CN106103477B - 稳健的抗体纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的方法。

Description

稳健的抗体纯化
本发明涉及从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的方法。
现有技术
A蛋白以及单克隆抗体纯化
由于抗体（mAb）被用于药物应用，所以需要其具有极高的纯度[A. Jungbauer, G.Carta, in: Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim (Germany) 2010]。
A蛋白首先是56 kDa 的表面蛋白，最初发现于细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的细胞壁中。其由 spa 基因编码而其调控由DNA拓扑结构、细胞渗透性以及称为ArlS-ArlR的双组分系统所控制。由于其结合免疫球蛋白的能力，其已被用于生物化学研究中。其原本由折叠成三螺旋束的五个同源Ig结合结构域构成。每个结构域均能够结合来自许多哺乳动物物种的蛋白质，最值得注意的是 IgG。其结合大部分免疫球蛋白的Fc区内的重链，并且在人类VH3家族的情况下，也结合Fab区内的重链。通过在血清中的这些相互作用，其中IgG分子以错误的取向结合（相对于正常的抗体功能），细菌破坏调理作用和吞噬作用。
通常采用哺乳动物细胞培养来生产市场上现有的大多数治疗用单克隆抗体（mAb）。生产这些药物抗体一般从装有中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（其将所述抗体分泌到细胞外液中）的悬浮液的生物反应器开始。然后使所得抗体经受一系列工序（包括澄清、过滤和纯化），其移除细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白质（HCP）、脂质、DNA、病毒、细菌、抗体聚集体等。此系列工序经常被称为下游工序（DSP）。
最常用的DSP包括一个或两个结合-洗脱层析纯化步骤后接一个或两个流通精炼步骤。一般的下游纯化工序采用装满基于多孔珠的层析介质的填充柱或基于膜的设备。将这些单元操作串联采用并且每一项均靶向在流通精炼或结合/洗脱捕获模式中清除一种颗粒杂质。精炼介质的主要目标之一是降低杂质的浓度（例如，参考mAb的浓度，HCP降至< 10ppm）。
总而言之，一般的抗体纯化工序包括初始的A蛋白亲和捕获步骤后接一个或多个离子交换精炼步骤，其目的在于降低一种或多种关键杂质（如，例如，宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和其它低分子量物质）的水平。从抗体分离抗体片段尤为困难，因为它们具有相似的特性，尤其是含有FC的片段。后者通常无法用A蛋白层析分离。
通常，在某些条件下于A蛋白捕获步骤之后进行进一步的抗体纯化步骤（例如，CEX、AEX）以移除残留的杂质。这需要在那些纯化步骤之前对抗体保持溶液进行多项调整（例如，pH调整、传导性调整）。此外，这些pH和传导性的改变使目标分子产生应激，并生成抗体相关的杂质（例如，抗体聚集体、抗体片段）。
近来，工业界已经出现一个值得关注的趋势，即：试图减少纯化步骤数，同时保持产品质量属性。使用生物反应器获得更高表达效价的技术的使用也在工业界呈上升趋势。这两个趋势的结合已经导致更多的产品被加样到柱上，从而导致相当昂贵的层析介质的负担增加以及更低的产品纯度，而这两种结果都是不期望的。
为了提高对所需蛋白质产品（如抗体或特殊蛋白质片段）的层析纯化的选择性，在改变纯化方法的同时已经开发了各种层析材料。尤其是，分离材料表面的特定衍生化应当导致在澄清的细胞培养基中更有选择性地将不期望的杂质从所需产品分离。但这些特殊且复杂的表面衍生化使得这些层析材料的生产较市售产品昂贵得多，从而致使其在工业规模纯化上的用途不那么有吸引力。
在层析材料领域的其它进展集中在基于有机基底的分离材料上，这是因为基于硅材料的市售材料通常受到碱性环境的影响并丧失稳定性（尤其是在再生期间）。
基于有机聚合物的固定相可在宽泛的pH条件范围上工作。因此，可在高pH条件下强力清洁聚合树脂。但现有的聚合固定相在高性能生物分子分离所用的中等至高压力条件下是一定程度上可压缩的。
在存在非溶剂的情况下由含有二乙烯基苯（DVB）的混合物的悬浮聚合生产的常规大孔共聚物代表了具有宽泛的孔径分布和表面积范围的聚合物。此类聚合物珠在例如US4,686,269中公开。这些聚合物珠由乙烯基芳族单体制备，具有0.5至50 µm的平均粒径。但其在常用于生产规模的层析柱的高压力条件下并非是刚性的。用于层析的聚合物珠的刚性是至关重要的，这是因为其与多孔聚合物固定相一道提供了分离期间所必需的压力和流动特性。
目标
要解决的问题是对稳健（robust）且可靠的抗体纯化步骤的需求，该步骤有效适用于宽泛的条件下的流通模式，其中关键杂质（如HCP和抗体片段）的水平被降低。
发明概述
本发明涉及从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的方法，其中使含有抗体的溶液与疏水性层析材料接触一段适当的时间，由此所述抗体主要保留在溶液中而HCP、抗体片段和低分子量物质被所述疏水性层析材料所吸附。
详细而言，所述疏水性层析材料为颗粒状并且其由交联的乙烯基苯、乙基苯乙烯、聚(乙基)苯乙烯-二乙烯基苯制成，或由聚(乙基)苯乙烯-二乙烯基苯 乙二醇-二甲基丙烯酸酯树脂制成。优选地，所述树脂由交联的聚合物构成，所述交联的聚合物由苯乙烯和二乙烯基苯以98 : 2至最高10 : 90的重量%比例构成。在改进形式中，颗粒状材料由以98 : 2至最高10 : 90的重量%比例与共聚物交联的聚苯乙烯组成，所述共聚物为二乙烯基苯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物。
为了进行从所需抗体移除和分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质，使水性澄清细胞培养溶液与疏水性层析材料接触，所述水性澄清细胞培养溶液的pH值范围为2–11，优选5–9并且传导性范围为1–150 mS/cm，优选2–50 mS/cm。优选地，所述水溶液以范围在150–1000 cm/min，优选300–900 cm/min的流速通过。在特别优选的实施方案中，在A蛋白亲和结合步骤之后进行宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的分离。如果需要，纯化序列包括采用离子交换树脂处理。
通常使用颗粒状的疏水性层析分离材料进行分离，所述分离材料的平均粒径范围为10 µm至600 µm，优选20 µm至150 µm，最优选20 µm至63 µm。这种尺寸的合适疏水性多孔聚合物珠的孔径范围为优选4–500 nm，更优选10–30 nm，最优选13 nm至25 nm。
如以上所指出的，纯化序列可包括至少一种采用离子交换树脂的处理，其优选为对于A蛋白的分离特异性的。采用此类离子交换树脂处理与采用多孔疏水性聚合物珠处理的结合有利地导致HCP耗尽至多至<10 ng并且同时移除沥滤出的A蛋白。如果所述疏水性聚合物颗粒由交联的乙烯基苯、聚(乙基)苯乙烯-二乙烯基苯组成，或由聚(乙基)苯乙烯-二乙烯基苯 乙二醇-二甲基丙烯酸酯树脂组成，则在此情况下会获得特别好的清洁效果。
本发明的目标是，具体地讲，疏水性层析分离材料用于从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的用途，所述疏水性层析分离材料的孔径范围为4 nm至500 nm，优选10 nm–30 nm，最优选13 nm至25 nm。本发明所用的疏水性层析分离材料优选由交联的乙烯基苯、交联的乙基苯乙烯、聚苯乙烯/聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯制成，或由聚苯乙烯/聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯 乙二醇-二甲基丙烯酸酯树脂制成。在尤其优选的实施方案中，本文所述的所用疏水性、刚性聚合物珠的平均粒径范围为10 µm至600 µm，优选20 µm至150 µm，最优选20 µm至63 µm，并且孔径范围为4 nm至500 nm，优选10nm–30 nm，最优选13 nm至25 nm。
发明详述
在本文所述的各项实验中，据发现，多孔疏水相互作用材料（如多孔聚(二)乙烯基芳族珠）可用于从细胞培养溶液中大规模纯化抗体。这些纯化步骤可以在捕获层析步骤的上游或下游完成，以降低存在于含有目标蛋白质的样品（例如，澄清的细胞培养溶液）中的一种或多种杂质的水平。
出于此目的，使澄清的细胞培养溶液与疏水相互作用材料接触，例如与多孔疏水性聚苯乙烯珠接触，并温育一段特定时间以选择性地降低低分子量物质的水平。通过此过程，有可能从含有目标抗体的培养溶液中选择性地减少不需要的抗体片段和HCP。所述疏水相互作用材料特别适合经受A蛋白捕获后抗体溶液并适用于通过使澄清的细胞培养溶液与所述材料接触一段适当的时间而选择性地降低低分子量物质（例如抗体片段、HCP）的水平。为了进行此纯化工序，将所述疏水相互作用材料（例如，聚苯乙烯珠）掺入到一根或若干根层析柱或其它设备（如过滤器壳体等）中。然后，将这些填充柱以流通模式用于蛋白质纯化工序，由此培养溶液中的低分子量物质（如抗体片段和HCP）在流经所述柱期间与所述疏水性多孔相互作用材料相互作用，而低分子量物质（例如抗体片段、HCP）的水平被降低。在这种情况下，当流动速度的范围被调整至150 cm/min - 1000cm/min，并且尤其是300 -900cm/min时，获得了良好的纯化结果。
另外，在本文所述的实验中，据发现，如果澄清培养液的pH范围被调整至2至11，并且优选3至9，则可以实现良好的纯化结果。
同时已经证实，如果溶液的传导性的范围为1 mS/cm–50 mS/cm，并且尤其是2–50mS/cm，则是有利的。
如本文的实验所证实的，据发现，尤其令人惊讶的是，澄清细胞培养基的高纯度可以通过使用小多孔聚合物珠形式的疏水相互作用材料而实现。在一些实施方案中，此材料可主要由聚苯乙烯或聚乙基苯乙烯组成并且可以由疏水性和亲水性单体（例如二乙烯基苯（DVB）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA））的混合物交联而成。
所述多孔聚合物珠一般由悬浮聚合生产。其可以由例如类似于US 4,382,124中所公开的方法生产，并且其中孔隙度是在存在致孔剂（porogen）（也被称为“相增充剂(phaseextender)”或“沉淀剂”）的情况下通过悬浮聚合被引入共聚物珠的，所述致孔剂是所述单体的溶剂但却是所述聚合物的非溶剂。常规的多孔聚合物（如根据US 4,382,124而制备的那些）一般涵盖了使用宽泛的相对于单体相、单体类型、交联单体类型、交联剂水平、聚合引发剂和引发剂浓度的致孔剂类型、致孔剂浓度。然而，本发明是基于意想不到的发现：当疏水性单体的比例处于特殊范围内时，这些聚合物珠对于纯化细胞培养液体中的抗体特别适合且有效。
在不希望受到理论束缚的同时，据信，就本发明而言，主要在通过增加聚合物中所含疏水性分子的份额而改变聚合物基体时实现靶分子能力的提高。做出此改变时考虑到了聚合物结构单体的平衡以及致孔剂量的平衡以及交联剂水平的平衡，所有这些共同影响靶分子的孔隙度、刚性和结合能力的参数。
令人惊讶的是，通过这些选定的开放式多孔疏水性聚合物珠可以实现对HCP分离的显著改善。多孔结构使得进出聚合物基体的分子能够迅速扩散，并且由于聚合物珠的孔隙度，所以具有大的表面积可用于与细胞培养基中所含有的不需要的蛋白质及杂质的相互作用。因此，这些材料对于分离固定相中的生物分子非常有效。最现代的商业化聚合反相层析固定相似乎就是围绕着这些标准所设计的，并且在更低的压力条件下使用，然而，在更高的压力条件（一般在10至100巴的范围内）下，这些材料是可压缩的。幸运的是，根据本发明的聚合物珠具有提高的刚性，并同时具有高孔隙度，从而提供了高的颗粒内部扩散能力。
本发明中所用的疏水性多孔聚合物珠可用于从含有单克隆抗体的溶液中移除宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质，其通过使所述溶液与液相层析柱中的所述聚合物珠接触而实现，所述液相层析柱的直径范围为1至100 cm，优选5至50 cm，其中所述柱在至高达100巴的压力，并且优选0.2至80巴的压力下工作。一般，制备规模的柱在10至50cm的范围内并在0.2至80巴的压力范围内工作。
根据本发明的多孔聚合物珠一般是球状共聚物珠，其具有至多200 µm的平均粒径，这是可用于通过高效反相液相层析（如在直径为1至100 cm范围的柱中）分离和纯化生物分子的聚合物珠的一般尺寸。
一般来讲，当多孔分离材料的平均粒径（d50）在10–600 µm，优选20–150 µm的范围内时，已发现其特别有效，而具有平均粒子大小在20–63 µm范围内的此类材料已被表明是尤其有效的。
具有孔径在4 - 500 nm范围内的此类疏水性分离材料（优选聚苯乙烯珠）似乎适用于所需的分离效果。纯化实验已表明，具有10-30 nm的平均孔径的疏水相互作用材料导致所需的分离结果。当使用球状疏水性聚合物珠时，这些所需的分离结果可以被进一步改善，所述球状疏水性聚合物珠由适当的材料制成并且其平均孔径在13–25 nm的范围内。本发明的合适的多孔聚合物珠具有的表面积（BET）范围优选300至1000 m2/g（平方米/克），更优选450至850 m2/g，并且最优选500至800 m2/g。
可用于制备本文所述的多孔聚合物珠的合适的单不饱和乙烯基芳族单体包括但不限于：苯乙烯、C1–C4烷基取代的苯乙烯、乙烯基萘和乙烯基蒽。优选地，所述单不饱和乙烯基芳族单体选自苯乙烯和C1–C4烷基取代的苯乙烯中的一者或多者。合适的C1–C4烷基取代的苯乙烯的组中包括：乙基乙烯基苯、乙烯基甲苯、二乙基苯乙烯、乙基甲基苯乙稀和二甲基苯乙稀。应当理解，上述乙烯基芳族单体中每一者的各种位置异构体中的任一者均是合适的。
这意味着，特别适用于本发明的多孔聚合物珠可使用一种或多种选自以下的单体制备：乙烯基苯（苯乙烯）、乙基苯乙烯、二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽、二乙烯基二甲苯以及这些单体的任何结构同分异构体。
优选地，使用乙烯基苯（苯乙烯）和二乙烯基苯的共聚物或乙基苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物制备所述多孔聚合物。在本发明的优选实施方案中，所应用的交联多孔聚合物珠以彼此98 : 2至10 : 90%的重量比例包含苯乙烯和二乙烯基苯。
任选地，除乙烯基芳族单体外也可使用脂族不饱和单体，例如(甲基)丙烯酸和(甲基)丙烯酸的烷基酯，以用于制备本文所述的疏水性多孔聚合物珠。这些脂族不饱和单体可在所需聚合物珠的制备中被用作交联剂。
合适的脂族交联单体选自：乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙二醇二乙烯基醚和三乙烯基环己烷，并且其可用于制备根据本发明的交联疏水性多孔聚合物珠。所述脂族单体可以作为交联单体单独使用或与上述聚乙烯基芳族单体结合使用。
在这两种变型中，乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和二乙二醇二乙烯基醚均特别适用于制备多孔珠。优选地，这些脂族交联单体与聚乙烯基芳族交联单体结合使用。在这些条件下，基于形成所述刚性且多孔的聚合物珠所用的总单体重量，一般包含所述脂族单体的量为0至50%，并且优选0至30%。
在本文所述的多孔聚合物颗粒的本发明的用途中，使用由聚苯乙烯组成的多孔聚合物珠实现了优越的分离结果，所述聚苯乙烯与二乙烯基苯或其衍生物和选自乙二醇二甲基丙烯酸酯及二乙二醇二乙烯基醚的单体的共聚物交联，其中聚苯乙烯与交联共聚物的比例范围为98 : 2至最高10 : 90的重量%。在优选的实施方案中，使用了由聚(乙基)苯乙烯组成的多孔颗粒，其与二乙烯基苯和乙二醇甲基丙烯酸酯的共聚物以98 : 2至最高14 :86的重量%的比例交联。就这一点而言，已经发现：对于从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质，多孔珠更为适合，其中所含(二)乙烯基芳族单体的量大于50重量%。因此，优选由单乙烯基芳族的聚合物组成的多孔珠，所述聚合物与二乙烯基苯和乙二醇甲基丙烯酸酯的共聚物以约10 : 90至98 : 2的重量%的比例交联。更优选其中所述比例为按重量计约14 : 86的此类多孔珠。
优选的疏水性多孔聚合物选自下列中的一种或多种：乙烯基苯（苯乙烯）共聚物、乙基乙烯基苯（乙基苯乙烯）共聚物、二乙烯基苯共聚物、交联的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、交联的聚苯乙烯 乙二醇二甲基丙烯酸酯、交联的聚二乙烯基苯 乙二醇二甲基丙烯酸酯。最优选的是：交联的聚(乙基)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物以及与二乙烯基苯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯。
可用于制备所述多孔聚合物的致孔剂包括：疏水性致孔剂（如(C7–C10)芳香烃和(C6-C12)饱和烃）和亲水性致孔剂（如(C4 – C10)链烷醇和聚(亚烷基)二醇）。因此，合适的致孔剂可以，例如，选自：甲苯、乙基苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯。应当理解，上述烃类中任一者的各种位置异构体中的任一者均是合适的。优选地，所述芳香烃为甲苯或二甲苯或二甲苯的混合物或甲苯与二甲苯的混合物。此外，如以上所指出的，饱和烃也可以被用作致孔剂。合适的实例包括但不限于，例如，己烷、庚烷或异辛烷。就本发明而言，优选的饱和烃为异辛烷。合适的链烷醇包括但不限于：异丁醇、叔戊醇、正戊醇、异戊醇、甲基异丁基甲醇、（4-甲基-2-戊醇）、己醇和辛醇。优选地，致孔剂混合物包含：选自一种或多种(C5-C8)链烷醇的亲水性致孔剂和选自一种或多种(C7-C10)芳香烃的疏水性致孔剂。
一般，向聚合悬浮液中加入过量的致孔剂，按单体的重量计，通常总量为100至170%，优选115–150 %，并且更优选120至140 %。另外，将用于制备根据本发明的聚合物的致孔剂与溶剂体系混合，所述溶剂体系包含至少疏水性溶剂和任选的疏水性较差的溶剂（“亲水性”溶剂），并且这两者均帮助构造多孔珠。顾名思义，疏水性较差（或如上所述“亲水性”）溶剂具有至少一些有限的水溶性，例如，0.5至5%，而疏水性溶剂显示出10至100 ppm或更低的水溶性。
通常，具有低疏水性的致孔剂（即，“亲水性致孔剂”）与疏水性致孔剂的比例范围为0.7 : 1至最高3 : 1，优选0.8 : 1至最高2.5 : 1，最优选0.9 : 1至2.4 : 1。
可用于制备适用于本发明的聚合物的聚合引发剂是本领域普通技术人员所熟知的，并且包括单体可溶性引发剂如过氧化物、氢过氧化物以及相关引发剂。这些引发剂在市场上有售。偶氮引发剂（如偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酰胺等）也是可用的。根据引发剂的性质，其使用水平按包含的乙烯基单体的总重量计在0.5至10%的范围内。
此外，可用于制备所述多孔聚合物珠的分散剂或悬浮剂可以是惯用的表面活性剂，其是离子的并且可能包含具有1至24个碳原子的疏水性烷基链。适用于悬浮聚合的另一类市售分散剂为非离子表面活性剂，其基于环氧化羟烷基纤维素衍生物。一般，这些添加剂按水相的总重量计以约0.01至最高4%的水平使用。
如果合适，可以使用其它分散剂并且可与那些表面活性剂和分散剂一同应用。例如，聚合分散剂（包括纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、淀粉等）可与本文所用的其它表面活性剂或分散剂混合使用。但最优选的是加入离子表面活性剂，其可以通过用水冲洗而被容易地从所制备的聚合物珠上移除。
为了制备本文所公开的多孔疏水性聚合物珠，制备了含有助悬剂(suspensionaid)的连续水相溶液并随后将此溶液与含有聚乙烯基芳族单体、自由基引发剂以及例如1至1.7份（混合的）致孔剂（疏水性和亲水性致孔剂）/一份单体混合物的单体混合物混合。然后在升高的温度（一般在40至100℃，例如进行1至约15小时）下，单体/致孔剂的组合发生聚合并且随后将致孔剂，例如通过蒸馏或溶剂洗涤，从所得聚合物珠中移除。然后通过常规方法（如脱水和干燥）分离所得多孔聚合物珠。
任选地，制备聚合物珠可包括清洁聚合物表面残留的在聚合期间所用的分散剂和悬浮剂的处理。此处理可包括如专利文献（JP 61-141704或JP 57-98504或EP 1 179 732B1）中公开的酶处理。
由于其孔隙度和机械强度，所制备的聚合物珠尤其适用于填充柱。有利的是，这些多孔且刚性的聚合物珠可用于从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质，其通过使所述液体与在液相层析柱中的这些聚合物珠（甚至在升高的压力下）接触而实现。这些珠尤其适用于生物分子在高通量速率下的高性能分离和纯化而不会由于长期使用而积累压力。
如本发明所用的多孔聚合物珠的特征在于选定的孔隙度和孔径分布，其可以通过反尺寸排阻层析（iSEC）测定。适用于本发明的聚合物珠的孔隙度ε的范围一般为0.4至1.0，并且优选0.45至0.75。这些珠具有的表面积为300至100 m2/g [BET]，更优选450至850 m2/g，并且最优选在500至800 m2/g的非常窄的范围内。
在此公开的聚合物珠意想不到地很适用于从含有单克隆抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质。由于其化学性质和其纳米多孔结构，这些材料尤其适用于与低分子量蛋白质的疏水相互作用并且可以被纳入流通模式下的基于层析柱的蛋白质纯化工序。这些多孔聚合物珠的特性以及过程控制的类型导致层析柱负担的降低，并因此延长了层析柱的使用期限，同时降低了关键杂质（如HCP和抗体片段）的水平。有利的是，所应用的聚苯乙烯珠不需要是衍生得到的，而因此较在此纯化步骤中常用的层析凝胶具有高得多的成本效益。本文所述的分离材料相当便宜并且可以再生，从而降低了抗体纯化平台及以外的总成本。
另外，令人惊讶的是，本文所述的疏水性材料可以用在捕获层析步骤的上游或下游以降低一种或多种杂质的水平。在根据要求保护的方法的一些实施方案中，在A蛋白亲和层析步骤之前使样品与疏水性材料接触。通常，在使样品与疏水性材料接触之前，使用A蛋白亲和层析步骤。
另外，疏水性材料的应用不限于所给出的实例，这是因为其基于尺寸排阻机制以及对低分子量物质（尤其是分子量<70kDa的化合物）的疏水性吸附。此结果是对单克隆抗体相关分子（如抗体片段或HCP）的选择性移除。
此外，本发明提供了基于层析的抗体纯化步骤，其中本文所述的层析材料可以再生并且适用于宽泛的操作窗口（例如，pH 3-11；传导性 1mS/cm-50mS/cm；操作速度 150cm/min–1000cm/min）。具体地讲，多孔聚合物珠在低和高pH值下的抗性在此具有巨大的优势，这是因为令人满意的再生成为可能并且这些材料具有可观的更长的使用期限。
正如以上已经指出的，使用本文所述的疏水性多孔聚合物珠从澄清的细胞培养液中移除低分子量物质（尤其是分子量<70kDa的化合物）既可以工业规模也可以微量进行，这是因为所选的分离材料对压力稳定并且在高的压力下不容易变形。用户可以任意方式进行层析纯化。不言自明，根据所应用的细胞培养和低分子量蛋白质的性质，一种或另一种多孔聚合物颗粒组合物可能有利于纯化步骤。在此，专业人员可在由纯(乙烯基)烷基芳族化合物制成的多孔聚合物或由合适的丙烯酸酯交联的那些多孔聚合物之间选择。在这种情况下，本领域普通技术人员可以容易地识别出最合适的聚合物珠。
但这些材料不限于用于移除低分子量物质，尤其是分子量<70kDa的化合物（如抗体片段或HCP）。令人惊讶的是，据发现，可以使用根据本发明的多孔疏水性聚合物珠容易地从细胞培养基中分离出未在之前的纯化步骤被分离或被洗掉的A蛋白。令人惊讶的是，使用多孔聚合物珠可以独立于培养基的pH值而实现从细胞培养基中分离A蛋白。在实验中可以表明，例如PS-DVB-EGDMA树脂能够在静态结合条件下，在pH 4.00和pH 8.00的溶液中吸附A蛋白。
就利用专用于分离A蛋白的市售离子交换树脂与多孔疏水性聚合物珠的联合处理并且其中装置一个接一个地依次连接（例如填充有离子交换树脂，例如填充有Eshmuno®CPX后接Eshmuno®Q后接PS-DVB-EGDMA的柱）而言，容易达到最高达<10ng HCP的耗尽，包括移除沥滤出的A蛋白。
本说明书使得本领域普通技术人员能够全面实施本发明。因此，即使没有进一步的说明，也可以认为本领域普通技术人员将能够在最宽的范围内利用以上说明。
如果有任何不清楚，可以理解，应当查阅所引用的出版物和专利文献。因此，这些文件被视为本说明书公开内容的一部分。
为了更好地理解并且为了阐明本发明，在下文中描述了处于本发明的保护范围内的实施例。这些实施例也起到说明可能的变形的作用。
此外，对于本领域普通技术人员，自不待言，在给出的实施例中和在本说明书的其它部分中，存在于组合物中的组分的量按整个组合物计始终总计达100重量%或摩尔%，并且不可超过此百分比，即使从所指出的百分比范围可以产生更高的值。因此，除非另外指明，否则%数据为重量%或摩尔%，而比例除外，其以体积数据显示。
如整个说明书中所用，下列术语将具有下列含义，除非上下文另有明确指示：
术语“烷基(甲基)丙烯酸酯”指代对应的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯；类似地，术语“(甲基)丙烯酸”指代丙烯酸或甲基丙烯酸以及对应的衍生物（如酯或酰胺）。如以上所指出的，所有提及的百分比均将按所涉及的聚合物或组合物（溶液）的总重量计而被表示为重量百分比（%），除非另外指明。术语“共聚物”指代含有两种或更多种不同单体（包括位置异构体）的单元的聚合物组合物。
本文使用了下列缩写：
g = 克；
ppm = 按重量/体积计百万分之一；
m = 米；
cm = 厘米；
mm = 毫米；
µm = 微米（微米）= 10-6 m；
nm = 纳米 = 10-9m,
ml = 毫升；L = 升。除非另外指明，否则所列出的范围均解读为包括端点值的和可组合的。
实施例和说明书以及权利要求书中给出的温度始终为摄氏度（℃）。
方法：
颗粒特性：
颗粒表征是本领域已知的并由：I. C. Edmundson, Particle-size analysis,H. S. Bean, A. H. Beckett 和 J. E. Carles (编撰) 在：Advances inPharmaceutical Sciences 第2卷, Academic Press, London 1967, 95-174中描述。
粒子大小分布和平均直径可以通过激光衍射法使用Mastersizer 2000E（MalvernInstruments Ltd., UK）或通过激光光阻(laser light blocking)技术（Accusizer™, 型号 770, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, Calif., USA）测量。
微球体的形状和表面特性（孔隙度）可以通过扫描电子显微镜术（SEM）分析确立。
孔径通过本领域已知的方法测定。大孔可以使用水银孔率法测定。在这种情况下，按照所用水银孔率法分析仪（例如AutoPore IV 9500, Micromeritics, USA）的规程来完成用于分析孔径的实验。也可能从扫描电子显微镜照片（SEM）估计孔的尺寸，其中在干燥后，所述聚合物微球体的直径和表面特征通过扫描电子显微镜（SEM）（JSM-6700F.JEOL,Japan）被观测到。将微球体重悬浮于蒸馏水中并将分散体滴在一张铝箔上并在环境气氛中干燥。将样品置于具有双面导电粘合带的金属底座(metal stub)上并在减小的压力（低于5Pa）下采用JFC-1600精细涂布机（JEOL, Japan）以薄金膜涂布。
中孔的孔径及其比表面积也可以使用按照标准规程进行的氮吸附/解吸测量法（BET方法）测定。后一种方法也可以用于测定BET表面积。
HCP ELISA 测试
经纯化的蛋白质常常含有少量来自表达生物的污染蛋白质，称为宿主细胞蛋白质（HCP）。生物产物中的这些宿主细胞蛋白质（HCP）是与工艺相关的杂质，其必须经过定性与定量地鉴定和评价。为了对本文公开的分离方法的纯化有效性进行定量，使用了ELISA（酶联免疫吸附测定）测试系统。ELISA测试系统是工艺特异性的，用于检测来自特定细菌或来自特定培养的细胞系（例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养物）的HCP。
例如，CHO HCP ELISA试剂盒的原理基于样品中CHO蛋白质与两种抗体（一种被固定在微孔中，而另一种缀合至辣根过氧化物酶（HRP））的结合。经过温育和洗涤步骤之后，加入显色底物（TMB）并通过HRP在底物上的酶促反应显色，该反应与存在于样品中的抗原的量成正比。加入终止溶液以终止反应，并随后使用ELISA微孔读数器测量在450 nm处的吸光度。由CHO HCP的标准曲线计算出样品和对照中的CHO蛋白质的浓度。
用于对分离的HCP定量的另一种方法是通过SDS-PAGE后接条带分析（通过BioDoc凝胶分析软件）完成的。
SDS-PAGE分析的原理由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）组成并涉及基于蛋白质大小而将它们分离开。通过在变性和还原条件下加热样品，蛋白质变为解折叠的并被SDS去污剂分子包裹，从而获得了与多肽链的长度成比例的高的净负电荷。当被加样到凝胶基质并置于电场中时，带负电的蛋白质分子向带正电的电极迁移并通过分子筛效应被分离开。在通过蛋白质特异的染色技术显现之后，可以通过蛋白质迁移距离与已知分子量的标准的迁移距离的比较来估计其大小。也可能在被称为蛋白质印迹法的程序中，将分离的蛋白质印到带正电的膜上并用蛋白质特异的抗体进行探测。
可以通过BioDocAnalyze系统（一部科学级数码相机以及所包括的用于凝胶和印迹分析的软件）完成对分离的蛋白质的记录和后续分析。此系统在市场上有售。
附图列表：
图1a：经过不同条件处理后，在各种A蛋白捕获后的抗体池(pool)中mAb03的减少和HCP的减少（%）。
图1b：经过不同条件处理后，在各种A蛋白捕获后的抗体池中mAb05的减少和HCP的减少（%）。
图1c：经过不同条件处理后，在各种A蛋白捕获后的抗体池中mAb07的减少和HCP的减少（%）。
图1d：经过不同条件处理后，在各种A蛋白捕获后的抗体池中mAb08的减少和HCP的减少（%）。
图2a：在用具有31.4 nm的平均直径孔的多孔PS-DVB颗粒材料于不同条件下处理后，mAb05的减少和HCP的减少（%）。
图2b：在用具有20.4 nm的平均直径孔的PS-DVB颗粒材料于不同条件下处理后，mAb05的减少和HCP的减少（%）。
图2c：在用具有15.8 nm的平均直径孔的PS-DVB颗粒材料于不同条件下处理后，mAb05的减少和HCP的减少（%）。
图3：在用具有15.8 nm的平均直径孔的PS-DVB颗粒材料处理后，mAb的减少和HCP的减少（%）。
图4：在用具有15.8 nm的平均直径孔并且被分为不同粒子大小（范围从>63µm（顶线）到40-63µm（中线）并到20-40µm（底线））的PS-DVB颗粒材料处理后，mAb的减少和HCP的减少（%）。
图5：在下列颗粒材料的不同加样下，mAb03的水平和含有FC的片段的穿透水平：PS-DVB（PS01）–平均孔径31.4 nm、PS-DVB（PS02）–平均孔径20.4 nm 以及PS-DVB（PS03）–平均孔径15.8 nm。
图6：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb03的水平和HCP的穿透水平，其中30422（d50-36.1µm）和PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，30410（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，而30423（d50-35.5µm）由与二乙烯基苯（50%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（50%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。
图7a：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb06 HCP的穿透水平，其中30422（d50-36.1µm）和PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，30410（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。第3次运行和第5次运行是用A蛋白后的mAb06池（pH5.0，传导性-1.4mS/cm）进行的，而第4次运行、第7次运行和第9次运行是用这样的A蛋白后的mAb06池进行的：其中加入了NaCl以将所述池的传导性提高至3mS/cm。
图7b：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb06 LMW（%）穿透水平，其中30422（d50-36.1µm）和PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，30410（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。第3次运行和第5次运行是用A蛋白后的mAb06池（pH 5.0，传导性-1.4mS/cm）进行的，而第4次运行、第7次运行和第9次运行是用这样的后A蛋白后的mAb06池进行的：其中加入了NaCl以将所述池的传导性提高至3mS/cm。
图7c：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb05 LMW（%）穿透水平，其中PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，MS39（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，而AC是天然活性炭（Nuchar HD）。
图7d：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb05 HCP的穿透水平，其中PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，MS39（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，而AC是天然活性炭（Nuchar HD）。
图8：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb03 HCP的穿透水平，其中30410材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。第1-3次运行代表了经过柱的清洁与再平衡后的顺序运行。
图9：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb03 HCP的穿透水平，其中30410材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。P242是竞争剂疏水性材料，P248是竞争剂疏水性材料，而Nuchar HD是尺寸在40-63µm的活性炭材料。
图10a：经过在PS-DVB-EGDMA颗粒材料上的不同加样后，在各种A蛋白后（例如Prosep Ultra Plus (PUP)、Mab Select Sure、Eshmuno A）的mAb03池中HCP的水平，其中此材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。
图10b：经过在PS-DVB-EGDMA颗粒材料上的不同加样后，在各种mAb07 A蛋白（例如PUP, MAB Select Sure Eshmuno A）池中HCP的水平，其中此材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。
图11：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb03 HCP的穿透水平，其中在一个实验中，加入NaCl至0.5M的浓度。30451材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，30410材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。
图12：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，以900 cm/h操作时，mAb03 HCP的穿透水平，其中30410材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。P242是竞争剂疏水性材料，而P248也是竞争剂疏水性材料。
图13：DVB-EGDMA、Eshmuno® S和Eshmuno® Q树脂上A蛋白吸附的还原SDS PAGE分析。
实施例
基础珠：
合成基于聚苯乙烯的材料（如P353、P374和P375）
将25.6 g 聚乙烯醇和0.38 g SDS溶于614.2 g 水中以形成用于以下悬浮聚合的水相。通过19.94 g 乙基乙烯基苯、75 g 二乙烯基苯、41.57 g 乙二醇二甲基丙烯酸酯、90.24 g 甲苯、90.24 g 2-乙基-1-己醇（hexanole）和0.96 g AIBN的均匀溶液形成有机相。在反应器容器中，将有机相加入水相中并使这两相在25℃、用搅拌器于480 rpm下乳化以实现预期的粒子大小分布。60 min后，加入640 g水并将反应混合物加热至72℃。使温度保持在72℃两小时并随后升至82℃。使混合物在82℃聚合额外的两小时。在聚合后，在过滤漏斗上过滤此悬浮液并如下洗涤颗粒：60℃的1.5升水，然后是60℃的5升甲醇，40℃的5升甲苯和2升甲醇。将最终产物在真空烘箱中于50℃和50毫巴干燥24小时。就干物质而言的得率是定量的。根据所预期的粒子大小分布，通过筛分法按照现有技术程序将最终产物分类。
实施例1
在本实验中，评价了不同材料从A蛋白后捕获池中移除杂质的能力。测试了两种疏水性材料在静态模式下的杂质移除：
a) 由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料（PS-DVB）
和
b) 由与二乙烯基苯共聚物和乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物交联的聚苯乙烯（m）组成的颗粒材料（PS-DVB-EGDMA）。磷酸缓冲盐水（PBS，10 mM 磷酸根，pH 7.4）被用作所测试材料在经受A蛋白后捕获池之前的平衡和洗涤缓冲液。在剧烈摇动下并在对应于抗体加样（重量比）/颗粒材料体积的一组加样下，使样品经受两种不同的后A蛋白后捕获池过夜。那些加样为0.5、1和2 kg/L。过夜温育之后，过滤掉颗粒材料并使用尺寸排阻层析、HCPELISA和HPLC Prot A方法分析样品以收集性能数据。本实验的结果显示，本实验中所用的两种颗粒材料均吸附HCP和抗体片段（参见表1、2）。
表1：多种抗体的静态片段移除
抗体 材料 片段的起始量（%） 2 kg/L 加样 1 kg/L 加样 0.5 kg/L 加样
mAb04 PS-DVB 1.97 1.41 0.88 0.00
mAb04 PS-DVB-EGDMA 1.99 1.62 1.18 0.72
mAb05 PS-DVB 0.31 0.12 0.03 0.00
mAb05 PS-DVB-EGDMA 0.31 0.15 0.10 0.00
表2：多种抗体的静态宿主细胞蛋白质移除
抗体 材料 2 kg/L 加样(LRV 移除) 1 kg/L 加样(LRV 移除) 0.5 kg/L 加样(LRV 移除)
mAb04 PS-DVB 0.61 0.96 1.24
mAb04 PS-DVB-EGDMA 0.45 0.91 1.29
mAb05 PS-DVB 1.71 2.15 2.21
mAb05 PS-DVB-EGDMA 1.63 1.89 2.26
所有那些实验中的抗体得率均大于80%。
实施例2
在本实验中，评价了不同材料从A蛋白后捕获池中移除所添加的抗体片段的能力。检查了疏水性材料：
a) 由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料（PS-DVB）
和
b) 由与二乙烯基苯共聚物和乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料（PS-DVB-EGDMA）在静态模式下移除杂质的能力。
磷酸缓冲盐水（PBS，10 mM 磷酸根，pH 7.4）被用作所测试材料在经受A蛋白后捕获模型池之前的平衡和洗涤缓冲液，所述池富集了经过木瓜蛋白酶消化的抗体溶液。在剧烈摇动下并在对应于抗体加样（重量比）/颗粒材料体积的一组加样下，使样品经受所生成的A蛋白后捕获池过夜。所述加样为0.5和1 kg/L。过夜温育之后，过滤掉颗粒材料并使用尺寸排阻层析和HPLC Prot A方法分析样品以收集性能数据。注意到，所用的两种颗粒材料均吸附所添加的抗体片段（参见下表3）。
表3：所添加的抗体片段的静态片段移除
抗体 材料 1 kg/L 加样(LRV 移除) 0.5 kg/L 加样(LRV 移除)
mAb08 PS-DVB 0.22 0.48
mAb08 PS-DVB-EGDMA 0.9 0.21
在所有实验中，抗体得率均高于80%。
实施例3
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料（PS-DVB）从各种A蛋白后捕获的抗体池中移除HCP的能力，其中将后A蛋白后池调整至宽范围的pH和传导性条件。测量以一式两份进行：混合25 µl 颗粒材料和1000 µl PPP（卵黄高磷蛋白磷酸肽；在不同pH和NaCl浓度的缓冲液中以1:4稀释）并温育30分钟。通过ELISA测定对HCP的减少进行定量，而通过SDS-PAGE对mAb的减少进行定量，并且通过BioDoc凝胶分析软件进行后续的条带分析（参见图1a-d）。
图1a：经过不同条件处理后，mAb03的减少和HCP的减少（%）。
图1b：经过不同条件处理后，mAb05的减少和HCP的减少（%）。
图1c：经过不同条件处理后，mAb07的减少和HCP的减少（%）。
图1d：经过不同条件处理后，mAb08的减少和HCP的减少（%）。
实施例4
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的、具有不同平均孔径（通过反SEC和PSS软件估计）的颗粒材料（PS-DVB）从澄清的细胞培养池中移除HCP的能力，其中已经将所述细胞培养池调整至宽范围的pH和传导性条件。测量以一式两份进行：混合25 µl 颗粒材料和1000 µl PPP（在不同pH和NaCl浓度的缓冲液中以1:4稀释）并温育30分钟。通过ELISA测定对HCP的减少进行定量，而通过SDS-PAGE对mAb的减少进行定量，并且通过BioDoc凝胶分析软件进行后续的条带分析（参见图2a-c）。
图2a：在用具有31.4 nm直径的平均孔径的PS-DVB颗粒材料于不同条件下处理后，mAb05的减少和HCP的减少（%）。
图2b：在用具有20.4 nm直径的平均孔径的PS-DVB颗粒材料于不同条件下处理后，mAb05的减少和HCP的减少（%）。
图2c：在用具有15.8 nm直径的平均孔径的PS-DVB颗粒材料于不同条件下处理后，mAb05的减少和HCP的减少（%）。
实施例5
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的、具有15.8 nm的平均孔径（通过反SEC和PSS软件估计）的颗粒材料（PS-DVB）从澄清的细胞培养池中移除HCP的能力。测量以一式两份进行：混合25 µl 颗粒材料和1000 µl PPP（在50 mMTRIS，pH 9，0.5 M NaCl中以1:4稀释）并温育30分钟。通过ELISA测定对HCP的减少进行定量，而通过SDS-PAGE对mAb的减少进行定量，并且通过BioDoc凝胶分析软件进行后续的条带分析（参见图3）。
图3：在用具有15.8 nm直径的平均孔径的PS-DVB颗粒材料处理后，mAb的减少和HCP的减少（%）。
实施例6
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的、具有15.8 nm的平均孔径（通过反SEC和PSS软件估计）的并且被分为（湿筛）不同的颗粒材料尺寸范围的颗粒材料（PS-DVB）从A蛋白后捕获池中移除HCP的能力。测量以一式两份进行：混合25 µl 颗粒材料和1000 µl PPP（在50 mM TRIS，pH 9，0.5 M NaCl中以1:4稀释）并温育30分钟。通过ELISA测定对HCP的减少进行定量，而通过SDS-PAGE对mAb的减少进行定量，并且通过BioDoc凝胶分析软件进行后续的条带分析（参见图4）。
图4：在用具有15.8 nm的平均直径孔并且被分为不同粒子大小（范围从>63µm（顶线）到40-63µm（中线）并到20-40µm（底线））的PS-DVB颗粒材料处理后，mAb的减少和HCP的减少（%）。
实施例7
在本实验中，评价了由用二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的、具有不同平均孔径（通过反SEC和PSS软件估计）的颗粒材料（PS-DVB）从A蛋白后抗体池中移除所引入的经过木瓜蛋白酶消化和Prot A亲和纯化后的含有重链（FC）的抗体片段的能力，其中在A蛋白后抗体池中掺加了已知量的经消化和纯化的含有FC的抗体片段。测量在动态模式下进行：将颗粒材料填入层析柱中并在使用50mM的乙酸盐缓冲液（pH 5.0）平衡后，用准备好的料以300cm/h对其装料。通过SEC-HPLC对片段水平进行定量（参见图5）：
图5：在下列颗粒材料的不同加样下，mAb03的水平和含有FC的片段的穿透水平：PS-DVB（PS01）–平均孔径31.4 nm、PS-DVB（PS02）–平均孔径20.4 nm 以及PS-DVB（PS03）–平均孔径15.8 nm。
实施例8
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯（PS-DVB）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）的各种比例的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料从A蛋白后抗体池中移除HCP的能力。测量在动态模式下进行：将颗粒材料填入层析柱中并在使用50mM的乙酸盐缓冲液（pH 5.0，LF ~2mS/cm，>20CV）平衡后，用A蛋白后的mAb03料（pH 5.0，LF~3mS/cm）@350cm/h对其装料。起始的HCP浓度为900 ng/ml，而mAb浓度为8.4 mg/ml。将所有材料尺寸均限为20-40µm的粒子大小，并用Accusizer估计平均粒子大小分布。通过SEC-HPLC对抗体水平进行定量，并通过ELISA测量对HCP的量定量（参见图6）：
图6：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb03的水平和HCP的穿透水平，其中30422（d50-36.1µm）和PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，30410（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，而30423（d50-35.5µm）由与二乙烯基苯（50%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（50%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。
实施例9
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯（PS-DVB）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）的各种比例的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料从各种A蛋白后抗体池中移除HCP和低分子量物质（例如抗体片段）的能力。测量在动态模式下进行：将颗粒材料填入层析柱中并在使用50mM的乙酸盐缓冲液（pH 5.0，LF ~2mS/cm，>20CV）平衡后，用A蛋白后抗体料（pH 5.0）@300cm/h对其装料。将所有材料尺寸均限为20-40µm的粒子大小，并用Accusizer估计平均粒子大小分布。通过SEC-HPLC对抗体水平进行定量，并通过ELISA测量对HCP的量定量（参见图7a-d）：
图7a：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb06 HCP的穿透水平，其中30422（d50-36.1µm）和PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，30410（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。第3次运行和第5次运行是用A蛋白后的mAb06池（pH5.0，传导性-1.4mS/cm）进行的，而第4次运行、第7次运行和第9次运行是用这样的A蛋白后的mAb06池进行的：其中加入了NaCl以将所述池的传导性提高至3mS/cm。
图7b：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb06 LMW（%）穿透水平，其中30422（d50-36.1µm）和PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，30410（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。第3次运行和第5次运行是用A蛋白后的mAb06池（pH 5.0，传导性-1.4mS/cm）进行的，而第4次运行、第7次运行和第9次运行是用这样的A蛋白后的mAb06池进行的：其中加入了NaCl以将所述池的传导性提高至3mS/cm。
图7c：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb05 LMW（%）穿透水平，其中PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，MS39（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，而AC是天然活性炭（Nuchar HD）。
图7d：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb05 HCP的穿透水平，其中PS02（d50-40.9µm）材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，MS39（d50-35.2µm）材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成，而AC是天然活性炭（Nuchar HD）。
实施例10
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯（PS-DVB）（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料从各种A蛋白后抗体池中移除HCP以及在清洁后再利用所述颗粒材料的能力。测量在动态模式下进行：将颗粒材料填入层析柱中并在使用50mM的乙酸盐缓冲液（pH 5.0，LF ~2mS/cm，>20CV）平衡后，用A蛋白后抗体料（pH 5.0）@300cm/h对其装料。将材料尺寸限为40-63µm的粒子大小，并用Accusizer估计平均粒子大小分布。使用后，将柱用60% DPG溶液洗脱20CV并用50mM 乙酸盐缓冲液（pH 5.0，LF ~2mS/cm，>20CV）再平衡。通过SEC-HPLC对抗体水平进行定量，并通过ELISA测量对HCP的量定量（参见图8）：
图8：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb03 HCP的穿透水平，其中30410材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。第1-3次运行代表了经过柱的清洁与再平衡后的顺序运行。
实施例11
在本实验中，对比市售的疏水性材料，评价了由与二乙烯基苯（PS-DVB）（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料从各种A蛋白后抗体池中移除HCP的能力。测量在动态模式下进行：将颗粒材料填入层析柱中并在使用50mM的乙酸盐缓冲液（pH 5.0，LF ~2mS/cm，>20CV）平衡后，用A蛋白后抗体料（pH 5.0）@600cm/h对其装料。通过SEC-HPLC对抗体水平进行定量，并通过ELISA测量对HCP的量定量（参见图9）：
图9：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb03 HCP的穿透水平，其中30410材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。P242是竞争剂疏水性材料，P248是竞争剂疏水性材料，而Nuchar HD是尺寸在40-63µm的活性炭材料。
实施例12：
应用不同类型的活性炭或疏水性树脂在静态条件下从单克隆抗体溶液中移除单克隆抗体片段
本代表性实施例证明，可以用不同类型的活性炭和不同类型的疏水性树脂通过静态处理从单克隆抗体溶液中选择性地移除单克隆抗体片段。
所制备的MAB08溶液中有大约1.7%的单克隆抗体片段，并随后用三种不同类型的活性炭或两种不同类型的疏水性树脂中的一种在静态条件下处理，如下所述。
MAB08储备溶液是通过用木瓜蛋白酶处理经过纯化的单克隆抗体以将其消化成片段来制备的。消化后，通过加入0.3 M 碘乙酸盐溶液使该酶失活。用透析管（标准RC透析试验试剂盒，Spectra/Por 1-3，3.5K MWCO，54 mm FLAT WIDTH，系列号：132725, SpectrumLaboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, 90220 USA）将经消化的单克隆抗体溶液透析到水中以移除缓冲盐。透析管含有大约0.15 L的经消化的单克隆抗体溶液，浸没在4.0L的水中24小时。然后，将透析管移入装有4.0 L 新鲜水的新容器中，在其中保持浸没另外24小时。
掺加有单克隆抗体片段的MAB08溶液是由18.0 mL 经消化的MAB II、72.0 mL 未消化的MAB08（水溶液）和9.0 mL 250 mM Tris（pH 7）制备的。然后，将此溶液通过0.22 µm的膜（具有0.22 µm Millipore Express® PLUS 膜的Stericup®-GP，250 mL，产品号：SCGPU02RE, EMD Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, USA）过滤。
然后，在15 mL 离心管中装入5 mg或10 mg 的MeadWestVaco Nuchar HD 活性炭（MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, USA）、10 mg 的Norit Darco KB-G 活性炭（Norit Americas Inc., Marshall, Texas, USA）或10 mg 的Norit CGP Super 活性炭（Norit Americas Inc., Marshall, Texas, USA）。在第二组15 mL 离心管中装入25 µL或50 µL 的DVB疏水性树脂或DVB-EGDMA疏水性树脂。在用作对照的第三组15 mL 离心管中不装入介质。然后，向离心管中加入5.0 mL含有1.7%的片段的掺加有片段的MAB08溶液。让这些管旋转20小时。然后，使所有的管经受离心并通过0.22微米的膜（Millex® 注射器过滤单元（Syringe Filter Units），Millex®-GV，0.22 µm, PVDF, 33 mm, γ射线灭菌，产品号：SLGV033RB, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, USA）过滤以移除可能依然悬浮在溶液中的任何颗粒。保留在样品中的MAB08的量通过采用A蛋白 HPLC的IgG定量方法测定。保留在样品中的片段的百分比通过尺寸排阻层析测定。
如下表4中所汇总的，本实验证明，可能用不同类型的活性炭和不同类型的疏水性树脂通过静态处理从含有单克隆抗体的溶液中选择性地移除单克隆抗体片段。片段的百分比随着向单克隆抗体溶液中所加入的活性炭或疏水性树脂的量的增加而降低。数据表明了意料之外的结果：两种树脂均可以用于在静态结合条件下从单克隆抗体溶液中选择性地移除单克隆抗体片段。
表4：经过用三种不同类型的活性炭和两种不同类型的疏水性树脂静态处理MAB08溶液后的单克隆抗体回收以及片段百分比。
介质 介质的量 MAB08 浓度 MAB08 回收 片段百分比
两份对照的平均值 - 7.86 - 1.72
Nuchar HD 10 mg 7.75 99% 0.73
Nuchar HD 20 mg 7.60 97% 0.34
CGP Super 10 mg 7.53 96% 1.08
CGP Super 20 mg 7.57 96% 0.66
Darco KB-G 10 mg 7.73 98% 1.01
Darco KB-G 20 mg 7.76 99% 0.47
DVB-EGDMA 树脂 25 µL 7.36 94% 1.41
DVB-EGDMA 树脂 50 µL 7.60 97% 1.11
DVB 树脂 25 µL 7.66 98% 1.07
DVB 树脂 50 µL 7.52 96% 0.62
实施例13：
应用疏水性树脂在静态条件下从单克隆抗体溶液中移除单克隆抗体片段和HCP
本代表性实施例证明，可以用不同类型的疏水性树脂通过静态处理从单克隆抗体溶液中选择性地移除单克隆抗体片段和HCP二者。
所制备的MAB04溶液中含有大约1.99%的单克隆抗体片段和21 ppm的HCP。然后，用两种不同的疏水性树脂中的一种在静态条件下处理此溶液，如下所述。
MAB04通过CHO细胞培养产生，并经受A蛋白层析捕获工序，用50 mM 乙酸盐（pH3.5）洗脱产物。用1.8 M Tris碱将溶液pH调整至pH 7.5，并随后通过0.22 µm的膜（具有0.22 µm Millipore Express® PLUS 膜的Stericup®-GP，250 mL，产品号：SCGPU02RE, EMDMillipore Corp. Billerica, MA, 01821, USA）过滤。所得溶液通过尺寸排阻层析测定含有1.99%的片段、通过ELISA HCP测定法测定含有21 ppm的HCP。
然后，在15 ml 离心管中装入12.5 µL、25 µL或50 µL的交联的二乙烯基苯（DVB）树脂或交联的二乙烯基苯-乙二醇二甲基丙烯酸酯（DVB-EGDMA）树脂。在用作对照的第二组15 mL 离心管中不加入介质。然后，向离心管中加入5.0 mL含有1.99%的片段的MAB04溶液。让这些管旋转24小时。然后，使所有的溶液通过0.22微米的膜（Millex® 注射器过滤单元(Syringe Filter Units)，Millex®-GV，0.22 µm, PVDF, 33 mm, γ射线灭菌，产品号：SLGV033RB, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, USA）过滤以移除可能依然悬浮在溶液中的任何树脂颗粒。保留在样品中的MAB04的浓度通过UV分光光度计在280 nm处测定。保留在样品中的片段的百分比通过尺寸排阻层析测定。保留在样品中的HCP的浓度通过ELISA测定法测定。
如下表5a和5b中所汇总的，示出了用疏水性树脂处理前溶液中的单克隆抗体回收和片段百分比。本实验证明，用疏水性树脂静态处理单克隆抗体溶液选择性地移除单克隆抗体片段。保留在溶液中的片段的百分比随着向单克隆抗体溶液中所加入的疏水性树脂的量的增加而降低。数据表明了意料之外的结果：疏水性树脂可以用于在静态结合条件下从单克隆抗体溶液中选择性地移除单克隆抗体片段。
表5a：经过DVB-EGDMA疏水性树脂静态处理MAB04溶液后的单克隆抗体回收以及片段百分比。
所加入的树脂（µL） 抗体回收 HCP(ppm) 片段百分比
0 - 21 1.99%
12.5 94% 7 1.62%
25.0 94% 3 1.18%
50.0 83% 1 0.72%
表5b：经过交联的DVB疏水性树脂静态处理MAB04溶液后的单克隆抗体回收以及片段百分比。
所加入的树脂（µL） 抗体回收 HCP (ppm) 片段百分比
0 - 21 1.99%
12.5 >99% 4 1.41%
25.0 97% 2 0.88%
50.0 96% 1 0.00%
实施例14：
应用疏水性树脂在静态条件下从单克隆抗体溶液中移除单克隆抗体片段和HCP
本代表性实施例表明，可以用不同类型的疏水性树脂通过静态处理从单克隆抗体溶液中选择性地移除单克隆抗体片段。
所制备的MAB05溶液中含有大约0.31%的单克隆抗体片段和578 ppm的HCP。然后，用两种不同的疏水性树脂中的一种在静态条件下处理此溶液，如下所述。
MAB05通过CHO细胞培养产生，并经受A蛋白层析捕获工序，用50 mM 乙酸盐（pH3.5）洗脱产物。用1.8 M Tris碱将溶液pH调整至pH 7.5，并随后通过0.22 µm的膜（具有0.22 µm Millipore Express® PLUS 膜的Stericup®-GP，250 mL，产品号：SCGPU02RE, EMDMillipore Corp. Billerica, MA, 01821, USA）过滤。所得溶液通过尺寸排阻层析测定含有0.31%的片段并通过ELISA HCP测定法测定含有578 ppm的HCP。
然后，在15 mL 离心管中装入25 µL、50 µL或100 µL的交联的二乙烯基苯（DVB）树脂或交联的二乙烯基苯-乙二醇二甲基丙烯酸酯（DVB-EGDMA）树脂。在用作对照的第二组15mL 离心管中不加入介质。然后，向离心管中加入5.0 mL含有1.99%的片段的MAB05溶液。让这些管旋转24小时。然后，使所有的溶液通过0.22微米的膜（Millex® 注射器过滤单元(Syringe Filter Units)，Millex®-GV，0.22 µm, PVDF, 33 mm, γ射线灭菌，产品号：SLGV033RB, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, USA）过滤以移除可能依然悬浮在溶液中的任何树脂颗粒。保留在样品中的MAB05的浓度通过UV分光光度计在280 nm处测定。保留在样品中的片段的百分比通过尺寸排阻层析测定。保留在样品中的HCP的浓度通过ELISA测定法测定。
如下表6a、6b和6c中所汇总的，示出了用疏水性树脂处理前溶液中的单克隆抗体回收、片段百分比和HCP的浓度。本实验证明，用疏水性树脂静态处理单克隆抗体溶液选择性地移除单克隆抗体片段和HCP。保留在溶液中的片段的百分比随着向单克隆抗体溶液中所加入的疏水性树脂的量的增加而降低。数据表明了意料之外的结果：疏水性树脂可以用于在静态结合条件下从单克隆抗体溶液中选择性地移除单克隆抗体片段和HCP。
表6a：经过DVB-EGDMA疏水性树脂静态处理MAB04溶液后的单克隆抗体回收以及片段百分比。
所加入的树脂（µL） 抗体回收 HCP (ppm) 片段百分比
0 - 578 0.31%
25 94% 14 0.15%
50 93% 8 0.10%
100 86% 4 BDL*
* 低于检测极限。
表6b：经过交联的DVB疏水性树脂静态处理MAB04溶液后的单克隆抗体回收以及片段百分比。
所加入的树脂（µL） 抗体回收 HCP (ppm) 片段百分比
0 - 578 0.31%
25 97% 12 0.12%
50 93% 4 0.03%
100 87% 4 BDL*
* 低于检测极限。
表6c：经过交联的DVB疏水性树脂在不同pH和传导性条件下静态处理后的单克隆抗体回收以及片段百分比。
Figure 346783DEST_PATH_IMAGE001
实施例15：
应用疏水性树脂在动态条件下从单克隆抗体的各种Prot A后溶液中移除HCP
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯（PS-DVB）（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料从各种A蛋白后抗体池中移除HCP的能力。使用市售的Prosep® Ultra Plus或Mab Select Sure® 或Eshmuno® A材料生成Prot A后池，其中将含有目标抗体的澄清细胞培养物加样至再平衡的Prot A柱至40mg/ml的结合量值 @ 600cm/h并随后用再平衡缓冲液和0.5M NaCl溶液（5CV）洗涤，然后使用50mM 甘氨酸(glycyne)和50mM 乙酸缓冲液（pH 3.5）（5CV）洗脱。然后，将收集到的池加样到由与二乙烯基苯（PS-DVB）（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料上。测量在动态模式下进行：将颗粒材料填入层析柱中并在使用50mM的乙酸盐缓冲液（pH 5.0，LF ~2mS/cm，>20CV）平衡后，用A蛋白后抗体料（pH 5.0）@600cm/h对其装料。通过SEC-HPLC对抗体水平进行定量，并通过ELISA测量对HCP的量定量（参见图10）：
图10a：经过PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样后，在各种A蛋白后（例如Prosep®Ultra Plus (PUP)、Mab Select Sure®、Eshmuno® A）的mAb03池中HCP的水平，其中此材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。
图10b：经过PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样后，在各种A蛋白后（例如Prosep®Ultra Plus (PUP)、Mab Select Sure®、Eshmuno® A）的mAb07池中HCP的水平，其中此材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。
实施例16：
应用疏水性树脂在动态条件下从单克隆抗体的含盐的Prot A后溶液中移除HCP
在以下实验中，评价了由与二乙烯基苯（PS-DVB）（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料从含盐的A蛋白后抗体池中移除HCP的能力。测量在动态模式下进行：将颗粒材料填入层析柱中并在使用50mM的乙酸盐缓冲液（pH 5.0，LF ~2mS/cm，>20CV）平衡后，用含盐（例如0.5m NaCl）的A蛋白后抗体料（pH 5.0）@600cm/h对其装料。通过SEC-HPLC对抗体水平进行定量，并通过ELISA测量对HCP的量定量（参见图11）：
图11：在PS-DVB EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb03 HCP的穿透水平，其中在一个实验中，加入NaCl至0.5M的浓度。30451材料由与二乙烯基苯共聚物交联的聚苯乙烯（m）组成，30410材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚苯乙烯（m）组成。
实施例17
在本实验中，对比市售的疏水性材料，评价了由与二乙烯基苯（PS-DVB）（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料从各种A蛋白后抗体池中移除HCP的能力。测量在动态模式下进行：将颗粒材料填入层析柱中并在使用50mM的乙酸盐缓冲液（pH 5.0，LF ~2mS/cm，>20CV）平衡后，用A蛋白后抗体料（pH 5.0）@900cm/h对其装料。通过SEC-HPLC对抗体水平进行定量，并通过ELISA测量对HCP的量定量（参见图12）：
图12：在PS-DVB-EGDMA颗粒材料的不同加样下，mAb03 HCP的穿透水平，其中30410材料由与二乙烯基苯（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成。P242是竞争剂疏水性材料，P248是竞争剂疏水性材料。
实施例18
应用PS-DVB-EGDMA树脂在静态条件下移除A蛋白
本实施例证明，可以用PS-DVB-EGDMA树脂在各种pH条件下通过静态处理从溶液中选择性地移除A蛋白。
制备了两种含有A蛋白的溶液：
a) 将大约2mg/ml的A蛋白溶于含有50mM NaCl的25mM 乙酸盐-磷酸盐缓冲液（pH4.00）中；
b) 将大约2mg/ml的A蛋白溶于含有50mM NaCl的50mM TRIS 缓冲液（pH 8.00）中。
然后，将所制备的溶液通过0.22 µm的膜（具有0.22 µm Millipore Express®PLUS 膜的Stericup®-GP，250 mL，产品号：SCGPU02RE, EMD Millipore Corp. Billerica,MA, 01821, USA）过滤并随后用三种不同类型的树脂（例如DVB-EGDMA树脂、Eshmuno® S、Eshmuno® Q）中的一种在静态条件下处理，如下所述。
在1.5 ml Eppendorf小瓶中装入200µl的PS-DVB-EGDMA树脂、200µl Eshmuno®S、200µl Eshmuno® Q（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）。然后，向准备好的Eppendorf小瓶中加入1 mL的所制备的A蛋白溶液。让这些小瓶摇动20小时。然后，使所有的管经受离心并通过0.22微米的膜（Millex® 注射器过滤单元(Syrings Filter Units)，Millex®-GV，0.22 µm, PVDF, 33 mm, γ射线灭菌，产品号：SLGV033RB, EMD Millipore Corporation,Billerica, MA, 01821, USA）过滤以移除可能依然悬浮在溶液中的任何珠。保留在样品中的A蛋白的量通过在280nm处的光度吸附（photometric adsorption）而测定并另外经受SDS-PAGE分析。
如下表7中所汇总的，本实验证明，可能用不同类型的珠通过静态处理从被调整至不同pH值的溶液中选择性地吸附A蛋白。由于Eshmuno® S 在pH 4.00的溶液中吸附了A蛋白，其未能在pH 8.00的溶液中吸附A蛋白。另外，Eshmuno® Q 能够在pH 8.00的溶液中吸附A蛋白，但未能在pH 4.00的溶液中吸附A蛋白。令人惊讶的是，数据表明了意料之外的结果：PS-DVB-EGDMA树脂能够在静态结合条件下，在pH 4.00和pH 8.00的溶液中吸附A蛋白。
表7：用三种不同的树脂类型在两种不同的pH条件下静态处理后，A蛋白的水平。
Figure 263923DEST_PATH_IMAGE002
图13：根据实施例18的DVB-EGDMA、Eshmuno® S和Eshmuno® Q树脂上A蛋白吸附的还原SDS PAGE分析，其中
M = PerfectProteinTM 标记；
PA = 起始溶液（2mg/ml A蛋白）；
S = @ Eshmuno®S 吸附后的上清液；
Q = @ Eshmuno®Q 吸附后的上清液；
P = @ DVB-EGDMA 吸附后的上清液。
实施例19：
应用疏水性树脂结合离子交换材料在动态条件下从单克隆抗体的Prot A后溶液中移除HCP
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯（PS-DVB）（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料（686.75m²/g表面积，14 nm 平均孔径以及41µm 平均粒子大小）从A蛋白后抗体池中移除HCP的能力。使用市售的Prosep® Ultra Plus生成Prot A后池，其中将含有目标抗体的澄清细胞培养物加样至再平衡的Prot A柱至40mg/ml的结合量值 @ 600cm/h并随后用再平衡缓冲液（5 CV）洗涤，然后使用50mM 甘氨酸(Glycyne)和50mM 乙酸缓冲液（pH 3.5）（5CV）洗脱。然后，将收集到的池单独地装载到由与二乙烯基苯（PS-DVB）（70%）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）（30%）的共聚物交联的聚(乙基)苯乙烯（m）组成的颗粒材料、Eshmuno®CPX、Eshmuno®Q上，以及通过将所有设备直接相连而组合在一起装载。测量在动态模式下进行：将颗粒材料填入层析柱中并在使用20mM的磷酸盐缓冲液（pH 6.75，LF ~4mS/cm，>20CV）平衡后，用A蛋白后的抗体料（pH 6.75，传导性~2.7mS/cm，~1000ng/ml HCP的量）@600cm/h对其装料。就组合的实例而言，所用设备按以下顺序依次相连：PS-DVB-EGDMA，然后是Eshmuno®CPX，然后是Eshmuno®Q。通过SEC-HPLC对抗体水平进行定量，并通过ELISA测量对HCP的量定量（参见表8）：
表8：用三种不同的树脂类型单独地以及组合地动态处理后的HCP水平（ppm）。
Figure 105977DEST_PATH_IMAGE003
* 计算得到的抗体加样/树脂体积。就组合的实例而言，所有用到的柱均具有相同体积，但加样计算的是第一根柱（PS-DVB_EGDMA树脂）。

Claims (12)

1.从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质、抗体片段和低分子量物质的方法，其特征在于，使具有范围为5–9的pH值和范围为2–50 mS/cm的传导性且含有抗体的水性澄清细胞培养溶液与具有范围为1–100 cm的直径的液相层析柱中的疏水性层析材料接触一段时间，由此所述柱在至高达100 bar的压力下工作，且由此所述抗体保留在溶液中而宿主细胞蛋白质、抗体片段和低分子量物质被所述疏水性层析材料所吸附，所述疏水性层析材料是具有范围为10 µm–600 µm的平均粒径和范围为4–500 nm的孔径的刚性颗粒状的分离材料
且由交联的聚合物构成，所述交联的聚合物又由以98 : 2至最高10 : 90的重量%比例与共聚物交联的聚苯乙烯或聚乙基苯乙烯组成，所述共聚物为二乙烯基苯与乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述液相层析柱具有范围为5–50 cm的直径。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于所述液相层析柱在范围为0.2-80 bar的压力下工作。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于所述疏水性层析材料是具有范围为20 µm–150 µm的平均粒径的刚性颗粒状的分离材料。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于所述疏水性层析材料是具有范围为20 µm–63 µm的平均粒径的刚性颗粒状的分离材料。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于所述疏水性层析材料是具有范围为10–30 nm的孔径的刚性颗粒状的分离材料。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于所述疏水性层析材料是具有范围为13–25 nm的孔径的刚性颗粒状的分离材料。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于，所述水性澄清细胞培养溶液以范围在150–1000 cm/min的流速通过。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述水性澄清细胞培养溶液以范围在300–900cm/min的流速通过。
10.根据权利要求1-7和9中任一项的方法，其特征在于，所述分离在A蛋白亲和结合步骤之后进行。
11.根据权利要求1-7和9中任一项的方法，其特征在于进一步包括用离子交换树脂处理。
12.根据权利要求1-7和9中任一项的方法，其特征在于，将至少一种专门用于分离A蛋白的、采用离子交换树脂的分离处理与如权利要求1-7中任一项所述的疏水性层析材料的处理相结合，使得宿主细胞蛋白质耗尽最高至<10ng并移除沥滤出的A蛋白。
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