｋav＜０．１７
　関係（Ｇ）：５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、－０．０４８２×ｌｏｇＭｗ＋０．３≦Ｋav＜０．１７
　関係（Ｆ）に関し、直線Ｋav＝０．１７は、例えば図１～６で既定値４として示された直線である。また、関係（Ｇ）に関し、直線Ｋav＝Ｋａｖ＝－０．０４８２×ｌｏｇＭｗ＋０．３は、例えば図１～６では、既定値６として示された直線である。すなわち、関係（Ｇ）は、５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、図１～４の既定値４の直線と既定値６の直線の間の範囲を示している。
　本開示の多孔質セルロース媒体は、セルロースにより構成されており、本開示本開示の効果を阻害しないことを限度として、公知の多孔質セルロース媒体に含まれる公知の成分を含んでいてもよい。例えば、無置換のセルロースと、無置換のセルロースを除くグルコースユニットを有するポリマーとを含む多孔質セルロース媒体とすることができ、当該ポリマーとして、カルボキシメチルセルロース、リン酸セルロースなどを好適に使用することができる。このような多孔質セルロース媒体には、無置換セルロースにより構成された多孔質セルロースそのものにはない機能性（前記のポリマーが備える機能性）を付与することができる。本開示の多孔質セルロース媒体は、通常水湿の状態で保存することができる。乾燥させる場合には、糖類、グリセリンなどを適量加える。水湿で長期保存する場合には、腐敗を防ぐためにアルコールやアジ化ナトリウムなどの防腐剤を加える。また、グリセリンや糖類、尿素などを加えた状態で乾燥することもできる。
　また、本開示の多孔質セルロース媒体は、サイズ排除クロマトグラフィーに特に好適に利用することができる。さらに、このことは、とりもなおさず、多孔質セルロース媒体に適当なリガンドを結合することによって、もしくは、表面の官能基を別の官能基へと置換・修飾することによって、サイズ排除以外のさまざまのモードによるクロマトグラフィー分離にも利用できることを示す。これらには、イオン交換、疎水性、アフィニティーなどのモードが含まれる。
　また、本開示の多孔質セルロース媒体に、架橋剤を用いて、セルロース鎖間を共有結合により架橋することで、より強度を向上させた分離剤としても利用することができる。
　本開示の多孔質セルロース媒体や架橋した多孔質セルロース媒体に、アフィニティーリガンドを固定化することにより、吸着体を製造することもできる。この吸着体は、アフィニティークロマトグラフィー用の分離剤としても利用することができる。
　本開示において、多孔質セルロース媒体の製造方法は、前記の粒子径と、関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足するものが得られることを限度として、特に制限されず、下記の「２．多孔質セルロース媒体の製造方法」に示す製造方法により、好適に製造することができる。
２．多孔質セルロース媒体の製造方法
　本開示の多孔質セルロース媒体の製造方法は、セルロース溶液をスプレーノズルから空間中に噴霧して微粒子とする微粒子化工程と、当該微粒子を凝固相中で凝固させる凝固工程とを備えており、微粒子化工程において、セルロース溶液を噴霧する空間に供給される気体が、スプレーノズルからセルロース溶液と共に供給される気体のみに制御されていることを特徴としている。このような製造方法を採用することにより、前記の粒子径と、関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足する、本開示の多孔質セルロース媒体を好適に製造することができる。
（微細化工程）
　微細化工程においては、セルロース溶液をスプレーノズルから空間中に噴霧して微粒子とする。さらに、微粒子化工程において、セルロース溶液を噴霧する空間に供給される気体は、スプレーノズルからセルロース溶液と共に供給される気体のみに制御されている。
　セルロース溶液としては、セルロースを含む液体であって、後述の凝固相中で凝固されるものであれば、特に制限されない。例を挙げるならセルロースを溶媒に溶解したものである。溶媒としては、銅エチレンジアミン液、Ｎ－メチルモルホリンオキシド（ＮＭＭＯ）一水和物、苛性アルカリ－尿素系水溶液、チオシアン酸カルシウム水溶液、塩化リチウムのＮ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド溶液、塩化リチウムのジメチルフォルムアミド溶液、塩化リチウムのジメチルイミダゾリウム溶液、塩化リチウムのジメチルスルホキシド溶液などが挙げられる。これらの溶媒は、１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を混合して用いてもよい。これらの中でも、溶媒としては、苛性アルカリ－尿素系水溶液（例えば、尿素、チオ尿素などを含む、尿素－水酸化アルカリ水溶液）が好ましい。
　なお、セルロース溶液とは、セルロースを含む液体であって、流動性を示し、凝固相に触れたときにセルロースが固体化するものを指し、セルロース溶液中において、セルロース分子が分散しているか、一部会合物を残しているか、微細な繊維状物が単に分散しているに過ぎないもの（分散液と呼ばれることがある。）かは問わない。すなわち、本開示の多孔質セルロース媒体の製造方法において、セルロース溶液とは、セルロースを含む液体であることを意味し、セルロースが液体中に分散している分散液と、セルロースが液体中に溶解している溶液とを包含する概念である。本開示の多孔質セルロース媒体の製造方法においては、セルロース溶液にセルロースが含まれていればよく、その形態については、分散・溶解、又はこれらの混合状態のいずれであってもよい。
　以下、尿素－水酸化アルカリ水溶液を溶媒とする場合を例にとってセルロース溶液の調製法を具体的に説明する。
　水酸化アルカリ水溶液に含まれるアルカリは、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化四級アンモニウムが好ましく、製品安全性、価格、溶解あるいは分散の良さの面から水酸化ナトリウムが最も好ましい。
　前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度に特に限定は無いが、３～２０質量％であることが好ましい。アルカリの濃度がこの範囲であれば、セルロースのアルカリ水溶液への分散性・膨潤性、溶解性が高くなるため好ましい。より好ましいアルカリの濃度は５～１５質量％であり、さらに好ましくは６～１０質量％である。
　上記アルカリ水溶液にさらに尿素又はチオ尿素を加える。尿素又はチオ尿素の濃度は１０～１５質量％が好ましい。水に三成分（セルロース、水酸化アルカリ、尿素又はチオ尿素）を加えるが、添加順序はセルロースの溶解状態を最適化するために、適切に選ぶ。こうして得られたスラリーを後に述べる条件で冷却することにより、全成分を添加した直後よりも透明なセルロース溶液が得られる。
　セルロースは、微粒子化工程において、セルロース溶液としてスプレーノズルから噴霧されると、微粒子となり、凝固相と接触すると固体化するものであれば、いかなるものであってもよいが、溶解性に優れる、溶液の粘度が低く扱い易いなどの観点などから、軽度の酸加水分解を加えた、いわゆる微結晶セルロースや、酢酸セルロースから脱アセチル化により再生したもの、レーヨン繊維などが好ましい。
　セルロースの分子量は特に制限されないが、重合度としては１０００以下であることが好ましい。重合度が１０００以下であれば、アルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなり、好ましい。また重合度が１０以上であれば、得られるセルロースビーズの機械的強度が大きくなるため好ましい。より好ましい重合度の範囲は５０以上５００以下、さらに好ましくは１００以上４００以下、特に好ましくは１５０以上３００以下である。
　その他、溶解性が向上されたセルロースの例としては、溶解パルプも挙げられる。
　アルカリ水溶液とセルロースとの混合条件は、セルロース溶液が得られれば特に制限されない。例えば、アルカリ水溶液にセルロースを加えてもよいし、セルロースにアルカリ水溶液を加えてもよい。
　セルロースは、アルカリ水溶液と混合する前に、水に懸濁させておいてもよい。
　また、セルロース溶液中のセルロースの濃度は、１～１０質量％であることが好ましい。１質量％以上であれば、得られる多孔質セルロース媒体の機械的強度が大きくなるため好ましく、１０質量％以下であれば、セルロース溶液の粘度が低く、所定の粒子径となるようにしてスプレーノズルからの噴霧することが容易になるため好ましい。セルロース溶液におけるセルロースの濃度としては、より好ましくは２～６質量％、さらに好ましくは３～５質量％が挙げられる。なお、このセルロース溶液中のセルロース濃度には、溶解・分散・膨潤しきれず均一にならなかった分を含めない。
　セルロース溶液を調製する際の温度としては、特に制限されないが、例えば、セルロースと尿素あるいはチオ尿素を含むアルカリ水溶液とを室温で混合し、撹拌しながら低温に冷却し、その後扱いやすい温度に戻すことによりセルロース溶液が好適に形成される。低温に冷却する際の温度としては、例えば０℃ないし－３０℃、好ましくは－５℃ないし－１５℃程度が挙げられる。また、前記の関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足し、かつ、所定の粒子径を有する本開示の多孔質セルロースをより一層好適に製造する観点から、スプレーノズルから噴霧されるセルロース溶液の温度としては、好ましくは０～５０℃程度、より好ましくは１０～４０℃程度が挙げられる。また、同様の観点から、セルロース溶液をスプレーノズルから空間中に噴霧する際の空間の温度としては、好ましくは０～５０℃程度、より好ましくは１０～４０℃程度が挙げられる。
　微粒子化工程において、セルロース溶液を噴霧する空間に供給される気体は、スプレーノズルからセルロース溶液と共に供給される気体のみに制御されている。例えば、セルロース溶液を噴霧する空間は、排気口を介して接続することができるが、排気口からは外部の気体が供給されないように制御され、スプレーノズルからセルロース溶液と共に空間に供給される気体が排気口を介して外部に導かれるようにする（すなわち、微粒子化工程において、セルロース溶液を噴霧する空間は、外部空間に対して陰圧側にならない）。すなわち、セルロース溶液を噴霧する空間は、外部の気体と遮断されており、開放系と比較して凝固相液体の蒸気の濃度が高められた空間である。
　スプレーノズルからセルロース溶液と共に空間に供給される気体は、不活性気体であることが好ましく、例えば、窒素ガス、アルゴンなどが好ましい。また、スプレーノズルから供給される気体と、空間内の気体とは、同じであることが好ましい。
　前記の関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足し、かつ、所定の粒子径を有する本開示の多孔質セルロース媒体をより一層好適に製造する観点から、スプレーノズルから噴霧されるセルロース溶液の粒子径としては、製造される多孔質セルロース媒体に、粒子径１～６００μｍ、さらには５～４００μｍ、さらには１０～２５０μｍの多孔質セルロース粒子が含まれれば特に制限されないが、好ましくは１０～２００μｍ程度が挙げられる。
　スプレーノズルとしては、液体を１０～２００μｍ程度の粒子径で噴霧できるものであれば特に制限されず、市販の二流体ノズル、三流体ノズルなどを使用することができる。
　セルロース溶液の微粒子化は、後述の凝固工程における凝固相の上から、噴霧されたセルロース溶液が重力で落下するように噴霧して行うことが好ましい。具体的には、凝固相の上にスプレーノズルを設置した状態で、スプレーノズルからセルロース溶液を空間内に噴霧し、重力による自由落下で凝固相に接触させるようにすることが好ましい。前記関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足し、かつ、所定の粒子径を有する本開示の多孔質セルロースをより一層好適に製造する観点から、凝固相の表面からスプレーノズルの先端までの高さとしては、好ましくは０．１ｍ～２０ｍ、より好ましくは１ｍ～２０ｍである。
（凝固工程）
　凝固工程においては、前記微粒子化工程で形成されたセルロース溶液の微粒子を、凝固相中で凝固させる。
　セルロース溶液の微粒子を凝固相中で凝固させる際には、前記の通り、セルロース溶液の微粒子を凝固相に接触させる。
　凝固相としては、セルロース溶液を凝固させるものとして公知のものが使用でき、例えば、アルコール、ケトン、エステル、エーテル、水、無機酸、及び無機塩水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液相もしくはその蒸気相、又は不活性気体の気相と前記液相もしくは蒸気相との組み合わせにより構成することができる。凝固相を構成する成分は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。凝固相は、セルロース溶液の溶媒とは異なる成分で構成されていることが好ましい。
　凝固相は、これらの中でも、水、アルコールの液相が好ましく、特にアルコールの液相を用いることが好ましい。また、水とアルコールの混合溶媒（アルコール水溶液）を用いることも好ましい。
　アルコールとしては特に制限されないが、炭素数６以下のアルコールが好ましく、炭素数４以下のアルコールがより好ましく、最も好ましいのはメタノールである。
　凝固相の温度としては、前記の関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足し、かつ、所定の粒子径を有する本開示の多孔質セルロースをより一層好適に製造する観点から、好ましくは－３０℃～５０℃程度、好ましくは－２０℃～４０℃程度が挙げられる。
　得られた多孔質セルロース媒体は、水、メタノールやエタノールなどのアルコールを用いた適当な方法で洗浄し、通常水湿の状態で保存することができる。前記の通り、多孔質セルロース媒体を乾燥させる場合には、糖類、グリセリンなどを適量加える。水湿で長期保存する場合には、腐敗を防ぐためにアルコールやアジ化ナトリウムなどの防腐剤を加える。また、グリセリンや糖類、尿素などを加えた状態で乾燥することもできる。
　以下に、実施例及び比較例を示して本開示を詳細に説明する。ただし、各実施例における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本開示の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本開示は、実施例によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。
＜実施例１＞
（セルロース溶液の調製）
　フラスコの中で水に水酸化ナトリウムを溶解、室温に冷却したのち、撹拌しながらこの中に粉末セルロース（旭化成　セオラスＰＨ１０１　重合度２００程度）を分散させた。更に尿素を加えて溶かしたのち、撹拌しながら約１時間をかけて－１５℃まで冷却、その後、水浴を用いて室温まで温めると、ほぼ透明な溶液となった。各試薬の添加量は、セルロース溶液の状態で、水酸化ナトリウムが７質量％、粉末セルロースが４質量％、尿素が１２質量％となるよう秤量・添加した。
（微粒子化）
　得られたセルロース溶液（温度２５℃）を三流体ノズルから窒素ガスと共に霧状に鉛直方向上から下へ噴霧（噴霧されたセルロース溶液の粒径は１０～２００μｍ程度）し、凝固相としての液体メタノール（温度２５℃）中に落下させた。噴霧する空間はノズルから流入する窒素ガスを逃がす排気口以外閉じられた空間（温度２５℃の窒素ガスで満たされている）とし、三流体ノズルの下方に液体メタノールが設置してある。排気口には噴霧したセルロースが噴霧空間から漏れないよう、フィルタを設置しており、噴霧空間が外部と比較して積極的に陰圧とならないように設計した。噴霧後、液体メタノール中に得られた微粉末を回収した。この微粉末を目開き２５０μｍの篩に通し、目開き１０μｍの篩の上で繰り返し水洗することにより、多孔質セルロース媒体（粒子径１０～２５０μｍ）を得た。
＜実施例２＞
　実施例１における粉末セルロースを再生セルロースとし、セルロース溶液の時点でのセルロース濃度を３質量％とした以外、実施例１と同様の手順で多孔質セルロース媒体（粒子径１０～２５０μｍ）を調製した。
＜実施例３＞
　実施例１における粉末セルロースを日本製紙　ＫＣフロック　Ｗ―２００（重合度２５０程度）とし、セルロース溶液の時点でのセルロース濃度を３質量％とした以外、実施例１と同様の手順で多孔質セルロース媒体（粒子径１０～２５０μｍ）を調製した。
＜実施例４＞
　実施例１における噴霧ノズルを二流体ノズルとした以外、実施例１と同様の手順で多孔質セルロース媒体（粒子径１０～２５０μｍ）を調製した。
＜実施例５＞
　実施例１における噴霧ノズルを実施例４とは異なる種類の二流体ノズルとした以外、実施例１と同様の手順で多孔質セルロース媒体（粒子径１０～２５０μｍ）を調製した。
＜実施例６＞
　実施例４におけるノズル下方に設置する液体メタノールの組成を水とメタノールの等量混合液とした以外、実施例４と同様の手順で多孔質セルロース媒体（粒子径１０～２５０μｍ）を調製した。
＜実施例７＞
　実施例４における水酸化ナトリウムを水酸化リチウムとし、セルロース溶液の時点での水酸化リチウム濃度を８質量％とし、尿素濃度を１５質量％とした以外、実施例４と同様の手順で多孔質セルロース媒体（粒子径１０～２５０μｍ）を調製した。
＜比較参考例１＞
　特許文献１の実施例２について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図５のグラフを作成した。
＜比較参考例２＞
　特許文献１の実施例３について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図５のグラフを作成した。
＜比較参考例３＞
　特許文献１の実施例４について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図５のグラフを作成した。
＜比較参考例４＞
　特許文献１の実施例５について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図５のグラフを作成した。
＜比較参考例５＞
　特許文献１の実施例７について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図５のグラフを作成した。
＜比較参考例６＞
　特許文献１の実施例８について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図５のグラフを作成した。
＜比較参考例７＞
　特許文献２の比較例１について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図６のグラフを作成した。
＜比較参考例８＞
　特許文献２の実施例４について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図６のグラフを作成した。
＜比較参考例９＞
　特許文献２の実施例１について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図６のグラフを作成した。
＜比較参考例１０＞
　特許文献２の実施例２について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図６のグラフを作成した。
＜比較参考例１１＞
　特許文献１の比較例２について示された結果（グラフ）から数値を読み取り、ゲル分配係数ＫavとｌｏｇＭｗの数値をプロットして図６のグラフを作成した。
＜ゲル分配係数Ｋavの測定と、ｌｏｇＭｗとの関係の算出＞
　実施例で得られた多孔質セルロース媒体を篩で分級し、目開き５３μｍと１０６μｍの篩の間に挟まれた画分をサイズ排除クロマトグラフィーの担体として用い、純水を移動相として、標準ポリエチレンオキシドをサイズ排除クロマトグラフィーに供し、ゲル分配係数Ｋavを求めた。具体的には、分級した多孔質セルロース媒体をカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製「Ｔｒｉｃｏｒｎ　１０／１００」）にベッド高さが８ｃｍ以上となるように充填した。高速液体クロマトグラフィーシステムに接続し、サイズ排除クロマトグラフィーの測定を行った。マーカーとしては、ポリエチレンオキシド（ＴＯＳＯＨ社製　ＴＳＫｇｅｌ標準ポリエチレンオキシド　ＳＥキット）およびデキストラン（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製　Ｂｌｕｅ　Ｄｅｘｔｒａｎ　２０００）を超純水に溶解して用いた。カラムに脱気した超純水を流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで通液しながら、先ず、カラム中のビーズ部分以外の体積を求めるために、重量平均分子量２×１０6のデキストラン（Ｂｌｕｅ　ｄｅｘｔｒａｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製　Ｂｌｕｅ　Ｄｅｘｔｒａｎ　２０００））の溶液を注入し、注入からＲＩモニターでピークが観測されるまでの通液量を求めた。次いで、各マーカーの溶液でも同様に通液量を求めた。測定値を下記式に代入し、Ｋavの値を算出した。
Ｋav＝（ＶR－Ｖ0）／（Ｖt－Ｖ0）
［式中、ＶRは各マーカー溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖ0は重量平均分子量２×１０6のデキストラン溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖtはカラム内のビーズの体積（ｍＬ）を示す。］
　以下に示す既定値１～７の直線と共に、図１～４に結果を示す。なお、比較参考例１～１１についても、特許文献１，２から数値を読み取り、ゲル分配係数Ｋavと、ｌｏｇＭｗとの関係を図５，６に示した。
既定値１の直線：４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＝－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５
既定値２の直線：５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、Ｋav＝０．１９
既定値３の直線：４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＝－０．５２１×ｌｏｇＭｗ＋２．９７
既定値４の直線：５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、Ｋav＝０．１７
既定値５の直線：４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＝－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋３
既定値６の直線：５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、Ｋav＝－０．０４８２×ｌｏｇＭｗ＋０．３
既定値７の直線：４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＝－０．５２１×ｌｏｇＭｗ＋３．２

Claims (6)

  1. 　粒子径が１～６００μｍの多孔質セルロース粒子を含む、多孔質セルロース媒体であって、
    　前記多孔質セルロース媒体を篩で分級し、目開き５３μｍと１０６μｍの篩の間に挟まれた画分をサイズ排除クロマトグラフィーの担体として用い、純水を移動相として、標準ポリエチレンオキシドをサイズ排除クロマトグラフィーに供した場合に、前記標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、以下の関係（Ａ）及び（Ｂ）を充足する、多孔質セルロース媒体。
    ４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５　　（Ａ）
    ５．７５≦ｌｏｇＭｗにおいて、０≦Ｋav＜０．１９　　（Ｂ）
  2. 　前記標準ポリエチレンオキシドの重量平均分子量Ｍｗとゲル分配係数Ｋavとが、以下の関係（Ｃ）を充足する、請求項１に記載の多孔質セルロース媒体。
    ４．８０≦ｌｏｇＭｗ≦５．５０において、－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋３＞Ｋav＞－０．４４５×ｌｏｇＭｗ＋２．５５　　（Ｃ）
  3. 　セルロース溶液をスプレーノズルから空間中に噴霧して微粒子とする微粒子化工程と、
    　前記微粒子を凝固相中で凝固させる凝固工程と、
    を備える、多孔質セルロース媒体の製造方法であって、
    　前記微粒子化工程において、前記セルロース溶液を噴霧する前記空間に供給される気体は、前記スプレーノズルから前記セルロース溶液と共に供給される気体のみに制御されている、多孔質セルロース媒体の製造方法。
  4. 　前記セルロース溶液の溶媒が、銅エチレンジアミン液、Ｎ－メチルモルホリンオキシド（ＮＭＭＯ）一水和物、苛性アルカリ－尿素系水溶液、チオシアン酸カルシウム水溶液、塩化リチウムのＮ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド溶液、塩化リチウムのジメチルフォルムアミド溶液、塩化リチウムのジメチルイミダゾリウム溶液、及び塩化リチウムのジメチルスルホキシド溶液からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
  5. 　前記凝固相は、前記セルロース溶液の溶媒とは異なる成分で構成されている、請求項３又は４に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
  6. 　前記凝固相は、アルコール、ケトン、エステル、エーテル、水、無機酸、及び無機塩水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液相もしくはその蒸気相、又は不活性気体の気相と前記液相もしくは蒸気相との組み合わせにより構成されている、請求項３～５のいずれか１項に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
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