KR20170095308A

KR20170095308A - 미정제 용액으로부터의 표적 분자 포획

Info

Publication number: KR20170095308A
Application number: KR1020177019207A
Authority: KR
Inventors: 로마스 스쿠다스; 클라우스 아드리안; 비앙카 에델만; 마티아스 왼크
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2015-11-18
Publication date: 2017-08-22
Also published as: US10617975B2; JP6845139B2; CN107001411B; US20170340989A1; EP3233230A1; CA2970732C; CN107001411A; JP2018501234A; KR102441637B1; SG11201704822WA; WO2016096071A1; CA2970732A1

Abstract

본 발명은 표적 펩티드를 함유하는 용액으로부터 펩티드 집합체 및 단편의 분리 방법에 관한 것이다.

Description

미정제 용액으로부터의 표적 분자 포획 {TARGET MOLECULE CAPTURE FROM CRUDE SOLUTIONS}

재조합형 발현 펩티드가 약학적 적용에 사용되기 때문에, 이들은 유난히 고순도인 것이 요구된다 [E. P. Kroeff, R. A. Owens, E. L. Campbell, R. D. Johnson, H. I. Marks, Journal of Chromatography, 461 (1989) 45-61].

바이오치료법의 보다 저가 및 보다 고품질에 대한 시장 압력에 대응하여, 수많은 제조업체들은 가능하다면 포유류 배지에 대한 매력적인 대안으로서 미생물 발현 시스템 (대장균(E.coli)) 을 고려하고 있다. 미생물 발현 시스템은 높은 생산성 및 짧은 발현 속도를 특징으로 하지만, 통상적으로 표적 분자가 변성 상태로 수득된다.

일반적으로, 대장균(Escherichia coli) 배지는 현재 시중에서 다수의 재조합 펩티드를 제조하는데 활용된다 [F. A. O. Marston, Biochem. J. (1986) 240, 1-12]. 이들 치료적 펩티드의 제조는 전형적으로 치료적 펩티드를 높은 속도로 생성하는 세포 현탁물을 함유하는 생물반응기에서 개시되어, 세포내 유체의 봉입체의 형성 및 그 집합을 유도한다. 이후, 성장한 세포는 수확 및 파단되어 불용성 표적 펩티드를 함유하는 봉입체를 수득한다. 표적 분자 가용화 및 리폴딩(refolding) 후에, 이를 미스폴딩된 펩티드, DNA, HCP, 집합체 등을 제거하는 청징, 여과, 및 정제를 포함하는 일련의 방법에 적용한다. 상기 일련의 방법은 종종 다운스트림 방법 (DSP) 으로 칭한다.

가장 흔히 활용되는 DSP 는 1 또는 2 회의 결합-용리 크로마토그래피 정제 단계, 이후 1 또는 2 회의 통과 폴리싱 단계를 포함한다. 전형적인 다운스트림 정제 방법은 다공성 비드-기재 크로마토그래피 매질 또는 막-기재 장치가 충전된 팩킹된 컬럼을 활용한다. 이들 단위 작업은 연속적으로 활용되고, 각각은 통과 폴리싱 또는 결합/용리 포획 모드에서 특정한 불순물을 클리어링하는 것을 목표로 한다. 폴리싱 매질의 주 목적 중 하나는 표적 펩티드 농도에 대해 집합체 농도를 < 1% 로 줄이는 것이다.

상기 지시된 바와 같이, 통상적으로 표적 분자는 변성 상태로 수득된다. 상기는 정제 방법을 복잡하게 하는데, 표적 분자가 최종 정제 전에 가용화 및 리폴딩되어야 하기 때문이다. 이들 조건으로 인해, 방법은 매우 비효율적일 수 있는데, 전체 수율이 단지 5 내지 10% 범위이고, 단계적인 모드에서 5 배 이상의 소모적인 정제 단계가 정제 방법에서 요구되기 때문이다. 게다가, 주 불순물은 제거되어야 하는 집합화된 표적 분자이다.

따라서, 펩티드 리폴딩 방법은 가장 첼린징한 제조 단계 중 하나로서 [A. Jungbauer, Journal of Biotechnology 128 (2007) 587-596; A.P.J. Middelberg, Trends in Biotechnology Vol. 20 No. 10 October 2002, 437-443], 불용성 집합체의 형성으로 인해 높은 표적 펩티드 손실을 초래한다.

상기 방법은 목적하는 표적 분자의 포획 및 요구되는 1 차 정제 (생물치료적 분자 사양의 달성을 위해 수많은 직교성 기법 (예, 크기-배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 등) 을 사용하는 추가의 정제 단계가 뒤따름) 에 적합한 이온 교환 크로마토그래피 모드의 좁은 적용 범위 (예, pH 및 용매 전도성 의존) 를 기반으로 한다. 추가로, 차후의 결정화를 최종 고압 폴리싱 단계에서 사용되는 유기 용매의 제거를 위해 실시한다.

각 표적 분자에 대한 제조 방법은 물리적 특성 및 생물치료적 분자 사양에 상응하여 별개로 개발되었는데, 이는 제조비 및 타임-투-마켓(time-to-market) 을 증가시킨다.

요약해서, 전형적인 표적 펩티드 정제 방법은 물리적 특성 및 생물치료적 분자 사양에 상응하여 별개로 개발된다. 각종 청징, 여과, 및 정제 단계는 표적 펩티드를 정제하는데 사용된다. 예를 들어, EPO 정제에서 사용되는 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 [WO 03/045996; WO 00/27869; WO2009/147060] 와 같은 일부 기법은 보다 흔하다. 기타 방법은 포획 단계로서 소수성 폴리스티렌 수지 (예, Source 30RP) 를 사용한 직후, 이온 교환 단계 (EP0265222) 를 실시한 다음, 단편 및 집합체 분리를 위해 수산화인회석을 사용하는 것을 포함한다.

특히, 수산화인회석의 사용은 미생물 발현 시스템으로부터 표적 분자의 정제에 매우 중요한데, 주 방법 불순물이 표적 분자 집합체이기 때문이다 (WO 2005/044856; WO 2010/147686).

최근에, 정제 단계의 수를 줄이고자 시도하거나 또는 생성물 품질 속성의 유지를 간단하게 하기 위한 산업에서 주목할만한 경향이 있어왔다. 또한, 생물반응기를 사용한 보다 높은 발현 역가의 수득을 위한 기법의 사용은 산업에서 오름세이다. 이들 2 개의 경향들의 조합은 컬럼 상에 보다 많은 생성물의 적재를 유도함으로써 꽤 고가의 크로마토그래피의 부담 증가, 뿐만 아니라 생성물의 순도의 저하를 야기한다 (이들 모두는 바람직하지 않음).

집합체와 같은 목적하는 단백질성 생성물의 크로마토그래피 정제의 선택성의 개선을 위해, 각종 크로마토그래피 재료가 정제 방법의 대안과 동시에 개발되었다. 특히, 분리 재료의 표면의 특정한 유도체화는 목적하는 생성물로부터 목적하지 않는 불순물의 보다 선택적인 분리를 유도해야 한다. 그러나, 이들 특별하고 복잡한 표면 유도체화는 이들 크로마토그래피 재료의 생성이 시판품보다 아주 많이 고가이도록 함으로써 산업적 스케일 정제로의 그 용도는 거의 주목되지 않는다.

실리카 재료 기재의 시판 재료가 일반적으로 기본 환경에 영향을 받고, 특히 재생 동안 안정성을 잃기 때문에, 크로마토그래피 재료 분야에서의 기타 발전은 유기 기질 기재의 분리 재료로 이끌어졌다.

유기 폴리머 기재의 고정상은 넓은 범위의 pH 조건에서 작동될 수 있다. 따라서, 폴리머성 수지는 높은 pH 조건 하에 공격적으로 클리닝될 수 있다. 그러나, 현 폴리머성 고정상은 고성능 생체분자 분리에서 사용되는 중간압 또는 고압 조건에서 다소 압축성이다.

비용매의 존재 하에 디비닐벤젠(DVB)-함유 혼합물의 현탁 중합으로부터 생성된 종래의 매크로다공성 코폴리머는 넓은 범위의 기공 크기 분포 및 표면적을 갖는 폴리머를 나타낸다. 상기 폴리머 비드가, 예를 들어 US 4,686,269 에 개시되어 있다. 이들 폴리머 비드는 0.5 내지 50 μm 의 평균 입자 직경을 갖는 비닐-방향족 모노머로부터 제조된다. 그러나, 생산 스케일 크로마토그래피 컬럼에 흔히 사용되는 고압 조건 하에서는 강직성이 아니다. 크로마토그래피에 사용되는 폴리머 비드의 강직성은, 다공성 폴리머 고정상과 함께 분리 동안 필요한 압력 및 유동 특성을 제공하기 때문에 필수적이다.

상기 기재된 선행 기술 결과로부터, 결합 및 용리 모드, 뿐만 아니라 통과 모드에서 넓은 범위의 조건에서 효과적으로 적용가능하고, 집합체 및 표적 펩티드 단편과 같은 중요 불순물의 수준을 낮추는, 강력하고 신뢰성 있는 펩티드 정제 방법에 대한 요구가 존재한다.

본 발명의 목적은 또한 방법을 최적화하고, 요구되는 방법 단계의 수를 감소시키고, 생성 방법을 촉진시키는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 용이하게 실행가능한 방법 및 목적하는 생물약학적 분자의 생성 및 정제에 대한 상당히 감소된 비용을 제공하는 것이다.

예상외로, 폴리스티렌 입자가 넓은 작동 범위에서 리폴드 풀 또는 여과된 세포 배지 용액으로부터 직접 표적 분자의 포획에 적용될 수 있어, 내화성 용액을 사용해 용리 중 직접 단편화 및 집합화된 형태의 분리를 가능하게 하는 것을 발견하였다. 수득한 사전-정제된 표적 분자 용액을 최종 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피에 직접 적용할 수 있다.

더 구체적으로는, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 표적 펩티드를 함유하는 용액으로부터 펩티드 집합체 및 단편의 분리 방법에 관한 것이다:

(a) 표적 펩티드를 함유하는 샘플을 제공하는 단계;

(b) 적합한 시간 동안 샘플을 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시키고, 펩티드를 흡착하는 단계,

(c) 상이한 용매 조성물의 사용으로 표적 펩티드를 회수함으로써,

표적 펩티드로부터 집합화된 펩티드 및 펩티드 단편을 분리하는 단계.

특히, 본 발명은 청구항 제 1 항 내지 제 17 항에 의해 청구되는 바와 같은 방법에 관한 것이다.

도 1: P00446, LiChroprep® RP-18 및 Eshmuno® S 상에서 정적 포획 인슐린의 비환원 SDS-PAGE. 1 ml 의 5 mg/ml 인슐린 (50 mM 아세테이트, pH 4) 을 100 μl 평형화된 입자에 첨가하였음. 25℃ 에서 30 분 동안 흡착. 25℃ 에서 30 분 동안 용리 (각각 500 μl 50 mM 아세테이트, 40 Vol% DPG, pH 4, Eshmuno® S 의 경우에는 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 8). 나타낸 레인: M - 분자량 마커; S - 스타트 재료, SA - 흡착 후의 상청액, BA - 흡착 후의 비드.
도 2: P00446 폴리스티렌 입자로부터 포획된 미정제 인슐린의 용리 피크.
도 3: P00446 상에서 동적 미정제 인슐린 포획의 비환원 SDS-PAGE. 나타낸 레인: M - Perfect Protein Marker; F - 공급물 (pH 3.5 에서 출발 재료), FF - 통과액, A1-A5 - 용리 단편.
도 4: P00446 (컬럼 1.1 ml 직경 10 mm) 상에서 동적 포획 미가공 인슐린의 비환원 SDS-PAGE. AKTA FPLC 시스템 사용. 25 mM Tris, 100 mM 아르기닌, pH 7 로 10 CV 평형화. 30 ml 의 1 mg/ml 미가공 인슐린을 1 ml/min 유속으로 적재하였음. 20 CV 로 0% 로부터 100% 60 Vol.% DPG 까지 용리. 레인: M - 분자량 마커; S - 스타트 재료; FT - 통과액.
도 5: P00446 (컬럼 1.1 ml 직경 10 mm) 상에서 동적 미정제 pSCP194 포획의 비환원 SDS-PAGE. 레인: M - PerfectProtein™ 분자량 마커; F - 공급물 (세포의 고압 용해 후의 상청액 (pH 8.0, 300mM NaCl)); P00446 컬럼: 통과, 세정, 용리로부터 수합된 단편).
도 6: P00446 및 PS02 (컬럼 1.1 ml 직경 10 mm) 상에서 동적 미정제 인슐린 포획의 비환원 SDS-PAGE. 레인: S - 스타트 재료, FT - 통과 분획, PS02 B12-A8 용리 단편, 30410 A6-A1 용리 단편.
도 7: 선형 구배 및 용리 완충액 중 디프로필렌 글리콜을 사용하는, pH 3.5 에서 PP00446 에 의한 인슐린/집합체 정제의 크로마토그램.
도 8: 선형 구배 및 용리 완충액 중 디프로필렌 글리콜을 사용하는, PP00446 에 의한 인슐린/집합체 정제 동안의 모든 단편의 비환원 SDS-PAGE 분석. 레인: M - SeeBlue®Plus2 Prestained Standard, F - 공급 인슐린 출발 재료 (pH 3.5), 적재 - 적재 동안 통과액 수합, 세정 - 세정 단계 동안 통과액 수합, 용리 - P00446 컬럼으로부터 용리 분획 A1-A5. 용리 조건: 50% DPG (50mM 글리신, 50mM 아세트산 pH 3.5 구배).
도 9: 선형 구배 및 용리 완충액 중 에탄올을 사용하는, pH 3.5 에서 PP00446 에 의한 인슐린/집합체 정제의 크로마토그램.
도 10: 선형 구배 및 용리 완충액 중 에탄올을 사용하는, pH 3.5 에서 PP00446 에 의한 인슐린/집합체 정제 동안 모든 단편의 비환원 SDS-PAGE 분석. 레인: M - SeeBlue®Plus2 Prestained Standard, F - 공급 인슐린 출발 재료 (pH 3.5), L - 적재 동안 통과액 수합, W - 세정 단계 동안 통과액 수합, 용리 - P00446 컬럼으로부터 용리 분획 E1-E5. 용리 조건: 50% DPG (50mM 글리신, 50mM 아세트산 pH 3.5 구배).
도 11: 선형 구배 및 용리 완충액 중 디프로필렌 글리콜을 사용하는, pH 8.0 에서 PP00446 에 의한 인슐린/집합체 정제의 크로마토그램.
도 12: 선형 구배 및 용리 완충액 중 디프로필렌 글리콜을 사용하는, pH 8.0 에서 PP00446 에 의한 인슐린/집합체 정제 동안 모든 단편의 비환원 SDS-PAGE 분석. 레인: M - SeeBlue®Plus2 Prestained Standard, F - 공급 인슐린 출발 재료 (pH 8.0), L - 적재 동안 통과액 수합, W - 세정 단계 동안 통과액 수합, 용리 - P00446 컬럼으로부터 용리 분획 E1-E5. 용리 조건: 50% DPG (50mM TRIS pH 8.0 구배).
도 13: 단계 구배 및 용리 완충액 중 디프로필렌 글리콜을 사용하는, pH 3.5 에서 PP00446 에 의한 인슐린/집합체 정제의 크로마토그램.
도 14: 단계 구배 및 용리 완충액 중 디프로필렌 글리콜을 사용하는, pH 3.5 에서 PP00446 에 의한 인슐린/집합체 정제 동안 모든 단편의 비환원 SDS-PAGE 분석. 레인: M - SeeBlue®Plus2 Prestained Standard, F - 공급 인슐린 출발 재료 (pH 3.5), L - 적재 동안 통과액 수합, W - 세정 단계 동안 통과액 수합, 용리 - P00446 컬럼으로부터 용리 분획 E1-E7. 용리 조건: 50% DPG (50mM 글리신, 50mM 아세트산 pH 3.5).
도 15: 단계 구배 및 용리 완충액 중 디프로필렌 글리콜을 사용하는, pH 8.0 에서 PRLP-S 에 의한 인슐린/집합체 정제의 크로마토그램.
도 16: 단계 구배 및 용리 완충액 중 디프로필렌 글리콜을 사용하는, pH 8.0 에서 PRLP-S 에 의한 인슐린/집합체 정제 동안 모든 단편의 비환원 SDS-PAGE 분석. 레인: M - SeeBlue®Plus2 Prestained Standard, F - 공급 인슐린 출발 재료 (pH 8.0), L - 적재 동안 통과액 수합, W - 세정 단계 동안 통과액 수합, 용리 - P00446 컬럼으로부터 용리 분획 E1-E7. 용리 조건: 50% DPG (50mM TRIS pH 8.0).

본 발명은 표적 펩티드를 함유하는 용액으로부터 펩티드 집합체 및 단편의 분리 방법으로서, 이때 펩티드를 함유하는 용액을 소수성 크로마토그래피 재료와 적합한 시간 동안 접촉시킴으로써 펩티드를 소수성 크로마토그래피 재료로 흡착시킨 후, 상이한 용매 조성물을 사용해 흡착된 펩티드의 선택적 회수를 실시하는 것에 관한 것이다. 이로써, 집합화된 펩티드 형태는 표적 펩티드로부터 부분 또는 완전 분리될 수 있다.

상세하게는, 분리는 미립자이고 가교된 비닐벤젠, 에틸스티렌, 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠, 또는 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메틸아크릴레이트 수지로 만들어진 소수성 크로마토그래피 재료를 사용해 수행된다. 바람직하게는, 수지는 스티렌 및 디비닐벤젠이 98 : 2 에서 10 : 90 중량% 이하의 비로 구성되는 가교된 폴리머로 구성된다. 개질된 형태로, 미립자 재료는 디비닐벤젠 및 에틸렌글리콜디-메타크릴레이트의 코폴리머와 비 98 : 2 에서 10 : 90 중량% 이하로 가교된 폴리스티렌으로 이루어진다. 통상적으로, 이들 미립자, 소수성 크로마토그래피 분리 재료는 10 μm 내지 600 μm 범위, 바람직하게는 20 μm 내지 150 μm 범위, 가장 바람직하게는 20 μm 내지 63 μm 범위의 평균 입자 직경을 갖는다. 상기 크기의 적합한 소수성 다공성 폴리머 비드는 바람직하게는 4 - 500 nm 범위, 더 바람직하게는 10 - 30 nm 범위, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm 범위의 기공 크기를 갖는다.

본 발명의 목적은, 특히 표적 펩티드를 함유하는 용액으로부터 펩티드 단편 및 집합체의 분리를 위한, 4 nm 내지 500 nm 범위, 바람직하게는 10 nm - 30 nm 범위, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm 범위의 기공 크기를 갖는 소수성 크로마토그래피 분리 재료를 사용하는, 목적하는 펩티드로부터 집합화된 펩티드의 분리 방법이다. 본 발명의 사용되는 소수성 크로마토그래피 분리 재료는 바람직하게는 가교된 비닐벤젠, 가교된 에틸스티렌, 폴리스티렌/폴리에틸스티렌-디비닐벤젠, 또는 폴리스티렌/폴리에틸스티렌-디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메틸아크릴레이트 수지로 만들어진다. 특히 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 사용되는 소수성, 강직성 폴리머 비드는 10μm 내지 600 μm 범위, 바람직하게는 20 μm 내지 150 μm 범위, 가장 바람직하게는 20 μm 내지 63 μm 범위의 평균 입자 직경, 및 4 nm 내지 500 nm 범위, 바람직하게는 10 nm - 30 nm 범위, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm 범위의 기공 크기를 갖는다.

목적하는 펩티드로부터 집합화된 펩티드의 분리의 수행을 위해, 2 - 11 범위, 바람직하게는 3 - 8 범위의 pH 값 및 1 - 150 mS/cm 범위, 바람직하게는 2 - 50 mS/cm 범위의 전도성을 갖는 수용액을 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시킨다. 소수성 크로마토그래피 재료를 팩킹된 베드(bed) 의 ml 당 30-100 mg 의 표적 펩티드, 바람직하게는 팩킹된 베드의 ml 당 50-80 mg 의 표적 펩티드에 150 - 1000 cm/min 범위, 바람직하게는 300 - 900 cm/min 범위의 유속으로 노출시킨다. 표적 펩티드의 흡착 후에, 소수성 크로마토그래피 재료를 유기 용매를 함유하는 수용액에 직접 또는 구배 방식으로 노출시킨다. 유기 용매 농도에 따라, 집합화 및 표적 펩티드 사이의 부분 분리가 달성된다. 특히 바람직한 구현예에서, 집합체의 분리를 표적 분자 리폴딩 단계 후에 처리한다. 요구된다면, 정제 순서는 이온 교환 수지를 이용한 처리를 포함한다. 처리되는 유체로부터 분리되어야 하는 물질의 성질에 따라, 음이온 또는 양이온 교환 수지를 방법 단계에 적용할 수 있다. 바람직하게는, 양이온 교환 수지를 사용하여 술폰산 또는 술페이트기와 같은 음전하기를 제공할 수 있다. 상기 목적을 위해, 상표명 Eshmuno^(R) S 하에 시판되는 이온 교환 재료가 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.

표적 분자를 구배 방식으로 탈착시키기 위해, 용리 중 이동상의 조성을 바꾼다. 본 발명의 목적을 위해, 통상적으로 수성 용매 혼합물을 사용한다. 실험은 디프로필렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 에탄올, 메탄올 및 프로판올 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매를 포함하는 수성 혼합물이 양호한 분리 결과를 유도하는 것을 보여줬다. 일반적으로, 이들 용매 혼합물은 용리 설정을 위한 추가의 첨가제를 포함한다. 예를 들어, 용매 혼합물은 특정량의 글리신과 혼합할 수 있다.

추가로, pH 를 원하는 목적에 적절한 완충액을 첨가함으로써 조정한다. 어떤 pH 범위에서 용리가 실시되는지에 따라, 상이한 완충액이 적합하다. 따라서, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (TRIS), 아세테이트 또는 포스페이트 완충액과 같은 완충액을 적용할 수 있다. 나아가, 요구된다면, 용매 혼합물은 나트륨 클로라이드와 같은 적합한 염을 포함할 수 있다.

상응하는 구배 용리의 실시에 관한 상세한 정보가 전문가에 의해서 문헌 또는 적절한 텍스트북, 예를 들어 "Preparative Chromatography of Fine Chemicals and Pharmaceutical Agents", Henner Schmidt-Traub, Wiley-VCH Verlag, 2005, p. 152 - 161 에서 발견될 수 있다.

여기에 기재된 각종 실험에서, 다공성 폴리(디)비닐 방향족 비드와 같은 다공성 소수성 상호작용 재료가 대규모 펩티드 정제에 유용한 것으로 밝혀졌다. 이들 정제 단계를 목적하는 단백질을 함유하는 샘플 (예, 펩티드 리폴딩 풀) 에 존재하는 하나 이상의 불순물의 수준을 감소시키는데 수행할 수 있다.

상기 목적을 위해, 펩티드 리폴딩 용액을 소수성 상호작용 재료, 예를 들어 다공성 소수성 폴리스티렌 비드와 접촉시키고, 특정 시간 동안 인큐베이션하여 표적 펩티드 및 부분 또는 모든 불순물 (예, 집합체 및 단편) 을 흡착시킨다. 흡착 후에, 결합된 성분의 선택적 탈착이 각종 비의 유기 용매를 사용해 달성될 수 있다. 상기 절차에 의해, 목적하는 펩티드를 함유하는 용액으로부터 원치않는 펩티드 단편 및 집합체를 선택적으로 감소시킬 수 있다.

상기 소수성 상호작용 재료는 펩티드 리폴딩 용액에 후-적용하고, 적합한 시간 동안 청징된 세포 배지 용액을 재료와 접촉시킴으로써 집합화된 물질의 수준을 선택적으로 감소시키기에 특히 적합하다. 상기 정제 방법의 수행을 위해, 소수성 상호작용 재료 (예, 폴리스티렌 비드) 를 하나 또는 수 개의 크로마토그래피 컬럼(들) 또는 기타 장치, 예컨대 필터 하우징 등에 혼입시킨다. 이후, 이들 팩킹된 컬럼을 결합 및 용리 또는 통과 모드에서 단백질 정제 방법에 사용하는데, 이때 집합화된 물질은 소수성 상호작용 재료와 더 강하게 상호작용하고, 집합체 수준이 감소된다. 상기 경우에, 유속이 150 cm/min - 1000 cm/min, 특히 300 - 900cm/min 범위인 것으로 조정되는 경우, 양호한 정제 결과가 수득된다.

나아가, 여기에 기재된 실험에서, 용액의 pH 가 pH 2 내지 11 범위, 바람직하게는 pH 3 내지 8 범위인 것으로 조정된 경우 양호한 정제 결과가 달성가능하다.

동시에, 용액의 전도성이 1 mS/cm - 50 mS/cm 범위, 특히 2 - 50 mS/cm 범위인 경우 유리한 것으로 입증되었다.

추가로, 여기에 기재된 실험에서, 유기 용매, 예컨대 에탄올, 1-프로판올, 디프로필렌글리콜이 소수성 상호작용 재료로부터 흡착된 물질을 선택적으로 탈착시키는데 사용되는 경우 양호한 정제 결과가 달성가능한 것으로 밝혀졌다.

본원의 실험에 의해 제시되는 바, 특히 놀랍게는 고순도의 표적 펩티드가 소형 다공성 폴리머 비드 형태의 소수성 상호작용 재료를 사용해 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일부 구현예에서, 상기 재료는 주로 폴리스티렌 또는 폴리에틸스티렌으로 이루어질 수 있고, 소수성 및 친수성 모노머, 예를 들어 디비닐벤젠 (DVB) 및 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (EGDMA) 의 혼합물로 가교될 수 있다.

다공성 폴리머 비드는 전형적으로 현탁 중합에 의해 생성된다. 이들은, 예를 들어 US 4,382,124 에 개시된 것과 유사하고 모노머에게는 용매이지만 폴리머에게는 비용매인, 포로겐 ("상 확산제" 또는 "침전제" 로도 알려짐) 의 존재 하에 현탁 중합에 의해 다공성이 코폴리머 비드 내에 도입되는 방법에서 생성될 수 있다. 종래의 다공성 폴리머, 예컨대 US 4,382,124 에 따라 제조된 것들은 전형적으로 넓은 범위의 포로겐 유형, 모노머 상에 대한 포로겐 농도, 모노머 유형, 가교성 모노머 유형, 가교제 수준, 중합 개시제 및 개시제 농도의 사용을 포함한다. 그러나, 본 발명은 소수성 모노머의 비가 특별한 범위에 있는 경우, 이들 폴리머 비드가 세포 배지 액체로부터의 항체의 정제에 특히 적합하고 효과적이라는 예상외의 발견을 기반으로 한다.

이론에 구속되지 않으면서, 본 발명의 경우 폴리머 매트릭스가 폴리머 내 소수성 분자의 함유량을 증가시킴으로써 변경될 때 표적 분자에 대한 증가된 커패서티가 주로 달성되는 것으로 여겨진다. 상기 변경을 표적 분자의 다공성, 강직성 및 결합 커패서티의 파라미터에 완전히 영향을 미치는 폴리머 빌딩 모노머 및 포로겐의 양 및 가교제 수준의 밸런스를 고려하면서 수행하였다.

천만뜻밖에, 집합체의 상당히 개선된 분리가 이들 선택된 오픈 다공성 소수성 폴리머 비드에 의해 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 다공성 구조는 폴리머 매트릭스의 안과 밖으로 분자의 신속한 확산을 가능하게 하고, 폴리머 비드의 다공성으로 인한 큰 표면적이 세포 배지 매질에 함유된 원치않는 불순물과의 상호작용에 이용가능하다. 따라서, 이들 재료는 고정상에서 생체분자의 분리에 매우 효과적이다. 가장 최근에는, 시판 폴리머성 역상 크로마토그래피 고정상은 이들 기준에 따라 고안된 것으로 보이고, 보다 낮은 압력 조건 하에 사용되지만, 보다 높은 압력 조건 (전형적으로, 10 내지 100 bar 범위) 에서는, 이들 재료는 압축성이다. 다행이도, 본원에 기재된 바와 같은 폴리머 비드는 증가된 강직성을 갖고, 동시에 높은 다공성을 가짐으로써 입자내 확산을 위한 높은 커패서티를 제공한다.

본 발명에 사용되는 소수성 다공성 폴리머 비드는 1 내지 100 cm 범위, 바람직하게는 5 내지 50 cm 범위의 직경을 갖는 액체 크로마토그래피 컬럼 (이때, 컬럼은 100 bar 이하의 압력, 바람직하게는 0.2 내지 80 bar 범위의 압력에서 작동됨) 에서 폴리머 비드와 용액을 접촉시킴으로써 표적 펩티드를 함유하는 용액으로부터의 집합체의 제거에 잘 적합하다. 전형적으로, 분취 스케일 컬럼은 10 내지 50 cm 범위이고, 0.2 내지 80 bar 범위의 압력에서 작동된다.

본 발명에 따른 다공성 폴리머 비드는 전형적으로 고성능 역상 액체 크로마토그래피 (예컨대, 직경이 1 내지 100 cm 범위의 컬럼) 를 통해 생체분자의 분리 및 정제에 유용한 폴리머 비드에 전형적인 크기인 200 μm 이하의 평균 입자 크기 직경을 갖는 구형 코폴리머 비드이다.

일반적으로, 다공성 분리 재료는 10 - 600 μm 범위, 바람직하게는 20 - 150 μm 범위의 평균 입자 크기 직경 (d₅₀) 을 갖는 경우 특히 유효한 것으로 밝혀졌지만, 20 - 63 μm 범위의 평균 입자 크기를 갖는 상기 재료가 특히 유효한 것으로 보여졌다.

4 - 500 nm 범위의 기공 크기를 갖는, 상기 소수성 분리 재료, 바람직하게는 폴리스티렌 비드는 목적하는 분리 효과에 적합한 것으로 보인다. 정제 실험은 평균 기공 크기가 10-30 nm 인 소수성 상호작용 재료가 바람직한 분리 결과를 유도하는 것으로 나타났다. 이들 바람직한 분리 결과는 13 - 25 nm 범위의 평균 기공 크기 및 적합한 재료로부터 만들어진 구형 소수성 폴리머 비드가 사용되는 경우 추가로 개선될 수 있다. 본 발명의 적합한 다공성 폴리머 비드는 바람직하게는 300 내지 1000 m²/g (그램 당 제곱 미터) 범위, 더 바람직하게는 450 내지 850 m²/g 범위, 가장 바람직하게는 500 내지 800 m²/g 범위의 표면적 (BET) 을 갖는다.

본원에 기재된 다공성 폴리머 비드의 제조에 사용될 수 있는 적합한 단일불포화 비닐방향족 모노머는 비제한적으로 스티렌, C1 - C4-알킬-치환된 스티렌, 비닐나프탈렌 및 비닐안트라센을 포함한다. 바람직하게는, 단일불포화 비닐방향족 모노머는 스티렌 및 C1 - C4-알킬-치환된 스티렌 중 하나 이상으로부터 선택된다. 적합한 C1-C4-알킬치환된 스티렌의 기에 포함되는 것은 에틸비닐벤젠, 비닐톨루엔, 디에틸스티렌, 에틸메틸스티렌 및 디메틸스티렌이다. 상기 언급된 비닐방향족 모노머 각각의 각종 위치 이성질체 중 어느 하나가 적합한 것으로 여겨진다.

이는 본 발명에 적합한 다공성 폴리머 비드가 특히 비닐벤젠 (스티렌), 에틸스티렌, 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 디비닐나프탈렌, 디비닐안트라센, 디비닐자일렌 및 이들 모노머의 임의의 구조 이성질체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 모노머(들) 를 사용해 제조될 수 있다.

바람직하게는, 다공성 폴리머는 비닐벤젠 (스티렌) 및 디비닐벤젠 또는 에틸스티렌 및 디비닐벤젠의 코폴리머를 사용해 제조된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 적용된 가교된 다공성 폴리머 비드는 스티렌 및 디비닐벤젠을 98 : 2 내지 10 : 90% 의 서로에 대한 중량비로 포함한다.

임의로는, 지방족 불포화 모노머, 예를 들어 (메트)아크릴산 및 (메트)아크릴산의 알킬 에스테르가 또한 본원에 기재된 상기 소수성, 다공성 폴리머 비드의 제조를 위해 비닐방향족 모노머 외에 사용될 수 있다. 이들 지방족 불포화 모노머는 목적하는 폴리머 비드의 제조에서 가교제로서 사용될 수 있다.

적합한 지방족 가교성 모노머는 에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 디에틸렌글리콜 디비닐 에테르 및 트리비닐시클로헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된다 (본 발명에 따른 가교된 소수성 다공성 폴리머 비드의 제조에 사용될 수 있음). 지방족 모노머는 가교성 모노머로서 상기 언급된 폴리비닐방향족 모노머와의 조합으로 또는 단독으로 사용될 수 있다.

두 변형 모두에서, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 및 디에틸렌글리콜 디비닐 에테르는 다공성 비드의 제조에 특히 적합하다. 바람직하게는, 이들 지방족 가교성 모노머는 폴리비닐방향족 가교성 모노머와의 조합으로 사용된다. 이들 조건 하에, 지방족 모노머는 전형적으로 강직성 및 다공성 폴리머 비드를 형성하는데 사용되는, 전체 모노머 중량을 기준으로 0 내지 50% 범위의 양, 바람직하게는 0 내지 30% 범위의 양으로 포함된다.

본원에 기재된 다공성 폴리머 입자의 본 발명의 용도에서, 우세한 분리 결과는 디비닐벤젠 또는 그 유도체 및 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 및 디에틸렌글리콜 디비닐 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 모노머의 코폴리머로 가교되고, 폴리스티렌 및 가교성 코폴리머의 비가 98 : 2 에서 10 : 90 중량% 이하의 범위인 폴리스티렌으로 이루어진 다공성 폴리머 비드를 사용해 달성된다. 바람직한 구현예에서, 디비닐벤젠 및 에틸렌글리콜 메타크릴레이트의 코폴리머와 비 98 : 2 에서 14 : 86 중량% 이하로 가교된 폴리(에틸)스티렌으로 이루어진 다공성 입자가 사용된다. 상기 맥락상, 표적 펩티드를 함유하는 용액으로부터 집합화된 물질의 분리를 위해 다공성 비드가 보다 양호하게 적합하며, 이때 (디)비닐방향족 모노머가 50 중량% 초과의 양으로 함유된 것으로 밝혀졌다. 따라서, 디비닐벤젠 및 에틸렌글리콜 메타크릴레이트의 코폴리머와 비 약 10 : 90 내지 98 : 2 중량% 로 가교된 모노비닐방향족의 폴리머로 이루어진 다공성 비드가 바람직하다. 더 바람직한 것은 그 비가 중량을 기준으로 약 14 : 86 인 상기 다공성 비드이다.

바람직한 소수성 다공성 폴리머는 비닐벤젠 (스티렌) 코폴리머, 에틸비닐벤젠 (에틸스티렌) 코폴리머, 디비닐벤젠 코폴리머, 가교된 폴리스티렌-디비닐벤젠 코폴리머, 가교된 폴리스티렌 에틸렌글리콜-디메타크릴레이트, 가교된 폴리디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메타크릴레이트 중 하나 이상으로부터 선택된다. 가장 바람직한 것은 가교된 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠 코폴리머 및 디비닐벤젠 및 에틸렌글리콜-디메타크릴레이트의 코폴리머로 가교된 폴리(에틸)스티렌이다.

다공성 폴리머의 제조에 유용한 포로겐은 소수성 포로겐, 예컨대 (C₇ - C₁₀)방향족 탄화수소, 및 (C₆-C₁₂) 포화 탄화수소 및 친수성 포로겐, 예컨대 (C₄ - C₁₀) 알칸올 및 폴리알킬렌 글리콜을 포함한다. 따라서, 적합한 포로겐은, 예를 들어 톨루엔, 에틸벤젠, 오르토-자일렌, 메타-자일렌, 파라-자일렌으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 언급된 탄화수소의 어느 하나의 각종 위치 이성질체의 어느 하나가 적합한 것으로 여겨진다. 바람직하게는, 방향족 탄화수소는 톨루엔 또는 자일렌 또는 자일렌의 혼합물 또는 톨루엔 및 자일렌의 혼합물이다. 나아가, 상기 지시된 바와 같이, 포화 탄화수소는 또한 포로겐으로서 사용될 수 있다. 적합한 예는 비제한적으로 예를 들어 헥산, 헵탄 또는 이소옥탄을 포함한다. 바람직한 포화 탄화수소는 본 발명의 상기 경우에 이소옥탄이다. 적합한 알칸올은 비제한적으로 이소부틸 알코올, tert-아밀 알코올, n-아밀 알코올, 이소아밀 알코올, 메틸 이소부틸 카비놀, (4-메틸-2-펜타놀), 헥산올 및 옥탄올을 포함한다. 바람직하게는, 포로겐 혼합물은 하나 이상의 (C₅-C₈)알칸올로부터 선택된 친수성 포로겐 및 하나 이상의 (C₇-C₁₀)방향족 탄화수소로부터 선택된 소수성 포로겐을 포함한다.

전형적으로, 포로겐은 모노머의 중량을 기준으로 과잉으로, 보통 100 내지 170%, 바람직하게는 115 - 150, 더 바람직하게는 120 내지 140% 의 총량으로 중합 현탁물에 첨가된다. 또한, 본 발명에 따른 폴리머의 제조에 사용되는 포로겐을, 적어도 소수성 용매 및 임의로는 덜 소수성인 용매 ("친수성" 용매) 를 포함하고 모두가 다공성 비드의 빌딩을 지지하는 용매 시스템과 혼합한다. 덜 소수성 (또는 상기 언급된 바와 같이 "친수성") 인 용매가 예를 들어 0.5 내지 5% 범위의 적어도 일부 제한된 수용해도를 갖는 반면에, 소수성 용매가 10 내지 100 ppm 이하의 수용해도를 나타내는 것은 자명하다.

일반적으로, 낮은 소수성을 갖는 포로겐 (즉, "친수성 포로겐") 대 소수성 포로겐의 비는 0.7 : 1 에서 3 : 1 이하의 범위, 바람직하게는 0.8 : 1 에서 2.5 : 1 이하, 가장 바람직하게는 0.9 : 1 내지 2.4 : 1 범위이다.

본 발명에 적합한 폴리머의 제조에 유용한 중합 개시제는 당업자에 익히 공지되어 있고, 모노머 가용성 개시제, 예컨대 퍼옥시드, 히드로퍼옥시드, 및 관련된 개시제를 포함한다. 이들 개시제는 시판된다. 또한 유용한 것은 아조 개시제, 예컨대 아조디이소부티로니트릴, 아조디이소부티르아미드 등이다. 개시제의 성질에 따라, 사용 수준은 비닐 모노머를 포함하는 전체 중량을 기준으로 0.5 내지 10% 범위이다.

나아가, 다공성 폴리머 비드의 제조에 유용한 분산제 또는 현탁화제는 이온성이고 1 내지 24개의 탄소 원자를 함유하는 소수성 알킬 사슬을 함유할 수 있는 종래의 계면활성제일 수 있다. 현탁 중합에 적합한 또다른 분산제의 시판 군은 에폭시화된 히드록시알킬셀룰로오스 유도체 기재의 비이온성 계면활성제이다. 전형적으로, 이들 첨가제는 수성상의 전체 중량을 기준으로 약 0.01 에서 4% 이하의 수준으로 사용된다.

적합하다면, 기타 분산제가 사용될 수 있고, 이들 계면활성제 및 분산제와 함께 적용될 수 있다. 예를 들어, 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 전분 등을 포함하는 폴리머성 분산제는 본원에 사용된 기타 계면활성제 또는 분산제와의 혼합물에 사용될 수 있다. 그러나, 가장 바람직한 것은 물로 헹굼으로써 제조된 폴리머 비드로부터 용이하게 제거될 수 있는 이온성 계면활성제의 첨가이다.

본원에 개시된 다공성 소수성 폴리머 비드의 제조를 위해, 현탁물 보조제를 함유하는 연속 수성상 용액을 제조한 후, 상기 용액을 폴리비닐방향족 모노머, 자유 라디칼 개시제 및 모노머 혼합물 1 부 당 예를 들어 1 내지 1.7 부의 (혼합된) 포로겐 (소수성 및 친수성 포로겐) 을 함유하는 모노머 혼합물과 혼합한다. 이어서, 승온 (전형적으로, 40 내지 100℃ 에서, 예를 들어 1 내지 약 15 시간 동안) 에서 이렇게 중합된 모노머/포로겐 조합 및 포로겐을 수득한 폴리머 비드로부터, 예를 들어 증류 또는 용매 세정에 의해 제거한다. 이후, 수득한 다공성 폴리머 비드를 탈수 및 건조와 같은 종래의 방식으로 단리한다.

임의로는, 폴리머 비드의 제조는 중합 동안 사용되는 분산제 및 현탁화제의 잔류물의 폴리머 표면의 클렌징에 대한 처리를 포함할 수 있다. 상기 처리는 특허 문헌 (JP 61-141704 또는 JP 57-98504 또는 EP 1 179 732 B1) 에 개시된 바와 같이 효소 처리를 포함할 수 있다

제조된 폴리머 비드는 이의 다공성 및 기계적 강도로 인해 팩킹된 컬럼에서 특히 적합하다. 유리하게는, 이들 다공성 및 강직성 폴리머 비드는 심지어 상승된 압력에서도 액체 크로마토그래피 컬럼에서 용액을 이들 폴리머 비드와 접촉시킴으로써 표적 펩티드를 함유하는 용액으로부터 집합화된 물질의 분리에 유용하다. 이들 비드는 장기적인 사용으로 인한 압력 증강 없이 높은 처리 속도에서 생체분자의 고성능 분리 및 정제에 특히 적합하다.

본 발명에 사용된 바와 같은 다공성 폴리머 비드는 선택된 다공성 및 기공 크기 분포로 특성화되며, 이는 인버스 크기-배제 크로마토그래피 (iSEC) 로 측정될 수 있다. 본 발명에 적합한 폴리머 비드는 전형적으로 0.4 내지 1.0 범위, 바람직하게는 0.45 내지 0.75 범위의 다공성 ε 을 갖는다. 이들 비드는 300 내지 100 m²/g [BET], 더 바람직하게는 450 내지 850 m²/g 범위, 가장 바람직하게는 500 내지 800 m²/g 의 매우 좁은 범위의 표면적을 갖는다.

본원에 개시된 바와 같은 폴리머 비드는 표적 펩티드를 함유하는 용액으로부터의 집합화된 물질의 분리에 예상외로 잘 적합하다. 이의 화학 성질 및 이의 나노 다공성 구조로 인해, 이들 재료는 저분자량 단백질 및 펩티드와의 소수성 상호작용에 특히 적합하고, 결합 및 용리 또는 통과 모드에서 크로마토그래피 컬럼 기재 정제 방법에 혼입될 수 있다. 유리하게는, 적용된 폴리스티렌 비드는 유도체화될 필요가 없고, 따라서 상기 정제 단계에서 흔히 사용되는 크로마토그래피 겔보다 훨씬 더 비용 효율적이다. 본원에 기재된 분리 재료는 꽤 저렴하고, 재생될 수 있으며, 이로써 펩티드 정제 플랫폼 및 그 이후의 전체 비용을 감소시킬 수 있다.

추가로, 저분자량 물질, 특히 분자량 <70kDa 의 화합물의 소수성 흡착 및 크기 배제 메커니즘을 기반으로 하기 때문에, 소수성 재료의 적용은 제시된 예에 제한되지 않는다.

나아가, 본 발명은 크로마토그래피 기재 항체 정제 단계를 제공하며, 여기서 본원에 기재된 크로마토그래피 재료는 재생될 수 있고, 넓은 작동 범위 (예를 들면, pH 3-11; 전도성 1mS/cm-50mS/cm, 작동 속도 150cm/min - 1000cm/min) 에서 적용가능하다. 특히, 낮은 pH 값 및 높은 pH 값에서의 다공성 폴리머 비드의 저항성은, 만족스러운 재생이 가능하고 이들 재료가 상당히 보다 긴 수명을 갖기 때문에 여기서 크게 유리하다.

이미 상기 나타낸 바와 같이, 본원에 기재된 소수성 다공성 폴리머 비드를 사용해 펩티드 용액으로부터 저분자량 물질, 특히 분자량 <70kDa 의 화합물의 흡착은, 선택된 분리 재료가 압력에 대해 안정적이고 고압에서 변형의 경향이 없기 때문에 산업, 뿐만 아니라 마이크로-스케일 모두에서 수행될 수 있다. 사용자는 크로마토그래피 정제를 수행하는 방식에서 자유롭다. 적용된 용액 및 저분자량 단백질 및 펩티드의 성질에 따라 다공성 폴리머 입자의 조성물 어느 한쪽이 정제 단계에서 유리할 수 있음은 자명하다. 여기서, 전문가는 순수한 (비닐) 알킬 방향족으로부터 만들어진 다공성 폴리머 또는 적합한 아크릴레이트에 의해 가교된 것들 중에서 선택을 갖는다. 이 경우에, 가장 적합한 폴리머 비드는 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있다.

본 설명은 당업자로 하여금 본 발명을 포괄적으로 실시하도록 한다. 따라서, 심지어 추가의 코멘트 없이도, 당업자가 가장 넓은 범위로 상기 설명을 활용할 수 있을 것으로 추정된다.

어느 것도 불확실하다면, 인용된 공보 및 특허 문헌이 참조되어야 하는 것으로 여겨진다. 따라서, 이들 문헌은 본 설명의 개시 내용의 부분으로서 간주된다.

더 나은 이해를 위해 및 본 발명을 예시하기 위해, 실시예가 아래에 기재되어 있으며, 이는 본 발명의 보호 범위 내에 있다. 이들 실시예는 또한 가능한 변형을 예시하는데 기여한다.

나아가, 제시된 실시예 및 또한 설명의 나머지 모두에서 조성물에 존재하는 성분 양이 전체로서 조성물을 기준으로 단지 100 중량% 또는 mol% 가 되고, 나타낸 % 범위로부터 보다 높은 값이 나타날 수 있을지라도 상기 백분율을 초과할 수 없는 것은 당업자에게 말할 것도 없다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, % 데이터는 중량% 또는 mol% 이며, 부피 데이터로 나타내는 비는 예외로 한다.

명세서를 통틀어 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 문맥이 달리 명확히 지시되지 않는 한 하기 의미를 가져야 한다:

용어 "알킬(메트)아크릴레이트" 는 상응하는 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 에스테르로 칭하고; 유사하게, 용어 "(메트)아크릴" 은 아크릴산 또는 메타크릴산 및 상응하는 유도체, 예컨대 에스테르 또는 아미드로 칭한다. 상기 나타낸 바와 같이, 모든 백분율은 달리 명시되지 않는 한 관여된 폴리머 또는 조성물 (용액) 의 총 중량을 기준으로 중량 퍼센트 (%) 로 표현되는 것을 의미한다. 용어 "코폴리머" 는 위치 이성질체를 포함하는, 2 개 이상의 상이한 모노머 단위를 함유하는 폴리머 조성물로 칭한다.

하기 약어가 본원에서 사용된다:

g = 그램,

ppm = 중량/부피를 기준으로 하는 백만분율,

m = 미터,

cm = 센티미터,

mm = 밀리미터,

μm = 마이크로미터 (마이크론) = 10^-6 m,

nm = 나노미터 = 10^-9 m,

ml = 밀리리터, L = 리터. 달리 명시되지 않는 한, 열거된 범위는 포괄적이고 조합가능한 것으로 보여야 한다.

실시예 및 설명, 뿐만 아니라 청구범위에서 제시된 온도는 항상 섭씨온도 (℃) 이다.

방법:

입자 특성:

입자의 특성화가 당업계에 공지되어 있고, 하기에 의해 기재되어 있다: I. C. Edmundson, Particle-size analysis, H. S. Bean, A. H. Beckett and J. E. Carles (eds) in: Advances in Pharmaceutical Sciences vol.2, Academic Press, London 1967, 95-174.

입자 크기 분포 및 평균 직경을 Mastersizer 2000E (Malvern Instruments Ltd., UK) 를 사용하는 레이저 회절분석 또는 레이저 광 블로킹 기술 (Accusizer™, 모델 770, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, Calif., USA) 에 의해 측정할 수 있다.

마이크로스피어의 형상 및 표면 특성 (다공성) 은 주사 전자 현미경 (SEM) 분석에 의해 확립될 수 있다.

기공 크기를 당업계에 공지된 방법에 의해 측정한다. 매크로포어를 수은 다공성측정을 사용해 측정할 수 있다. 이 경우에, 기공 크기의 분석 실험을 사용되는 수은 다공성측정 분석기 (예를 들면, AutoPore IV 9500, Micromeritics, USA) 의 프로토콜에 따라 수행한다. 폴리머 마이크로스피어의 직경 및 표면 특성을 주사 전자 현미경 (SEM) (JSM-6700F. JEOL, Japan) 에 의해 건조 후 관측하는 경우, 주사 전자 마이크로그래프 (SEM) 로부터 기공 치수를 또한 추정할 수 있다. 마이크로스피어를 증류수에 재현탁시키고, 분산물을 알루미늄 호일 조각 상에 적하하고, 주위 분위기에서 건조시킨다. 샘플을 이중-측면의 전도성 접착 테이프를 사용해 금속 스터브(stub) 상에 두고, JFC-1600 미세 코팅기 (JEOL, Japan) 를 사용해 5 Pa 미만의 감압 하에 얇은 금 필름으로 코팅한다.

메조포어의 기공 크기 및 이의 비표면적은 또한 질소 흡착/탈착 측정을 사용해 측정될 수 있으며 (BET-방법), 이는 하기 표준 프로토콜에 의해 수행된다. 상기 후자의 방법은 또한 BET 표면적의 측정에 사용될 수 있다.

실시예

베이스 비드:

폴리스티렌 기재 재료 (예컨대, P353, P374 및 P375) 의 합성

25.6 g 폴리비닐알코올 및 0.38 g SDS 를 614.2 g 물 중에 용해시켜 하기 현탁 중합을 위한 수상을 형성한다. 19.94 g 에틸비닐벤젠, 75g 디비닐벤젠, 41.57 g 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 90.24 g 톨루엔, 90.24 g 2-에틸-1-헥산올 및 0.96 g AIBN 의 균일 용액으로 유기상을 형성한다. 유기상을 반응기 용기의 수상에 첨가하고, 2 개의 상을 480 rpm 에서 교반기로 25℃ 에서 에멀션화하여 기대된 입자 크기 분포를 달성한다. 60 min 후에, 640 g 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 72℃ 까지 가열한다. 2 시간 동안 온도를 72℃ 로 유지한 후, 82℃ 로 증가시킨다. 혼합물을 82℃ 에서 추가적인 2 시간 동안 중합한다. 중합 후에, 현탁물을 필터 깔때기에서 여과하고, 입자를 60℃ 의 1.5 리터 물, 이후 60℃ 의 5 리터 메탄올, 5 리터의 톨루엔 및 2 리터의 메탄올 (40℃) 로 세정한다. 최종 생성물을 24 시간 동안 50℃ 및 50 mbar 에서 진공 오븐에서 건조시킨다. 건조 질량에 관한 수율은 정량적이다. 기대되는 입자 크기 분포에 따라, 최종 생성물을 최신식의 절차에 따라 시빙(sieving) 함으로써 분류한다.

실시예 1

상기 실험에서, 상이한 재료를 재조합 펩티드 - 인슐린 흡착에 대한 이의 능력에 대해 평가한다. 하기 실시예에서, 폴리스티렌 (PS) 입자 P00446 을, 흔히 사용되는 LiChroprep® RP-18 (113900, Merck Millipore) 비드 및 하나의 양이온 교환 재료 (예, Eshmuno® S, 120078, Merck Millipore) 와 비교하면서 순수한 인슐린의 포획에 사용한다 (A11382IM, life technologies). 100 μl 입자를 1 ml 의 50 mM 아세테이트 pH 4 로 세정한다. 나중에, 50 mM 아세테이트 pH 4 중 1 ml 의 5 mg/ml 인슐린 용액을 30 분 동안 25℃ 에서 흡착시켰다. 원심분리 후에, 상청액을 제거한다 (5 μl 를 5 μl 겔 적재 완충액 (NP0007, life technologies) 과 혼합하였음). 입자를 1 ml 50 mM 아세테이트 pH 4 로 세정하고, 2 개의 튜브로 분리한다. 원심분리 후에, 상청액을 제거한다. 흡착 후의 비드에 대해서는, 1 부의 입자를 500 μl 겔 적재 완충액에 재현탁시킨다. 그 밖의 부를 30 분 동안 25℃ 에서 용리시킨다 (각각 500 μl 의 50 mM 아세테이트, 40Vol% DPG, pH 4, Eshmuno® S 의 경우에는 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 8). 원심분리 후에, 상청액을 제거한다 (5 μl 를 5 μl 겔 적재 완충액과 혼합하였음). 입자를 500 μl 50 mM 아세테이트 pH 4 로 세정한다. 원심분리 후에, 상청액을 제거한다. 용리 후의 비드에 대해서는, 입자를 500 μl 겔 적재 완충액에 재현탁시킨다. 10분 동안 99℃ 에서 모든 샘플의 가열 후에, 각각 10 μl 의 상청액/용리액, 5 μl 의 비드-샘플을 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gel (NP0336, life technologies) 상에 적재한다. 겔을 200 V 상수에서 25 분 동안 작동시킨다. 순수로의 세정 후에, 이를 SimplyBlue™ SafeStain (LC6065, life technologies) 로 염색하고, 순수로 탈염시킨다.

도 1 에서 나타낸 바와 같이, 폴리스티렌 비드 P00446 은 거의 완전히 인슐린을 흡착하며, 이는 입자-현탁물 mL 당 50 mg 단백질의 정적 결합 커패서티에 상응한다. 40 Vol% 디프로필렌 글리콜은 유용한 탈착 용액이다. PS 입자의 신규 기술은 흔히 사용되는 양이온 교환 방법과 견줄만하다. 비교를 위해, LiChroprep® RP-18 (대안적 역상 재료로서) 은 제시된 조건 하에 인슐린을 흡착하지 못한다.

실시예 2

상기 실험에서, 상이한 재료를 미정제 인슐린 A 흡착에 대한 이의 능력에 대해 평가한다. 하기 실시예에서, 폴리스티렌 (PS) 입자 P00446 를 20% 에탄올 150mM NaCl 용액을 사용해 10mm 직경 12mm 길이의 컬럼에 팩킹한다. 팩킹된 컬럼을 1 ml/min 로 20 이상의 컬럼 부피로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 를 사용해 평형화한다. 미정제 인슐린 용액 A 를 pH 3.5 로 조정한다 (인슐린 농도~1.7g/L). 60 ml 의 수득한 용액을 1 ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 직접 적재하고, 통과 분획을 별개 플라스크로 수합한다. 적재 후에, 컬럼을 평형 용액을 사용해 10CV 로 세정한다. 포획된 미정제 인슐린의 용리를 1ml/min 로 30 CV 로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 중 50% 에탄올 0-100% 의 구배 용리를 사용해 수행한다 (도 2). 단편을 수합하고, 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 3).

도 3 에서 나타낸 바와 같이, 폴리스티렌 비드 P00446 은 거의 완전히 인슐린을 흡착하며, 이는 팩킹된 베드 mL 당 >80 mg 단백질의 결합 커패서티에 상응한다. 50 Vol% 에탄올은 유용한 탈착 용액인데 (예, 회수율 101.33%), 이는 집합체 및 표적 분자 분리를 위해 폴리스티렌 입자를 사용할 수 있다는 것으로, 미정제 인슐린 포획을 위한 이온 교환기의 사용을 넘긴다 (데이터는 나타나 있지 않음).

실시예 3

상기 실험에서, 디비닐벤젠 코폴리머로 가교된 폴리(에틸)스티렌 (m) (PS-DVB) 으로 이루어진 미립자 재료를 미정제 인슐린 B 의 흡착에 대한 이의 능력에 대해 평가한다. 하기 실시예에서, 폴리스티렌 (PS) 입자 P00446 을 20% 에탄올 150mM NaCl 용액을 사용해 10mm 직경 12mm 길이의 컬럼에 팩킹한다. 팩킹된 컬럼을 1 ml/min 로 20 이상의 컬럼 부피로 50mM TRIS, 100mM 아르기닌 완충액 pH 7.0 을 사용해 평형화한다. 대장균 발현 시스템 유래의 미정제 인슐린 용액 B 를 pH 3.5 로 조정하고, 30 ml 의 수득한 용액을 1 ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 직접 적재하고, 통과 분획을 별개 플라스크로 수합한다. 적재 후에, 컬럼을 평형 용액을 사용해 10CV 로 세정한다. 포획된 미정제 인슐린의 용리를 1ml/min 로 20 CV 로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 중 60% 디프로필렌글리콜 0-100% 의 구배 용리를 사용해 수행한다. 단편을 수합하고, 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 4).

도 4 에서 나타낸 바와 같이, 폴리스티렌 비드 P00446 은 미정제 용액으로부터 인슐린 (5% 순도) 을 흡착하고, 디프로필렌글리콜 용액을 적용해 인슐린 단편을 집합체로부터 분리할 수 있다 (표적물은 >40% 순도를 달성함).

실시예 4

상기 실험에서, 디비닐벤젠 코폴리머로 가교된 폴리(에틸)스티렌 (m) (PS-DVB) 로 이루어진 미립자 재료를 미정제 단백질 pSCP194 의 흡착에 대한 이의 능력에 대해 평가한다. 하기 실시예에서, 폴리스티렌 (PS) 입자 P00446 을 20% 에탄올 150mM NaCl 용액을 사용해 10mm 직경 12mm 길이의 컬럼에 팩킹한다. 팩킹된 컬럼을 1 ml/min 로 20 이상의 컬럼 부피로 50mM TRIS, 100mM 아르기닌 완충액 pH 7.0 을 사용해 평형화한다. 단백질 pSCP194 를 함유하는 미정제 대장균 용해물을 pH 7.0 로 조정하고, 20 ml 의 수득한 용액을 1 ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 직접 적재하고, 통과 분획을 별개 플라스크로 수합한다. 적재 후에, 컬럼을 평형 용액을 사용해 10CV 로 세정한다. 포획된 미정제 인슐린의 용리를 1ml/min 로 20 CV 로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 중 60% 디프로필렌글리콜 0-100% 의 구배 용리를 사용해 수행한다. 단편을 수합하고, 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 5).

도 5 에서 나타낸 바와 같이, 폴리스티렌 비드 P00446 은 미정제 대장균 용해 용액으로부터 pSCP194 단백질을 흡착하고, 디프로필렌글리콜 용액을 적용해 포획된 표적물 (>80% 순도 달성) 을 용리할 수 있다.

실시예 5

상기 실험에서, 각종 비로 디비닐벤젠 코폴리머 (PS-DVB) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (PS-DVB-EGDMA) 코폴리머로 이루어진 재료로 가교된 폴리(에틸)스티렌 (m) 으로 이루어진 미립자 재료를 우레아의 존재 하에 인슐린의 흡착에 대한 이의 능력에 대해 평가한다.

하기 실시예에서, 폴리스티렌 (PS) 입자 P00446 을 20% 에탄올 150mM NaCl 용액을 사용해 10mm 직경 12mm 길이의 컬럼에 팩킹한다. 팩킹된 컬럼을 1 ml/min 로 20 이상의 컬럼 부피로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 를 사용해 평형화한다. 8M 우레아 용액 중 인큐베이션 후에 집합화된 인슐린을 함유하는 미정제 인슐린 용액을 pH 3.5 로 조정된 순수를 사용해 2M 우레아 농도로 희석한다. 50 ml 의 수득한 용액을 1 ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 직접 적재하고, 통과 분획을 별개 플라스크로 수합한다. 적재 후에, 컬럼을 평형 용액을 사용해 10CV 로 세정한다. 포획된 미정제 인슐린의 용리를 1ml/min 로 20 CV 로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 중 60% 디프로필렌글리콜 0-100% 의 구배 용리를 사용해 수행한다. 단편을 수합하고, 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 6).

도 6 에서 나타낸 바와 같이, 폴리스티렌 비드 P00446 및 PS02 는 미정제 2M 우레아 함유 용액으로부터 인슐린을 흡착하고, 디프로필렌글리콜 용액을 적용해 포획된 표적물 (>90% 순도 달성) 을 용리할 수 있다 (단편 A3-A4 및 A11-A12).

실시예 6

상기 실험에서, 각종 비로 디비닐벤젠 코폴리머 (PS-DVB) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (PS-DVB-EGDMA) 코폴리머로 가교된 폴리(에틸)스티렌 (m) 으로 이루어진 미립자 재료를 수성 완충액 중 디프로필렌 글리콜 유기 용매 및 선형 용리 구배를 사용해 pH 3.5 에서 이의 집합체로부터 인슐린 정제에 대한 이의 능력에 대해 평가한다. 하기 실시예에서, 1ml 폴리스티렌 (PS) 입자 PP00446 을 컬럼 신장용 분쇄 비드를 사용해 10mm 직경 6.2 길이의 컬럼에 팩킹한다. 컬럼 팩킹을 위해, 20% 에탄올 150mM NaCl 을 준비한다. 팩킹된 컬럼을 1ml/min 로 20 컬럼 부피로 50mM 글리신/50mM 아세트산 pH 3.5 (평형 완충액) 를 사용해 평형화한다. 인슐린/집합체 용액을 아세트산을 첨가함으로써 pH 3.5 로 조정한다 (인슐린 농도: ~1.5mg/ml). 92ml 의 제조된 용액을 1ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 적재하고, 통과액을 플라스크로 수합한다. 달성된 적재 후에, 컬럼을 1ml/min 로 15 컬럼 부피로 평형 완충액으로 헹구어 미결합된 인슐린 분자를 세정해 낸다. 세정 단계 동안의 통과액을 제 2 플라스크로 수합한다. 이어서, 용리를 1ml/min 로 40 컬럼 부피로 50mM 글리신/50mM 아세트산 (용리 완충액) 중 50% 디프로필렌 글리콜 0-100% 의 선형 구배를 사용해 개시한다. 용리액을 분획 당 10ml 로 분획화한다. 도 7 은 인슐린/집합체 정제 동안 기록된 크로마토그램을 나타낸다. 수합된 단편을 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 8).

도 8 에서 나타낸 바와 같이, PP00446 수지는 인슐린/집합체 용액에 의해 과적재된다. PP00446 의 측정된 동적 결합 커패서티는 팩킹된 베드 mL 당 >80mg 단백질에 도달한다. 50 Vol% 디프로필렌 글리콜이 적합한 탈착 용액일 뿐만 아니라 (예, 회수율: 115%) 선형 구배 용리 동안 이의 집합체로부터 인슐린의 분리를 가능하게 함이 명백하다.

실시예 7

상기 실험에서, 각종 비로 디비닐벤젠 코폴리머 (PS-DVB) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (PS-DVB-EGDMA) 코폴리머로 가교된 폴리(에틸)스티렌 (m) 으로 이루어진 미립자 재료를 에탄올 및 선형 용리 구배를 사용해 pH 3.5 에서 이의 집합체로부터 인슐린 정제에 대한 이의 능력에 대해 평가한다.

하기 실시예에서, 1ml 폴리스티렌 (PS) 입자 PP00446 을 컬럼 신장용 분쇄 비드를 사용해 10mm 직경 6.2 길이의 컬럼에 팩킹한다. 컬럼 팩킹을 위해, 20% 에탄올 150mM NaCl 을 준비한다. 팩킹된 컬럼을 1ml/min 로 20 컬럼 부피로 50mM 글리신/50mM 아세트산 pH 3.5 (평형 완충액) 를 사용해 평형화한다. 인슐린/집합체 용액을 아세트산을 첨가함으로써 pH 3.5 로 조정한다 (인슐린 농도: ~2.0mg/ml). 50ml 의 제조된 용액을 1ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 적재하고, 통과액을 플라스크로 수합한다. 달성된 적재 후에, 컬럼을 1ml/min 로 15 컬럼 부피로 평형 완충액으로 헹구어 미결합된 인슐린 분자를 세정해 낸다. 세정 단계 동안의 통과액을 제 2 플라스크로 수합한다. 이어서, 용리를 1ml/min 로 40 컬럼 부피로 50mM 글리신/50mM 아세트산 (용리 완충액) 중 50% 에탄올 0-100% 의 선형 구배를 사용해 개시한다. 용리액을 분획 당 10ml 로 분획화한다. 도 3 은 인슐린/집합체 정제 동안 기록된 크로마토그램을 나타낸다. 수합된 단편을 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 9).

도 10 에서 나타낸 바와 같이, PP00446 수지는 인슐린/집합체 용액에 의해 과적재된다. PP00446 의 측정된 동적 결합 커패서티 (DBC) 는 팩킹된 베드 mL 당 >60mg 단백질에 도달한다. 그 결과는 50 Vol% 에탄올이 탈착 용액으로서 사용될 수 있는 것을 나타낸다 (회수율: 96%). 디프로필렌 글리콜을 사용한 비슷한 조건 하의 용리와 달리, 상기 실시예로부터의 정제는 보다 낮은 DBC, 뿐만 아니라 악화된 회수율을 초래한다.

실시예 8

상기 실험에서, 각종 비로 디비닐벤젠 (PS-DVB) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (PS-DVB-EGDMA) 코폴리머로 가교된 폴리(에틸)스티렌 (m) 으로 이루어진 미립자 재료를 디프로필렌 글리콜 및 선형 용리 구배를 사용해 pH 8.0 에서 이의 집합체로부터 인슐린 분리에 대한 이의 능력에 대해 평가한다.

하기 실시예에서, 1ml 폴리스티렌 (PS) 입자 PP00446 을 컬럼 신장용 분쇄 비드를 사용해 10mm 직경 6.2 길이의 컬럼에 팩킹한다. 컬럼 팩킹을 위해, 20% 에탄올 150mM NaCl 을 준비한다. 팩킹된 컬럼을 1ml/min 로 20 컬럼 부피로 50mM TRIS pH 8.0 (평형 완충액) 을 사용해 평형화한다. 인슐린/집합체 용액을 1M TRIS 를 첨가함으로써 pH 8.0 로 조정한다. 나아가, 인슐린/집합체 용액의 전도성을 1M NaCl 용액에 의해 ~20mS/cm 로 설정한다 (인슐린 농도: ~0.6mg/ml). 75ml 의 제조된 용액을 1ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 적재하고, 통과액을 플라스크로 수합한다. 달성된 적재 후에, 컬럼을 1ml/min 로 15 컬럼 부피로 평형 완충액으로 헹구어 미결합된 인슐린 분자를 세정해 낸다. 세정 단계 동안의 통과액을 제 2 플라스크로 수합한다. 이어서, 용리를 1ml/min 로 40 컬럼 부피로 50mM TRIS pH 8.0 (용리 완충액) 중 50% 디프로필렌 글리콜 0-100% 의 선형 구배를 사용해 개시한다. 용리액을 분획 당 10ml 로 분획화한다. 도 5 는 인슐린/집합체 정제 동안 기록된 크로마토그램을 나타낸다. 수합된 단편을 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 11).

도 12 에서 나타낸 바와 같이, PP00446 수지는 인슐린 및 이의 집합체를 거의 완전히 흡착하고, 팩킹된 베드 mL 당 >70mg 단백질의 동적 결합 커패서티에 도달한다. 게다가, 선형 구배의 적용으로, 용리는 집합체로부터 인슐린 정제를 유도하고 (E2, E3), 대부분의 집합체는 용리 완충액 농도 > 80% 에서 탈착된다.

실시예 9

상기 실험에서, 각종 비로 디비닐벤젠 (PS-DVB) 및 에틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트 (PS-DVB-EGDMA) 코폴리머로 가교된 폴리(에틸)스티렌 (m) 으로 이루어진 미립자 재료를 디프로필렌 글리콜 및 단계 용리를 사용해 pH 8.0 에서 이의 집합체로부터 인슐린 분리에 대한 이의 능력에 대해 평가한다.

하기 실시예에서, 1ml 폴리스티렌 (PS) 입자 PP00446 을 컬럼 신장용 분쇄 비드를 사용해 10mm 직경 6.2 길이의 컬럼에 팩킹한다. 컬럼 팩킹을 위해, 20% 에탄올 150mM NaCl 을 준비한다. 팩킹된 컬럼을 1ml/min 로 20 컬럼 부피로 50mM 글리신/50mM 아세트산 pH 3.5 (평형 완충액) 를 사용해 평형화한다. 인슐린/집합체 용액을 아세트산을 첨가함으로써 pH 3.5 로 조정한다 (인슐린 농도: ~1.8mg/ml). 50ml 의 제조된 용액을 1ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 적재하고, 통과액을 플라스크로 수합한다. 달성된 적재 후에, 컬럼을 1ml/min 로 15 컬럼 부피로 평형 완충액으로 헹구어 미결합된 인슐린을 세정한다. 세정 단계 동안의 통과액을 제 2 플라스크로 수합한다. 이어서, 용리를 1ml/min 로 용리 완충액으로서 50mM 글리신/50mM 아세트산 중 50% 디프로필렌 글리콜을 사용하는 단계 구배 (40 컬럼 부피에 대해서는 70%, 20 컬럼 부피에 대해서는 100%) 를 사용해 개시한다. 용리액을 분획 당 10ml 로 분획화한다. 도 7 은 인슐린/집합체 정제 동안 기록된 크로마토그램을 나타낸다. 수합된 단편을 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 13).

도 14 에서 나타낸 바와 같이, PP00446 수지는 인슐린 및 인슐린 집합체를 결합한다 (동적 결합 커패서티: >70mg/ml). 상기 실험에서, 회수율은 96% 를 달성한다. 게다가, SDS-PAGE 분석에 의해서 대부분의 인슐린 집합체는 용리 완충액 농도가 70% 초과인 경우 수지로부터 탈착된다는 것이 입증된다. 상기 특성은 활용가능한 단계 구배를 적용함으로써 인슐린 집합체 분리가 가능하다.

실시예 10

상기 실험에서, 디비닐벤젠 코폴리머로 가교된 폴리(에틸)스티렌 (m) (PS-DVB) 으로 이루어진 미립자 재료를 디프로필렌 글리콜 및 단계 용리를 사용해 pH 8.0 에서 인슐린으로부터 집합체 제거에 대한 이의 능력에 대해 평가한다.

하기 실시예에서, 1ml 폴리스티렌 (PS) 입자 PRLP-S 를 컬럼 신장용 분쇄 비드를 사용해 10mm 직경 6.2 길이의 컬럼에 팩킹한다. 컬럼 팩킹을 위해, 20% 에탄올 150mM NaCl 을 준비한다. 팩킹된 컬럼을 1ml/min 로 20 컬럼 부피로 50mM TRIS pH 8.0 (평형 완충액) 을 사용해 평형화한다. 인슐린/집합체 용액을 1M TRIS 를 첨가함으로써 pH 8.0 으로 조정한다. 나아가, 인슐린/집합체 용액의 전도성을 1M NaCl 용액에 의해 ~20mS/cm 로 설정한다 (인슐린 농도: ~1.6mg/ml). 50ml 의 제조된 용액을 1ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 적재하고, 통과액을 플라스크로 수합한다. 달성된 적재 후에, 컬럼을 1ml/min 로 15 컬럼 부피로 평형 완충액으로 헹구어 미결합된 인슐린을 세정한다. 세정 단계 동안의 통과액을 제 2 플라스크로 수합한다. 이어서, 용리를 1ml/min 로 용리 완충액으로서 50mM TRIS pH 8.0 중 50% 디프로필렌 글리콜을 사용하는 단계 구배 (40 컬럼 부피에 대해서는 70%, 20 컬럼 부피에 대해서는 100%) 를 사용해 개시한다. 용리액을 분획 당 10ml 로 분획화한다. 도 9 는 인슐린/집합체 정제 동안 기록된 크로마토그램을 나타낸다. 수합된 단편을 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 15).

도 16 에서 나타낸 바와 같이, PRLP-S 수지는 팩킹된 베드 mL 당 >60mg 단백질의 측정된 동적 결합 커패서티로 인슐린을 결합한다. 나아가, SDS-PAGE 분석은, 단지 인슐린 모노머가 70% 의 용리 완충액 농도로 수지로부터 탈착됨을 나타낸다 (E1-E4). 도 10 에서, 인슐린 집합체가 용리 완충액을 100% 로 증가시킴으로써 탈착된다는 것이 입증된다 (E5). 인슐린 집합체 분리를 위한 단계 용리 구배의 사용은 인슐린 정제 방법을 능률화한다.

인슐린 포획을 위한 폴리스티렌 입자의 적용

하기 실시예에서, 폴리스티렌 (PS) 입자 P00446 을, 흔히 사용되는 LiChroprep® RP-18 (113900, Merck Millipore) 비드 및 하나의 양이온 교환 재료 (예, Eshmuno® S, 120078, Merck Millipore) 와 비교하면서 순수한 인슐린의 포획에 사용한다 (A11382IM, life technologies).

100 μl 입자를 1 ml 의 50 mM 아세테이트 pH 4 로 세정한다. 나중에, 50 mM 아세테이트 pH 4 중 1 ml 의 5 mg/ml 인슐린 용액을 30 분 동안 25℃ 에서 흡착한다. 원심분리 후에, 상청액을 제거한다 (5 μl 를 5 μl 겔 적재 완충액 (NP0007, life technologies) 과 혼합함). 입자를 1 ml 50 mM 아세테이트 pH 4 로 세정하고, 2 개의 튜브로 분리한다. 원심분리 후에, 상청액을 제거한다. 흡착 후의 비드에 대해서는, 1 부의 입자를 500 μl 겔 적재 완충액에 재현탁시킨다. 그 밖의 부를 30 분 동안 25℃ 에서 용리시킨다 (각각 500 μl 의 50 mM 아세테이트, 40Vol% DPG, pH 4, Eshmuno® S 의 경우에는 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 8). 원심분리 후에, 상청액을 제거한다 (5 μl 를 5 μl 겔 적재 완충액과 혼합하였음). 입자를 500 μl 50 mM 아세테이트 pH 4 로 세정한다. 원심분리 후에, 상청액을 제거한다. 용리 후의 비드에 대해서는, 입자를 500 μl 겔 적재 완충액에 재현탁시킨다. 10 분 동안 99℃ 에서 모든 샘플의 가열 후에, 각각 10 μl 의 상청액/용리액, 5 μl 의 비드-샘플을 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gel (NP0336, life technologies) 상에 적재한다. 겔을 200 V 상수에서 25 분 동안 작동시킨다. 순수로의 세정 후에, 이를 SimplyBlue™ SafeStain (LC6065, life technologies) 로 염색하고, 순수로 탈염시킨다.

도 1 은 P00446, LiChroprep® RP-18 및 Eshmuno® S 에서의 정적 포획 인슐린의 비환원 SDS-PAGE 를 나타낸다.

조건:

1 ml 의 5 mg/ml 인슐린 및 50 mM 아세테이트 pH 4 의 혼합물을 100 μl 평형화된 입자에 첨가한다. 흡착을 30 분 동안 25℃ 의 온도에서 수행한다. 이어서, 용리를 30 분 동안 25℃ 의 온도에서 용리시킨다 (각각 500 μl 50 mM 아세테이트 및 40 Vol% DPG, pH 4, Eshmuno® S 의 경우에는 50 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 8).

레인: M… MW-마커

S… 스타트 재료

SA… 흡착 후의 상청액

BA… 흡착 후의 비드

E… 용리액

BE… 용리 후의 비드

도 1 에서 나타낸 바와 같이,

폴리스티렌 비드 P00446 은 인슐린을 거의 완전히 흡착하며, 이는 입자-현탁물 mL 당 50 mg 단백질의 정적 결합 커패서티에 상응한다. 40 Vol% 디프로필렌 글리콜은 유용한 탈착 용액이다. PS 입자의 신규 기술은 흔히 사용되는 양이온 교환 방법과 견줄만하다.

비교를 위해, LiChroprep® RP-18 (대안적 역상 재료로서) 은 제시된 조건 하에 인슐린을 흡착하지 못한다.

미정제 인슐린 A 의 포획을 위한 폴리스티렌 입자의 적용

하기 실시예에서, 폴리스티렌 (PS) 입자 P00446 을 20% 에탄올 150mM NaCl 용액을 사용해 10mm 직경 12mm 길이의 컬럼에 팩킹한다.

팩킹된 컬럼을 1 ml/min 로 20 이상의 컬럼 부피로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 를 사용해 평형화한다. 미정제 인슐린 용액 A 를 pH 3.5 로 조정한다 (인슐린 농도~1.7g/L). 60 ml 의 수득한 용액을 1 ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 직접 적재하고, 통과 분획을 별개 플라스크로 수합한다. 적재 후에, 컬럼을 평형 용액을 사용해 10CV 로 세정한다. 포획된 미정제 인슐린의 용리를 1ml/min 로 30 CV 로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 중 50% 에탄올 0-100% 의 구배 용리를 사용해 수행한다 (도 2). 단편을 수합하고, 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 3).

도 2 는 P00446 폴리스티렌 입자로부터 포획된 미정제 인슐린의 용리 피크를 나타낸다.

도 3 은 P00446 에서 동적 미정제 인슐린 포획의 비환원 SDS-PAGE 를 나타낸다.

도 3 에서 나타낸 바와 같이, 폴리스티렌 비드 P00446 은 인슐린을 거의 완전히 흡착하며, 이는 팩킹된 베드 mL 당 >80 mg 단백질의 결합 커패서티에 상응한다. 50 Vol% 에탄올은 유용한 탈착 용액인데 (예, 회수율 101.33%), 이는 집합체 및 표적 분자 분리를 위해 폴리스티렌 입자를 사용할 수 있다는 것으로, 미정제 인슐린 포획을 위한 이온 교환기의 사용을 넘긴다 (데이터는 나타나 있지 않음).

미정제 인슐린 B 의 포획을 위한 폴리스티렌 입자의 적용

팩킹된 컬럼을 1 ml/min 로 20 이상의 컬럼 부피로 50mM TRIS, 100mM 아르기닌 완충액 pH 7.0 을 사용해 평형화한다. 대장균 발현 시스템 유래의 미정제 인슐린 용액 B 를 pH 3.5 로 조정하고, 30 ml 의 수득한 용액을 1 ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 직접 적재하고, 통과 분획을 별개 플라스크로 수합한다. 적재 후에, 컬럼을 평형 용액을 사용해 10CV 로 세정한다. 포획된 미정제 인슐린의 용리를 1ml/min 로 20 CV 로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 중 60% 디프로필렌글리콜 0-100% 의 구배 용리를 사용해 수행한다. 단편을 수합하고, 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 4).

도 4 는 AKTA FPLC 시스템을 사용한 P00446 (컬럼 1.1 ml 직경 10 mm) 에서의 동적 포획 미가공 인슐린의 비환원 SDS-PAGE 를 나타낸다. 10 CV 로 25 mM Tris, 100 mM 아르기닌, pH 7 로 평형화한다. 30 ml 의 1 mg/ml 미가공 인슐린을 1 ml/min 유속으로 적재한다. 20 CV 로 0% 에서 100% 60 Vol.% DPG 까지 용리시킨다.

레인: M… MW-마커

S… 스타트 재료

FT… 통과액

도 4 에서 나타낸 바와 같이, 폴리스티렌 비드 P00446 은 미정제 용액으로부터 인슐린 (5% 순도) 을 흡착하고, 디프로필렌글리콜 용액을 적용해 집합체로부터 인슐린 단편을 분리할 수 있다 (표적물은 >40% 순도를 달성함).

미정제 단백질 pSCP194 의 포획을 위한 폴리스티렌 입자의 적용

팩킹된 컬럼을 1 ml/min 로 20 이상의 컬럼 부피로 50mM TRIS, 100mM 아르기닌 완충액 pH 7.0 을 사용해 평형화한다. 단백질 pSCP194 를 함유하는 미정제 대장균 용해물을 pH 7.0 로 조정하고, 20 ml 의 수득한 용액을 1 ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 직접 적재하고, 통과 분획을 별개 플라스크로 수합한다. 적재 후에, 컬럼을 평형 용액을 사용해 10CV 로 세정한다. 포획된 미정제 인슐린의 용리를 1ml/min 로 20 CV 로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 중 60% 디프로필렌글리콜 0-100% 의 구배 용리를 사용해 수행한다. 단편을 수합하고, 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 5).

도 5 는 P00446 (컬럼 1.1 ml 직경 10 mm) 에서의 동적 미정제 pSCP194 포획의 비환원 SDS-PAGE 를 나타낸다.

우레아 중 미정제 인슐린의 포획을 위한 폴리스티렌 입자의 적용

팩킹된 컬럼을 1 ml/min 로 20 이상의 컬럼 부피로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 를 사용해 평형화한다. 8M 우레아 용액 중 인큐베이션 후에 집합화된 인슐린을 함유하는 미정제 인슐린 용액을 pH 3.5 로 조정된 순수를 사용해 2M 우레아 농도로 희석한다. 50 ml 의 수득한 용액을 1 ml/min 로 평형화된 컬럼 상에 직접 적재하고, 통과 분획을 별개 플라스크로 수합한다. 적재 후에, 컬럼을 평형 용액을 사용해 10CV 로 세정한다. 포획된 미정제 인슐린의 용리를 1ml/min 로 20 CV 로 50mM 글리신/50mM 아세트산 완충액 pH 3.5 중 60% 디프로필렌글리콜 0-100% 의 구배 용리를 사용해 수행한다. 단편을 수합하고, 비환원 SDS-PAGE 분석에 적용한다 (도 6). 도 6 은 P00446 및 PS02 (컬럼 1.1 ml 직경 10 mm) 에서의 동적 미정제 인슐린 포획의 비환원 SDS-PAGE 를 나타내다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 표적 펩티드를 함유하는 용액으로부터의 펩티드 집합체 및 단편의 분리 방법:
(a) 표적 펩티드를 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 적합한 시간 동안 샘플을 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시키고, 펩티드를 흡착하는 단계,
(c) 상이한 용매 조성물의 사용으로 표적 펩티드를 회수함으로써,
표적 펩티드로부터 집합화된 펩티드 및 펩티드 단편을 분리하는 단계.
제 1 항에 있어서, 소수성 크로마토그래피 재료가 미립자이고, 비닐벤젠, 스티렌, 에틸스티렌, 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠, 및 폴리(에틸)스티렌-디비닐벤젠 에틸렌글리콜-디메틸아크릴레이트 수지 군으로부터 선택되는 가교된 폴리머로 제조되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 미립자 소수성 크로마토그래피 재료가, 스티렌 및 디비닐벤젠이 비 98 : 2 에서 10 : 90 중량% 이하로 이루어진 가교된 폴리머, 또는 디비닐벤젠 및 에틸렌글리콜디-메타크릴레이트의 코폴리머와 비 98 : 2 에서 10 : 90 중량% 이하로 가교된 폴리스티렌으로 구성된 수지인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 미립자 소수성 크로마토그래피 분리 재료가 10 μm 내지 600 μm 범위, 바람직하게는 20 μm 내지 150 μm 범위, 가장 바람직하게는 20 μm 내지 63 μm 범위의 평균 입자 직경을 갖는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 미립자 소수성 크로마토그래피 분리 재료가 4 - 500 nm 범위, 바람직하게는 10 - 30 nm 범위, 가장 바람직하게는 13 nm 내지 25 nm 범위의 기공 크기를 갖는 소수성 다공성 폴리머 비드로 이루어지는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 단계 b) 에서 pH 값이 2 - 11 범위, 바람직하게는 3 - 8 범위이고 전도성이 1 - 150 mS/cm 범위, 바람직하게는 2 - 50 mS/cm 범위인 표적 펩티드를 함유하는 수용액을 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시키는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 단계 b) 에서 소수성 크로마토그래피 재료를 팩킹된 베드(bed) mL 당 30-100 mg 의 표적 펩티드, 바람직하게는 팩킹된 베드 mL 당 50-80 mg 의 표적 펩티드에 150 - 1000 cm/min 범위, 바람직하게는 300 - 900 cm/min 범위의 유속으로 노출시키는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 단계 c) 에서 소수성 크로마토그래피 재료를 직접 또는 구배 방식으로 유기 용매를 포함하는 수용액에 노출시킴으로써 함유된 유기 용매의 농도에 따라 집합화 및 표적 펩티드 사이의 부분 분리를 달성하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 단계 c) 에서 결합된 성분의 선택적 탈착 및 분리를 수성 혼합물에 함유된 유기 용매의 각종 비를 사용해 달성하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 펩티드 집합체의 분리를 표적 분자 리폴딩(refolding) 단계 후에 처리하는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 적합한 시간 동안 샘플을 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시키고 펩티드를 흡착한 후에, 적재된 크로마토그래피 재료를 적합한 시간 동안 집합화된 물질 수준의 선택적 감소를 위해 펩티드 리폴딩 용액에 후-적용하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 분리 및 정제 순서가 이온 교환 수지를 사용한 처리를 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 분리 및 정제를 결합 및 용리 또는 통과 모드로 수행함으로써 유속을 150 cm/min - 1000 cm/min 범위, 특히 300 - 900cm/min 범위로 조정하는 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 단계 c) 에서 에탄올, 1-프로판올 및 디프로필렌글리콜 군으로부터 선택되는 유기 용매를 사용해 소수성 크로마토그래피 재료로부터 흡착된 물질을 선택적 탈착하는 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 단계 b) 에서 샘플을 1 내지 100 cm 범위, 바람직하게는 5 내지 50 cm 범위의 직경을 갖는 액체 크로마토그래피 컬럼에서 폴리머 비드 형태의 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시키고, 컬럼을 100 bar 이하의 압력, 바람직하게는 0.2 내지 80 bar 범위의 압력에서 작동시키는 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 샘플을 10 내지 50 cm 범위의 직경을 갖는 액체 크로마토그래피 컬럼에서 폴리머 비드 형태의 소수성 크로마토그래피 재료와 접촉시키고, 컬럼을 0.2 내지 80 bar 범위의 압력에서 작동시키는 방법.
제 1 항 내지 제 16 항 중 하나 이상의 항에 있어서, 단계 a) 에서 대장균(E. coli) 발현 시스템 유래의 미정제 인슐린 용액을 제공하는 방법.