JP2018501234A - 粗製溶液からの標的分子捕捉 - Google Patents
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Abstract
Description
組み換え技術によって発現したペプチドが医薬用途に使用されるため、それらは非常に高純度であることが必要とされる[E. P. Kroeff, R. A. Owens, E. L. Campbell, R. D. Johnson, H. I. Marks, Journal of Chromatography, 461 (1989) 45-61]。
上記の先行技術から、結合および溶出モードならびにフロースルーモードにおける広範囲の条件において効果的に適用可能であり、かつ、凝集体および標的ペプチド断片などの重大な不純物のレベルが減少するロバストで信頼性のあるペプチド精製方法へのニーズが生じる。
予想外なことに、ポリスチレン粒子を、濾過した細胞培養溶液またはリフォールド物のプールからの直接的な標的分子の補足のために、広範な操作範囲(operational window)において適用することができ、断片化した形態および凝集した形態の分離を、不燃性溶液を使用して溶出液中で直接的に可能にすることができることが見出された。得られたプレ精製された(pre-purified)標的分子溶液は、最終精製のためのイオン交換クロマトグラフィーに直接供することができる。
より具体的には、本発明は、標的ペプチドを含有する溶液からペプチド凝集体および断片を分離するための方法であって、以下の工程:
(a)標的ペプチドを含有するサンプルを提供すること、
(b)サンプルを疎水性クロマトグラフィー材料と好適な時間接触させてペプチドを吸着させること、
(c)異なる溶媒組成物の使用により標的ペプチドを回収すること、
およびこれによって、凝集したペプチドおよびペプチド断片を標的ペプチドから分離すること
を含む、前記方法に関する。
特に、本発明は、請求項1〜17により請求されるとおりの方法に関する。
本発明は、標的ペプチドを含有する溶液からのペプチド凝集体および断片の分離のための方法であり、ペプチドを含有する溶液が、疎水性クロマトグラフィー材料と好適な時間接触し、それによりペプチドが疎水性クロマトグラフィー材料に吸着され、異なる溶媒組成物の使用による吸着されたペプチドの選択的な回収がこれに続く。これによって、凝集したペプチドの形態を、標的ペプチドから部分的にまたは完全に標的ペプチドから分離することができる。
詳細には、分離は、粒状であり、架橋されたビニルベンゼン、エチルスチレン、ポリ(エチル)スチレン−ジビニルベンゼンまたはポリ(エチル)スチレン−ジビニルベンゼンエチレングリコール−ジメチルアクリラート樹脂で作られた、疎水性クロマトグラフィー材料の使用により行われる。好ましくは、樹脂は、98:2〜10:90重量%までの比率のスチレンとジビニルベンゼンから構成された架橋ポリマーから構成されている。改変された形態において、粒状材料は、98:2〜10:90重量%までの比率のジビニルベンゼンとエチレングリコールジメタクリラートとのコポリマーで架橋されたポリスチレンからなる。多くの場合、これらの粒状の疎水性クロマトグラフ分離材料は、10μm〜600μmの範囲に、好ましくは20μm〜150μmの範囲に、最も好ましくは20μm〜63μmの範囲にある平均粒径を有する。このサイズの好適な疎水性多孔質ポリマービーズは、好ましい細孔径を、4〜500nmの範囲に、より好ましくは10〜30nmの範囲に、最も好ましくは13nm〜25nmの範囲に有する。
これに加えて、pHが、所望の目的のための適当な緩衝液の添加により調節される。いかなるpH範囲において溶出が起こるかに依存して、異なる緩衝液が好適である。したがって、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)、酢酸またはリン酸緩衝液が適用され得る。そのうえ、必要であれば、溶媒混合物は、塩化ナトリウムのような好適な塩を含んでもよい。
専門家は、対応する勾配溶出の実施に関する詳細な情報を、文献において、または適当な教科書において、例えば「Preparative Chromatography of Fine Chemicals and Pharmaceutical Agents」、Henner Schmidt-Traub、Wiley-VCH Verlag、2005年、152〜161頁にて、見出すことができる。
いずれの変化形においても、エチレングリコールジメタクリラート、グリシジルメタクリラート、およびジエチレングリコールジビニルエーテルは、多孔質ビーズの調製のためにとりわけ好適である。好ましくは、これらの脂肪族架橋モノマーは、ポリビニル芳香族架橋モノマーと組み合わせて使用される。これらの条件下で、脂肪族モノマーは、典型的には、硬質かつ多孔質のポリマービーズを形成するのに用いる総モノマー重量に基づいて0〜50%の範囲にある量で、好ましくは0〜30%の範囲にある量で含まれる。
g=グラム、
ppm=重量/体積での百万分率(parts per million)、
m=メートル、
cm=センチメートル、
mm=ミリメートル、
μm=マイクロメートル(ミクロン)=10−6m、
nm=ナノメートル=10−9m、
ml=ミリリットル、L=リットル。他に指定しない限り、挙げられる範囲は、両端を含み、合体可能であるものと読み取るものとする。
例および本記載において、ならびに特許請求の範囲において、与えられる温度は、常にセルシウス度(℃)である。
粒子の特質:
粒子の特徴づけは、当技術分野において公知であり、I. C. Edmundson, Particle-size analysis, H. S. Bean, A. H. Beckett and J. E. Carles (編):Advances in Pharmaceutical Sciences vol.2中、 Academic Press, London 1967, 95-174によって記載されている。
基本ビーズ:
ポリスチレンに基づく材料の合成(P353、P374およびP375など)
25.6gのポリビニルアルコールおよび0.38gのSDSを614.2gの水に溶解して、以下の懸濁重合のための水相を形成する。19.94gのエチルビニルベンゼン、75gのジビニルベンゼン、41.57gのエチレングリコールジメタクリラート、90.24gのトルエン、90.24gの2−エチル−1−ヘキサノールおよび0.96gのAIBNの均一な溶液により、有機相を形成する。有機相をリアクター容器中の水相に添加し、2つの相を、25℃において480rpmで攪拌器を用いて、見込まれる粒子サイズ分布に達成するために乳化させる。60分後、640gの水を添加し、反応混合物を72℃まで加熱する。2時間、温度を72℃に維持し、次に82℃に上昇させる。混合物を82℃でさらなる2時間重合させる。重合に続いて、懸濁液を濾過用漏斗で濾過し、粒子を1.5リットルの60℃の水で洗浄し、60℃にて5リットルのメタノールで、40℃にて5リットルのトルエンおよび2リットルのメタノールで洗浄することがこれに続く。最終生成物を真空オーブン中で24時間50℃および50mbarにおいて乾燥させる。乾燥質量に関する収量は、定量的である。見込まれる粒子サイズ分布に依って、最終生成物を、技術水準の手法に従うふるい分けにより分類する。
この実験においては、異なる材料について、組換えペプチド−インスリンを吸着するそれらの能力を評価する。以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、純粋インスリン(A11382IM、life technologies)の捕捉のために、通常使用されるLiChroprep(登録商標) RP-18(113900、Merck Millipore)のビーズおよび1つのカチオン交換材料(例えばEshmuno(登録商標) S、120078、Merck Millipore)との比較において使用する。100μlの粒子を、1mlの50mM酢酸、pH4で洗浄する。その後、50mM酢酸、pH4中の5mg/mlのインスリンの溶液1mlを、25℃にて30分間吸着させた。遠心分離の後、上清を除去する(5μlを、5μlのゲルローディング緩衝液、NP0007、life technologiesと混合した)。粒子を、1mlの50mM酢酸、pH4で洗浄し、2つの試験管に分ける。遠心分離の後、上清を廃棄する。吸着後のビーズについて、粒子の一部を500μlのゲルローディング緩衝液中に再懸濁させる。他の部分を500μlの50mM酢酸、40体積%のDPG、pH4で、それぞれ、50mMリン酸、500mM NaCl、pH8でEshmuno(登録商標) Sについて、25℃にて30分間溶出させる。遠心分離の後、上清を除去する(5μlを、5μlのゲルローディング緩衝液と混合した)。粒子を、500μlの50mM酢酸、pH4で洗浄する。遠心分離の後、上清を廃棄する。溶出後のビーズについて、粒子を500μlのゲルローディング緩衝液中に再懸濁させる。全てのサンプルを99℃にて10分間加熱した後、10μlの上清/溶出液それぞれ5μlのビーズサンプルを4〜12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標) Bis-Trisゲル(NP0336、life technologies)上にロードする。ゲルを、200Vの定電圧で25分間通電する。純水で洗浄した後、これをSimplyBlue(商標)SafeStain(LC6065、life technologies)で染色し、純水で脱染する。
この実験においては、異なる材料について、粗製インスリンAを吸着するそれらの能力を評価する。以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、10mmの直径の12mm長カラム中に、20%エタノール・150mM NaCl溶液を使用して充填する。充填カラムは、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液、pH3.5を使用して、少なくとも20カラム体積、1ml/分にて平衡化する。粗製インスリン溶液Aを、pH3.5(インスリン濃度約1.7g/L)に調節する。60mLの得られた溶液を、平衡化されたカラム上に直接1ml/分でロードして、フロースルー分画を別個のフラスコ中に収集する。ローディングの後、カラムを、平衡化溶液を使用して10CVで洗浄する。捕捉された粗製インスリンの溶出を、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液、pH3.5中の50%エタノールの0〜100%の勾配溶出を使用して、30CVにおいて1ml/分で行う(図2)。分画を収集し、非還元SDS PAGE分析に供する(図3)。
この実験においては、ジビニルベンゼンコポリマーと架橋された(PS−DVB)、ポリ(エチル)スチレン(m)からなる粒状材料について、粗製インスリンBを吸着するその能力を評価する。以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、10mmの直径の12mm長カラム中に、20%エタノール・150mM NaCl溶液を使用して充填する。充填カラムは、50mMTRIS、100mMアルギニン緩衝液、pH7.0を使用して、少なくとも20カラム体積、1ml/分にて平衡化する。E.coli発現系に由来する粗製インスリン溶液Bを、pH3.5に調節し、30mlの得られた溶液を、平衡化されたカラム上に直接1ml/分でロードして、フロースルー分画を別個のフラスコ中に収集する。ローディングの後、カラムを、平衡化溶液を使用して10CVで洗浄する。捕捉された粗製インスリンの溶出を、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液、pH3.5中の60%ジプロピレングリコールの0〜100%の勾配溶出を使用して、20CVにおいて1ml/分で行う。分画を収集し、非還元SDS PAGE分析に供する(図4)。
この実験においては、ジビニルベンゼンコポリマーと架橋された(PS−DVB)、ポリ(エチル)スチレン(m)からなる粒状材料について、粗製タンパク質pSCP194を吸着するそれらの能力を評価する。以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、10mmの直径の12mm長カラム中に、20%エタノール・150mM NaCl溶液を使用して充填する。充填カラムは、50mMTRIS、100mMアルギニン緩衝液、pH7.0を使用して、少なくとも20カラム体積、1ml/分にて平衡化する。タンパク質pSCP194を含有する粗製E.coli溶解物を、pH7.0に調節し、20mlの得られた溶液を、平衡化されたカラム上に直接1ml/分でロードして、フロースルー分画を別個のフラスコ中に収集する。ローディングの後、カラムを、平衡化溶液を使用して10CVで洗浄する。捕捉された粗製インスリンの溶出を、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液、pH3.5中の60%ジプロピレングリコールの0〜100%の勾配溶出を使用して、20CVにおいて1ml/分で行う。分画を収集し、非還元SDS PAGE分析に供する(図5)。
この実験においては、ジビニルベンゼンコポリマー(PS−DVB)およびエチレングリコールジメチルアクリラートからなる材料(PS−DVB−EGDMA)のコポリマーと種々の比率で架橋された、ポリ(エチル)スチレン(m)からなる粒状材料について、尿素の存在下においてインスリンを吸着するその能力を評価する。
以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、10mmの直径の12mm長カラム中に、20%エタノール・150mM NaCl溶液を使用して充填する。充填カラムは、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液、pH3.5を使用して、少なくとも20カラム体積、1ml/分にて平衡化する。8M尿素溶液中でのインキュベーション後の凝集したインスリンを含有する粗製インスリン溶液を、2M尿素濃度まで純水で希釈し、pH3.5に調節する。50mlの得られた溶液を、平衡化されたカラム上に直接1ml/分でロードして、フロースルー分画を別個のフラスコ中に収集する。ローディングの後、カラムを、平衡化溶液を使用して10CVで洗浄する。捕捉された粗製インスリンの溶出を、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液、pH3.5中の60%ジプロピレングリコールの0〜100%の勾配溶出を使用して、20CVにおいて1ml/分で行う。分画を収集し、非還元SDS PAGE分析に供した(図6)。
この実験においては、ジビニルベンゼンコポリマー(PS−DVB)およびエチレングリコールジメチルアクリラート(PS−DVB−EGDMA)のコポリマーと種々の比率で架橋された、ポリ(エチル)スチレン(m)からなる粒状材料について、線形溶出勾配および水性緩衝液中のジプロピレングリコール有機溶媒を使用してpH3.5で、インスリンをその凝集体から精製するその能力を評価する。以下の例については、1mlのポリスチレン(PS)粒子PP00446を、10mmの直径の6.2長カラム中に、カラムを延長するための研削ビーズを使用して充填する。カラムの充填のために、20%エタノール・150mM NaCl溶液を調製する。充填カラムは、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液、pH3.5(平衡化緩衝液)を使用して、少なくとも20カラム体積、1ml/分にて平衡化する。インスリン/凝集体溶液を、酢酸を添加することによりpH3.5に調節する(インスリン濃度:約1.5mg/ml)。92mlの調製した溶液を、平衡化されたカラム上に1ml/分でロードし、その間にフロースルーをフラスコ中に収集する。ローディングを完了した後、カラムを15カラム体積の平衡化緩衝液を用いて1ml/分ですすぎ、結合していないインスリン分子を洗い流す。洗い流し工程の間のフロースルーを、第2のフラスコ中に収集する。続いて、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液(溶出緩衝液)中の50%ジプロピレングリコールの0〜100%の線形勾配を使用して、40カラム体積において1ml/分で溶出を開始させる。溶出液を、分画あたり10mlにて分画化させる。図7は、インスリン/凝集体精製の間に記録されたクロマトグラムを描写する。収集した分画を、非還元SDS PAGE分析に供する(図8)。
この実験においては、ジビニルベンゼンコポリマー(PS−DVB)およびエチレングリコールジメチルアクリラート(PS−DVB−EGDMA)のコポリマーと種々の比率で架橋された、ポリ(エチル)スチレン(m)からなる粒状材料について、線形溶出勾配およびエタノールを使用してpH3.5で、インスリンをその凝集体から精製するその能力を評価する。以下の例については、1mlのポリスチレン(PS)粒子PP00446を、10mmの直径の6.2長カラム中に、カラムを延長するための研削ビーズを使用して充填する。カラムの充填のために、20%エタノール・150mM NaCl溶液を調製する。充填カラムは、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液、pH3.5(平衡化緩衝液)を使用して、少なくとも20カラム体積、1ml/分にて平衡化する。インスリン/凝集体溶液を、酢酸を添加することによりpH3.5に調節する(インスリン濃度:約2.0mg/ml)。50mlの調製した溶液を、平衡化されたカラム上に1ml/分でロードし、その間にフロースルーをフラスコ中に収集する。ローディングを完了した後、カラムを15カラム体積の平衡化緩衝液を用いて1ml/分ですすぎ、結合していないインスリン分子を洗い流す。洗い流し工程の間のフロースルーを、第2のフラスコ中に収集する。続いて、50mMグリシン/50mM酢酸緩衝液(溶出緩衝液)中の50%エタノールの0〜100%の線形勾配を使用して、40カラム体積において1ml/分で溶出を開始させた。溶出液を、分画あたり10mlにて分画化させた。図3は、インスリン/凝集体精製の間に記録されたクロマトグラムを描写する。収集した分画を、非還元SDS PAGE分析に供する(図9)。
この実験においては、ジビニルベンゼン(PS−DVB)およびエチレングリコールジメチルアクリラート(PS−DVB−EGDMA)のコポリマーと種々の比率で架橋された、ポリ(エチル)スチレン(m)からなる粒状材料について、線形溶出勾配およびジプロピレングリコールを使用してpH8.0で、インスリンをその凝集体から分離するその能力を評価する。以下の例については、1mlのポリスチレン(PS)粒子PP00446を、10mmの直径の6.2長カラム中に、カラムを延長するための研削ビーズを使用して充填する。カラムの充填のために、20%エタノール・150mM NaCl溶液を調製する。充填カラムは、50mM TRIS、pH8.0(平衡化緩衝液)を使用して、少なくとも20カラム体積、1ml/分にて平衡化する。インスリン/凝集体溶液を、1M TRISを添加することによりpH8.0に調節する。そのうえ、インスリン/凝集体溶液の伝導度を、1M NaCl溶液によって約20mS/cmに設定する(インスリン濃度:約0.6mg/ml)。75mlの調製した溶液を、平衡化されたカラム上に1ml/分でロードし、その間にフロースルーをフラスコ中に収集した。ローディングを完了した後、カラムを15カラム体積の平衡化緩衝液を用いて1ml/分ですすぎ、結合していないインスリン分子を洗い流す。洗い流し工程の間のフロースルーを、第2のフラスコ中に収集する。続いて、50mM TRIS、pH8(溶出緩衝液)中の50%エタノールの0〜100%の線形勾配を使用して、40カラム体積において1ml/分で溶出を開始させた。溶出液を、分画あたり10mlにて分画化させる。図5は、インスリン/凝集体精製の間に記録されたクロマトグラムを描写する。収集した分画を、非還元SDS PAGE分析に供する(図11)。
この実験においては、ジビニルベンゼン(PS−DVB)およびエチレングリコールジメチルアクリラート(PS−DVB−EGDMA)のコポリマーと種々の比率で架橋された、ポリ(エチル)スチレン(m)からなる粒状材料について、段階溶出およびジプロピレングリコールを使用してpH8.0で、インスリンをその凝集体から分離するその能力を評価する。
この実験においては、ジビニルベンゼン(PS−DVB)のコポリマーと架橋された、ポリ(エチル)スチレン(m)からなる粒状材料について、段階溶出およびジプロピレングリコールを使用してpH8.0で、インスリンから凝集体を除去するその能力を評価する。
以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、純粋インスリン(A11382IM、life technologies)の捕捉のために、通常使用されるLiChroprep(登録商標) RP-18(113900、Merck Millipore)のビーズおよび1つのカチオン交換材料(例えばEshmuno(登録商標) S、120078、Merck Millipore)との比較において使用する。
図1は、P00446、LiChroprep(登録商標) RP-18およびEshmuno(登録商標) S上の静止捕捉インスリンの非還元SDS PAGEを示す。
1mlの5mg/mlのインスリンおよび50mM酢酸、pH4を、100μlの平衡化された粒子に添加する。吸着を温度25℃にて30分間行う。続いて、溶出を、500μlの50mM酢酸、40体積%のDPG、pH4で、それぞれ、50mMリン酸、500mM NaCl、pH8でEshmuno(登録商標) Sについて、温度25℃にて30分間行う。
レーン:M…MWマーカー
S…出発材料
SA…吸着後の上清
BA…吸着後のビーズ
E…溶出液
BE…溶出後のビーズ
以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、10mmの直径の12mm長カラム中に、20%エタノール・150mM NaCl溶液を使用して充填する。
図2は、P00446ポリスチレン粒子からの捕捉された粗製インスリンの溶出ピークを示す。
図3は、P00446上の動的な粗製インスリンの捕捉の非還元SDS PAGEを示す。
以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、10mmの直径の12mm長カラム中に、20%エタノール・150mM NaCl溶液を使用して充填する。
図4は、AKTA FPLCシステムを使用したP00446(カラム1.1ml 直径10mm)上の動的捕捉原料インスリンの非還元SDS PAGEを示す。25mM Tris、100mMアルギニン、pH7を用いて10CVの平衡化。30mlの1mg/mlの原料インスリンを、1ml/分のフロー速度でロードする。0%から100%までの60体積%DPGでの20CVにおける溶出。
レーン:M…MWマーカー
S…出発材料
FT…フロースルー
以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、10mmの直径の12mm長カラム中に、20%エタノール・150mM NaCl溶液を使用して充填する。
図5は、P00446(カラム1.1ml 直径10mm)上の動的な粗製pSCP194の捕捉の非還元SDS PAGEを示す。
以下の例については、ポリスチレン(PS)粒子P00446を、10mmの直径の12mm長カラム中に、20%エタノール・150mM NaCl溶液を使用して充填する。
Claims (17)
- 標的ペプチドを含有する溶液からペプチド凝集体および断片を分離するための方法であって、以下の工程:
(a)標的ペプチドを含有するサンプルを提供すること、
(b)サンプルを疎水性クロマトグラフィー材料と好適な時間接触させてペプチドを吸着させること、
(c)異なる溶媒組成の使用により標的ペプチドを回収すること、
および
これによって、凝集したペプチドおよびペプチド断片を標的ペプチドから分離すること
を含む、前記方法。 - 疎水性クロマトグラフィー材料が、粒状であり、ビニルベンゼン、スチレン、エチルスチレン、ポリ(エチル)スチレン−ジビニルベンゼン、およびポリ(エチル)スチレン−ジビニルベンゼンエチレングリコール−ジメチルアクリラート樹脂の群から選択される架橋ポリマーで作られている、請求項1に記載の方法。
- 粒状の疎水性クロマトグラフ分離材料が、98:2〜10:90重量%までの比率のスチレンとジビニルベンゼンからなる架橋ポリマーから、または、98:2〜10:90重量%までの比率のジビニルベンゼンとエチレングリコールジメタクリラートとのコポリマーで架橋されたポリスチレンから構成される樹脂である、請求項1または2に記載の方法。
- 粒状の疎水性クロマトグラフ分離材料が、10μm〜600μmの範囲に、好ましくは20μm〜150μmの範囲に、最も好ましくは20μm〜63μmの範囲にある平均粒径を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 粒状の疎水性クロマトグラフ分離材料が、4nm〜500nmの範囲に、好ましくは10nm〜30nmの範囲に、最も好ましくは13nm〜25nmの範囲にある細孔径を有する疎水性多孔質ポリマービーズからなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)において、2〜11の範囲に、好ましくは3〜8の範囲にあるpH値と、1〜150mS/cmの範囲に、好ましくは2〜50mS/cmの範囲にある伝導度を有する、標的ペプチドを含有する水性溶液が、疎水性クロマトグラフィー材料と接触する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)において、疎水性クロマトグラフ材料が、充填床のmlあたり30〜100mgの標的ペプチドに、好ましくは充填床のmlあたり50〜80mgの標的ペプチドに、150〜1000cm/分の範囲にある、好ましくは300〜900cm/分の範囲にあるフロー速度でさらされる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)において、疎水性クロマトグラフ材料が、直接的または段階的な方式で、水性溶液含有有機溶媒にさらされ、それによって、含有される有機溶媒の濃度に依存して、凝集したペプチドと標的ペプチドとの間の部分的な分離が達成される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)において、水性混合物中に含有される種々の比率の有機溶媒を使用して、結合成分の選択的な溶離および分離が達成される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ペプチド凝集体の分離を、標的分子リフォールディング工程の後にプロセスする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルを疎水性クロマトグラフィー材料と好適な時間接触させてペプチドを吸着させた後に、ロードしたクロマトグラフィー材料を、選択的に凝集物質のレベルを減少させるために、好適な時間、ペプチドリフォールディング後の溶液に施す、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 分離および精製シーケンスが、イオン交換樹脂での処理を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 分離および精製を、結合および溶出またはフロースルーモードで行い、それによって、流速を150cm/分〜1000cm/分の範囲に、とりわけ300〜900cm/分の間にあるように調節する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)において、エタノール、1−プロパノールおよびジプロピレングリコールの群から選択される有機溶媒を、選択的に吸着物質を疎水性クロマトグラフィー材料から溶離させるために使用する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)において、サンプルを、1〜100cmの範囲に、好ましくは5〜50cmの範囲にある直径を有する液体クロマトグラフィーカラム中のポリマービーズの形態の疎水性クロマトグラフィー材料と接触させ、ここでカラムを、100barまでの圧力で、好ましくは0.2〜80barの範囲における圧力で操作する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルを、10〜50cmの範囲にある直径を有する液体クロマトグラフィーカラム中のポリマービーズの形態の疎水性クロマトグラフィー材料と接触させ、ここでカラムを、0.2〜80barの範囲における圧力で操作する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)において、E. coli発現系に由来する粗製インスリン溶液を提供する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
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