JP2016131923A - 分離材 - Google Patents
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[1]多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層とを備える分離材であって、水銀圧入法により測定される上記分離材における細孔容積分布が多峰性であり、細孔容積の最大値が細孔径0.05μm以上0.7μm未満の範囲にあり、かつ細孔径0.7μm以上5μm以下の範囲に極大値を有する峰における細孔容積の総和が全細孔容積の3〜20%である分離材。
[2]上記架橋高分子は更に疎水基を有する、[1]に記載の分離材。
[3]比表面積が30m2/g以上である、[1]又は[2]に記載の分離材。
[4]上記多孔質ポリマ粒子は、ジビニルベンゼンを含有するモノマを重合させて得られるポリマを含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の分離材。
[5]上記細孔容積分布における細孔容積の最大値が細孔径0.05μm以上0.6μm以下の範囲にある、[1]〜[4]のいずれかに記載の分離材。
[6]上記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が10〜300μmである、[1]〜[5]のいずれかに記載の分離材。
[7]平均粒径が10〜300μmである、[1]〜[6]のいずれかに記載の分離材。
[8]上記架橋高分子はアガロース又はその変性体由来の架橋高分子である、[1]〜[7]のいずれかに記載の分離材。
[9]上記多孔質ポリマ粒子1g当たり30〜400mgの上記被覆層を備える、[1]〜[8]のいずれかに記載の分離材。
[10]カラムに充填した場合、カラム圧が0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、[1]〜[9]のいずれかに記載の分離材。
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤を含むモノマを重合させて得られるポリマを含む粒子であり、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、アクリル系モノマ、スチレン系モノマを使用することができる。具体的なモノマとして以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。
本実施形態の被覆層は、水酸基を有する架橋高分子を含む。水酸基を有する架橋高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することにより、カラム圧の向上を抑制することができるとともに、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上にすることが可能となる。被覆層は、例えば、多孔質ポリマ粒子の表面に、水酸基を有する高分子を吸着させた後、高分子を架橋することによって、多孔質ポリマ粒子の表面に形成することができる。
水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、5〜20(mg/mL)が好ましい。この溶液を、多孔質体の細孔内に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド(プロテインA)等を表面上の水酸基等を介して導入することにより、イオン交換精製、アフィニティー精製等に使用することができる。イオン交換基を導入する方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
1)粒子を、超音波分散装置を使用して水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフロー、シスメックス製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径及び粒径のC.V.(変動係数)を測定する。
(吸湿後分離材質量−1)g/1g×100=吸湿度(%)
<多孔質ポリマ粒子1の合成>
500mLの三口フラスコに、純度96%のジビニルベンゼン(新日鉄住金化学社製、商品名DVB960)12g、ジエチルベンゼン4.5g、イソアミルアルコール19.5g、過酸化ベンゾイル0.64g、平均粒径1μmの炭酸カルシウム粒子3.0gをポリビニルアルコール水溶液(0.5質量%)に一括して加えて混合液を調製した。この混合液をマイクロプロセスサーバーを使用して乳化後、得られた乳化液を80℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約8時間撹拌した。得られた粒子をろ過し、アセトンで洗浄した。その後、酸水溶液で粒子中の炭酸カルシウムを溶解させ、多孔質ポリマ粒子1を得た。得られた多孔質ポリマ粒子1の平均粒径(体積基準)及び粒径のC.V.をレーザー回折粒度分布計(FPIA−3000(シスメックス社製))にて測定した。結果を表1に示す。
アガロース(Agarose LMP、(Promega社製))の水溶液(濃度2質量%)100mLに、水酸化ナトリウム4g及びグリシジルフェニルエーテル0.14gを投入して70℃で12時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで沈殿させ、沈殿物を洗浄し、変性アガロースを得た。得られた変性アガロースを再度水に溶解して20mg/mLの変性アガロース水溶液を調製した。この水溶液70mLに多孔質ポリマ粒子1を1gの割合で投入し、55℃で24時間撹拌することによって、変性アガロースを多孔質ポリマ粒子1に吸着させた。変性アガロースを吸着させた多孔質ポリマ粒子1をろ過し、熱水で洗浄した。多孔質ポリマ粒子1への変性アガロースの吸着量は乾燥させた粒子の熱重量減少を測定し、算出した。
得られた分離材0.5gをBSA(Bovine Serum Alubumin)濃度20mg/mLのリン酸緩衝液(pH7.4)50mLに投入し、24時間室温で撹拌を行った。その後、遠心分離を行って上澄み液をとった。分光光度計で上澄み液の280nmの吸光度を測定することによって求めた上澄み液中のBSA濃度から、分離材に吸着したBSA量を算出した。結果を表3に示す。
1gの乾燥させた分離材を恒温恒湿度試験槽(温度60℃、湿度90%)内に18時間放置し、その後、再度分離材の質量を測定した。以下の式により、分離材の吸湿度を算出した。結果を表3に示す。
(吸湿後分離材質量−1)g/1g×100=吸湿度(%)
分離材を含む水懸濁液をろ過して得られた分離材(乾燥質量20g)を5Mの水酸化ナトリウム水溶液200mLに投入し、室温で1時間放置した。別途、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量(60g)を16mLの水に溶解し、更にイソプロピルアルコール128m1と混合して得た溶液を、水酸化ナトリウム水溶液を含浸した状態の分離材を含む上記水酸化ナトリウム水溶液に加えた。水溶液の温度を70℃まで上げ、撹拌しながら2時間反応させた。反応終了後、生成物をろ取して水洗し、ジエチルアミノエチル(DEAE)基をイオン交換基として有する(DEAE変性)分離材を得た。以降の細孔容積分布、比表面積、イオン交換容量、カラム特性の評価には、DEAE変性分離材を用いた。
得られた分離材の細孔容積分布及び比表面積を、水銀圧入測定装置(オートポア:島津製作所社製)を用いて以下のようにして測定した。試料は、分離材のそのまま約0.05gを、標準5cc粉体用セル(ステム容積0.4cc)にとり、初期圧21kPa(約3psia、細孔直径約60μm相当)の条件で測定した。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角130degrees、水銀表面張力485dynes/cm(4.85×10−2mN/m)に設定した。細孔径0.05〜5μmの範囲に限定してそれぞれの値を算出した。得られた細孔容積分布について、各峰における細孔容積の全細孔容積(細孔径0.05〜5μmの細孔容積)に対する割合を、水銀圧入測定装置に付属の解析ソフトによって算出した。細孔容積の最大値を示す細孔径、当該最大値を有する峰における細孔容積の全細孔容積に対する割合、最大値以外の極大値を示す細孔径、当該極大値を有する峰における細孔容積の全細孔容積に対する割合、及び比表面積を表2に示す。分離材の細孔容積分布を図1に示す。分離材の細孔容積分布は、極大値が細孔径0.34μmにある峰及び1.28μmにある峰を有する二峰性であることが確認された。図1において、細孔容積は細孔径0.34μmに最大値を有し、当該最大値を有する峰における細孔容積は全細孔容積に対して91%であった。また、図1において、細孔径1.28μmに極大値を有する峰における細孔容積は、全細孔容積に対して9%であった。
12時間以上水で膨潤させた分離材を0.2〜0.3g定量し、ビーカに移し、0.1Nの水酸化ナトリウム溶液20mLを加え、25℃、1時間撹拌した。その後、フィルタを用いて吸引ろ過を行い、フィルタ上の粒子を洗浄液が中性になるまで洗浄した。その後、粒子をビーカに移し、0.1N塩酸水溶液20mLを添加し、室温で1時間撹拌した。その後、フィルタを用いて吸引ろ過を行い、フィルタ上の粒子を洗浄液が中性になるまで洗浄した。この洗浄液について自動電位差滴定装置を使用して0.1N水酸化ナトリウム水溶液で滴定を行うことによって、分離材のイオン交換容量(mmol/mL)を求めた。結果を表3に示す。
得られた分離材を濃度30質量%のスラリー(溶媒:メタノール)としてφ7.8mm×300mmのステンレスカラムに4MPaにて15分間かけて65cc充填し、以下の評価に用いた。
分離材を充填したカラムに流速を変えながら水を通し、流速とカラム圧の関係を測定した。カラム圧が0.3MPaであるときの線流速(通液速度)を求めた。結果を表3に示す。
分離材を充填したカラムに、20mmol/L Tris−塩酸緩衝液(pH8.0)を10カラム容量流した。その後、BSA濃度2mg/mLの20mmol/LのTris−塩酸緩衝液を通し、UV吸光度測定によってカラム出口での溶出液中のBSA濃度を測定した。カラム入口と出口のBSA濃度が一致するまで緩衝液を通した。線流速は上記通液性評価にてカラム圧が0.3MPaとなるときの速度と同様とした。その後、5カラム容量分の1M NaCl Tris−塩酸緩衝液で希釈した。10%break throughにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表3に示す。
q10=cfF(t10−t0)/VB
q10:10%breakthroughにおける動的吸着量(mg/mL wet resin)
cf:注入液のBSA濃度(mg/mL)
F:流速(mL/min)
VB:ベッド体積(mL)
t10:10%breakthroughにおける時間(min)
t0:BSA注入開始時間(min)
分離材を0.5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で24時間撹拌した後、リン酸緩衝液で洗浄後、上記カラム特性評価の場合と同様の方法でカラムに充填し、BSAの10%breakthrough動的吸着量を測定した。アルカリ処理前の10%breakthrough動的吸着量と比較し、アルカリ処理後の動的吸着量の減少割合が3%以下である場合を「○」、3%超20%以下である場合を「△」、20%超である場合を「×」とした。結果を表3に示す。
ジエチルベンゼンの使用量を10gに変更し、イソアミルアルコールの使用量を14gに変更し、炭酸カルシウムの使用量を4.0gに変更した以外は多孔質ポリマ粒子1と同様にして、多孔質ポリマ粒子2を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子2を実施例1と同様の方法で処理することによって分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について実施例1と同様の評価を行った。
イソアミルアルコールの使用量を15gに変更し、更にヘキサノール4.5gを使用し、炭酸カルシウムの使用量を5.0gに変更した以外は多孔質ポリマ粒子1と同様にして、多孔質ポリマ粒子3を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子3を実施例1と同様の方法で処理することによって分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼンの使用量を4gに変更し、更にジヒドロキシプロピルメタクリレート8gを使用し、炭酸カルシウムを使用しなかった以外は多孔質ポリマ粒子1と同様にして多孔質ポリマ粒子4を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子4を実施例1と同様の方法でDEAE変性処理のみを行って分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について、実施例1と同様の評価を行った。実施例1におけるDEAE変性前の分離材としては、多孔質ポリマ粒子4を用いて評価を行った。
市販のアガロース粒子(Capto DEAE:GEヘルスケア社製)を多孔質ポリマ粒子5として使用した。また、多孔質ポリマ粒子5をそのまま分離材として用い、実施例1と同様に評価を行った。
Span 80を追加して使用し、マイクロプロセスサーバーを使用しなかった以外は特開平1−254247号公報に記載の実施例1と同様にして、以下のように多孔質ポリマ粒子6を作製した。モノマとして2,3−ジヒドロキシプロピルメタクリレート11.2g、エチレングリコールジメタクリレート4.8gを用い、Span 80を5g用いて多孔質ポリマ粒子6を合成した。洗浄後の多孔質ポリマ粒子6の4gをデキストラン(分子量15万)1g、水酸化ナトリウム0.6g及び水素化ホウ素ナトリウム0.15gを蒸留水に溶解させた溶液6gを加えて、多孔質ポリマ粒子6の細孔内に含浸させた。得られたデキストラン溶液含浸重合体を、1質量%エチルセルローストルエン溶液1Lに加えて撹拌し、分散、懸濁させた。得られた懸濁液中に、エピクロルヒドリン5mLを加えて50℃に昇温し、この温度で6時間撹拌して、重合体の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を液と分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄し、分離材を得た。得られた多孔質ポリマ粒子6及び分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
炭酸カルシウムを使用しない点以外は多孔質ポリマ粒子1の粒子合成と同じ条件で多孔質ポリマ粒子7を合成し、実施例1と同様の処理を行って分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について実施例1と同様に評価を行った。
Claims (10)
- 多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層とを備える分離材であって、
水銀圧入法により測定される前記分離材における細孔容積分布が多峰性であり、
細孔容積の最大値が細孔径0.05μm以上0.7μm未満の範囲にあり、かつ
細孔径0.7μm以上5μm以下の範囲に極大値を有する峰における細孔容積の総和が全細孔容積の3〜20%である分離材。 - 前記架橋高分子は更に疎水基を有する、請求項1に記載の分離材。
- 比表面積が30m2/g以上である、請求項1又は2に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子は、ジビニルベンゼンを含有するモノマを重合させて得られるポリマを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記細孔容積分布における細孔容積の最大値が細孔径0.05μm以上0.6μm以下の範囲にある、請求項1〜4のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が10〜300μmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分離材。
- 平均粒径が10〜300μmである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記架橋高分子はアガロース又はその変性体由来の架橋高分子である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子1g当たり30〜400mgの前記被覆層を備える、請求項1〜8のいずれか一項に記載の分離材。
- カラムに充填した場合、カラム圧が0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の分離材。
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