CN107001411B - 从粗溶液捕获靶分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从含有靶肽的溶液分离肽聚集体和片段的方法。

Description

从粗溶液捕获靶分子
本发明涉及从含有靶肽的溶液分离肽聚集体和片段的方法。
现有技术
由于重组表达的肽用于药物应用，所以它们需要特别高的纯度[E. P. Kroeff，R.A. Owens，E. L. Campbell，R. D. Johnson，H. I. Marks，Journal of Chromatography，461（1989）45-61]。
为了响应更低成本和更高数量的生物治疗药物的市场压力，许多制造商正在考虑当可能时将微生物表达系统（大肠杆菌（E.coli））作为哺乳动物培养的有吸引力的替代品。微生物表达系统以高生产力和低表达率为特色，但通常以变性状态获得靶分子。
一般来说，大肠杆菌（Escherichia coli）培养物用于制造目前市场上大多数重组肽[F. A. O. Marston，Biochem. J.（1986）240,1-12]。这些治疗用肽的生产通常在生物反应器中开始，所述生物反应器含有以高速率生产治疗用肽的细胞悬浮液，从而导致其在细胞内液中的聚集和形成内含体。然后收获生长的细胞并使其破裂以获得含有不溶性靶肽的内含体。在靶分子增溶和再折叠后，使后者经历一系列过程，包括澄清、过滤和纯化，其去除错折叠的肽、DNA、HCP、聚集体等。这一系列的过程通常被称为下游过程（DSP）。
最常用的DSP包括一个或两个结合-洗脱（bind-elute）层析纯化步骤，随后是一个或两个流通（flow-through）精炼（polishing）步骤。典型的下游纯化方法采用填充有多孔的基于珠的层析介质的填充柱或基于膜的设备。这些单元操作被串联使用，并且每个操作都旨在以流通精炼或结合/洗脱捕获模式清除颗粒性杂质。精炼介质的主要目的之一是降低聚集体浓度到根据靶肽浓度<1％。
如上所述，通常以变性状态获得靶分子。这使得纯化过程复杂化，这是因为靶分子在最终纯化之前被增溶和重折叠。由于这些情况，该方法可能非常低效，这是因为总得率仅在5至10％的范围内，并且在纯化过程中需要至少5个耗时的逐步模式的纯化步骤。此外，主要杂质是必须去除的聚集的靶分子。
因此，肽重折叠过程是最具挑战性的生产步骤之一[A. Jungbauer，Journal ofBiotechnology 128（2007）587-596; A.P.J. Middelberg，Trends in BiotechnologyVol. 20 No. 10 2002年10月，437-443]，从而由于形成不溶性聚集体导致高的靶肽损失。
该方法基于离子交换层析模式的窄应用窗口（例如，pH和溶剂电导率依赖的），所述离子交换层析模式适合于捕获所期望的靶分子和所需的初级纯化，其后是使用许多正交技术（如，尺寸排阻层析、疏水作用等）的附加纯化步骤，以达到生物治疗分子的规格。此外，实施后续结晶以除去在最终高压精炼步骤中使用的有机溶剂。
每个靶分子的制造过程各自开发，对应于物理性质和生物治疗分子规格，从而增加制造成本和上市时间。
总之，典型的靶肽纯化过程是各自开发的，对应于物理性质和生物治疗分子规格。各种澄清、过滤和纯化步骤用于纯化靶肽。例如，一些技术更常见，例如用于EPO纯化的离子交换层析和疏水作用层析[WO 03/045996；WO 00/27869；WO2009/147060]。其它方法包括使用疏水聚苯乙烯树脂（例如，Source 30RP）作为捕获步骤，随后直接是离子交换步骤（EP0265222），随后是羟基磷灰石，用于片段和聚集体分离。
尤其羟基磷灰石的使用对于从微生物表达系统中纯化靶分子是非常重要的，这是因为主要工艺杂质是靶分子聚集体（WO 2005/044856；WO 2010/147686）。
最近，在工业中已经有设法减少保持产品质量属性的纯化步骤的数目或使其简化的明显趋势。同样，使用生物反应器获得更高表达效价的技术的使用是工业中的上升趋势。这两种趋势的组合已导致将更多的产物加载到柱上，从而导致相当昂贵的层析介质的增加的负担以及更低的产物纯度，这两者都是不希望有的。
为了改善所期望的蛋白质产物如聚集体的层析纯化的选择性，已经平行于纯化方法的改变开发出各种层析材料。尤其是分离材料表面的特异性衍生化应导致从期望的产物更选择性地分离不希望有的杂质。但这些特殊且复杂的表面衍生化使得这些层析材料的生产比商业上可获得的产品贵得多，因此它们在工业规模纯化中的用途不太有吸引力。
层析材料领域中的其他发展被吸引到基于有机底材的分离材料上，这是因为基于二氧化硅材料的商业上可获得的材料通常在碱性环境中受到影响并且失去稳定性，特别是在再生期间。
基于有机聚合物的固定相可在宽范围的pH条件下运行。因此，可以在高pH条件下强有力地清洗聚合物树脂。但目前的聚合物固定相在用于高性能生物分子分离的中至高压条件下是有点可压缩的。
通过含二乙烯基苯（DVB）的混合物在非溶剂存在下的悬浮聚合生产的常规大孔共聚物代表具有宽范围孔径分布和表面积的聚合物。这种聚合物珠例如在US 4,686,269中公开。这些聚合物珠由平均粒径为0.5至50 µm的乙烯基芳族单体制备。但它们在通常用于生产规模层析柱中的高压条件下不是刚性的。用于层析的聚合物珠的刚性是必不可少的，这是因为它与多孔聚合物固定相一起提供分离期间必要的压力和流动特性。
发明目的
从上述现有技术的结果可以看出，需要一种稳健和可靠的肽纯化方法，其可以在结合和洗脱模式以及流通模式的广泛条件下有效应用，并且其中关键杂质例如聚集体和靶肽片段的水平被降低。
本发明的目的也是最优化该方法并减少所需的工艺步骤的数目并加速生产过程。本发明的另一个目的是提供一种容易可行的方法，以及显著降低的生产和纯化所期望的生物药物（biopharmaceutical）分子的成本。
发明概述
出乎意料地发现，聚苯乙烯颗粒可以用于在宽的操作窗口（operational window）中直接从过滤的细胞培养液或重折叠池捕获靶分子，从而使得能够使用不易燃的溶液直接在洗脱中分离片段化和聚集形式。获得的预纯化的靶分子溶液可以直接经历离子交换层析以进行最终纯化。
更具体地，本发明涉及从含有靶肽的溶液分离肽聚集体和片段的方法，包括以下步骤：
（a）提供含有靶肽的样品；
（b）使所述样品与疏水层析材料接触适当的时间段并吸附肽，
（c）通过使用不同的溶剂组合物回收靶肽，并
从而使聚集的肽和肽片段与靶肽分离。
特别地，本发明涉及如权利要求1至17所请求保护的方法。
发明详述
本发明涉及一种从含有靶肽的溶液分离肽聚集体和片段的方法，其中将含有肽的溶液与疏水层析材料接触合适的时间段，由此肽被疏水层析材料吸附，随后通过使用不同的溶剂组合物选择性回收吸收的肽。因此，聚集的肽形式可以部分地或完全地与靶肽分离。
详细地说，分离是通过使用疏水层析材料进行的，该疏水层析材料是颗粒的并由交联的乙烯基苯、乙基苯乙烯、聚（乙基）苯乙烯-二乙烯基苯或聚（乙基）苯乙烯-二乙烯基苯乙二醇-二甲基丙烯酸酯树脂制备。优选地，树脂由交联聚合物组成，所述交联聚合物由比例为98:2至最高10:90重量％的苯乙烯和二乙烯基苯组成。在改性形式中，颗粒材料由聚苯乙烯组成，其以98:2至最高10:90重量％的比例与二乙烯基苯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物交联。通常，这些颗粒状疏水层析分离材料具有的平均粒径在10 μm-600 μm的范围内，优选在20 μm-150 μm的范围内，最优选在20 μm-63 μm的范围内。该尺寸的合适的疏水多孔聚合物珠具有的孔径优选在4-500 nm的范围内，更优选在10-30 nm的范围内，最优选在13 nm-25 nm的范围内。
本发明的目的具体是通过使用孔径在4 nm-500 nm范围内，优选在10 nm-30 nm范围内，最优选在13 nm-25 nm范围内的用于从含有靶肽的溶液分离聚集体和肽片段的疏水层析分离材料使聚集的肽与所期望的肽分离的方法。本发明所用的疏水层析分离材料优选由交联的乙烯基苯、交联的乙基苯乙烯、聚苯乙烯/聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯或聚苯乙烯/聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯乙二醇-二甲基丙烯酸酯树脂制备。在尤其优选的实施方案中，本文所述的所使用的疏水刚性聚合物珠具有的平均粒径在10 μm-600 μm的范围内，优选在20 μm-150 μm的范围内，最优选在20 μm-63 μm的范围内，且孔径在4 nm-500 nm的范围内，优选在10 nm-30 nm的范围内，最优选在13 nm-25 nm的范围内。
为了实现使聚集的肽与所期望的肽分离，将pH值在2-11范围内，优选在3-8范围内且电导率在1-150 mS/cm范围内，优选在2-50 mS/cm范围内的水溶液与疏水层析材料接触。将疏水层析材料以在150-1000 cm/分钟范围内，优选在300-900 cm/分钟范围内的流速暴露于每ml填充床中30-100 mg靶肽，优选每ml填充床中50-80 mg靶肽。吸附靶肽后，疏水层析材料以直接或梯度的方式暴露于含有机溶剂的水溶液中。依赖于有机溶剂浓度，实现了聚集的肽和靶肽之间的部分分离。在特别优选的实施方案中，在靶分子重折叠步骤之后进行聚集体的分离。如果需要，纯化顺序包括用离子交换树脂处理。依赖于待从处理的流体分离的物质的性质，可以在工艺步骤中应用阴离子或阳离子交换树脂。优选地，可以使用提供带负电荷的基团如磺酸或硫酸根基团的阳离子交换树脂。已经发现，为此目的，以商品名Eshmuno(R) S销售的离子交换材料是特别合适的。
为了以梯度方式解吸靶分子，洗脱时间期间流动相的组成发生变化。为了本发明的目的，使用有用的水性溶剂混合物。实验已表明，包含至少一种选自双丙甘醇、二甘醇、乙醇、甲醇和丙醇的溶剂的水性混合物导致良好的分离结果。通常，这些溶剂混合物包含用于设置洗脱的其它添加剂。例如，溶剂混合物可与一定量的甘氨酸混合。此外，通过加入适当的缓冲剂来调节pH用于所期望的目的。依赖于洗脱发生在什么pH范围内，不同的缓冲剂是合适的。因此，可以应用缓冲剂如三（羟甲基）-氨基甲烷（TRIS）、乙酸盐或磷酸盐缓冲剂。此外，如果需要，溶剂混合物可以包含合适的盐，如氯化钠。
关于相应梯度洗脱的实施的详细信息可以由专家从文献或适当的教科书中找到，例如“Preparative Chromatography of Fine Chemicals and Pharmaceutical Agents”，Henner Schmidt-Traub，Wiley-VCH Verlag，2005，p. 152 - 161。
在这里描述的各种实验中，发现多孔疏水作用材料如多孔聚（二）乙烯基芳族珠可用于大规模肽纯化。可以进行这些纯化步骤，以降低存在于含有目标蛋白质的样品（例如，肽重折叠池）中的一种或多种杂质的水平。
为此目的，将肽重折叠溶液与疏水作用材料接触，例如与多孔疏水聚苯乙烯珠接触，并温育一定时间段以吸附靶肽和部分或全部杂质（例如，聚集体和级分）。吸附后，可以使用各种比例的有机溶剂来实现结合的组分的选择性解吸。通过该程序，可能从含有目标肽的溶液选择性地降低不想要的肽片段和聚集体。
所述疏水作用材料尤其适合于加到肽重折叠后溶液（post peptide refoldingsolutions），以及通过使澄清的细胞培养液与材料接触合适的时间段来选择性地降低聚集的物质的水平。为了进行这个纯化过程，疏水作用材料（例如，聚苯乙烯珠）被并入一个或几个层析柱或其它设备，例如过滤器壳等中。然后将这些填充柱以结合和洗脱或流通模式用于蛋白质纯化过程，由此聚集的物质与疏水作用材料相互作用更强，且聚集体的水平降低。在这种情况下，当将流速调节到150 cm/分钟-1000 cm/分钟的范围内，且尤其300-900 cm/分钟时，获得了良好的纯化结果。
此外，在本文所述的实验中，发现如果将溶液的pH调节至pH 2-11的范围内，且优选pH 3-8的范围内，则可以实现良好的纯化结果。
同时，已经证明如果溶液的电导率在1 mS/cm-50 mS/cm的范围内，且尤其是在2-50 mS/cm的范围内，则是有利的。
此外，在本文所述的实验中，发现如果使用诸如乙醇、1-丙醇、双丙甘醇的有机溶剂来选择性地从疏水作用材料解吸所吸附的物质，则可以实现良好的纯化结果。
如本文的实验所证实的，发现尤其令人惊讶的是，通过使用小多孔聚合物珠形式的疏水作用材料可以实现靶肽的高纯度。在一些实施方案中，该材料可以主要由聚苯乙烯或聚乙基苯乙烯组成，并且可以通过疏水和亲水单体的混合物交联，例如二乙烯基苯（DVB）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）。
通常通过悬浮聚合生产多孔聚合物珠。它们可以在这样的方法中生产，所述方法例如类似于US 4,382,124中公开的方法，并且其中孔隙度通过在致孔剂（porogen）（也称为“相增量剂（phase extender）”或“沉淀剂”）的存在下通过悬浮聚合引入到共聚物珠中，所述致孔剂是单体的溶剂，但是聚合物的非溶剂。常规的多孔聚合物，例如根据US 4,382,124制备的那些，一般包括使用宽范围的致孔剂类型、相对于单体相的致孔剂浓度、单体类型、交联单体类型、交联剂水平、聚合引发剂和引发剂浓度。然而，本发明基于如下出乎意料的发现：当疏水单体的比例在特定范围内时，这些聚合物珠在从细胞培养液体纯化抗体中尤其合适并有效。
虽然不希望受理论束缚，但是认为在本发明的情况下，主要当通过增加聚合物中含有的疏水分子的份额而改变聚合物基质时来实现增加的靶分子额。考虑到聚合物结构单体和致孔剂的量和交联剂水平的平衡，进行这种改变，所述聚合物结构单体和致孔剂的量和交联剂水平共同影响靶分子的孔隙度、刚性和结合量参数。
非常出乎意料地，发现通过这些选择的开放（open）多孔疏水聚合物珠可以实现聚集体的显著改善的分离。多孔结构使得分子能够快速扩散进出聚合物基质，并且由于聚合物珠的孔隙度，可以获得大的表面积用于与细胞培养基中包含的不需要的杂质的相互作用。因此，这些材料在分离固定相中的生物分子方面非常有效。大多数现代商业聚合物反相层析固定相似乎围绕这些标准设计，并且在较低压力条件下使用，然而，在较高压力条件下（一般在10-100巴的范围内），这些材料是可压缩的。幸运的是，这里描述的聚合物珠具有增加的刚性，并且同时具有高孔隙度，从而为颗粒内扩散提供高容量。
用于本发明的疏水多孔聚合物珠非常适合于从含有靶肽的溶液除去聚集体，这通过将溶液与聚合物珠在直径在1-100 cm范围内，优选在5-50 cm范围内的液相层析柱中接触实现，其中柱在最高达100巴的压力下，且优选在0.2-80巴的压力下操作。一般，制备级柱在10-50 cm的范围内，并且在0.2-80巴范围内的压力下操作。
根据本发明的多孔聚合物珠一般是具有最高达200 μm的平均粒度直径的球形共聚物珠，其是用于通过高效反相液相层析分离和纯化生物分子的聚合物珠的一般尺寸（例如，在直径为1-100 cm的柱中）。
通常，当多孔分离材料具有的平均粒度直径（d50）在10-600 μm范围内，优选在20-150 μm范围内时，已经发现它们特别有效，而具有在20-63 μm范围内的平均粒度的这种材料已显示出特别有效。
具有的孔径在4-500 nm范围内的这种疏水分离材料，优选聚苯乙烯珠，似乎适合于所期望的分离效果。纯化实验已经表明，平均孔径在10-30 nm的疏水作用材料导致期望的分离结果。当使用由合适的材料和13-25 nm的平均孔径制成的球形疏水聚合物珠时，可以进一步改善这些期望的分离结果。本发明的合适的多孔聚合物珠优选具有在300-1000m2/g（平方米/克）范围内，更优选在450-850 m2/g范围内，且最优选在500-800 m2/g范围内的表面积（BET）。
可用于制备本文所述的多孔聚合物珠的合适的单不饱和乙烯基芳族单体包括但不限于苯乙烯、C1-C4-烷基取代的苯乙烯、乙烯基萘和乙烯基蒽。优选地，单不饱和乙烯基芳族单体选自苯乙烯和C1-C4-烷基取代的苯乙烯中的一种或多种。合适的C1-C4-烷基取代的苯乙烯组中包括乙基乙烯基苯、乙烯基甲苯、二乙基苯乙烯、乙基甲基苯乙烯和二甲基苯乙烯。应当理解，每种上述乙烯基芳族单体的各种位置异构体中的任何一种都是合适的。
这意味着适合于本发明的多孔聚合物珠特别可以使用一种或多种选自乙烯基苯（苯乙烯）、乙基苯乙烯、二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽、二乙烯基二甲苯和这些单体的任何结构异构体的单体制备。
优选使用乙烯基苯（苯乙烯）和二乙烯基苯或乙基苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物制备多孔聚合物。在本发明的优选实施方案中，所应用的交联多孔聚合物珠包含彼此重量比为98:2至10:90％的苯乙烯/和二乙烯基苯。
任选地，除乙烯基芳族单体外，脂族不饱和单体，例如（甲基）丙烯酸和（甲基）丙烯酸的烷基酯也可用于制备本文所述的疏水多孔聚合物珠。这些脂族不饱和单体可以用作制备所期望的聚合物珠中的交联剂。
合适的脂族交联单体选自乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙二醇二乙烯基醚和三乙烯基环己烷，并且其可用于制备根据本发明的交联的疏水多孔聚合物珠。脂族单体可以单独使用或与上述聚乙烯基芳族单体组合用作交联单体。
在两种变体中，乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和二乙二醇二乙烯基醚尤其适合于制备多孔珠。优选地，这些脂族交联单体与聚乙烯基芳族交联单体组合使用。在这些条件下，基于用于形成刚性和多孔聚合物珠的总单体重量，包含的脂族单体的量一般为0-50％，且优选为0-30％。
在本文所述的多孔聚合物颗粒的本发明用途中，使用由聚苯乙烯组成的多孔聚合物珠实现了优异的分离结果，所述聚苯乙烯与二乙烯基苯或其衍生物和选自乙二醇二甲基丙烯酸酯和二乙二醇二乙烯基醚的单体的共聚物交联，且其中聚苯乙烯和交联共聚物的比例在98:2至最高10:90重量％的范围内。在优选的实施方案中，使用由聚（乙基）苯乙烯组成的多孔颗粒，所述聚（乙基）苯乙烯与二乙烯基苯乙烯和乙二醇甲基丙烯酸酯的共聚物以98:2至最高14:86重量％的比例交联。关于这一点，已经发现，为了从含有靶肽的溶液分离聚集的物质，多孔珠被更好地适应，其中（二）乙烯基芳族单体的含量超过50重量％。因此，由单乙烯基芳族化合物的聚合物组成的多孔珠是优选的，所述聚合物与二乙烯基苯和乙二醇甲基丙烯酸酯的共聚物以约10:90至98:2重量％的比例交联。更优选的是这种多孔珠，其中该比例按重量计为约14:86。
优选的疏水多孔聚合物选自乙烯基苯（苯乙烯）共聚物、乙基乙烯基苯（乙基苯乙烯）共聚物、二乙烯基苯共聚物、交联聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、交联聚苯乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、交联聚二乙烯基苯乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或多种。最优选的是交联聚（乙基）苯乙烯-二乙烯基苯共聚物和与二乙烯基苯和乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物交联的聚（乙基）苯乙烯。
用于制备多孔聚合物的致孔剂包括疏水致孔剂，如（C7-C10）芳族烃和（C6-C12）饱和烃，和亲水致孔剂，如（C4-C10）链烷醇和聚（亚烷基）二醇。因此，合适的致孔剂可以例如选自甲苯、乙苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯。应当理解，任何上述烃的各种位置异构体中的任何一种都是合适的。优选地，芳族烃是甲苯或二甲苯或二甲苯的混合物或甲苯和二甲苯的混合物。此外，如上所述，饱和烃也可用作致孔剂。合适的实例包括但不限于例如己烷、庚烷或异辛烷。在本发明的这种情况下，优选的饱和烃是异辛烷。合适的链烷醇包括但不限于异丁醇、叔戊醇、正戊醇、异戊醇、甲基异丁基甲醇、（4-甲基-2-戊醇）、己醇和辛醇。优选地，致孔剂混合物包含选自一种或多种（C5-C8）链烷醇的亲水致孔剂和选自一种或多种（C7-C10）芳族烃的疏水致孔剂。
通常，基于单体的重量，致孔剂通常过量加入到聚合悬浮液中，通常总量为100-170％，优选115-150，且更优选120-140％。此外，用于制备根据本发明的聚合物的致孔剂与溶剂体系混合，所述溶剂体系包含至少疏水溶剂和任选的较不疏水的溶剂（“亲水”溶剂），并且这两者都支持多孔珠的构建。显然，较不疏水的（或如上所述的“亲水”）溶剂具有至少一些有限的水溶性，例如为0.5-5％，而疏水溶剂显示10-100 ppm或更低的水溶性。
通常，具有低疏水性的致孔剂（即，“亲水致孔剂”）与疏水致孔剂的比例在0.7:1至最高3:1的范围内，优选在0.8:1至最高2.5:1的范围内，最优选为0.9:1-2.4:1。
用于制备适合于本发明的聚合物的聚合引发剂是本领域技术人员所熟知的，且包括单体可溶性引发剂如过氧化物、氢过氧化物和相关引发剂。这些引发剂是可商购的。诸如偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酰胺等的偶氮引发剂也是有用的。依赖于引发剂的性质，使用水平基于包含乙烯基单体的总重量在0.5至10％的范围内。
此外，用于制备多孔聚合物珠的分散剂或悬浮剂可以是常规的表面活性剂，其是离子型的并且可以含有含1-24个碳原子的疏水烷基链。适合于悬浮聚合的另一可商业获得的分散剂组是基于环氧化羟烷基纤维素衍生物的非离子型表面活性剂。一般，这些添加剂的使用水平基于水相的总重量为约0.01至最高4％。
如果合适，可以使用其它分散剂，并且可以与那些表面活性剂和分散剂一起使用其它分散剂。例如，包括纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、淀粉等的聚合分散剂可以以与本文使用的其它表面活性剂或分散剂的混合物使用。但最优选的是加入离子型表面活性剂，其可以通过用水漂洗容易地从制备的聚合物珠中除去。
为了制备本文公开的多孔疏水聚合物珠，制备含有悬浮助剂的连续水相溶液，且然后将该溶液与含有聚乙烯基芳族单体的单体混合物、自由基引发剂和例如1至1.7份（混合的）致孔剂（疏水和亲水致孔剂）/1份单体混合物混合。单体/致孔剂组合然后在升高的温度下聚合（一般在40-100℃，例如进行1-约15小时），并且致孔剂随后从所得聚合物珠中除去，例如通过蒸馏或溶剂洗涤。然后通过常规方法分离得到的多孔聚合物珠，如脱水和干燥。
任选地，聚合物珠的制备可以包括清除聚合物表面中在聚合过程中使用的分散剂和悬浮剂残留物的处理。该处理可以包括如专利文献（JP 61-141704或JP 57-98504或EP 1179 732 B1）中公开的酶处理。
由于其孔隙度和机械强度，制备的聚合物珠尤其适合于填充柱。有利地，这些多孔和刚性的聚合物珠可用于通过使溶液与液相层析柱中的这些聚合物珠接触（即使在升高的压力下）从含有靶肽的溶液分离聚集的物质。这些珠尤其适合于在高物料通过速率的生物分子的高效分离和纯化，而没有由于延长时间的使用的压力积累。
用于本发明的多孔聚合物珠的特征在于选择的孔隙度和孔径分布，其可以通过反向尺寸排阻层析（iSEC）来确定。适合于本发明的聚合物珠一般具有在0.4-1.0范围内，且优选在0.45-0.75范围内的孔隙度ε。这些珠具有300-100 m2/g的表面积[BET]，更优选450-850 m2/g，且最优选在500-800 m2/g的非常窄的范围内。
本文公开的聚合物珠出乎意料地非常适合于从含有靶肽的溶液分离聚集的物质。由于它们的化学性质和它们的纳米多孔结构，这些材料尤其适合于与低分子量蛋白质和肽的疏水相互作用，并且可以以结合和洗脱或流通模式整合到基于层析柱的纯化方法中。有利地，所施加的聚苯乙烯珠不需要被衍生化，且因此在该纯化步骤中比通常使用的层析凝胶更合算。本文所述的分离材料相当廉价并且可以再生，从而降低了肽纯化平台及其以外的整体成本。
此外，疏水材料的应用不限于给定的实例，这是因为它基于尺寸排阻机制和低分子量物质，尤其是分子量<70kDa的化合物的疏水吸附。
此外，本发明提供了一种基于层析的抗体纯化步骤，其中本文所述的层析材料可以再生，并且可在宽的操作窗口（例如，pH 3-11；电导率1 mS/cm-50 mS/cm，操作速度150cm/分钟-1000cm/分钟）应用。特别地，多孔聚合物珠在低和高pH值下的电阻在这里是非常有利的，这是因为令人满意的再生是可能的，并且这些材料具有显著更长的寿命。
如上文已经显示的，由于所选择的分离材料针对压力是稳定的，且在高压下不易变形，所以可以在工业和小规模两者上进行使用本文所述的疏水多孔聚合物珠从肽溶液中吸附低分子量物质，尤其是分子量<70kDa的化合物。用户进行层析纯化的方式是自由的。显然，依赖于所应用的溶液和低分子量蛋白质和肽的性质，多孔聚合物颗粒的一种或其它组成对纯化步骤可能是有利的。这里专家可以选择由纯（乙烯基）烷基芳族化合物制成的多孔聚合物或由合适的丙烯酸酯交联的多孔聚合物。在这种情况下，本领域技术人员可以容易地鉴定最合适的聚合物珠。
本说明书使本领域技术人员能够全面地实施本发明。即使没有进一步的评论，也因此假设本领域技术人员将能够在最广泛的范围内利用上述描述。
如果有什么不清楚的话，要理解应该查阅引用的出版物和专利文献。因此，这些文件被认为是本说明书的公开内容的一部分。
为了更好的理解并且为了阐明本发明，下面描述在本发明的保护范围内的实施例。这些实施例也用于阐明可能的变形。
此外，对本领域技术人员而言不言而喻的是，在给出的实施例中以及也在说明书的剩余部分中，组合物中存在的组分量基于整体组合物总是仅总计达100重量％或摩尔％，且不能超过这个百分比，即使从所指示的百分比范围可能产生更高的值。除非另有说明，否则％数据因而为重量％或摩尔％，除了比例之外，所述比例以体积数据显示。
如贯穿整个说明书中使用的，以下术语应具有以下含义，除非上下文另有明确说明：
术语“烷基（甲基）丙烯酸酯”是指相应的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯；类似地，术语“（甲基）丙烯酸”是指丙烯酸或甲基丙烯酸和相应的衍生物，例如酯或酰胺。如上所述，除非另有规定，否则所提到的所有百分比都将基于所涉及的聚合物或组合物（溶液）的总重量表示为重量百分比（％）。术语“共聚物”是指含有两种或更多种不同单体（包括位置异构体）的单元的聚合物组合物。
本文使用以下缩写：
g=克，
ppm=按重量/体积计的百万分之一，
m=米，
cm=厘米，
mm=毫米，
µm =微米（微米）= 10-6 m，
nm=纳米=10-9 m，
ml =毫升，L =升。除非另有规定，列出的范围应被视为包括端点在内的且可组合。
实施例和说明书以及权利要求中给出的温度总是摄氏度（℃）。
方法：
颗粒特性：
颗粒的表征是本领域已知的，并由以下描述：I. C. Edmundson，Particle-sizeanalysis，H. S. Bean，A. H. Beckett和J. E. Carles（编）：Advances inPharmaceutical Sciences vol.2，Academic Press，London 1967，95-174。
颗粒大小分布和平均直径可以通过使用Mastersizer 2000E的激光衍射法（Malvern Instruments Ltd.，UK）或通过激光阻断技术（AccusizerTM，Model 770，ParticleSizing Systems，Santa Barbara，Calif.，USA）来测量。
微球体的形状和表面特性（孔隙度）可以通过扫描电镜术（SEM）分析来确立。
孔径由本领域已知的方法确定。大孔可以使用水银孔隙度测定法测定。在这种情况下，用于分析孔径的实验按照使用的水银孔隙度测定法分析仪（例如， AutoPore IV9500，Micromeritics，USA）的规程进行。也可能从扫描电子显微照片（SEM）估计孔的尺寸，其中通过扫描电子显微镜（SEM）（JSM-6700F. JEOL，日本）在干燥后观察聚合物微球体的直径和表面特征。将微球体重新悬浮在蒸馏水中，并将分散体滴在一片铝箔上，且在环境气氛下干燥。将样品放置在具有双面导电胶带的金属短柱（stub）上，并用JFC-600精细涂布机（JEOL，日本）在低于5 Pa的减压下涂布薄金膜。
中孔的孔径及其比表面积也可以使用氮吸附/解吸测量（BET-方法）来测定，其通过以下标准规程进行。该后一种方法也可用于确定BET表面积。
图列表：
图1：P00446、LiChroprep® RP-18和Eshmuno® S上的静态捕获胰岛素的非还原SDS-PAGE。将1ml 5mg/ml胰岛素@50mM乙酸盐pH 4加入到100 μl平衡的颗粒中。吸附30分钟@25℃。用500 μl 50 mM乙酸盐，40 Vol％DPG，pH 4分别洗脱30分钟@25℃，对于Eshmuno® S为50 mM磷酸盐，500 mM NaCl，pH 8。显示的泳道：M-分子量标记；S-起始材料，SA-吸附后的上清液，BA-吸附后的珠。
图2：从P00446聚苯乙烯颗粒捕获的粗胰岛素的洗脱峰。
图3：P00446上的动态粗胰岛素捕获的非还原SDS-PAGE。显示的泳道：M-PerfectProtein标记; F-进料（起始材料在pH 3.5），FF-流通物，A1-A5-洗脱级分。
图4：使用ÄKTA FPLC系统的P00446（柱1.1 ml直径10 mm）上的动态捕获粗胰岛素的非还原SDS-PAGE。用25 mM Tris，100 mM精氨酸，pH 7进行10 CV平衡。以1 ml/分钟的流速加样30 ml的1 mg/ml粗胰岛素。从0％直至100％的60 Vol.％ DPG在20 CV中洗脱。
泳道：M-分子量标记；S-起始材料；FT-流通物。
图5：P00446（柱1.1 ml直径10 mm）上的动态粗pSCP194捕获的非还原SDS-PAGE。泳道：M-PerfectProteinTM分子量标记；F-进料（高压裂解细胞@pH 8.0，300mM NaCl后的上清液）；从P00446柱收集的级分：流通，洗涤，洗脱）。
图6：在P00446和PS02（（柱1.1 ml直径10 mm）上的动态粗胰岛素捕获的非还原SDS-PAGE。泳道：S-起始材料，FT-流通级分，PS02 B12-A8洗脱级分，30410 A6-A1洗脱级分。
图7：使用在洗脱缓冲液中的线性梯度和双丙甘醇用PP00446在pH 3.5的胰岛素/聚集体纯化的层析谱。
图8：使用在洗脱缓冲液中的线性梯度和双丙甘醇用PP00446在pH 3.5的胰岛素/聚集体纯化过程中所有级分的非还原SDS-PAGE分析。泳道：M-SeeBlue®Plus2预先染色标准物，F-进料胰岛素起始材料@pH 3.5，加样-加样过程中的流通物收集，洗涤-洗涤步骤过程中的流通物收集，洗脱-来自P00446柱的洗脱级分A1-A5。洗脱条件：在50mM甘氨酸，50mM乙酸pH 3.5中50％DPG梯度。
图9：使用在洗脱缓冲液中的线性梯度和乙醇用PP00446在pH 3.5的胰岛素/聚集体纯化的层析谱。
图10：使用在洗脱缓冲液中的线性梯度和乙醇用PP00446在pH 3.5的胰岛素/聚集体纯化过程中所有级分的非还原SDS-PAGE分析。泳道：M-SeeBlue®Plus2预先染色标准物，F-进料胰岛素起始材料@pH 3.5，L-加样过程中的流通物收集，W-洗涤步骤过程中的流通物收集，洗脱-来自P00446柱的洗脱级分E1-E5。洗脱条件：在50mM甘氨酸，50mM乙酸pH 3.5中50％DPG梯度。
图11：使用在洗脱缓冲液中的线性梯度和双丙甘醇用PP00446在pH 8.0的胰岛素/聚集体纯化的层析谱。
图12：使用在洗脱缓冲液中的线性梯度和双丙甘醇用PP00446在pH 8.0的胰岛素/聚集体纯化过程中所有级分的非还原SDS-PAGE分析。泳道：M-SeeBlue®Plus2预先染色标准物，F-进料胰岛素起始材料@pH 8.0，L-加样过程中的流通物收集，W-洗涤步骤过程中的流通物收集，洗脱-来自P00446柱的洗脱级分E1-E5。洗脱条件：在50mM TRIS pH 8.0中50％DPG梯度。
图13：使用在洗脱缓冲液中的分级梯度和双丙甘醇用PP00446在pH 3.5的胰岛素/聚集体纯化的层析谱。
图14：使用在洗脱缓冲液中的分级梯度和双丙甘醇用PP00446在pH 3.5的胰岛素/聚集体纯化过程中所有级分的非还原SDS-PAGE分析。泳道：M-SeeBlue®Plus2预先染色标准物，F-进料胰岛素起始材料@pH 3.5，L-加样过程中的流通物收集，W-洗涤步骤过程中的流通物收集，洗脱-来自P00446柱的洗脱级分E1-E7。洗脱条件：在50mM甘氨酸，50mM乙酸pH3.5中50％DPG。
图15：使用在洗脱缓冲液中的分级梯度和双丙甘醇用PRLP-S在pH 8.0的胰岛素/聚集体纯化的层析谱。
图16：使用在洗脱缓冲液中的分级梯度和双丙甘醇用PRLP-S在pH 8.0的胰岛素/聚集体纯化过程中所有级分的非还原SDS-PAGE分析。泳道：M-SeeBlue®Plus2预先染色标准物，F-进料胰岛素起始材料@pH 8.0，L-加样过程中的流通物收集，W-洗涤步骤过程中的流通物收集，洗脱-来自P00446柱的洗脱级分E1-E7。洗脱条件：在50mM TRIS pH 8.0中50％DPG。
实施例
基础珠：
基于聚苯乙烯的材料（如P353、P374和P375）的合成
将25.6 g聚乙烯醇和0.38 g SDS溶解在614.2 g水中以形成水相用于以下的悬浮聚合。有机相由19.94 g乙基乙烯基苯、75g二乙烯基苯、41.57 g乙二醇二甲基丙烯酸酯、90.24 g甲苯、90.24 g 2-乙基-1-己醇和0.96 g AIBN的均相溶液形成。将有机相加入到反应器容器中的水相中，并将两相用搅拌器在25℃以480 rpm乳化，以达到预期的颗粒大小分布。60分钟后，加入640 g水，并将反应混合物加热至最高达72℃。将温度保持在72℃2小时，并然后增加至82℃。混合物在82℃再聚合2小时。聚合后，将悬浮液在漏斗上过滤，并用1.5升60℃的水洗涤颗粒，随后为60℃的5升甲醇，40℃的5升甲苯和2升甲醇。最终产物在真空烘箱中于50℃和50毫巴干燥24小时。关于干重（dry mass）的得率是定量的。依赖于预期的颗粒大小分布，最终产物根据作为现有技术的程序通过筛分分类。
实施例1
在本实验中，评价了不同材料吸附重组肽-胰岛素的能力。对于以下实施例，与常用的LiChroprep® RP-18（113900，Merck Millipore）珠和一种阳离子交换材料（例如，Eshmuno® S，120078，Merck Millipore）相比，将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446用于捕获纯胰岛素（A11382IM，life technologies）。用1 ml 50 mM乙酸盐pH 4洗涤100 μl颗粒。然后于25℃将1 ml溶于50 mM乙酸盐pH 4中的5 mg/ml胰岛素溶液吸附30分钟。离心后，取出上清液（5μl与5μl凝胶加样缓冲液混合，NP0007，life technologies）。颗粒用1 ml 50 mM乙酸盐pH 4洗涤并分成2管。离心后，弃去上清液。对于吸附后的珠，将一部分颗粒重悬浮于500μl凝胶加样缓冲液中。将另一部分分别用500 μl的50 mM乙酸盐、40Vol％ DPG，pH 4于25℃洗脱30分钟，对于Eshmuno® S为50 mM磷酸盐，500 mM NaCl，pH 8。离心后，取出上清液（5μl与5 μl凝胶加样缓冲液混合）。颗粒用500 μl 50mM乙酸盐pH 4洗涤。离心后，弃去上清液。对于洗脱后的珠，将颗粒重悬浮于500 μl凝胶加样缓冲液中。将所有样品于99℃加热10分钟后，将分别为5 μl珠-样品的10 μl上清液/洗脱物加样到4-12％ NuPAGE® Novex®Bis-Tris凝胶（NP0336，life technologies）上。凝胶在200 V恒定值下运行25分钟。用纯水洗涤后，用SimplyBlueTM SafeStain（LC6065，life technologies）染色，并用纯水脱色。
如图1所示，聚苯乙烯珠P00446几乎完全吸附胰岛素，其对应于每ml颗粒-悬浮液50 mg蛋白质的静态结合量。40 Vol％双丙甘醇是有用的解吸溶液。PS颗粒的新技术与常用的阳离子交换方法相当。相比之下，LiChroprep® RP-18（作为可替代的反相材料）在给定条件下不吸附胰岛素。
实施例2
在该实验中，评价了不同材料的吸附粗胰岛素A的能力。对于以下实施例，使用20％乙醇150 mM NaCl溶液将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446填充在10mm直径12mm长的柱中。使用50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5以1 ml/分钟将填充柱平衡至少20柱体积。将粗胰岛素溶液A调节至pH 3.5（胰岛素浓度~1.7g/L）。将60 ml获得的溶液以1 ml/分钟直接加样到平衡的柱上，并将流通（flow through）的级分收集在单独的瓶中。加样后，使用平衡溶液用10CV洗涤柱。捕获的粗胰岛素的洗脱使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5中的50％乙醇的梯度洗脱以1ml/分钟在30 CV中进行（图2）。收集级分并对其实施非还原SDS-PAGE分析（图3）。
如图3所示，聚苯乙烯珠P00446几乎完全吸附胰岛素，其对应于每ml填充床的>80mg蛋白质的结合量。50 Vol％乙醇是有用的解吸溶液（例如，回收为101.33％），从而使得能够使用聚苯乙烯颗粒进行聚集体和靶分子分离，对于粗胰岛素捕获这是使用离子交换剂不被注意到的（数据未显示）。
实施例3
在本实验中，评价了由与二乙烯基苯共聚物交联的聚（乙基）苯乙烯（m）（PS-DVB）组成的颗粒材料的吸附粗胰岛素B的能力。对于以下实施例，使用20％乙醇150mM NaCl溶液将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446填充在10mm直径12mm长的柱中。使用50mM TRIS，100mM精氨酸缓冲液pH 7.0以1 ml/分钟将填充柱平衡至少20柱体积。将源自大肠杆菌表达系统的粗胰岛素溶液B调节至pH 3.5，并将30 ml所得溶液以1 ml/分钟直接加样到平衡的柱上，并将流通的级分收集在单独的瓶中。加样后，使用平衡溶液用10CV洗涤柱。捕获的粗胰岛素的洗脱使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5中的60％双丙甘醇的梯度洗脱以1ml/分钟在20CV中进行。收集级分并对其实施非还原SDS-PAGE分析（图4）。
如图4所示，聚苯乙烯珠P00446从粗溶液吸附胰岛素（5％纯度），且可以应用双丙甘醇溶液来使胰岛素片段与聚集体和靶分离，从而实现>40％的纯度。
实施例4
在这个实验中，评价了由与二乙烯基苯共聚物交联的聚（乙基）苯乙烯（m）（PS-DVB）组成的颗粒材料的吸附粗蛋白质pSCP194的能力。对于以下实施例，使用20％乙醇150mM NaCl溶液将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446填充在10mm直径12mm长的柱中。使用50mMTRIS，100mM精氨酸缓冲液pH 7.0以1 ml/分钟将填充柱平衡至少20柱体积。将含有蛋白质pSCP194的粗大肠杆菌裂解物调节至pH 7.0，并将20 ml所得溶液以1 ml/分钟直接加样到平衡的柱上，并将流通的级分收集在单独的瓶中。加样后，使用平衡溶液用10CV洗涤柱。捕获的粗胰岛素的洗脱使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5中的60％双丙甘醇的梯度洗脱以1ml/分钟在20CV中进行。收集级分并对其实施非还原SDS-PAGE分析（图5）。
如图5所示，聚苯乙烯珠P00446从粗大肠杆菌裂解物溶液吸附pSCP194蛋白质，且可以应用双丙甘醇溶液来洗脱捕获的靶，从而实现>80％的纯度。
实施例5
在本实验中，评价了由聚（乙基）苯乙烯（m）组成的颗粒材料在尿素存在下吸附胰岛素的能力，所述聚（乙基）苯乙烯（m）以各种比例与二乙烯基苯共聚物（PS-DVB）和由乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）共聚物组成的材料交联。对于以下实施例，使用20％乙醇150mM NaCl溶液将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446填充在10mm直径12mm长的柱中。使用50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5以1 ml/分钟将填充柱平衡至少20柱体积。将在8M尿素溶液中温育后含有聚集的胰岛素的粗胰岛素溶液使用纯水稀释至2M尿素浓度，调节至pH 3.5。将50 ml得到的溶液以1 ml/分钟直接加样到平衡的柱上，并将流通的级分收集在单独的瓶中。加样后，使用平衡溶液用10CV洗涤柱。捕获的粗胰岛素的洗脱使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5中的60％双丙甘醇的梯度洗脱以1ml/分钟在20CV中进行。收集级分并对其实施非还原SDS-PAGE分析（图6）。
如图6所示，聚苯乙烯珠P00446和PS02从粗含2M尿素的溶液吸附胰岛素，且可以应用双丙甘醇溶液来洗脱捕获的靶，从而实现>90％的纯度（级分A3-A4和A11-A12）。
实施例6
在本实验中，评价了由以各种比例与二乙烯基苯共聚物（PS-DVB）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）共聚物交联的聚（乙基）苯乙烯（m）组成的颗粒材料使用在水性缓冲液中的线性洗脱梯度和双丙甘醇有机溶剂于pH 3.5将胰岛素从其聚集体纯化的能力。对于以下实施例，使用研磨珠将1ml聚苯乙烯（PS）颗粒PP00446填充在10mm直径6.2长的柱中以延长柱。对于柱填充，制备20％乙醇150mM NaCl。使用50mM甘氨酸/50mM乙酸pH 3.5（平衡缓冲液）以1ml/分钟将填充柱平衡20柱体积。通过加入乙酸将胰岛素/聚集体溶液调节至pH3.5（胰岛素浓度：~1.5mg/ml）。将92ml制备的溶液以1ml/分钟加样到平衡的柱上，同时将流通物（flow through）收集在瓶中。完成加样后，用平衡缓冲液以1ml/分钟漂洗柱15柱体积，以洗去未结合的胰岛素分子。在洗去步骤过程中的流通物被收集在第二个瓶中。随后，使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸（洗脱缓冲液）中的50％双丙甘醇的线性梯度以1ml/分钟在40柱体积中起始洗脱。将洗脱物以每级分10ml分级分离。图7描绘了在胰岛素/聚集体纯化期间记录的层析谱。对收集的级分实施非还原SDS-PAGE分析（图8）。
如图8所示，PP00446树脂由胰岛素/聚集体溶液过载。PP00446的测量的动态结合量达到每ml填充床> 80mg蛋白质。显而易见的是，50 Vol％的双丙甘醇不仅是合适的解吸溶液（例如，回收：115％），而且也使得在线性梯度洗脱期间胰岛素能够与其聚集体分离。
实施例7
在该实验中，评价了由以各种比例与二乙烯基苯共聚物（PS-DVB）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）共聚物交联的聚（乙基）苯乙烯（m）组成的颗粒材料使用线性洗脱梯度和乙醇于pH 3.5将胰岛素从其聚集体纯化的能力。对于以下实施例，使用研磨珠将1ml聚苯乙烯（PS）颗粒PP00446填充在10mm直径6.2长的柱中以延长柱。对于柱填充，制备20％乙醇150mM NaCl。使用50mM甘氨酸/50mM乙酸pH 3.5（平衡缓冲液）以1ml/分钟将填充柱平衡20柱体积。通过加入乙酸将胰岛素/聚集体溶液调节至pH 3.5（胰岛素浓度：~2.0mg/ml）。将50ml制备的溶液以1ml/分钟加样到平衡的柱上，同时将流通物收集在瓶中。完成加样后，用平衡缓冲液以1ml/分钟漂洗柱15柱体积，以洗去未结合的胰岛素分子。在洗去步骤过程中的流通物被收集在第二个瓶中。随后，使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸（洗脱缓冲液）中的50％乙醇的线性梯度以1ml/分钟在40柱体积中起始洗脱。将洗脱物以每级分10ml分级分离。图3描述了在胰岛素/聚集体纯化期间记录的层析谱。对收集的级分实施非还原SDS-PAGE分析（图9）。
如图10所示，PP00446树脂由胰岛素/聚集体溶液过载。PP00446的测量的动态结合量（DBC）达到每ml填充床>60mg蛋白质。结果揭示，50 Vol％乙醇可用作解吸溶液（回收：96％）。与使用双丙甘醇在类似条件下的洗脱形成对照的是，从该实施例的纯化导致较低的DBC以及劣化的回收。
实施例8
在这个实验中，评价了由以各种比例与二乙烯基苯（PS-DVB）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）共聚物交联的聚（乙基）苯乙烯（m）组成的颗粒材料使用线性洗脱梯度和双丙甘醇于pH 8.0使胰岛素与其聚集体分离的能力。对于以下实施例，使用研磨珠将1ml聚苯乙烯（PS）颗粒PP00446填充在10mm直径6.2长的柱中以延长柱。对于柱填充，制备20％乙醇150mM NaCl。使用50mM TRIS pH 8.0（平衡缓冲液）以1ml/分钟将填充柱平衡20柱体积。通过加入1M TRIS将胰岛素/聚集体溶液调节至pH 8.0。此外，通过1M NaCl溶液将胰岛素/聚集体溶液的电导率设定为~20mS/cm（胰岛素浓度：~0.6mg/ml）。将75ml制备的溶液以1ml/分钟加样到平衡的柱上，同时将流通物收集在瓶中。完成加样后，用平衡缓冲液以1ml/分钟漂洗柱15柱体积，以洗去未结合的胰岛素分子。在洗去步骤过程中的流通物被收集在第二个瓶中。随后使用0-100％的在50mM TRIS pH 8.0（洗脱缓冲液）中的50％双丙甘醇的线性梯度以1ml/分钟在40柱体积中起始洗脱。将洗脱物以每级分10ml分级分离。图5描述了在胰岛素/聚集体纯化期间记录的层析谱。对收集的级分实施非还原SDS-PAGE分析（图11）。
如图12所示，PP00446树脂几乎完全吸附胰岛素及其聚集体，且达到每ml填充床>70mg蛋白质的动态结合量。此外，通过应用线性梯度，洗脱导致从聚集体（E2，E3）纯化胰岛素，而大多数聚集体在>80％的洗脱缓冲液浓度解吸。
实施例9
在这个实验中，评价了由以各种比例与二乙烯基苯（PS-DVB）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（PS-DVB-EGDMA）共聚物交联的聚（乙基）苯乙烯（m）组成的颗粒材料使用台阶洗脱和双丙甘醇于pH 8.0使胰岛素与其聚集体分离的能力。
对于以下实施例，使用研磨珠将1ml聚苯乙烯（PS）颗粒PP00446填充在10mm直径为6.2长的柱中以延长柱。对于柱填充，制备20％乙醇150mM NaCl。使用50mM甘氨酸/50mM乙酸pH 3.5（平衡缓冲液）以1ml/分钟将填充柱平衡20柱体积。通过加入乙酸将胰岛素/聚集体溶液调节至pH 3.5（胰岛素浓度：~1.8mg/ml）。将50ml制备的溶液以1ml/分钟加样到平衡的柱上，同时将流通物收集在瓶中。完成加样后，用平衡缓冲液以1ml/分钟漂洗柱15柱体积，以洗去未结合的胰岛素。在洗去步骤过程中的流通物被收集在第二个瓶中。随后，使用在50mM甘氨酸/50mM乙酸中的50％双丙甘醇作为洗脱缓冲液，以1ml/分钟使用分级梯度（40柱体积为70％，20柱体积为100％）起始洗脱。将洗脱物以每级分10ml 分级分离。图7描绘了在胰岛素/聚集体纯化期间记录的层析谱。对收集的级分实施非还原SDS-PAGE分析（图13）。
如图14所示，PP00446树脂结合胰岛素和胰岛素聚集体（动态结合量：> 70mg/ml）。在这个实验中，回收达到了96％。此外，通过SDS-PAGE分析证明，当洗脱缓冲液浓度高于70％时，大多数胰岛素聚集体从树脂解吸。该性质使得能够通过应用可利用的分级梯度来实现胰岛素聚集体分离。
实施例10
在这个实验中，评价了由与二乙烯基苯（PS-DVB）共聚物交联的聚（乙基）苯乙烯（m）组成的颗粒材料使用台阶洗脱和双丙甘醇于pH 8.0将聚集体从胰岛素除去的能力。
对于以下实施例，使用研磨珠将1ml聚苯乙烯（PS）颗粒PRLP-S填充在10mm直径6.2长的柱中以延长柱。对于柱填充，制备20％乙醇150mM NaCl。使用50mM TRIS pH 8.0（平衡缓冲液）以1ml/分钟将填充柱平衡20柱体积。通过加入1M TRIS将胰岛素/聚集体溶液调节至pH 8.0。此外，通过1M NaCl溶液将胰岛素/聚集体溶液的电导率设定为~20mS/cm（胰岛素浓度：~1.6mg/ml）。将50ml制备的溶液以1ml/分钟加样到平衡的柱上，同时将流通物收集在瓶中。完成加样后，用平衡缓冲液以1ml/分钟漂洗柱15柱体积，以洗去未结合的胰岛素。在洗去步骤过程中的流通物被收集在第二个瓶中。随后，使用在50mM TRIS pH 8.0中的50％双丙甘醇作为洗脱缓冲液，以1ml/分钟使用分级梯度（40柱体积为70％，20柱体积为100％）起始洗脱。将洗脱物以每级分10ml分级分离。图9描述了在胰岛素/聚集体纯化期间记录的层析谱。对收集的级分实施非还原SDS-PAGE分析（图15）。
如图16所示，PRLP-S树脂以每ml填充床>60mg蛋白质的测量的动态结合量结合胰岛素。此外，SDS-PAGE分析概述了利用70％的洗脱缓冲液浓度仅仅胰岛素单体从树脂解吸（E1-E4）。在图10中证明，通过将洗脱缓冲液增加到100％，胰岛素聚集体解吸（E5）。胰岛素聚集体分离的台阶洗脱梯度的应用使胰岛素纯化过程效率更高。
应用聚苯乙烯颗粒捕获胰岛素
对于以下实施例，与常用的LiChroprep® RP-18（113900，Merck Millipore）珠和一种阳离子交换材料（例如，Eshmuno® S，120078，Merck Millipore）相比，将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446用于捕获纯胰岛素（A11382IM，life technologies）。
用1 ml 50 mM乙酸盐pH 4洗涤100 μl颗粒。然后于25℃将1 ml溶于50 mM乙酸盐pH 4中的5 mg/ml胰岛素溶液吸附30分钟。离心后，取出上清液（5μl与5μl凝胶加样缓冲液混合，NP0007，life technologies）。颗粒用1 ml 50 mM乙酸盐pH 4洗涤并分成2管。离心后，弃去上清液。对于吸附后的珠，将一部分颗粒重悬浮于500 μl凝胶加样缓冲液中。将另一部分分别用500 μl的50 mM乙酸盐、40Vol％ DPG，pH 4于25℃洗脱30分钟，对于Eshmuno® S为50 mM磷酸盐，500 mM NaCl，pH 8。离心后，取出上清液（5 μl与5 μl凝胶加样缓冲液混合）。颗粒用500 μl 50mM乙酸盐pH 4洗涤。离心后，弃去上清液。对于洗脱后的珠，将颗粒重悬浮于500 μl凝胶加样缓冲液中。将所有样品于99℃加热10分钟后，将分别为5 μl珠-样品的10 μl上清液/洗脱物加样到4-12％ NuPAGE® Novex® Bis-Tris凝胶（NP0336，lifetechnologies）上。凝胶在200 V恒定值下运行25分钟。用纯水洗涤后，用SimplyBlueTMSafeStain（LC6065，life technologies）染色，并用纯水脱色。
图1显示在P00446、LiChroprep® RP-18和Eshmuno® S上的静态捕获胰岛素的非还原SDS-PAGE。
条件：
将1ml 5mg/ml胰岛素和50 mM乙酸盐pH 4的混合物加入到100 μl平衡的颗粒中。在25℃的温度进行吸附30分钟。随后在25℃的温度分别用500 μl 50mM乙酸盐和40 Vol％DPG，pH 4洗脱30分钟，对于Eshmuno® S为50 mM磷酸盐，500mM NaCl，pH 8。
泳道：M...MW标记
S...起始材料
SA...吸附后的上清液
BA...吸附后的珠
E...洗脱物
BE...洗脱后的珠
如图1所示，聚苯乙烯珠P00446几乎完全吸附胰岛素，其对应于每ml颗粒-悬浮液50 mg蛋白质的静态结合量。40 Vol％双丙甘醇是有用的解吸溶液。PS颗粒的新技术与常用的阳离子交换方法相当。
相比之下，LiChroprep® RP-18（作为可替代的反相材料）在给定条件下不吸附胰岛素。
应用聚苯乙烯颗粒捕获粗胰岛素A
对于以下实施例，使用20％乙醇150 mM NaCl溶液将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446填充在10mm直径12mm长的柱中。
使用50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5以1 ml/分钟将填充柱平衡至少20柱体积。将粗胰岛素溶液A调节至pH 3.5（胰岛素浓度~1.7g/L）。将60 ml获得的溶液以1 ml/分钟直接加样到平衡的柱上，并将流通（flow through）的级分收集在单独的瓶中。加样后，使用平衡溶液用10CV洗涤柱。捕获的粗胰岛素的洗脱使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5中的50％乙醇的梯度洗脱以1ml/分钟在30 CV中进行（图2）。收集级分并对其实施非还原SDS-PAGE分析（图3）。
图2显示了从P00446聚苯乙烯颗粒捕获的粗胰岛素的洗脱峰。
图3显示了P00446上的动态粗胰岛素捕获的非还原SDS-PAGE。
如图3所示，聚苯乙烯珠P00446几乎完全吸附胰岛素，其对应于每ml填充床的>80mg蛋白质的结合量。50 Vol％乙醇是有用的解吸溶液（例如，回收为101.33％），从而使得能够使用聚苯乙烯颗粒进行聚集体和靶分子分离，对于粗胰岛素捕获这是使用离子交换剂不被注意到的（数据未显示）。
应用聚苯乙烯颗粒捕获粗胰岛素B
对于以下实施例，使用20％乙醇150mM NaCl溶液将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446填充在10mm直径12mm长的柱中。
使用50mM TRIS，100mM精氨酸缓冲液pH 7.0以1 ml/分钟将填充柱平衡至少20柱体积。将源自大肠杆菌表达系统的粗胰岛素溶液B调节至pH 3.5，并将30 ml所得溶液以1ml/分钟直接加样到平衡的柱上，并将流通的级分收集在单独的瓶中。加样后，使用平衡溶液用10CV洗涤柱。捕获的粗胰岛素的洗脱使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH3.5中的60％双丙甘醇的梯度洗脱以1 ml/分钟在20CV中进行。收集级分并对其实施非还原SDS-PAGE分析（图4）。
图4显示使用ÄKTA FPLC系统的P00446（柱1.1 ml直径10 mm）上的动态捕获粗胰岛素的非还原SDS-PAGE。用25mM Tris，100mM精氨酸，pH 7进行10 CV平衡。以1ml/分钟的流速加样30ml的1mg/ml粗胰岛素。从0％直至100％的60 Vol.％ DPG在20 CV中洗脱。
泳道：M...MW标记
S...起始材料
FT...流通物
如图4所示，聚苯乙烯珠P00446从粗溶液吸附胰岛素（5％纯度），且可以应用双丙甘醇溶液来使胰岛素片段与聚集体和靶分离，从而实现>40％的纯度。
应用聚苯乙烯颗粒捕获粗蛋白质pSCP194
对于以下实施例，使用20％乙醇150mM NaCl溶液将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446填充在10mm直径12mm长的柱中。
使用50mM TRIS，100mM精氨酸缓冲液pH 7.0以1 ml/分钟将填充柱平衡至少20柱体积。将含有蛋白质pSCP194的粗大肠杆菌裂解物调节至pH 7.0，并将20 ml所得溶液以1ml/分钟直接加样到平衡的柱上，并将流通的级分收集在单独的瓶中。加样后，使用平衡溶液用10CV洗涤柱。捕获的粗胰岛素的洗脱使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH3.5中的60％双丙甘醇的梯度洗脱以1ml/分钟在20CV中进行。收集级分并对其实施非还原SDS-PAGE分析（图5）。
图5显示P00446（柱1.1 ml直径10 mm）上的动态粗pSCP194捕获的非还原SDS-PAGE。
如图5所示，聚苯乙烯珠P00446从粗大肠杆菌裂解物溶液吸附pSCP194蛋白质，且可以应用双丙甘醇溶液来洗脱捕获的靶，从而实现>80％的纯度。
应用聚苯乙烯颗粒捕获尿素中的粗胰岛素
对于以下实施例，使用20％乙醇150mM NaCl溶液将聚苯乙烯（PS）颗粒P00446填充在10mm直径12mm长的柱中。
使用50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5以1 ml/分钟将填充柱平衡至少20柱体积。将在8M尿素溶液中温育后含有聚集的胰岛素的粗胰岛素溶液使用纯水稀释至2M尿素浓度，调节至pH 3.5。将50 ml得到的溶液以1 ml/分钟直接加样到平衡的柱上，并将流通的级分收集在单独的瓶中。加样后，使用平衡溶液用10CV洗涤柱。捕获的粗胰岛素的洗脱使用0-100％的在50mM甘氨酸/50mM乙酸缓冲液pH 3.5中的60％双丙甘醇的梯度洗脱以1ml/分钟在20CV中进行。收集级分并对其实施非还原SDS-PAGE分析（图6）。图6：显示在P00446和PS02（柱1.1 ml直径10 mm）上的动态粗胰岛素捕获的非还原SDS-PAGE。
如图6所示，聚苯乙烯珠P00446和PS02从粗含2M尿素的溶液吸附胰岛素，且可以应用双丙甘醇溶液来洗脱捕获的靶，从而实现>90％的纯度（级分A3-A4和A11-A12）。

Claims (23)

1.从含有靶肽的溶液分离肽聚集体和片段的方法，包括以下步骤
（a）提供含有靶肽的样品；
（b）使所述样品与疏水层析材料接触适当的时间段并吸附肽，所述疏水层析材料由聚苯乙烯或聚乙基苯乙烯组成，所述聚苯乙烯或聚乙基苯乙烯以98:2至最高10:90重量％的比例与二乙烯基苯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物交联，
（c）通过使用不同的溶剂组合物回收靶肽，并
从而使聚集的肽和肽片段与靶肽分离。
2.权利要求1所述的方法，其中所述疏水层析材料具有的平均粒径在10 μm-600 μm的范围内。
3.权利要求1所述的方法，其中所述疏水层析材料具有的平均粒径在20 μm-150 μm的范围内。
4.权利要求1所述的方法，其中所述疏水层析材料具有的平均粒径在20 μm-63 μm的范围内。
5.权利要求1所述的方法，其中所述疏水层析材料由疏水多孔聚合物珠组成，所述疏水多孔聚合物珠具有的孔径在4-500 nm的范围内。
6.权利要求1所述的方法，其中所述疏水层析材料由疏水多孔聚合物珠组成，所述疏水多孔聚合物珠具有的孔径在10-30 nm的范围内。
7.权利要求1所述的方法，其中所述疏水层析材料由疏水多孔聚合物珠组成，所述疏水多孔聚合物珠具有的孔径在13 nm-25 nm的范围内。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤b）中，将含有靶肽的水溶液与疏水层析材料接触，所述含有靶肽的水溶液具有在2-11范围内的pH值和在1-150 mS/cm范围内的导电性。
9.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤b）中，将含有靶肽的水溶液与疏水层析材料接触，所述含有靶肽的水溶液具有在3-8范围内的pH值和在2-50 mS/cm范围内的导电性。
10.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤b）中，将所述疏水层析材料以在150-1000 cm/分钟范围内的流速暴露于每ml填充床中30-100 mg靶肽。
11.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤b）中，将所述疏水层析材料以在300-900 cm/分钟范围内的流速暴露于每ml填充床中50-80 mg靶肽。
12.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤c）中，所述疏水层析材料以直接或梯度的方式暴露于含有机溶剂的水溶液中，由此依赖于含有的有机溶剂浓度，实现了聚集的肽和靶肽之间的部分分离。
13.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤c）中，使用包含在水性混合物中的各种比例的有机溶剂实现结合的组分的选择性解吸和分离。
14.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在靶分子重折叠步骤之后进行肽聚集体的分离。
15.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在将样品与疏水层析材料接触适当的时间段并吸附肽之后，将加样的层析材料加到肽重折叠后溶液，以选择性降低聚集的物质的水平合适的时间段。
16.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述使聚集的肽和肽片段与靶肽分离包括用离子交换树脂处理。
17.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述分离以结合和洗脱或流通模式进行，由此将流速调节到150 cm/分钟-1000 cm/分钟的范围内。
18.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述分离以结合和洗脱或流通模式进行，由此将流速调节为300-900 cm/分钟。
19.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤c）中，使用选自乙醇、1-丙醇和双丙甘醇的有机溶剂来选择性地从所述疏水层析材料解吸所吸附的物质。
20.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤b）中，将所述样品与聚合物珠形式的疏水层析材料在直径在1-100 cm范围内的液相层析柱中接触，且其中所述柱在最高达100巴的压力下操作。
21.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤b）中，将所述样品与聚合物珠形式的疏水层析材料在直径在5-50 cm范围内的液相层析柱中接触，且其中所述柱在0.2-80巴的压力下操作。
22.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将所述样品与聚合物珠形式的疏水层析材料在直径在10-50 cm范围内的液相层析柱中接触，且其中所述柱在0.2-80巴范围内的压力下操作。
23.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤a）中，提供源自大肠杆菌表达系统的粗胰岛素溶液。
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