KR20160128411A

KR20160128411A - 강건한 항체 정제

Info

Publication number: KR20160128411A
Application number: KR1020167027436A
Authority: KR
Inventors: 로마스 스쿠다스; 마티아스 왼크; 비앙카 에델만; 지몬 브라운; 미카일 코즐로프; 매튜 티 스톤; 케빈 갈리포
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2015-02-18
Publication date: 2016-11-07
Also published as: EP3114455A1; SG11201607341SA; US10457720B2; US20170073394A1; ES2784638T3; JP2017509621A; JP7037275B2; CA2942134A1; JP2020128373A; CN106103477A; KR102405382B1; WO2015131978A1; EP3114455B1; DK3114455T3; SG10201807572PA; JP7153041B2; CN106103477B; CA2942134C

Abstract

본 발명은 항체 함유 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질의 분리 방법에 관한 것이다.

Description

강건한 항체 정제 {ROBUST ANTIBODY PURIFICATION}

본 발명은 항체 함유 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

단백질 A 및 단일클론 항체의 정제

항체 (mAbs)는 약제학적 응용을 위해 사용되기 때문에, 이들은 예외적으로 높은 순도여야 한다 [A. Jungbauer, G. Carta, in: Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim (Germany) 2010].

단백질 A는 처음에는 세균 황색포도구균의 세포 벽에서 본래 발견된 56 kDa 표면 단백질이다. 단백질 A는 스파(spa) 유전자에 의해 암호화되고, 이것의 조절은 DNA 위상학, 세포성 삼투압, 및 ArlS-ArlR로 불리는 2성분 시스템에 의해 조절된다. 단백질 A는 면역글로불린을 결합시키는 이것의 능력 때문에 생화학적 연구에 사용되어 왔다. 단백질 A는 원래, 3개 나선 다발로 접히는 5개의 동종 Ig-결합 도메인으로 구성된다. 각각의 도메인은 많은 포유동물 종으로부터의 단백질, 가장 두드러지게는 IgG을 결합시킬 수 있다. 각각의 도메인은 인간 VH3 과의 경우에 Fab 영역 내 및 또한 가장 큰 면역글로불린의 Fc 영역 내 중쇄(heavy chain)를 결합시킨다. (정상 항체 기능과 비교하여) IgG 분자가 잘못된 배향으로 결합되는 혈청 내에서 이들의 상호작용을 통해서 세균은 옵소닌화 및 포식작용을 파괴시킨다.

일반적으로, 현재 판매되는 대부분의 치료용 단일클론 항체 (mAbs)를 제조하는데 포유동물 세포 배양물이 사용된다. 이러한 약물 항체의 생산은 전형적으로, 항체를 세포외액 내로 분비하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포의 현탁액을 함유하는 생물반응기에서 시작된다. 그 후, 생성되는 항체에 세포, 세포 파편, 숙주 세포 단백질 (HCP), 지질, DNA, 바이러스, 세균, 항체 응집체 등을 제거하는 정화, 여과 및 정제를 포함하는 일련의 과정을 실시한다. 이러한 일련의 과정은 종종 하류 과정 (DSP)으로 칭해진다.

가장 일반적으로 사용된 DSP에는 하나 또는 두 개의 결합-용출 크로마토그래피 정제 단계에 이어, 하나 또는 두 개의 유체-통과(flow-through) 연마 단계가 포함된다. 전형적인 하류 정제 과정에는 다공성 비드 기반의 크로마토그래피 매질(media)로 채워진 패킹된 컬럼 또는 멤브레인 기반의 장치가 사용된다. 이러한 단위 조작은 연속적으로 사용되며, 각각은 유체-통과 연마 또는 결합/용출 포획 방식으로 미립자 불순물을 제거하는 것을 목표로 한다. 연마 매질의 주요 목적 중 하나는, 불순물 농도를 감소시키는 것이다 (예를 들어, mAb 농도에 대해서는 < 10 ppm으로 HCP 감소).

요컨대, 전형적인 항체 정제 과정에는 초기 단백질 A 친화 포획 단계에 이어, 하나 이상의 이온 교환 연마 단계가 포함되는데, 이들의 목적은 하나 이상의 중요 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 다른 저분자량 물질의 수준을 감소시키는 것이다. 항체 단편은 특히 항체로부터 분리하기가 어려운데, 그 이유는 이들 단편, 특히 FC 함유 단편이 유사한 특성을 갖기 때문이다. FC 함유 단편은 일반적으로 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여서는 분리되지 않는다.

일반적으로, 특정 조건에서 단백질 A 포획 단계 후에 추가의 항체 정제 단계 (예를 들어, CEX, AEX)가 수행되어 잔류 불순물이 제거된다. 이것에는 그러한 정제 단계 전에 항체 보유 용액의 많은 조정 (예를 들어, pH 조정, 전도도 조정)이 필요하다. 또한, 이러한 pH 및 전도도 이동은 관심 분자에 응력을 가하며 항체 관련 불순물 (예를 들어, 항체 응집체, 항체 단편)을 생성시킨다.

최근에는, 산업에서 생성물 품질 특성을 유지하는 정제 단계 수를 시험하고 감소시키려는 두드러진 경향이 있다. 또한, 생물반응기를 사용하여 더 높은 표현 역가를 얻기 위한 기술을 사용하는 것이 산업적으로 부상되고 있는 경향이다. 이러한 두 개 경향을 조합시키려면 컬럼 상으로 더 많은 생성물을 로딩해야 했고, 이에 의해 상당히 고가의 크로마토그래피 매질의 증가된 부담 뿐 아니라 더 낮은 생성물 순도가 초래되었는데, 이 둘 모두는 바람직하지 않다.

원하는 단백질성 생성물, 예컨대 항체 또는 특수한 단백질 단편의 크로마토그래피 정제의 선택성을 개선시키기 위해서, 정제 방법의 변경과 함께 다양한 크로마토그래피 재료가 개발되어 오고 있다. 특히 분리 재료 표면의 특정한 유도체화(derivatization)는, 정화된 세포 배양물 매질 내 원하는 생성물로부터 원하지 않는 불순물을 더욱 선택적으로 분리해야 한다. 그러나 이러한 특수하고 복잡한 표면 유도체화는 이러한 크로마토그래피 재료의 생산을 상업적으로 입수가능한 생성물보다 훨씬 더 고가로 만들어서, 산업적인 규모 정제에서 이들의 사용이 덜 관심을 끌게 된다.

크로마토그래피 재료 분야에서의 다른 발전은 유기 기재(substrate) 기반의 분리 재료를 이끌어 내었는데, 그 이유는 실리카 재료 기반의 상업적으로 입수가능한 재료는 일반적으로 염기성 환경에서 영향을 받으며, 특히 재생 동안 안정성을 잃는다.

유기 중합체 기반의 정지 상은 광범위한 pH 조건에 걸쳐서 작동될 수 있다. 따라서, 고분자 수지는 높은 pH 조건 하에서 활발하게 세정될 수 있다. 그러나, 현재의 고분자 정지 상은 고성능 생체분자 분리에 사용된 중압 내지 고압 조건에서 약간 압축될 수 있다.

비-용매의 존재 하에서 디비닐벤젠(DVB)-함유 혼합물의 현탁 중합으로부터 생성된 통상적인 거대다공성 공중합체는, 광범위한 다공 크기 분포 및 표면적을 갖는 중합체를 나타낸다. 그와 같은 중합체 비드는 예를 들어, US 4,686,269에 개시되어 있다. 이러한 중합체 비드는 0.5 내지 50 μm의 평균 입자 직경을 갖는 비닐-방향족 단량체로부터 제조된다. 그러나, 이들은 생산 규모의 크로마토그래피 컬럼에 일반적으로 사용된 고압 조건 하에서는 강성을 나타내지 않는다. 크로마토그래피에 사용된 중합체 비드의 강성은, 이 비드가 다공성 중합체 정지 상과 함께 분리 동안 필수적인 압력 및 유동 특성을 제공하기 때문에 필수적이다.

해결되어야 하는 문제는, 중요 불순물, 예컨대 HCP 및 항체 단편의 수준이 감소되는, 유체 통과 방식으로 광범위한 조건에서 효과적으로 적용가능한, 강건하며 신뢰성 있는 항체 정제 단계가 필요하다는 것이다.

본 발명은, 항체 함유 용액을 적합한 시간 기간 동안 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시켜서 항체가 주로 용액 내에 머물며, 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질은 소수성 크로마토그래피 재료에 의해 흡착되는, 항체 함유 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

상세하게, 소수성 크로마토그래피 재료는 미립자이고, 이것은 가교결합된 비닐벤젠, 에틸스티렌, 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠으로, 또는 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메틸아크릴레이트 수지로 구성된다. 바람직하게는 상기 수지는 98:2 내지 10:90 중량% 비의 스티렌 및 디비닐벤젠으로 구성된 가교결합된 중합체로 구성된다. 변형된 형태에서, 상기 미립자 재료는 98:2 내지 10:90 중량% 비의 디비닐벤젠 및 에틸렌글리콜디-메타크릴레이트의 공중합체로 가교결합되는 폴리스티렌으로 구성된다.

원하는 항체로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 제거하고 분리하기 위해서, 2-11의 범위 내, 바람직하게는 5-9의 범위 내 pH 값, 및 1-150 mS/cm 범위 내, 바람직하게는 2-50 mS/cm 범위 내 전도도를 갖는 수성의 정화된 세포 배양물 용액을 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시킨다. 바람직하게는 상기 수성 용액을 150-1000 cm/min의 범위 내, 바람직하게는 300-900 cm/min의 범위 내 유속에서 통과시킨다. 특히 바람직한 구현예에서, 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질의 분리물은 단백질 A 친화 결합 단계 후에 처리된다. 필요하다면, 정제 순서에는 이온 교환 수지를 사용한 처리가 포함된다.

보통 분리물은 10 μm 내지 600 μm의 범위 내, 바람직하게는 20 μm 내지 150 μm의 범위 내, 가장 바람직하게는 20 μm 내지 63 μm의 범위 내 평균 입자 직경을 갖는 미립자, 소수성 크로마토그래피 분리 재료를 사용하여 처리된다. 이러한 크기의 적합한 소수성 다공성 중합체 비드는 4 내지 500 nm의 범위 내, 더욱 바람직하게는 10 내지 30 nm의 범위 내, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm의 범위 내 바람직한 다공 크기를 갖는다.

이상에 명시되어 있듯이, 정제 순서에는 단백질 A의 분리를 위해 특정된 이온 교환 수지를 사용한 적어도 1회의 처리가 포함될 수 있다. 그와 같은 이온 교환 수지를 사용한 처리 및 다공성 소수성 중합체 비드를 사용한 처리를 조합시키면, 유리하게 <10 ng까지 HCP가 고갈되게 되고 걸러진(leached) 단백질 A가 동시에 제거된다. 이 경우에 소수성 중합체 입자가 가교결합된 비닐벤젠, 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠으로, 또는 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메틸아크릴레이트 수지로 이루어지면, 특히 우수한 세정 효과가 얻어진다.

본 발명의 대상은 특히, 항체 함유 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 분리하기 위한, 4 nm 내지 500 nm의 범위 내, 바람직하게는 10 nm 내지 30 nm의 범위 내, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm의 범위 내 다공 크기를 갖는 소수성 크로마토그래피 분리 재료의 용도이다. 본 발명의 사용된 소수성 크로마토그래피 분리 재료는 바람직하게는 가교결합된 비닐벤젠, 가교결합된 에틸스티렌, 폴리스티렌/폴리에틸스티렌-디비닐벤젠으로, 또는 폴리스티렌/폴리에틸스티렌-디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메틸아크릴레이트 수지로 구성된다. 특히 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 사용된 소수성, 강성 중합체 비드는 10μm 내지 600 μm의 범위 내, 바람직하게는 20 μm 내지 150 μm의 범위 내, 가장 바람직하게는 20 μm 내지 63 μm의 범위 내 평균 입자 직경, 및 4 nm 내지 500 nm의 범위 내, 바람직하게는 10 nm 내지 30 nm의 범위 내, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm의 범위 내 다공 크기를 갖는다.

발명의 상세한 설명

본원에 기재된 다양한 실험에서, 다공성 소수성 상호작용 재료, 예컨대 다공성 폴리(디)비닐 방향족 비드가 세포 배양물 용액으로부터 대규모 항체 정제에 유용하다는 것이 발견되었다. 이러한 정제 단계들은 관심있는 단백질을 함유하는 샘플 (예를 들어, 정화된 세포 배양물 용액) 중에 존재하는 하나 이상의 불순물의 수준을 감소시키기 위해 포획 크로마토그래피 단계의 상류 또는 하류에서 수행될 수 있다.

이러한 목적을 위해, 정화된 세포 배양물 용액을 소수성 상호작용 재료와 접촉, 예를 들어 다공성 소수성 폴리스티렌 비드와 접촉시키고, 저분자량 물질의 수준을 선택적으로 감소시키도록 특정 시간 기간 동안 인큐베이션시킨다. 이 과정에 의해, 관심있는 항체를 함유하는 배양물 용액으로부터 원치않는 항체 단편 및 HCP를 선택적으로 감소시킬 수 있다. 상기 소수성 상호작용 재료는 단백질 A 포획 후의 항체 용액에 대해 적용되고, 정화된 세포 배양물 용액을 적합한 시간 기간 동안 상기 재료와 접촉시킴으로써 저분자량 물질 (예를 들어, 항체 단편, HCP)의 수준을 선택적으로 감소시키는데 특히 적합하다. 이 정제 과정을 수행하기 위해, 소수성 상호작용 재료 (예를 들어, 폴리스티렌 비드)를 하나 또는 여러 개의 크로마토그래피 컬럼(들) 또는 다른 장치, 예컨대 필터 하우징 등의 내로 편입시킨다. 그 후, 이러한 패킹된 컬럼은 유체-통과 방식으로 단백질 정제 과정에 사용되어, 배양물 용액의 저분자량 물질, 예컨대 항체 단편 및 HCP가 컬럼 유체 통과 동안 소수성, 다공성 상호작용 재료와 상호작용하고, 저분자량 물질 (예를 들어, 항체 단편, HCP)의 수준이 감소된다. 이 경우에, 유속이 150 cm/min - 1000 cm/min, 및 특히 300 - 900 cm/min의 범위 내에 있도록 조정되면, 우수한 정제 결과가 얻어진다.

또한, 본원에 기재된 실험에서는, 정화된 배양액의 pH가 2 내지 11의 범위 내, 및 바람직하게는 3 내지 9의 범위 내에 있도록 조정되는 경우에 우수한 정제 결과가 얻어질 수 있음이 발견되었다.

동시에, 용액의 전도도가 1 mS/cm 내지 50 mS/cm의 범위 내, 및 특히 2 - 50 mS/cm의 범위 내에 있는 경우에 유리한 것으로 입증되었다.

본원에서의 실험에 의해 입증되었듯이, 고순도의 정화된 세포 배양물 매질이, 작은 다공성 중합체 비드 형태의 소수성 상호작용 재료를 사용함에 의해서 성취될 수 있음이 특히 놀라운 것으로 발견되었다. 일부 구현예에서, 이 재료는 주로 폴리스티렌 또는 폴리에틸스티렌으로 이루어지며, 소수성 및 친수성 단량체, 예를 들어 디비닐벤젠 (DVB) 및 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (EGDMA)의 혼합물에 의해 가교결합될 수 있다.

다공성 중합체 비드는 전형적으로 현탁 중합에 의해서 생성된다. 이 비드는 예를 들어, US 4,382,124에 개시된 방법과 유사하고, 단량체에 대한 용매이지만 중합체에 대한 용매는 아닌 다공 유도물질 (porogen) ("상 연장제" 또는 "침전제"로 또한 공지됨)의 존재 하에서 현탁 중합에 의해 공중합체 비드 내로 다공도(porosity)가 도입되는 방법으로 생성될 수 있다. 통상적인 다공성 중합체, 예컨대 US 4,382,124에 따라 제조된 것들은 전형적으로 광범위한 다공 유도물질 유형, 단량체 상(phase)에 대한 다공 유도물질 농도, 단량체 유형, 가교결합되는 단량체 유형, 가교결합제 수준, 중합 개시제 및 개시제 농도의 사용을 포함한다. 그러나, 본 발명은 소수성 단량체의 비가 특별한 범위 내에 있는 경우에, 이러한 중합체 비드가 세포 배양액으로부터 항체를 정제하는데 특히 적합하며 효과적이라는 예상치 않은 발견에 기반하고 있다.

이론에 결합시키기 원치 않지만, 본 발명의 경우에, 중합체 내 소수성 분자의 함유된 몫을 증가시켜서 중합체 매트릭스를 변경시키는 경우에 목표 분자에 대한 증가된 용량이 주로 얻어지는 것으로 생각된다. 이러한 변경은, 목표 분자의 다공도, 강성 및 결합 용량의 파라미터에 함께 영향을 미치는 중합체 형성 단량체, 다공 유도물질의 양 및 가교결합제 수준의 균형을 고려하여 수행되었다.

놀랍게도, HCP의 현격하게 개선된 분리는 이러한 선택된 개방 다공성의 소수성 중합체 비드에 의해서 성취될 수 있다. 다공성 구조에 의해 분자가 중합체 매트릭스 내로 및 밖으로 신속하게 확산될 수 있고, 중합체 비드의 다공도 때문에 세포 배양물 매질 중에 함유된 불순물 및 원치 않는 단백질과의 상호작용에 큰 표면적이 이용가능하다. 따라서, 이러한 재료는 정지 상 내 생체분자를 분리하는데 매우 효과적이다. 가장 최신식의 상업적인 고분자 역상 크로마토그래피 정지 상이 이러한 기준에 가깝게 설계되는 것으로 보이며, 저압 조건 하에서 사용되지만, 더욱 높은 압력 조건 (전형적으로는 10 내지 100 bar 범위 내)에서 이러한 재료는 압축될 수 있다. 운 좋게도, 본 발명에 따른 중합체 비드는 증가된 강성을 가지며, 동시에 높은 다공도를 가져서, 입자 내 확산을 위한 높은 용량을 제공한다.

본 발명에 사용된 소수성 다공성 중합체 비드는, 단일클론 항체 함유 용액을, 1 내지 100 cm의 범위 내, 바람직하게는 5 내지 50 cm의 범위 내 직경을 가지며 100 bar 이하의 압력에서 및 바람직하게는 0.2 내지 80 bar의 압력에서 작동되는 액체 크로마토그래피 컬럼 내 중합체 비드와 접촉시킴으로써, 상기 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 제거하는데 유용하다. 전형적으로, 분취(preparative) 규모 컬럼은 10 내지 50 cm의 범위 내이며, 0.2 내지 80 bar의 범위 내 압력에서 작동된다.

본 발명에 따른 다공성 중합체 비드는 (예컨대, 직경이 1 내지 100 cm 범위 내인 컬럼에서) 고성능 역상 액체 크로마토그래피를 통해 생체분자를 분리 및 정제하는데 유용한 중합체 비드에 대해 전형적인 크기인 200 μm 이하의 평균 입도 직경을 갖는 전형적으로 구형의 공중합체 비드이다.

일반적으로, 다공성 분리 재료는, 이들이 10 내지 600 μm의 범위 내, 바람직하게는 20 내지 150 μm의 범위 내 평균 입도 직경 (d₅₀)을 갖는 경우에 특히 효과적임이 발견된 반면, 20 내지 63 μm의 범위 내 평균 입도를 갖는 그와 같은 재료가 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다.

4-500 nm의 범위 내 다공 크기를 갖는 그와 같은 소수성 분리 재료, 바람직하게는 폴리스티렌 비드가 원하는 분리 효과에 적합한 것으로 보인다. 정제 실험으로부터 10-30 nm의 평균 다공 크기를 갖는 소수성 상호작용 재료가 바람직한 분리 결과를 나타냄이 입증되었다. 이러한 바람직한 분리 결과는, 적합한 재료로 되어 있고 13 내지 25 nm 범위 내 평균 다공 크기의 구형의 소수성 중합체 비드가 사용되는 경우에 추가로 개선될 수 있다. 본 발명의 적합한 다공성 중합체 비드는 바람직하게는 300 내지 1000 m²/g (그램 당 제곱미터)의 범위 내, 더욱 바람직하게는 450 내지 850 m²/g의 범위 내, 및 가장 바람직하게는 500 내지 800 m²/g의 범위 내 표면적 (BET)을 보유한다.

본원에 기재된 다공성 중합체 비드의 제조에 사용될 수 있는 적합한 단일포화된 비닐방향족 단량체에는 비제한적으로 스티렌, C1-C4-알킬-치환된 스티렌, 비닐나프탈렌 및 비닐안트라센이 포함된다. 바람직하게는 단일포화된 비닐방향족 단량체는 스티렌 및 C1-C4-알킬-치환된 스티렌 중 하나 이상으로부터 선택된다. 적합한 C1-C4-알킬-치환된 스티렌의 그룹에는 에틸비닐벤젠, 비닐톨루엔, 디에틸스티렌, 에틸메틸스티렌 및 디메틸스티렌이 포함된다. 각각의 언급된 비닐방향족 단량체의 다양한 위치 이성질체 중 임의 것이 적합한 것으로 이해된다.

이는, 특히 본 발명에 적합한 다공성 중합체 비드가 비닐벤젠 (스티렌), 에틸스티렌, 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 디비닐나프탈렌, 디비닐안트라센, 디비닐크실렌 및 이러한 단량체의 임의 구조 이성질체로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단량체(들)를 사용하여 제조될 수 있음을 의미한다.

바람직하게는 다공성 중합체는 비닐벤젠 (스티렌) 및 디비닐벤젠, 또는 에틸스티렌 및 디비닐벤젠의 공중합체를 사용하여 제조된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 적용된 가교결합된 다공성 중합체 비드는 98:2 내지 10:90%의 서로에 대한 중량 비로 스티렌/ 및 디비닐벤젠을 포함한다.

임의로 지방족 불포화 단량체, 예를 들어 (메트)아크릴산, 및 (메트)아크릴산의 알킬 에스테르가 또한, 비닐방향족 단량체에 추가하여 본원에 기재된 상기 소수성, 다공성 중합체 비드를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 지방족 불포화 단량체는 원하는 중합체 비드의 제조에서 가교결합제로서 사용될 수 있다.

적합한 지방족의 가교결합되는 단량체는 에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 디에틸렌글리콜 디비닐 에테르 및 트리비닐사이클로헥산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고, 이들은 본 발명에 따른 가교결합된 소수성 다공성 중합체 비드를 제조하는데 사용될 수 있다. 상기 지방족 단량체는 가교결합되는 단량체로 단독으로 또는 상기 언급된 폴리비닐방향족 단량체와 함께 사용될 수 있다. 둘 모두의 변형예에서, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 및 디에틸렌글리콜 디비닐 에테르가 다공성 비드를 제조하는데 특히 적합하다. 바람직하게는 이러한 지방족의 가교결합되는 단량체는 폴리비닐방향족의 가교결합되는 단량체와 함께 사용된다. 이러한 조건 하에서, 지방족 단량체는 전형적으로 강성 및 다공성의 중합체 비드를 형성시키는데 사용된 총 단량체 중량을 기준으로 0 내지 50%의 범위 내 양으로 및 바람직하게는 0 내지 30%의 범위 내 양으로 포함된다.

본원에 기재된 다공성 중합체 입자의 본 발명에 따른 사용에서는, 디비닐벤젠 또는 이것의 유도체와, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트 및 디에틸렌글리콜 디비닐 에테르로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단량체의 공중합체로 가교결합되는 폴리스티렌으로 이루어지는 다공성 중합체 비드를 사용하여 우수한 분리 결과가 얻어지며, 여기서 폴리스티렌 및 가교결합되는 공중합체의 비는 98:2 내지 10:90 중량%의 범위 내이다. 바람직한 구현예에서는, 98:2 내지 14:86 중량% 비의 디비닐벤젠과 에틸렌글리콜 메타크릴레이트의 공중합체로 가교결합되는 폴리(에틸)스티렌으로 이루어지는 다공성 입자가 사용된다. 이와 관련하여, 항체 함유 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 분리하기 위해서는, (디)비닐방향족 단량체가 50 중량% 초과의 양으로 함유되는 다공성 비드가 더욱 적합하다는 것이 발견되었다. 따라서, 약 10:90 내지 98:2 중량% 비의 디비닐벤젠과 에틸렌글리콜 메타크릴레이트의 공중합체로 가교결합되는 모노비닐방향족 중합체로 이루어지는 다공성 비드가 바람직하다. 상기 비가 약 14:86 중량%인 그러한 다공성 비드가 더욱 바람직하다.

바람직한 소수성 다공성 중합체는 비닐벤젠 (스티렌) 공중합체, 에틸비닐벤젠 (에틸스티렌) 공중합체, 디비닐벤젠 공중합체, 가교결합된 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 가교결합된 폴리스티렌 에틸렌글리콜-디메타크릴레이트, 가교결합된 폴리디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메타크릴레이트 중 하나 이상으로부터 선택된다. 가교결합된 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 및 디비닐벤젠과 에틸렌글리콜-디메타크릴레이트의 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌이 가장 바람직하다.

다공성 중합체를 제조하는데 유용한 다공 유도물질에는 소수성 다공 유도물질, 예컨대 (C₇-C₁₀)방향족 탄화수소 및 (C₆-C₁₂) 포화 탄화수소, 및 친수성 다공 유도물질, 예컨대 (C₄-C₁₀) 알칸올 및 폴리알킬렌 글리콜이 포함된다. 따라서, 적합한 다공 유도물질은 예를 들어, 톨루엔, 에틸벤젠, 오르쏘-크실렌, 메타-크실렌, 파라-크실렌으로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 언급된 탄화수소 중 임의 것의 다양한 위치 이성질체 중 임의 것이 적합한 것으로 이해된다. 바람직하게는, 방향족 탄화수소는 톨루엔 또는 크실렌, 또는 크실렌의 혼합물, 또는 톨루엔과 크실렌의 혼합물이다. 또한, 이상에서 명시된 바와 같이, 포화 탄화수소가 또한 다공 유도물질로 사용될 수 있다. 적합한 예에는 비제한적으로 예를 들어, 헥산, 헵탄 또는 이소옥탄이 포함된다. 본 발명의 경우에 바람직한 포화 탄화수소는 이소옥탄이다. 적합한 알칸올에는 비제한적으로 이소부틸 알콜, tert-아밀 알콜, n-아밀 알콜, 이소아밀 알콜, 메틸 이소부틸 카비놀, (4-메틸-2-펜탄올), 헥산올 및 옥탄올이 포함된다. 바람직하게는 다공 유도물질 혼합물은 하나 이상의 (C₅-C₈)알칸올로부터 선택된 친수성 다공 유도물질 및 하나 이상의 (C₇-C₁₀)방향족 탄화수소로부터 선택된 소수성 다공 유도물질을 포함한다.

전형적으로 다공 유도물질은 과량으로, 보통 단량체의 중량을 기준으로 100 내지 170%, 바람직하게는 115 내지 150% 및 더 바람직하게는 120 내지 140%의 총량으로 중합 현탁액에 첨가된다. 또한, 본 발명에 따른 중합체를 제조하는데 사용된 다공 유도물질은, 적어도 소수성 용매 및 임의로 덜 소수성 용매 ("친수성" 용매)를 포함하고 둘 모두가 다공성 비드의 형성을 지지하는 용매계와 혼합된다. 상기 덜 소수성 (또는 상기 언급된 "친수성") 용매는 예를 들어, 0.5 내지 5% 범위 내의 적어도 일부의 제한된 수 용해도를 갖는 반면, 소수성 용매는 10 내지 100 ppm 또는 그 미만의 수 용해도를 나타내는 것으로 자체 설명된다.

일반적으로, 적은 소수성을 갖는 다공 유도물질 (즉, "친수성 다공 유도물질") 대 소수성 다공 유도물질의 비는 0.7:1 내지 3:1의 범위 내, 바람직하게는 0.8:1 내지 2.5:1의 범위 내, 가장 바람직하게는 0.9:1 내지 2.4:1의 범위 내이다.

본 발명에 적합한 중합체를 제조하는데 유용한 중합 개시제는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 여기에는 단량체 가용성 개시제, 예컨대 퍼옥사이드, 하이드로퍼옥사이드, 및 관련된 개시제가 포함된다. 이러한 개시제는 상업적으로 입수가능하다. 아조 개시제, 예컨대 아조디이소부티로니트릴, 아조디이소부티르아미드 등이 또한 유용하다. 개시제의 성질에 따라서, 사용 수준은 포함되는 비닐 단량체의 총 중량을 기준으로 0.5 내지 10%의 범위 내이다.

또한, 다공성 중합체 비드를 제조하는데 유용한 분산제 또는 현탁제는, 이온성이며 1 내지 24개의 탄소 원자를 함유하는 소수성 알킬 쇄를 함유할 수 있는 통상적인 계면활성제일 수 있다. 현탁 중합에 적합한 분산제의 또 다른 상업적으로 입수가능한 그룹은, 에폭시화 하이드록시알킬셀룰로오스 유도체 기반인 비이온성 계면활성제이다. 전형적으로 이러한 첨가제는 수성 상의 총 중량을 기준으로 약 0.01 내지 4%의 수준에서 사용된다.

적합하다면, 다른 분산제가 사용될 수 있고, 그러한 계면활성제 및 분산제와 함께 적용될 수 있다. 예를 들어, 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 전분 등을 포함하는 고분자 분산제가 본원에서 사용된 다른 계면활성제 또는 분산제와의 혼합물로 사용될 수 있다. 그러나, 물로 헹굼으로써 제조된 중합체 비드로부터 용이하게 제거될 수 있는 이온성 계면활성제를 첨가하는 것이 가장 바람직하다.

본원에 개시된 다공성 소수성 중합체 비드를 제조하기 위해서, 현탁 보조제를 함유하는 연속 수성 상 용액을 제조한 다음, 이 용액을 폴리비닐방향족 단량체, 유리 라디칼 개시제 및 예를 들어, 1부의 단량체 혼합물 당 1 내지 1.7부의 (혼합된) 다공 유도물질 (소수성 및 친수성 다공 유도물질)을 함유하는 단량체 혼합물과 혼합한다. 그 후, 고온 (전형적으로 40 내지 100℃, 예를 들어, 1 내지 약 15시간)에서 중합된 단량체/다공 유도물질 조합물 및 다공 유도물질을, 후속하여 예를 들어, 증류 또는 용매 세척에 의해서 생성되는 중합체 비드로부터 제거한다. 그 후, 생성되는 다공성 중합체 비드를 통상적인 수단, 예컨대 탈수 및 건조에 의해 단리시킨다.

임의로, 중합체 비드의 제조에는 중합 동안 사용된 분산제 및 현탁제의 잔여물을 중합체 표면으로부터 세정하기 위한 처리가 포함될 수 있다. 이 처리에는 특허 문헌 (JP 61-141704 또는 JP 57-98504 또는 EP 1 179 732 B1)에 개시된 효소 처리가 포함될 수 있다.

제조된 중합체 비드는 이 비드의 다공도 및 기계적 강도 때문에 패킹된 컬럼에 특히 적합하다. 유리하게는, 이러한 다공성 및 강성의 중합체 비드는, 항체 함유 용액을 심지어 고압에서 액체 크로마토그래피 컬럼 내 이러한 중합체 비드와 접촉시켜서 상기 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 분리하는데 유용하다. 이러한 비드는 연장된 사용으로 인한 압력 증가(buildup) 없이 높은 처리량 속도에서 생체분자의 고성능 분리 및 정제에 특히 적합하다.

본 발명에 사용된 다공성 중합체 비드는, 역 크기 배제 크로마토그래피 (iSEC)에 의해 측정될 수 있는 선택된 다공도 및 다공 크기 분포에 의해 특성결정된다. 본 발명에 적합한 중합체 비드는 전형적으로 0.4 내지 1.0의 범위 내 및 바람직하게는 0.45 내지 0.75 범위 내의 다공도를 갖는다. 이러한 비드는 300 내지 100 m²/g [BET]의 범위 내, 더 바람직하게는 450 내지 850 m²/g의 범위 내, 및 가장 바람직하게는 500 내지 800 m²/g의 매우 좁은 범위 내 표면적을 보유한다.

본원에 개시된 중합체 비드는 예상치않게, 단일클론 항체 함유 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 분리하는데 매우 적합하다. 이 비드의 화학적 성질 및 나노 다공성 구조 때문에, 이러한 재료들은 저분자량 단백질과의 소수성 상호작용에 특히 적합하며, 크로마토그래피 컬럼 기반의 단백질 정제 과정 내로 유체-통과 방식으로 편입될 수 있다. 이러한 다공성 중합체 비드의 특성 및 공정 제어 유형에 의해 크로마토그래피 컬럼의 부담이 감소되고, 결과적으로 크로마토그래피 컬럼의 수명(life span)이 증가되는 동시에, 중요 불순물, 예컨대 HCP 및 항체 단편의 수준이 감소된다. 유리하게는, 적용된 폴리스티렌 비드는 유도체화시킬 필요가 없고, 따라서 이 정제 단계에서 일반적으로 사용된 크로마토그래피 겔보다 훨씬 더 비용 효과적이다. 본원에 기재된 분리 재료는 상당히 저가이며 재생될 수 있어서, 항체 정제 플랫폼의 전반적인 비용이 감소된다.

또한, 놀랍게도 본원에 기재된 소수성 재료는 하나 이상의 불순물의 수준을 감소시키기 위해 포획 크로마토그래피 단계의 상류 또는 하류에서 사용될 수 있다. 청구된 방법에 따른 일부 구현예에서, 단백질 A 친화 크로마토그래피 단계 전에 샘플을 소수성 재료와 접촉시킨다. 일반적으로, 단백질 A 친화 크로마토그래피 단계는 샘플을 소수성 재료와 접촉시키기 전에 사용된다.

부가적으로, 소수성 재료의 적용은, 이것이 크기 배제 메커니즘 및 저분자량 물질, 특히 분자량 < 70kDa 화합물의 소수성 흡착에 기반하고 있기 때문에, 제시된 예로 제한되지 않는다. 이에 의해 단일클론 항체 관련된 분자, 예컨대 항체 단편 또는 HCP의 선택적 제거가 얻어진다.

또한, 본 발명은, 본원에 기재된 크로마토그래피 재료가 재생될 수 있고 넓은 작동 윈도우 (예를 들어, pH 3-11; 전도도 1 mS/cm-50 mS/cm, 조작 속도 150 cm/min-1000 cm/min)에서 적용가능한 크로마토그래피 기반의 항체 정제 단계를 제공한다. 특히, 낮은 및 높은 pH 값에서 다공성 중합체 비드의 저항이 여기서 매우 이로운데, 그 이유는 만족스러운 재생이 가능하며 이러한 재료가 상당히 더 긴 수명을 갖기 때문이다.

이미 이상에서 명시되었듯이, 본원에 기재된 소수성 다공성 중합체 비드를 사용하여 정화된 세포 배양액으로부터 저분자량 물질, 특히 분자량 <70 kDa의 화합물의 제거는, 선택된 분리 재료가 압력에 대해 안정하고 고압에서 변형되기 쉽지 않기 때문에 산업적인 및 또한 미세-규모 둘 모두에서 수행될 수 있다. 사용자는 크로마토그래피 정제를 수행하는 방식에서 자유롭다. 적용된 세포 배양물 및 저분자량 단백질의 성질에 따라서, 다공성 중합체 입자의 한 또는 다른 조성물이 정제 단계에 대해 유리할 수 있는 것으로 자체 설명된다. 여기서, 당업자는 순수 (비닐) 알킬 방향족으로 된 다공성 중합체 또는 적합한 아크릴레이트에 의해 가교결합되는 것들을 선택한다. 이 경우에, 가장 적합한 중합체 비드는 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.

그러나, 이러한 재료들은 저분자량 물질, 특히 분자량 <70 kDa의 화합물, 예컨대 항체 단편 또는 HCP를 제거하기 위해 사용되는 것으로 제한되지 않는다. 놀랍게도, 이전 정제 단계에서 분리되지 않거나 씻겨져 나가는 단백질 A가 본 발명에 따른 다공성 소수성 중합체 비드를 사용하여 세포 배양물 매질로부터 용이하게 분리될 수 있음이 발견되었다. 놀랍게도, 세포 배양물 매질로부터 단백질 A의 분리는 다공성 중합체 비드를 사용하여 상기 매질의 pH 값과는 독립적으로 수행될 수 있다. 실험에서, 예를 들어, PS-DVB-EGDMA 수지는 정적인(static) 결합 조건 하에서 pH 4.00 및 pH 8.00 용액 중에서 단백질 A를 흡착할 수 있음이 입증될 수 있다.

단백질 A를 분리하기 위한 특정의 상업적으로 입수가능한 이온 교환 수지로 및 다공성 소수성 중합체 비드로 조합하여 처리하는 경우, 및 장치 순서가 연속적으로 연결되는 경우에, 예를 들어 이온 교환 수지로 패킹된, 예를 들어, Eshmuno®CPX에 이어 Eshmuno®Q에 이어 PS-DVB-EGDMA로 패킹된 컬럼에서, 걸러진 단백질 A의 제거를 포함하는 <10 ng까지의 HCP 고갈이 용이하게 얻어진다.

본 설명에 의해 당업자는 본 발명을 이해력 있게 실시할 수 있게 된다. 따라서 심지어 추가 설명 없이도, 당업자는 상기 설명을 가장 광범위한 범주에서 사용할 수 있을 것으로 추정된다.

어느 것이라도 명확하지 않으면, 인용된 공보 및 특허 문헌을 참고해야 하는 것으로 이해된다. 따라서, 이러한 문서들은 본 설명의 개시 내용의 일부로 간주된다.

본 발명의 보다 나은 이해를 위해 및 예시를 위해서, 본 발명의 보호 범위 내에 있는 실시예가 이하에 설명되어 있다. 이러한 실시예는 또한 가능한 변형예를 예시하기 위해 제공된다.

또한, 제시된 실시예에서 및 또한 본 설명의 나머지 부분 둘 모두에서, 조성물 중에 존재하는 성분 양은 항상 전체로 조성물을 기준으로 단지 합하여 100 중량% 또는 몰%가 되며, 더 높은 값이 명시된 퍼센트 범위로부터 비롯될 수 있다 하더라도 이 퍼센트를 초과할 수 없음이 당업자에게 자명하다. 따라서 달리 명시되지 않으면, % 데이터는, 비를 제외하고 부피 데이터로 표시되는 중량% 또는 몰%이다.

명세서 전체를 통하여 사용된 하기 용어들은, 문맥이 명확히 다른 것을 명시하지 않으면 하기 의미를 지녀야 한다:

용어 "알킬(메트)아크릴레이트"는 상응하는 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 에스테르를 칭한다; 유사하게, 용어 "(메트)아크릴"은 아크릴 또는 메타크릴산 및 상응하는 유도체, 예컨대 에스테르 또는 아미드를 칭한다. 이상에서 명시된 바와 같이, 칭해진 모든 퍼센트는 달리 특정되지 않으면, 관련된 중합체 또는 조성물 (용액)의 총 중량을 기준으로 중량 퍼센트 (%)로 표현될 것이다. 용어 "공중합체"는 위치 이성질체를 포함하는, 둘 또는 그 초과의 상이한 단량체의 단위체를 함유하는 중합체 조성물을 칭한다.

하기 약어들이 본원에서 사용된다:

g = 그램,

ppm = 중량/부피에 의한 백만분율,

m = 미터,

cm = 센티미터,

mm = 밀리미터,

μm = 마이크로미터 (마이크론) = 10^-6 m ,

nm = 나노미터 = 10^-9 m,

ml = 밀리리터, L = 리터. 달리 특정되지 않으면, 나열된 범위는 포함되고 조합가능한 것으로 읽혀져야 한다.

실시예 및 설명에서 뿐만 아니라 청구범위에서 제시된 온도는 항상 섭씨 온도 (℃)이다.

방법:

입자 특성:

입자의 특성결정은 당해 기술에 공지되어 있고, 하기 문헌에 기재되어 있다: I. C. Edmundson, Particle-size analysis, H. S. Bean, A. H. Beckett and J. E. Carles (eds) in: Advances in Pharmaceutical Sciences vol.2, Academic Press, London 1967, 95-174.

입도 분포 및 평균 직경은 Masterisizer 2000E (Malvern Instruments Ltd., UK)를 사용한 레이저 회절법에 의해 또는 레이저 광 차단 기술 (Accusizer™, 모델 770, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, Calif., USA)에 의해 측정될 수 있다.

미세구체(microsphere)의 형상 및 표면 특성 (다공도)은 주사 전자 현미경 (SEM) 분석에 의해 확립될 수 있다.

다공 크기는 당해 기술에 공지되어 있는 방법에 의해 측정된다. 큰다공(macropore)은 수은 다공측정법(porosimetry)을 사용하여 측정될 수 있다. 이 경우에, 다공 크기를 분석하기 위한 실험은 사용된 수은 다공측정법 분석기 (예를 들어, AutoPore IV 9500, Micromeritics, USA)의 프로토콜에 따라서 수행된다. 건조 후에 주사 전자 현미경 (SEM) (JSM-6700F. JEOL, Japan)에 의해 중합체 미세구체의 직경 및 표면 특성이 관찰되는 주사 전자 현미경사진 (SEM)으로부터 다공 치수를 또한 추정할 수 있다. 미세구체를 증류수 중에 재현탁시키고, 분산물을 알루미늄 호일 조각 위에 적하하고, 주위 대기에서 건조시킨다. 샘플을 양면 전도성 접착 테이프를 사용하여 금속 토막 위에 놓고, JFC-1600 미세 코팅기 (JEOL, Japan)를 사용하여 5 Pa 미만의 감압 하에서 금박으로 코팅한다.

중간다공(mesopore)의 다공 크기 및 이들의 비 표면적은 또한 하기 표준 프로토콜로 수행되는 질소 흡착/탈착 측정법 (BET-방법)을 사용하여 측정될 수 있다. 이 후자의 방법은 또한 BET 표면적을 측정하는데 사용될 수 있다.

HCP ELISA 시험

정제된 단백질은 항상, 숙주 세포 단백질 (HCP)로 칭해지는, 발현 유기체로부터의 소량의 오염되는 단백질을 함유한다. 생물학적 제제 내 이러한 숙주 세포 단백질 (HCP')은 정량적으로 및 정성적으로 확인되고 평가되어야 하는 과정-관련된 불순물이다. 본원에 개시된 분리 방법의 정제 효율성을 평가하기 위해서, ELISA (효소 면역 측정법) 시험 시스템이 사용된다. ELISA 시험 시스템은 특정 세균으로부터 또는 특정의 배양된 세포주 (예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물)로부터 HCP를 검출하기 위해 과정-특이적이다.

예를 들어, CHO HCP ELISA 키트의 원리는, 샘플 내 CHO 단백질의, 마이크로웰 상에 부동화시킨 하나의 항체, 및 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP)에 접합된 나머지 하나의 항체인 2개 항체에 대한 결합에 기반한다. 인큐베이션 및 세척 단계 후에, 발색 기질 (TMB)이 첨가되고, 샘플 중에 존재하는 항원의 양에 직접적으로 비례하는, 기질 상에서 HRP의 효소 반응에 의해 색채가 나타난다. 중지 용액을 첨가하여 반응을 종결시킨 다음, ELISA 마이크로웰 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정한다. 샘플 및 대조군 내 CHO 단백질의 농도를 CHO HCP의 표준 곡선으로부터 계산한다.

SDS-PAGE에 이어, BioDoc 겔 분석 소프트웨어를 통한 밴드 분석에 의해 수행된 분리된 HCP의 또 다른 정량화 방법.

SDS-PAGE 분석의 원리는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 이루어지고, 이들의 크기에 기반한 단백질 분리를 포함한다. 변성 및 환원 조건 하에서 샘플을 가열시킴으로써, 단백질이 풀리게 되고, SDS 세정제 분자로 코팅되어 폴리펩타이드 쇄의 길이에 비례하는 높은 순 음 전하가 얻어진다. 겔 매트릭스 상으로 로딩되고 전기 장에 위치하는 경우에, 음으로 하전된 단백질 분자는 양으로 하전된 전극 쪽으로 이동하고, 분자 체 효과에 의해서 분리된다. 단백질 특이적인 염색 기술로 시각화한 후에, 공지된 분자량의 표준의 이동 거리와 단백질의 이동 거리를 비교하여 단백질 크기를 추정할 수 있다. 웨스턴 블롯팅으로 명명된 과정에서, 분리된 단백질이 양으로 하전된 멤브레인 위로 블롯으로 나타나고(blot), 단백질 특이적인 항체를 프로브 (probe) 하는 것이 또한 가능하다.

분리된 단백질의 문서화 및 후속한 분석은 학술(scientific) 등급의 디지털 카메라인 BioDocAnalyze 시스템을 통하여 수행될 수 있고, 여기에는 겔 및 블롯을 분석하기 위한 소프트웨어가 포함되었다. 이 시스템은 상업적으로 입수가능하다.

도 1a: 상이한 조건에서 처리한 후의 다양한 항체 단백질 A 포획 후 풀(pool) 내에서 mAb03 감소 및 HCP 감소 (%).
도 1b: 상이한 조건에서 처리한 후의 다양한 항체 단백질 A 포획 후 풀 내에서 mAb05 감소 및 HCP 감소 (%).
도 1c: 상이한 조건에서 처리한 후의 다양한 항체 단백질 A 포획 후 풀 내에서 mAb07 감소 및 HCP 감소 (%).
도 1d: 상이한 조건에서 처리한 후의 다양한 항체 단백질 A 포획 후 풀 내에서 mAb08 감소 및 HCP 감소 (%).
도 2a: 상이한 조건에서 31.4 nm 직경의 평균 다공을 갖는 다공성 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb05 감소 및 HCP 감소 (%).
도 2b: 상이한 조건에서 20.4 nm 직경의 평균 다공을 갖는 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb05 감소 및 HCP 감소 (%).
도 2c: 상이한 조건에서 15.8 nm 직경의 평균 다공을 갖는 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb05 감소 및 HCP 감소 (%).
도 3: 15.8 nm 직경의 평균 다공을 갖는 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb 감소 및 HCP 감소 (%).
도 4: 15.8 nm 직경의 평균 다공을 가지며 > 63μm (상부선), 40-63μm (중간선) 및 20-40μm (하부선) 범위 내의 상이한 입도로 분류된 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb 감소 및 HCP 감소 (%).
도 5: 평균 다공 크기 31.4 nm의 PS-DVB (PS01), 평균 다공 크기 20.4 nm의 PS-DVB (PS02), 및 평균 다공 크기 15.8 nm의 PS-DVB (PS03) 미립자 재료를 상이하게 로딩한 경우의 mAb03 수준 및 FC 함유 단편 돌파(break through) 수준.
도 6: 30422 (d₅₀-36.1μm) 및 PS02 (d₅₀-40.9μm) 재료가 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30410 (d₅₀-35.2 μm) 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30423 (d₅₀-35.5 μm)이 디비닐벤젠 (50%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (50%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb03 수준 및 HCP 돌파 수준.
도 7a: 30422 (d₅₀-36.1 μm) 및 PS02 (d₅₀-40.9 μm) 재료가 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30410 (d₅₀-35.2 μm) 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb06 HCP 돌파 수준. 시행 3 및 시행 5는 mAb06 단백질 A 포획 후 풀 (pH 5.0, 전도도-1.4 mS/cm)을 사용하여 수행되었고, 시행 4, 시행 7 및 시행 9는 mAb06 단백질 A 포획 후 풀을 사용하여 수행되었는데, 여기서 풀 전도도를 3 mS/cm로 증가시키기 위해서 NaCl를 첨가하였다.
도 7b: 30422 (d₅₀-36.1 μm) 및 PS02 (d₅₀-40.9 μm) 재료가 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30410 (d₅₀-35.2 μm) 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb06 LMW (%) 돌파 수준. 시행 3 및 시행 5는 mAb06 단백질 A 포획 풀 (pH 5.0, 전도도-1.4 mS/cm)을 사용하여 수행되었고, 시행 4, 시행 7 및 시행 9는 mAb06 단백질 A 포획 후 풀을 사용하여 수행되었는데, 여기서 풀 전도도를 3 mS/cm로 증가시키기 위해서 NaCl를 첨가하였다.
도 7c: PS02 (d₅₀-40.9 μm) 재료가 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, MS39 (d₅₀-35.2 μm) 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, AC가 천연 활성탄 (Nuchar HD)인, PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb05 LMW (%) 돌파 수준.
도 7d: PS02 (d₅₀-40.9 μm) 재료가 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, MS39 (d₅₀-35.2 μm) 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, AC가 천연 활성탄 (Nuchar HD)인, PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb05 HCP 돌파 수준.
도 8: 30410 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩되는 경우의 mAb03 HCP 돌파 수준. 시행 1 내지 3은 컬럼 세정 및 재평형화 후의 연속 시행을 나타낸다.
도 9: 30410 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩되는 경우의 mAb03 HCP 돌파 수준. P242는 경쟁적인 소수성 재료이고, P248은 경쟁적인 소수성 재료이고, Nuchar HD는 40-63μm로 크기 맞춰지는 활성탄 물질이다.
도 10a: 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료 상에 상이하게 로딩시킨 후의, 다양한 mAb03 단백질 A 포획 후 (예를 들어, Prosep Ultra Plus (PUP), Mab Select Sure, Eshmuno A) 풀 내 HCP 수준.
도 10b: 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료 상에 상이하게 로딩시킨 후의, 다양한 mAb07 단백질 A 포획 후 (예를 들어, PUP, MAB Select Sure Eshmuno A) 풀 내 HCP 수준.
도 11: 한 실험에서 NaCl를 0.5M 농도로 첨가한 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb03 HCP 돌파 수준. 30451 재료는 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30410 재료는 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어진다.
도 12: 30410 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우에 900 cm/h에서 작동된 mAb03 HCP 돌파 수준. P242는 경쟁적인 소수성 재료이고, P248은 또한 경쟁적인 소수성 재료이다.
도 13: DVB-EGDMA, Eshmuno^® S, 및 Eshmuno^® Q 수지 상에 흡착된 단백질 A의 환원된 SDS PAGE 분석.

실시예

베이스 비드:

폴리스티렌 기반 재료 (예컨대, P353, P374 및 P375)의 합성

25.6 g 폴리비닐알콜 및 0.38 g SDS를 614.2 g 물에 용해시켜서 하기 현탁 중합을 위한 수 상을 형성시켰다. 유기 상은 19.94 g 에틸비닐벤젠, 75g 디비닐벤젠, 41.57 g 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 90.24 g 톨루엔, 90.24 g 2-에틸-1-헥산올 및 0.96 g AIBN의 균질 용액에 의해서 형성시킨다. 상기 유기 상을 반응기 용기 내 수 상에 첨가하고, 2개의 상을 480 rpm에서의 교반기를 사용하여 25℃에서 유화시켜서, 예상된 입도 분포가 얻어지게 한다. 60분 후에, 640 g 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 72℃까지 가열시킨다. 2시간 동안, 온도를 72℃에서 유지한 다음, 82℃로 증가시킨다. 상기 혼합물을 추가 2시간 동안 82℃에서 중합시킨다. 중합 후, 현탁액을 여과 깔대기 상에서 여과하고, 입자를 60℃의 1.5 리터 물에 이어, 60℃의 5 리터 메탄올, 5 리터의 톨루엔 및 40℃의 2 리터 메탄올로 세척한다. 최종 생성물을 24시간 동안 50℃ 및 50 mbar에서의 진공 오븐에서 건조시킨다. 건조 질량에 대한 수득율은 정량적이다. 예상된 입도 분포에 따라서, 최신 기술의 과정에 따라 체 분리하여 최종 생성물을 분류한다.

실시예 1

이 실험에서는, 상이한 재료를 단백질 A 포획 후 풀로부터 불순물을 제거하는 이들의 능력에 대해서 평가한다. 2개의 소수성 재료:

a) 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB), 및

b) 디비닐벤젠 공중합체 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 공중합체로 가교결합된 폴리스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)를, 정적인 방식으로 불순물 제거에 대해서 시험한다. 포스페이트 완충 식염수 (PBS, 10 mM 포스페이트, pH 7.4)를, 시험된 재료에 단백질 A 포획 후 풀을 가하기 전에 이 시험된 재료에 대한 평형 및 세척 완충제로서 사용한다. 강한 교반 하에 및 미립자 재료 부피 당 하나의 항체 로딩 (중량 비)에 상응하는 한 세트를 로딩하면서, 밤새 샘플에 2개의 상이한 단백질 A 포획 후 풀을 가한다. 그러한 로딩량은 0.5, 1 및 2 kg/L이다. 밤새 인큐베이션 한 후에, 미립자 재료를 여과해 내고, 샘플을 크기 배제 크로마토그래피, HCP ELISA 및 HPLC 단백질 A 방법을 사용하여 분석하여 성능 데이터를 수집한다. 이 실험의 결과는, 이 실험에 사용된 둘 모두의 미립자 재료가 HCP 및 항체 단편을 흡착함을 나타낸다 (하기 표 1, 2 참고).

표 1: 다수 항체에 대한 정적인 단편 제거

표 2: 다수 항체로부터 정적인 숙주 세포 단백질 제거

그러한 실험 모두에서 항체 수득율은 80%를 초과하였다.

실시예 2

이 실험에서는, 상이한 재료를 단백질 A 포획 후 풀로부터 첨가된 항체 단편을 제거하는 이들의 능력에 대해서 평가한다.

소수성 재료:

b) 디비닐벤젠 공중합체 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)를 정적인 방식으로 불순물을 제거하는 이들의 능력에 대해서 조사한다.

포스페이트 완충 식염수 (PBS, 10 mM 포스페이트, pH 7.4)를, 시험된 재료에 모델 단백질 A 포획 후 풀을 가하기 전에 시험된 재료에 대한 평형 및 세척 완충제로서 사용하는데, 상기 단백질 A 포획 후 풀에는 파파인 소화된 항체 용액이 풍부하게 존재한다. 강한 교반 하에 및 미립자 재료 부피 당 하나의 항체 로딩 (중량 비)에 상응하는 한 세트를 로딩하면서, 밤새 샘플에 생성된 단백질 A 포획 후 풀을 가한다. 로딩량은 0.5 및 1 kg/L이다. 밤새 인큐베이션 한 후에, 미립자 재료를 여과해 내고, 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 및 HPLC 단백질 A 방법을 사용하여 분석하여 성능 데이터를 수집한다. 사용된 둘 모두의 미립자 재료가 첨가된 항체 단편을 흡착함이 주목된다 (하기 표 3 참고).

표 3: 첨가된 항체 단편의 정적인 단편 제거

모든 실험에서, 항체 수득율은 80%보다 높다.

실시예 3

이 실험에서는, 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB)를 다양한 항체 단백질 A 포획 후 풀로부터 HCP를 제거하는 이들의 능력에 대해서 평가하는데, 여기서 단백질 A 포획 후 풀은 광범위한 pH 및 전도도 조건으로 조정된다. 25 μl 미립자 재료 및 1000 μl PPP (포스비틴 포스포펩타이드; 상이한 pH 및 NaCl 농도의 완충제 중에서 1:4 희석됨)를 혼합시켜서 측정을 이중으로 실시하고, 30분 동안 인큐베이션한다. HCP 감소는 ELISA 검정을 통해 정량화한 반면에, mAb 감소는 SDS-PAGE를 통해 정량화하고, 후속한 밴드 분석은 BioDoc 겔 분석 소프트웨어를 통해 수행한다 (도 1a-d 참고).

도 1a: 상이한 조건에서 처리한 후의 mAb03 감소 및 HCP 감소 (%).

도 1b: 상이한 조건에서 처리한 후의 mAb05 감소 및 HCP 감소 (%).

도 1c: 상이한 조건에서 처리한 후의 mAb07 감소 및 HCP 감소 (%).

도 1d: 상이한 조건에서 처리한 후의 mAb08 감소 및 HCP 감소 (%)

실시예 4

이 실험에서는, (역 SEC 및 PSS 소프트웨어에 의해 추정된) 상이한 평균 다공 크기를 갖는, 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB)를, 광범위한 pH 및 전도도 조건으로 조정된 정화된 세포 배양물 풀로부터 HCP를 제거하기 위한 이들의 능력에 대해서 평가한다. 25 μl 미립자 재료 및 1000 μl PPP (상이한 pH 및 NaCl 농도의 완충제 중에서 1:4 희석됨)를 혼합시켜서 측정을 이중으로 실시하고, 30분 동안 인큐베이션한다. HCP 감소는 ELISA 검정을 통해 정량화한 반면에, mAb 감소는 SDS-PAGE를 통해 정량화하고, 후속한 밴드 분석은 BioDoc 겔 분석 소프트웨어를 통해 수행한다 (도 2a-c 참고):

도 2a: 상이한 조건에서 직경 31.4 nm의 평균 다공 크기를 갖는 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb05 감소 및 HCP 감소 (%).

도 2b: 상이한 조건에서 직경 20.4 nm의 평균 다공 크기를 갖는 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb05 감소 및 HCP 감소 (%).

도 2c: 상이한 조건에서 직경 15.8 nm의 평균 다공 크기를 갖는 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb05 감소 및 HCP 감소 (%).

실시예 5

이 실험에서는, (역 SEC 및 PSS 소프트웨어에 의해 추정된) 15.8 nm의 평균 다공 크기를 갖는, 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB)를, 정화된 세포 배양물 풀로부터 HCP를 제거하기 위한 이들의 능력에 대해서 평가한다. 25 μl 미립자 재료 및 1000 μl PPP (50 nM TRIS pH 9 0.5 M NaCl 중에서 1:4 희석됨)를 혼합시켜서 측정을 이중으로 실시하고, 30분 동안 인큐베이션한다. HCP 감소는 ELISA 검정을 통해 정량화한 반면에, mAb 감소는 SDS-PAGE를 통해 정량화하고, 후속한 밴드 분석은 BioDoc 겔 분석 소프트웨어를 통해 수행한다 (도 3 참고):

도 3: 직경 15.8 nm의 평균 다공 크기를 갖는 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb 감소 및 HCP 감소 (%).

실시예 6

이 실험에서는, (역 SEC 및 PSS 소프트웨어에 의해 추정된) 15.8 nm의 평균 다공 크기를 가지며 상이한 미립자 재료 크기 범위로 분류된 (체 분리), 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB)를, 단백질 A 포획 후 풀로부터 HCP를 제거하기 위한 이들의 능력에 대해서 평가한다. 25 μl 미립자 재료 및 1000 μl PPP (50 nM TRIS pH 9 0.5 M NaCl 중에서 1:4 희석됨)를 혼합시켜서 측정을 이중으로 실시하고, 30분 동안 인큐베이션한다. HCP 감소는 ELISA 검정을 통해 정량화한 반면에, mAb 감소는 SDS-PAGE를 통해 정량화하고, 후속한 밴드 분석은 BioDoc 겔 분석 소프트웨어를 통해 수행한다 (도 4 참고):

도 4: 15.8 nm 직경의 평균 다공을 가지며 > 63μm (상부 선), 40-63μm (중간 선) 및 20-40μm (하부 선) 범위 내의 상이한 입도로 분류된 PS-DVB 미립자 재료로 처리한 후의 mAb 감소 및 HCP 감소 (%).

실시예 7

이 실험에서는, (역 SEC 및 PSS 소프트웨어에 의해 추정된) 상이한 평균 다공 크기를 갖는, 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB)를, 단백질 A 포획 후 항체 풀로부터 파파인 소화 및 단백질 A 친화 정제 후의 도입된 중쇄 (FC) 함유 항체 단편을 제거하기 위한 이들의 능력에 대해서 평가하는데, 여기서 공지된 양의 소화되고 정제된 FC 함유 항체 단편이 항체 단백질 A 포획 후 풀 내에 스파이크되어 있다. 측정은 동적인 방식으로 수행하는데, 미립자 재료를 크로마토그래피 컬럼 내에 패킹시키고, 이 컬럼을 pH 5.0의 50 mM 아세테이트 완충제를 사용하여 평형화시킨 후에, 제조된 공급물로 300 cm/h에서 채운다. 단편 수준을 SEC-HPLC를 통해 정량화한다 (도 5 참고):

도 5: 평균 다공 크기 31.4 nm의 PS-DVB (PS01), 평균 다공 크기 20.4 nm의 PS-DVB (PS02), 및 평균 다공 크기 15.8 nm의 PS-DVB (PS03) 미립자 재료를 상이하게 로딩한 경우의 mAb03 수준 및 FC 함유 단편 돌파 수준.

실시예 8

이 실험에서는, 다양한 비의 디비닐벤젠 (PS-DVB) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)를, 단백질 A 포획 후 항체 풀로부터 HCP를 제거하는 이들의 능력에 대해서 평가한다. 측정은 동적인 방식으로 수행하는데, 미립자 재료를 크로마토그래피 컬럼 내에 패킹시키고, 이 컬럼을 ＞20 CV에서 50 mM 아세테이트 완충제 (pH 5.0, LF ~2 mS/cm)를 사용하여 평형화시킨 후에, 350 cm/h에서 mAb03 단백질 A 포획 후 공급물 (pH 5.0, LF ~3 mS/cm)로 채운다. 출발 HCP 농도는 900 ng/ml이고 mAb 농도는 8.4 mg/ml이다. 20-40μm 입도 및 평균 입도 분포로 크기 맞춰진 모든 재료를 Accusizer를 사용하여 추정하였다. 항체 수준을 SEC-HPLC를 통해 정량화하였고, HCP 양을 ELISA 측정을 통해 정량화하였다 (도 6 참고):

도 6: 30422 (d₅₀-36.1μm) 및 PS02 (d₅₀-40.9μm) 재료는 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30410 (d₅₀-35.2 μm) 재료는 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30423 (d₅₀-35.5 μm)은 디비닐벤젠 (50%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (50%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb03 수준 및 HCP 돌파 수준.

실시예 9

이 실험에서는, 다양한 비의 디비닐벤젠 (PS-DVB) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)를, 다양한 단백질 A 포획 후 항체 풀로부터 HCP 및 저분자량 물질 (예를 들어, 항체 단편)을 제거하는 이들의 능력에 대해서 평가한다. 측정은 동적인 방식으로 수행하는데, 미립자 재료를 크로마토그래피 컬럼 내에 패킹시키고, 이 컬럼을 ＞20 CV에서 50 mM 아세테이트 완충제 (pH 5.0, LF ~2 mS/cm)를 사용하여 평형화시킨 후에, 300 cm/h에서 항체 단백질 A 포획 후 공급물 (pH 5.0)로 채운다. 20-40μm 입도 및 평균 입도 분포로 크기 맞춰진 모든 재료를 Accusizer를 사용하여 추정하였다. 항체 수준을 SEC-HPLC를 통해 정량화하고, HCP 양을 ELISA 측정을 통해 정량화한다 (도 7a-d 참고):

도 7a: 30422 (d₅₀-36.1 μm) 및 PS02 (d₅₀-40.9 μm) 재료가 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30410 (d₅₀-35.2 μm) 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb06 HCP 돌파 수준. 시행 3 및 시행 5는 mAb06 단백질 A 포획 후 풀 (pH 5.0, 전도도-1.4 mS/cm)을 사용하여 수행되고, 시행 4, 시행 7 및 시행 9는 mAb06 단백질 A 포획 후 풀을 사용하여 수행되는데, 여기서 풀 전도도를 3 mS/cm로 증가시키기 위해서 NaCl를 첨가한다.

도 7b: 30422 (d₅₀-36.1 μm) 및 PS02 (d₅₀-40.9 μm) 재료가 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30410 (d₅₀-35.2 μm) 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb06 LMW (%) 돌파 수준. 시행 3 및 시행 5는 mAb06 단백질 A 포획 후 풀 (pH 5.0, 전도도-1.4 mS/cm)을 사용하여 수행되고, 시행 4, 시행 7 및 시행 9는 mAb06 단백질 A 포획 후 풀을 사용하여 수행되는데, 여기서 풀 전도도를 3 mS/cm로 증가시키기 위해서 NaCl를 첨가한다.

도 7c: PS02 (d₅₀-40.9 μm) 재료가 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, MS39 (d₅₀-35.2 μm) 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, AC가 천연 활성탄 (Nuchar HD)인, PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb05 LMW (%) 돌파 수준.

도 7d: PS02 (d₅₀-40.9 μm) 재료가 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, MS39 (d₅₀-35.2 μm) 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, AC가 천연 활성탄 (Nuchar HD)인, PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb05 HCP 돌파 수준.

실시예 10

이 실험에서는, 디비닐벤젠 (PS-DVB) (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)를, 다양한 단백질 A 포획 후 항체 풀로부터 HCP를 제거하고 세정 후의 미립자 재료를 재사용하는 이들의 능력에 대해서 평가한다. 측정은 동적인 방식으로 수행하는데, 미립자 재료를 크로마토그래피 컬럼 내에 패킹시키고, 이 컬럼을 ＞20 CV에서 50 mM 아세테이트 완충제 (pH 5.0, LF ~2 mS/cm)를 사용하여 평형화시킨 후에, 300 cm/h에서 단백질 A 포획 후 항체 공급물 (pH 5.0)로 채운다. 40-63 μm 입도 및 평균 입도 분포로 크기 맞춰진 재료를 Accusizer를 사용하여 추정하였다. 사용 후에, 컬럼을 20 CV 동안 60% DPG 용액으로 용리시키고, ＞20 CV에서 50 mM 아세테이트 완충제 (pH 5.0, LF ~2 mS/cm)를 사용하여 재평형화시킨다. 항체 수준은 SEC-HPLC를 통해 정량화하고 HCP 양은 ELISA 측정을 통해 정량화한다 (도 8 참고):

도 8: 30410 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩되는 경우의 mAb03 HCP 돌파 수준. 시행 1 내지 3은 컬럼 세정 및 재평형화 후의 연속 시행을 나타낸다.

실시예 11

이 실험에서는, 디비닐벤젠 (PS-DVB) (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)를, 상업적으로 입수가능한 소수성 재료와 비교하여, 다양한 단백질 A 포획 후 항체 풀로부터 HCP를 제거하는 이들의 능력에 대해서 평가한다. 측정은 동적인 방식으로 수행하는데, 미립자 재료를 크로마토그래피 컬럼 내에 패킹시키고, 이 컬럼을 ＞20 CV에서 50 mM 아세테이트 완충제 (pH 5.0, LF ~2 mS/cm)를 사용하여 평형화시킨 후에, 600 cm/h에서 단백질 A 포획 후 항체 공급물 (pH 5.0)로 채운다. 항체 수준을 SEC-HPLC를 통해 정량화하고, HCP 양을 ELISA 측정을 통해 정량화한다 (도 9 참고):

도 9: 30410 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩되는 경우의 mAb03 HCP 돌파 수준. P242는 경쟁적인 소수성 재료이고, P248은 경쟁적인 소수성 재료이며, Nuchar HD는 40-63μm로 크기 맞춰진 활성탄 물질이다.

실시예 12:

정적인 조건하에서 단일클론 항체의 용액으로부터 단일클론 항체 단편을 제거하기 위한 상이한 유형의 활성탄 또는 소수성 수지의 적용

이 대표 실시예는, 단일클론 항체 단편이 상이한 유형의 활성탄 및 상이한 유형의 소수성 수지를 사용한 정적인 처리에 의해서 단일클론 항체 용액으로부터 선택적으로 제거될 수 있음을 입증한다.

하기한 바와 같이 대략 1.7%의 단일클론 항체 단편을 지닌 MAB08의 용액을 제조한 다음, 정적인 조건 하에서 3개의 상이한 유형의 활성탄 중 하나 또는 2개의 상이한 유형의 소수성 수지로 처리한다.

정제된 단일클론 항체를 파파인 효소로 처리하여 이 항체를 단편으로 소화되게 함으로써 MAB08 원액(stock) 용액을 제조한다. 소화 후에, 0.3 M 아이오도아세테이트 용액을 첨가하여 효소를 불활성화시킨다. 소화된 단일클론 항체 용액을 투석 관(tubing) (표준 RC 투석 시험 키트, Spectra/Por 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT WIDTH, 일련 번호: 132725, Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, 90220 USA)을 사용하여 물 내로 투석하여 완충제 염을 제거한다. 대략 0.15 L의 소화된 단일클론 항체 용액을 함유한 상기 투석 관을 24시간 동안 4.0 L의 물에 잠기게 한다. 그 후, 투석 관을 4.0 L의 새로운 물을 함유한 새로운 용기로 옮기고, 여기서 추가 24시간 동안 잠기게 한 채로 유지하였다.

18.0 mL의 소화된 MAB II, 72.0 mL의 수 중의 미소화된 MAB08, 및 9.0 mL의 pH 7의 250 mM Tris로부터 단일클론 항체 단편이 스파이크 된 MAB08 용액을 제조한다. 그 후, 상기 용액을 0.22 μm 멤브레인 (0.22 μm Millipore Express^® PLUS 멤브레인을 구비한 Stericup^®-GP, 250 mL, 카달로그 번호: SCGPU02RE, EMD Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과시킨다.

그 후, 15 mL 원심분리 관에 5 mg 또는 10 mg의 MeadWestVaco Nuchar HD 활성탄 (MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, USA), 10 mg의 Norit Darco KB-G 활성탄 (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, USA), 또는 10 mg의 Norit CGP 수퍼 활성탄 (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, USA)을 넣는다. 제2 세트의 15 mL 원심분리 관에 25 μL 또는 50 μL의 DVB 소수성 수지 또는 DVB-EGDMA 소수성 수지를 넣는다. 대조로 사용되는 제3 세트의 15 mL 원심분리 관에는 매질을 첨가하지 않는다. 그 후, 1.7% 단편을 함유하는 5.0 mL의 단편 스파이크 된 MAB08 용액을 상기 원심분리 관에 첨가한다. 상기 관을 20시간 동안 회전시킨다. 그 후, 모든 관에 원심분리를 실시하고, 0.22 마이크론 멤브레인 (Millex^® Syringe Filter Units, Millex^®-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, 감마 멸균화됨, 카달로그 번호: SLGV033RB, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과하여, 용액 중에 현탁된 채로 남아있을 수 있는 임의의 입자를 제거한다. 샘플 중에 남아있는 MAB08의 양은 단백질 A HPLC에 의한 IgG 정량화로 측정한다. 샘플 중에 남아있는 단편의 백분율은 크기 배제 크로마토그래피로 측정한다.

하기 표 4에 요약되어 있듯이, 이 실험은, 상이한 유형의 활성탄 및 상이한 유형의 소수성 수지를 사용한 정적인 처리에 의해서 단일클론 항체를 함유하는 용액으로부터 단일클론 항체 단편을 선택적으로 제거할 수 있음을 입증한다. 단일클론 항체 용액에 첨가된 활성탄 또는 소수성 수지의 양이 증가됨에 따라 단편의 백분율이 감소된다. 데이터는, 둘 모두의 수지가 정적인 결합 조건 하에서 단일클론 항체의 용액으로부터 단일클론 항체 단편을 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있다는 예상치 못한 결과를 나타낸다.

표 4: 3개의 상이한 유형 활성탄 및 2개의 상이한 유형 소수성 수지를 사용한 MAB08 용액의 정적인 처리 후의 단편의 백분율 및 단일클론 항체의 회수.

실시예 13:

정적인 조건 하에서 단일클론 항체 용액으로부터 단일클론 항체 단편 및 HCP를 제거하기 위한 소수성 수지의 적용

이 대표 실시예는, 단일클론 항체 단편 및 HCP 둘 모두가 상이한 유형의 소수성 수지를 사용한 정적인 처리에 의해서 단일클론 항체 용액으로부터 선택적으로 제거될 수 있음을 입증한다.

대략 1.99%의 단일클론 항체 단편 및 21 ppm의 HCP를 지닌 MAB04의 용액을 제조한다. 그 후, 이 용액을 하기한 바와 같이 정적인 조건 하에서 2개의 상이한 소수성 수지 중 하나로 처리한다.

MAB04를 CHO 세포 배양물에 의해 생성시키고, 여기에 생성물을 pH 3.5의 50 mM 아세테이트를 사용하여 용리시키는 단백질 A 크로마토그래피 포획 과정을 실시한다. 1.8 M Tris 염기를 사용하여 용액 pH를 pH 7.5로 조정한 다음, 0.22 μm 멤브레인 (0.22 μm Millipore Express^® PLUS 멤브레인을 구비한 Stericup^®-GP, 250 mL, 카달로그 번호: SCGPU02RE, EMD Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과한다. 생성되는 용액은, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 1.99%의 단편을 갖는 것으로 측정되고 ELISA HCP 검정에 의해 21 ppm의 HCP를 갖는 것으로 측정된다.

그 후, 15 ml 원심분리 관에 12.5 μL, 25 μL 또는 50 μL의 가교결합된 디비닐벤젠 (DVB) 수지 또는 가교결합된 디비닐벤젠-에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (DVB-EGDMA) 수지를 넣는다. 대조로 사용되는 제2 세트의 15 mL의 원심분리 관에는 매질을 첨가하지 않는다. 그 후, 1.99%의 단편을 함유하는 5.0 mL MAB04 용액을 상기 원심분리 관에 첨가한다. 상기 관들을 24 시간 동안 회전시킨다. 그 후, 모든 용액을 0.22 마이크론 멤브레인 (Millex^® Syringe Filter Units, Millex^®-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, 감마 멸균화됨, 카달로그 번호: SLGV033RB, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과하여, 용액 중에 현탁된 채로 남아있을 수 있는 임의의 수지 입자를 제거한다. 샘플 중에 남아있는 MAB04의 농도를 280 nm에서 UV 분광광도계로 측정한다. 샘플 중에 남아있는 단편의 백분율은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정한다. 샘플 중에 남아있는 HCP 농도는 ELISA 검정에 의해 측정한다.

하기 표 5a 및 5b에 요약되어 있듯이, 소수성 수지로 처리한 후의 용액 내 단편의 백분율 및 단일클론 항체의 회수가 표시되어 있다. 실험은, 단일클론 항체 용액을 소수성 수지로 정적으로 처리하여 단일클론 항체 단편이 선택적으로 제거됨을 입증한다. 단일클론 항체 용액에 첨가된 소수성 수지의 양이 증가됨에 따라, 용액 중에 남아있는 단편의 백분율이 감소된다. 데이타는, 소수성 수지가 정적인 결합 조건 하에서 단일클론 항체의 용액으로부터 단일클론 항체 단편을 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있다는 예상치 못한 결과를 나타낸다.

표 5a: DVB-EGDMA 소수성 수지를 사용한 MAB04 용액의 정적인 처리 후의 단편의 백분율 및 단일클론 항체의 회수.

표 5b: 가교결합된 DVB 소수성 수지를 사용한 MAB04 용액의 정적인 처리 후의 단편의 백분율 및 단일클론 항체의 회수.

실시예 14:

이 대표 실시예는, 단일클론 항체 단편이 상이한 유형의 소수성 수지를 사용한 정적인 처리에 의해서 단일클론 항체 용액으로부터 선택적으로 제거될 수 있음을 입증한다.

대략 0.31%의 단일클론 항체 단편 및 578 ppm의 HCP를 지닌 MAB05의 용액을 제조한다. 그 후, 이 용액을 하기와 같이 정적인 조건 하에서 2개의 상이한 유형의 소수성 수지 중 하나로 처리한다.

MAB05를 CHO 세포 배양물에 의해 생성시키고, 여기에 생성물을 pH 3.5의 50 mM 아세테이트를 사용하여 용리시키는 단백질 A 크로마토그래피 포획 과정을 실시한다. 1.8 M Tris 염기를 사용하여 용액 pH를 pH 7.5로 조정한 다음, 0.22 μm 멤브레인 (0.22 μm Millipore Express^® PLUS 멤브레인을 구비한 Stericup^®-GP, 250 mL, 카달로그 번호: SCGPU02RE, EMD Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과한다. 생성되는 용액은, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 0.31%의 단편을 갖는 것으로 측정되고 ELISA HCP 검정에 의해 578 ppm의 HCP를 갖는 것으로 측정된다.

그 후, 15 ml 원심분리 관에 25 μL, 50 μL 또는 100 μL의 가교결합된 디비닐벤젠 (DVB) 수지 또는 가교결합된 디비닐벤젠-에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (DVB-EGDMA) 수지를 넣는다. 대조로 사용되는 제2 세트의 15 mL의 원심분리 관에는 매질을 첨가하지 않는다. 그 후, 1.99%의 단편을 함유하는 5.0 mL MAB05 용액을 상기 원심분리 관에 첨가한다. 상기 관들을 24 시간 동안 회전시킨다. 그 후, 모든 용액을 0.22 마이크론 멤브레인 (Millex^® Syringe Filter Units, Millex^®-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, 감마 멸균화됨, 카달로그 번호: SLGV033RB, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과하여, 용액 중에 현탁된 채로 남아있을 수 있는 임의의 수지 입자를 제거한다. 샘플 중에 남아있는 MAB05의 농도는 280 nm에서 UV 분광광도계에 의해 측정한다. 샘플 중에 남아있는 단편의 백분율은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정한다. 샘플 중에 남아있는 HCP 농도는 ELISA 검정에 의해 측정하였다.

하기 표 6a, 6b 및 6c에 요약되어 있듯이, 소수성 수지로 처리한 후의 용액 내 HCP의 농도, 단편의 백분율 및 단일클론 항체의 회수가 표시되어 있다. 실험은, 단일클론 항체 용액을 소수성 수지로 정적으로 처리하여 단일클론 항체 단편 및 HCP가 선택적으로 제거됨을 입증한다. 단일클론 항체 용액에 첨가된 소수성 수지의 양이 증가됨에 따라, 용액 중에 남아있는 단편의 백분율이 감소된다. 데이타는, 소수성 수지가 정적인 결합 조건 하에서 단일클론 항체의 용액으로부터 단일클론 항체 단편 및 HCP를 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있다는 예상치 못한 결과를 나타낸다.

표 6a: DVB-EGDMA 소수성 수지를 사용한 MAB05 용액의 정적인 처리 후의 단편의 백분율 및 단일클론 항체의 회수.

표 6b: 가교결합된 DVB 소수성 수지를 사용한 MAB05 용액의 정적인 처리 후의 단편의 백분율 및 단일클론 항체의 회수.

표 6c: 상이한 pH 및 전도도 조건에서 가교결합된 DVB 소수성 수지를 사용한 정적 처리 후의 단편의 백분율 및 단일클론 항체의 회수

실시예 15:

동적인 조건 하에서 단일클론 항체의 다양한 단백질 A 포획 후 용액으로부터 HCP를 제거하기 위한 소수성 수지의 적용

이 실험에서는, 디비닐벤젠 (PS-DVB) (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)를, 다양한 항체 단백질 A 포획 후 풀로부터 HCP를 제거하는 이것의 능력에 대해서 평가하였다. 상기 단백질 A 포획 후 풀은 상업적으로 입수가능한 Prosep^® Ultra Plus 또는 Mab Select Sure^® 또는 Eshmuno^® A 재료를 사용하여 생성시켰는데, 여기서 관심있는 항체를 함유하는 정화된 세포 배양물을 600 cm/h에서 40 mg/ml 결합 용량 값으로 재평형화된 단백질 A 컬럼 상으로 놓은 다음, 5 CV 동안 재평형화 완충제 및 0.5M NaCl 용액으로 세척한 후에, pH 3.5의 50 mM 아세트산 및 50 mM 글리신을 사용하여 5CV 용리시켰다. 그 후, 수집된 풀을, 디비닐벤젠 (PS-DVB) (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)에 넣었다. 측정을 동적 방식으로 수행하는데, 미립자 재료를 크로마토그래피 컬럼에 패킹시키고, > 20CV에서 50 mM 아세테이트 완충제 pH 5.0, LF ~2mS/cm로 평형화시킨 후에 이 컬럼에 600 cm/h에서 항체 단백질 A 포획 후 공급물 (pH 5.0)을 넣는다. 항체 수준은 SEC-HPLC를 통해 정량화하였고, HCP 양은 ELISA 측정을 통해 정량화하였다 (도 10 참고):

도 10a: 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료 상에 상이하게 로딩시킨 후의, 다양한 mAb03 단백질 A 포획 후 (예를 들어, Prosep^® Ultra Plus (PUP), Mab Select Sure, Eshmuno A) 풀 내 HCP 수준.

도 10b: 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료 상에 상이하게 로딩시킨 후의, 다양한 mAb07 단백질 A 포획 후 (예를 들어, Prosep^® Ultra Plus (PUP), MAB Select Sure Eshmuno A) 풀 내 HCP 수준.

실시예 16:

동적인 조건 하에서 단일클론 항체의 염 함유 단백질 A 포획 후 용액으로부터 HCP를 제거하기 위한 소수성 수지의 적용

하기 실험에서는, 디비닐벤젠 (PS-DVB) (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)를, 염 함유 단백질 A 포획 후 항체 풀로부터 HCP를 제거하는 이것의 능력에 대해서 평가하였다. 측정을 동적인 방식으로 수행하는데, 미립자 재료를 크로마토그래피 컬럼에 패킹시키고, > 20CV에서 50 mM 아세테이트 완충제 pH 5.0, LF ~2mS/cm로 평형화시킨 후에 이 컬럼에 600 cm/h에서 염 함유 (예를 들어, 0.5m NaCl) 항체 단백질 A 포획 후 공급물 (pH 5.0)을 넣는다. 항체 수준은 SEC-HPLC를 통해 정량화하고, HCP 양은 ELISA 측정을 통해 정량화한다 (도 11 참고):

도 11: 한 실험에서 NaCl를 0.5M 농도로 첨가한 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb03 HCP 돌파 수준. 30451 재료는 디비닐벤젠 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지고, 30410 재료는 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 구성된다.

실시예 17

이 실험에서는, 디비닐벤젠 (PS-DVB) (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA)를, 상업적으로 입수가능한 소수성 재료와 비교하여, 다양한 항체 단백질 A 포획 후 풀로부터 HCP를 제거하는 이것의 능력에 대해서 평가한다. 측정을 동적인 방식으로 수행하는데, 미립자 재료를 크로마토그래피 컬럼에 패킹시키고, 20 CV에서 50 mM 아세테이트 완충제 pH 5.0, LF ~2mS/cm로 평형화시킨 후에 이 컬럼에 900 cm/h에서 단백질 A 포획 후 항체 공급물 (pH 5.0)을 넣는다. 항체 수준은 SEC-HPLC를 통해 정량화하고, HCP 양은 ELISA 측정을 통해 정량화한다 (도 12 참고):

도 12: 30410 재료가 디비닐벤젠 (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 PS-DVB-EGDMA 미립자 재료가 상이하게 로딩된 경우의 mAb03 HCP 돌파 수준. P242는 경쟁적인 소수성 재료이고, P248은 경쟁적인 소수성 재료이다.

실시예 18

정적인 조건 하에서 단백질 A를 제거하기 위한 PS-DVB-EGDMA 수지의 적용

이 실시예는, 다양한 pH 조건에서 PS-DVB-EGDMA 수지로 정적으로 처리하여 용액으로부터 단백질 A가 선택적으로 제거될 수 있음을 입증한다.

단백질 A를 함유하는 하기 2개의 용액을 제조한다:

a) 대략 2 mg/ml의 단백질 A를, 50 mM NaCl를 함유하는 25 mM 아세테이트-포스페이트 완충제 pH 4.00에 용해시킨다.

b) 대략 2 mg/ml의 단백질 A를, 50 mM NaCl를 함유하는 50 mM TRIS 완충제 pH 8.00에 용해시킨다.

그 후, 제조된 용액을 0.22 μm 멤브레인 (0.22 μm Millipore Express^® PLUS 멤브레인을 구비한 Stericup^®-GP, 250 mL, 카달로그 번호: SCGPU02RE, EMD Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과시킨 다음, 하기와 같이 정적인 조건 하에서 3개의 상이한 유형 수지 (예를 들어, DVB-EGDMA 수지, Eshmuno^® S, Eshmuno^® Q) 중 하나로 처리한다.

1.5 ml 에펜도르프 바이알에 200μl의 PS-DVB-EGDMA 수지, 200μl Eshmuno^® S, 200μl Eshmuno^® Q (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)를 넣는다. 그 후, 1 mL의 제조된 단백질 A 용액을 상기 제조된 에펜도르프 바이알에 첨가한다. 상기 바이알을 20시간 동안 교반한다. 그 후, 모든 관에 원심분리를 실시하고, 0.22 마이크론 멤브레인 (Millex^® Syringe Filter Units, Millex^®-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, 감마 멸균화됨, 카달로그 번호: SLGV033RB, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과하여, 용액 중에 현탁된 채로 남아있을 수 있는 임의 비드를 제거한다. 샘플 중에 남아있는 단백질 A의 양을 280 nm에서의 광도계 흡착에 의해 측정하고, 추가로 SDS-Page 분석을 실시한다.

하기 표 7에 요약되어 있듯이, 이 실험은, 상이한 유형의 비드를 사용한 정적인 처리에 의해서 상이한 pH 값으로 조정된 용액으로부터 단백질 A를 선택적으로 흡착할 수 있음을 입증한다. Eshmuno^® S가 pH 4.00 용액에서 단백질 A를 흡착했기 때문에, 이것은 pH 8.00 용액에서는 단백질 A를 흡착하지 못하였다. 또한, Eshmuno^® Q는 pH 8.00 용액에서는 단백질 A를 흡착할 수 있었지만, pH 4.00에서는 흡착하지 못하였다. 놀랍게도, 데이터는 PS-DVB-EGDMA 수지가 정적인 결합 조건 하에서 pH 4.00 및 pH 8.00 용액 중에서 단백질 A를 흡착할 수 있다는 예상치 못한 결과를 나타낸다.

표 7: 2개의 상이한 pH 조건에서 3개의 상이한 수지 유형을 사용한 정적인 처리 후의 단백질 A 수준.

도 13: M = PerfectProtein^TM 마커,

PA = 출발 용액 (2 mg/ml 단백질 A),

S = Eshmuno^® S에서의 흡착 후 상청액,

Q = Eshmuno^® Q에서의 흡착 후 상청액,

P = DVB-EGDMA에서의 흡착 후 상청액인,

실시예 18에 따른 DVB-EGDMA, Eshmuno^® S, 및 Eshmuno^® Q 수지 상에 흡착된 단백질 A의 환원된 SDS PAGE 분석.

실시예 19:

이온 교환 물질과 함께 동적인 조건 하에서 단일클론 항체의 단백질 A 포획 후 용액으로부터 HCP를 제거하기 위한 소수성 수지의 적용

이 실험에서는, 디비닐벤젠 (PS-DVB) (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA) (686,75 m²/g 표면적, 14 nm 평균 다공 크기, 및 41μm 평균 입도)를, 단백질 A 포획 후 항체 풀로부터 HCP를 제거하는 이것의 능력에 대해서 평가한다. 상기 단백질 A 포획 후 풀은 상업적으로 입수가능한 Prosep® Ultra Plus를 사용하여 생성시켰는데, 여기서 관심있는 항체를 함유하는 정화된 세포 배양물을 600 cm/h에서 40 mg/ml 결합 용량 값으로 재평형화된 단백질 A 컬럼 상에 놓은 다음, 5 CV 동안 재평형화 완충제로 세척한 후에, pH 3.5의 50 mM 아세트산 완충제 및 50 mM 글리신을 사용하여 5CV 용리시켰다. 그 후, 수집된 풀을, 개별적으로 및 함께 모든 장치를 직접 연결시키는 디비닐벤젠 (PS-DVB) (70%) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (30%) 공중합체로 가교결합된 폴리(에틸)스티렌 (m)으로 이루어지는 미립자 재료 (PS-DVB-EGDMA), Eshmuno^® CPX, Eshmuno^® Q에 넣었다. 측정을 동적인 방식으로 수행하는데, 미립자 재료를 크로마토그래피 컬럼에 패킹시키고, > 20CV에서 20 mM 포스페이트 완충제 pH 6.75, LF ~4 mS/cm로 평형화시킨 후에 이 컬럼에 600 cm/h에서 항체 단백질 A 포획 후 공급물 (pH 6.75, 전도도 ~2,7 mS/cm, ~1000 ng/ml HCP 양)을 넣는다. 조합시킨 예의 경우에는, 모든 장치를 PS-DVB-EGDMA에 이어 Eshmuno^® CPX에 이어 Eshmuno^® Q의 순서로 차례대로 연결시켰다. 항체 수준은 SEC-HPLC를 통해 정량화하였고, HCP 양은 ELISA 측정을 통해 정량화하였다 (하기 표 8 참고):

표 8: 개별적으로 및 함께 3개의 상이한 수지 유형으로 동적으로 처리한 후의 HCP 수준 (ppm).

^*수지 부피 당 계산된 항체 로딩량. 조합시킨 예의 경우에, 사용된 모든 컬럼은 동일한 부피를 지녔지만, 로딩은 제1 컬럼 (PS-DVB-EGDMA 수지)에 대해서만 적용된다.

Claims

항체 함유 용액을 일정 시간 기간 동안 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시켜서, 항체는 용액 중에 머무르며 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질은 소수성 크로마토그래피 재료에 의해 흡착됨을 특징으로 하는, 항체 함유 용액으로부터 HCP, 항체 단편 및 저분자량 물질의 분리 방법.
제 1 항에 있어서, 소수성 크로마토그래피 재료가 가교결합된 비닐벤젠, 가교결합된 에틸비닐벤젠, 폴리스티렌-디비닐벤젠, 폴리에틸스티렌-디비닐벤젠으로, 또는 폴리에틸스티렌-디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메틸아크릴레이트 수지로 된 미립자임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 98:2 내지 10:90 중량% 비의 모노비닐방향족 단량체 및 디비닐방향족 단량체로 구성된 가교결합된 중합체로 구성되는 크로마토그래피 재료가 적용됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 98:2 내지 10:90 중량% 비의 모노비닐방향족 단량체, 및 디비닐방향족과 디(메트)아크릴에스테르 단량체의 혼합물로 구성된 가교결합된 중합체로 구성되는 크로마토그래피 재료가 적용됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 98:2 내지 10:90 중량% 비의 디비닐벤젠 및 에틸렌글리콜 메타크릴레이트의 공중합체로 가교결합되는 폴리스티렌 또는 폴리(에틸)스티렌으로 이루어지는 미립자 크로마토그래피 재료가 적용됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 내지 11의 범위 내, 바람직하게는 5 내지 9의 범위 내 pH 값, 및 1 내지 150 mS/cm 범위 내, 바람직하게는 2 내지 50 mS/cm의 범위 내 전도도를 갖는 수성 용액이 적용됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 용액을 150 내지 1000 cm/min의 범위 내, 바람직하게는 300 내지 900 cm/min의 범위 내 유속에서 통과시킴을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리가 단백질 A 친화 결합 단계 후에 실시됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 처리 순서에 이온교환 수지를 사용한 처리가 포함됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 처리가 10 μm 내지 600 μm 범위 내, 바람직하게는 20 μm 내지 150 μm 범위 내, 가장 바람직하게는 20 μm 내지 63 μm 범위 내 평균 입자 직경을 갖는 미립자의 소수성 크로마토그래피 분리 재료를 사용하여 실시됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리가 4 내지 500 nm의 범위 내, 바람직하게는 10 내지 30 nm의 범위 내, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm의 범위 내 다공 크기(pore size)를 갖는 소수성 크로마토그래피 분리 재료를 사용하여 실시됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A를 분리하기 위한 특정의 이온 교환 수지를 사용한 적어도 하나의 분리 처리를 다공성 소수성 중합체 비드를 사용한 처리와 조합시켜서, < 10 ng까지 HCP를 고갈시키고 걸러진 단백질 A를 제거함을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 단백질 A를 분리하기 위한 특정의 이온 교환 수지(들)로의 처리(들)를, 가교결합된 비닐벤젠, 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠으로, 또는 폴리스티렌-디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메틸아크릴레이트 수지로 이루어지는 소수성 중합체 비드를 사용한 처리와 조합시킴을 특징으로 하는 방법.
항체 함유 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 분리하기 위한, 4 nm 내지 500 nm의 범위 내, 바람직하게는 10 nm 내지 30 nm의 범위 내, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm의 범위 내 다공 크기를 갖는 소수성 크로마토그래피 분리 재료의 용도.
항체 함유 용액으로부터 숙주 세포 단백질 (HCP), 항체 단편 및 저분자량 물질을 분리하기 위한, 10 μm 내지 600 μm의 범위 내, 바람직하게는 20 μm 내지 150 μm의 범위 내, 가장 바람직하게는 20 μm 내지 63 μm의 범위 내 평균 입자 직경, 및 4 nm 내지 500 nm의 범위 내, 바람직하게는 10 nm 내지 30 nm의 범위 내, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm의 범위 내 다공 크기를 갖는 소수성이며 강성인 중합체 비드의 용도.