WO2014038686A1 - 吸着体 - Google Patents

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WO2014038686A1
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adsorbent
beads
cellulose
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protein
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義和 河井
健一郎 森尾
史憲 鴻池
佳奈 渡邊
鈴木　康之
優 平野
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株式会社カネカ
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Definitions

  • the present invention relates to an adsorbent. Specifically, the present invention relates to an adsorbent using a porous cellulose bead obtained by a specific production method and having an excellent adsorption amount.
  • Adsorbents using porous cellulose beads are safer than other synthetic polymers, have less non-specific adsorption, can be used in a wide pH range, and are mechanical while being polysaccharides. There is an advantage of high strength. Examples of applications include various medical adsorbents, chromatographic adsorbents, and affinity adsorbents. In particular, affinity adsorbents have been used as medical adsorbents and adsorbents for purifying antibody pharmaceuticals because they can efficiently purify target substances or reduce the concentration of unwanted substances.
  • an adsorbent in which protein A is immobilized on a porous carrier as an affinity ligand has attracted attention
  • an adsorbent capable of specifically adsorbing and eluting immunoglobulin (IgG) an adsorbent (adsorbent for purifying antibody pharmaceuticals) in which protein A is immobilized on a porous carrier as an affinity ligand has attracted attention.
  • Adsorbents in which dextran sulfate is bound to porous cellulose beads for the treatment of high cholesterol plasma are commercially available (for example, Kaneka Liposorber).
  • the production of porous cellulose beads used for adsorbents has little corrosive and toxic properties such as calcium thiocyanate aqueous solution because there is almost no solvent that can dissolve the raw material cellulose powder. It is obtained by dissolving in a solvent and solidifying (for example, Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 3 a method for obtaining cellulose beads by dissolving cellulose in an ionic liquid is disclosed.
  • ionic liquids are quite expensive, and are unsuitable for use as an auxiliary material at the industrial level, and there are few toxicological data on the safety of ionic liquids that may remain even though they are in trace amounts. When it is used for the production of adsorbents for pharmaceutical purification, it is expected that considerable safety examination will be required.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and uses porous cellulose beads having high mechanical strength obtained by a simple method without using auxiliary materials having high toxicity and corrosivity.
  • An object of the present invention is to provide an adsorbent having a large adsorption amount.
  • the inventors of the present invention in the step of producing porous cellulose beads, in contact with the coagulation liquid in a state where the raw material cellulose powder is not completely dissolved in low-temperature alkali.
  • the adsorbent using the obtained porous cellulose beads was found to have a large amount of adsorption specifically, and the present invention was completed. That is, the adsorbent of the present invention is characterized by using porous cellulose beads obtained by bringing a cellulose dispersion prepared by mixing a low-temperature alkaline aqueous solution and raw cellulose powder into contact with a coagulation solvent.
  • the adsorbent according to the present invention preferably contains an affinity ligand.
  • the amount of affinity ligand introduced is, for example, from 1 mg to 500 mg per mL of the adsorbent.
  • the affinity ligand is preferably protein A.
  • the protein A has alkali resistance.
  • the protein A is an orientation control type.
  • 5% DBC of IgG when RT is 3 minutes is 60 g / L or more.
  • 5% DBC of IgG when RT is 6 minutes is 70 g / L or more.
  • the present invention also relates to an adsorbent comprising dextran sulfate as a ligand.
  • the adsorbed amount is preferably 7 g / L or more.
  • the low temperature is preferably 20 ° C. or lower.
  • the cellulose concentration in the cellulose dispersion is preferably 1 to 10% by weight, and the alkali concentration of the alkaline aqueous solution is preferably 5 to 15% by weight.
  • the present invention relates to a purification method using the adsorbent.
  • the present invention also relates to a treatment method using the adsorbent.
  • an adsorbent with high adsorption amount and high strength using porous cellulose obtained without using a complicated process which is industrially disadvantageous without using a toxic and corrosive auxiliary raw material. Can be obtained.
  • the adsorbent according to the present invention comprises a step of preparing a cellulose dispersion by mixing a low-temperature alkaline aqueous solution and raw cellulose powder, and porous cellulose beads obtained by bringing the cellulose dispersion into contact with a coagulation solvent It is characterized by using.
  • the adsorbent of the present invention is not particularly limited as long as it can use the function of adsorbing or eluting (dissociating) a target molecule (target product), but can fully utilize the characteristics that can be used in a wide pH range. It can be preferably used for affinity chromatography.
  • an affinity ligand that specifically binds to the target substance to be adsorbed can be introduced into the porous cellulose beads.
  • the introduction amount of the affinity ligand of the present invention is preferably from 1 mg to 500 mg per mL of the adsorbent. If the amount of affinity ligand introduced is 1 mg or more per 1 mL of the adsorbent, the amount adsorbed to the target product is preferably increased, and if it is 500 mg or less, the production cost can be suppressed.
  • a more preferable affinity ligand introduction amount is 2 mg or more and 120 mg or less, more preferably 3 mg or more and 60 mg or less, particularly preferably 4 mg or more and 30 mg or less, and most preferably 4 mg or more and 15 mg or less per 1 mL of the adsorbent.
  • the amount of ligand introduced per 1 mL of the adsorbent may be, for example, 10 mg to 80 mg, preferably 20 mg to 50 mg.
  • a more preferable affinity ligand introduction amount is 0.03 ⁇ mol or more and 5 ⁇ mol or less, more preferably 0.05 ⁇ mol or more and 2 ⁇ mol or less, particularly preferably 0.1 ⁇ mol or more and 0.75 ⁇ mol or less, most preferably per 1 mL of the adsorbent. Is 0.1 ⁇ mol or more and 0.5 ⁇ mol or less.
  • the amount of affinity ligand introduced can be determined by a method such as measuring the absorbance derived from the affinity ligand in the supernatant of the reaction solution after the immobilization reaction or the BCA method (ANALYTICALANABIOCHEMISTRY 191, 343-346 (1990)). .
  • the amount of affinity ligand introduced can be determined by analyzing the N content of the adsorbent.
  • affinity ligands for use in therapeutic (medical) adsorbents or antibody drug purification adsorbents antigens that are highly specific for antibodies, proteins such as protein A, protein G, and L, and variants thereof, Examples include peptides having antibody binding activity.
  • an adsorbent capable of specifically adsorbing and eluting immunoglobulin (IgG) and the like an adsorbent in which protein A is immobilized on a carrier as an affinity ligand has attracted attention.
  • Adsorbents on which protein A is immobilized are attracting attention as adsorbents for the treatment of rheumatism, hemophilia and dilated cardiomyopathy.
  • the adsorbent of the present invention is preferably an adsorbent into which protein A is introduced as an affinity ligand.
  • Protein A that can be used in the present invention is not particularly limited, and natural products, genetically modified products, and the like can be used without limitation. Further, it may be an antibody binding domain and a variant thereof, a fusion protein, or the like.
  • molecular weight fractionation and fractionation using various chromatographic and membrane separation techniques such as ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, and hydroxyapatite chromatography from bacterial cell extracts or culture supernatants. Protein A produced by combining and / or repeating purification methods selected from techniques such as fractional precipitation can also be used.
  • protein A obtained by the method described in International Patent Publication WO2006 / 004067 and US Patent Publication US515151350 can be preferably used.
  • the adsorbent not only has a large amount of adsorption, but also requires various characteristics depending on the application. For example, in purification applications, it is necessary to recover the target product at a high concentration. Generally called a recovery process or an elution process, a characteristic required for the ligand in this process is that the target substance is easily dissociated.
  • a characteristic required for the ligand in this process is that the target substance is easily dissociated.
  • protein A is used as a ligand
  • the characteristic that the antibody is easily dissociated in the recovery step is preferable, and it can be suitably used in the present invention.
  • An example is protein A described in WO2011 / 118699.
  • the adsorbent is often reused, and in order to reuse, it is necessary to perform a cleaning process or a regeneration process.
  • a solution containing urea, guanidine, or the like is used. However, since the preparation of the solution is complicated, a method of washing and regenerating with an
  • an alkali-resistant ligand can be preferably used.
  • protein A having alkali resistance can be preferably used.
  • An example is protein A described in WO2011 / 118699.
  • the protein A is preferably an orientation control type.
  • the orientation control type refers to those having a sequence that facilitates the binding of the end portion of protein A and the beads when immobilized on cellulose beads.
  • the orientation-controlled protein A has amino acid substitutions in all Lys (lysine residues) of the amino acid sequence derived from any one of the E, D, A, B, and C domains of protein A. It is desirable to have an amino acid sequence into which a mutation has been introduced and a sequence to which Lys is added at the end.
  • the amount of the active group of the beads for immobilizing the ligand is preferably 1 ⁇ mol or more per 1 mL of the beads.
  • the inactivation process after ligand fixation will become complicated if there are too many amounts of active groups, it is preferable that it is 500 micromol or less per mL of beads.
  • the amount of active groups is more preferably 5 ⁇ mol or more and 250 ⁇ mol or less, more preferably 10 ⁇ mol or more and 125 ⁇ mol or less, particularly preferably 20 ⁇ mol or more and 60 ⁇ mol or less, and most preferably 30 ⁇ mol or more and 50 ⁇ mol or less.
  • the active group on the bead is preferably a formyl group from the viewpoint that a ligand can be easily bonded or a compound having an active group can be bonded to easily provide many active groups.
  • the adsorption amount of the target product of the adsorbent of the present invention can be determined by a method of measuring 5% dynamic binding capacity (DBC) in a state where the adsorbent is packed in the column.
  • DBC dynamic binding capacity
  • the amount of adsorption of the target product is preferably 1 g or more per liter of the adsorbent when the adsorption treatment is performed for 3 minutes of residence time (residence time, hereinafter abbreviated as RT). If the amount of adsorption of the target product is 1 g or more per liter of the adsorbent, it is preferable because purification can be performed efficiently. Moreover, if the adsorption amount of the target object is 200 g or less per liter of the adsorbent, the adsorbed target object is easily eluted from the adsorbent.
  • the adsorption amount of the target product by the adsorbent is 10 g or more and 150 g or less per liter of the adsorbent, more preferably 30 g or more and 100 g or less, particularly preferably 50 g or more and 90 g or less, and most preferably 60 g or more and 80 g. It is as follows.
  • the amount of adsorption of the target product is preferably 20 g or more and 200 g or less per liter of the adsorbent, more preferably 40 g or more and 150 g or less, particularly preferably 60 g or more and 100 g or less, and most preferably It is 70 g or more and 90 g or less.
  • Dextran sulfate can be preferably used as another ligand of the adsorbent of the present invention.
  • an adsorbent suitable for various ion exchange chromatography can be obtained. It is also suitable as an adsorbent that adsorbs LDL cholesterol, and can also be used as a medical adsorbent that adsorbs and removes LDL cholesterol.
  • the amount of LDL cholesterol adsorbed is preferably from 1 g to 50 g per liter of the adsorbent. If it is 1 g or more, a suitable treatment can be performed when used for a therapeutic adsorbent. If it is 50 g or less, the side effect by the rapid fall of LDL cholesterol can be suppressed. More preferably, it is 2 to 20 g, particularly preferably 4 to 15 g, and most preferably 6 to 10 g.
  • low temperature refers to a temperature lower than normal temperature. If the temperature is lower than normal temperature, there is no major problem, but if it is -20 ° C or higher, it is preferable because the temperature control equipment is simple and the running cost is low. Moreover, if it is 10 degrees C or less, since coloring of a cellulose dispersion liquid decreases and the dispersibility and swelling property of a cellulose become high, it is preferable.
  • the temperature is preferably ⁇ 10 ° C. or higher and 20 ° C. or lower. If it is ⁇ 10 ° C. or higher, freezing of the alkaline aqueous solution can be suppressed.
  • a cellulose dispersion liquid can be prepared efficiently and coloring of a cellulose dispersion liquid can be suppressed.
  • the temperature is preferably ⁇ 5 ° C. or higher, more preferably ⁇ 2 ° C. or higher, particularly preferably ⁇ 1 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or lower, further preferably 9 ° C. or lower, and further preferably 5 ° C. or lower. It is preferably 4 ° C. or lower, more preferably 1 ° C. or lower.
  • the said temperature is 9 degrees C or less, since the sphericity of the obtained porous cellulose bead becomes high, it is preferable.
  • Alkali can be used without particular limitation as long as it shows alkalinity when it becomes an aqueous solution.
  • Lithium hydroxide, sodium hydroxide and potassium hydroxide are preferable from the viewpoint of availability, and sodium hydroxide is most preferable from the viewpoint of product safety and price.
  • the alkali concentration of the alkaline aqueous solution is not particularly limited, but is preferably 3 to 20% by weight. If the alkali concentration is within this range, the dispersibility / swellability of cellulose in an alkaline aqueous solution is increased, which is preferable.
  • the concentration of alkali is more preferably 5 to 15% by weight, further preferably 7 to 10% by weight, and most preferably 8 to 10% by weight.
  • the type of the raw material cellulose powder is not particularly limited.
  • substituted cellulose such as cellulose introduced with a substituent for improving solubility
  • ordinary non-substituted cellulose powder is used as a raw material. be able to.
  • the molecular weight of the raw material cellulose is not particularly limited, but the degree of polymerization is preferably 1000 or less. When the degree of polymerization is 1000 or less, the dispersibility / swellability in an aqueous alkali solution is increased, which is preferable. Moreover, since the mechanical strength of the obtained porous cellulose bead will become large if a polymerization degree is 10 or more, it is preferable.
  • a more preferable range of the polymerization degree is 50 or more and 500 or less, more preferably 100 or more and 400 or less, particularly preferably 200 or more and 350 or less, and most preferably 250 or more and 350 or less.
  • the raw material cellulose powder those having a median particle size of 10 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less are preferably used.
  • the method of the present invention it is not necessary to dissolve the cellulose, so there is no need to grind the raw material cellulose powder by a special method in order to improve the solubility.
  • the raw material cellulose powder is excessively pulverized, the overall production efficiency is lowered. That is, conventionally, raw material cellulose powder has been extremely refined by blasting or wet pulverization in order to dissolve cellulose in a low-temperature alkaline aqueous solution. However, these treatments increase the production cost. Therefore, the median particle size of the raw cellulose powder is preferably 10 ⁇ m or more.
  • the median particle size is 10 ⁇ m or more, there is an effect that it is difficult to generate lumps in the cellulose dispersion.
  • the median particle size is 500 ⁇ m.
  • the median particle size is more preferably 15 ⁇ m or more, further preferably 20 ⁇ m or more, particularly preferably 45 ⁇ m or more, and further preferably 200 ⁇ m or less. It is also a preferred embodiment that the median particle size of the raw material cellulose powder is, for example, 5 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, particularly 10 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • examples of the raw material cellulose having improved solubility include dissolved pulp.
  • Dissolving pulp can not be denied that it is a raw material suitable for producing the cellulose dispersion, but as is conventionally known, in order to obtain dissolving pulp, there are many cases that adopt a manufacturing method with a large environmental load, At present, the present inventors have come to know that this is a raw material that is very difficult to obtain as a raw material for producing porous cellulose beads because of structural problems in the cellulose-related industry. In the method of the present invention, porous cellulose beads can be produced satisfactorily without using dissolving pulp.
  • the porous cellulose beads used in the present invention it is preferable to use cellulose that is generally easily available from the viewpoint of the overall production cost and production efficiency.
  • the mixing conditions of the alkaline aqueous solution and the raw material cellulose powder There are no particular limitations on the mixing conditions of the alkaline aqueous solution and the raw material cellulose powder.
  • the raw material cellulose powder may be added to the alkaline aqueous solution, or the alkaline aqueous solution may be added to the raw cellulose powder. It is preferable to add the raw material cellulose powder after adjusting the aqueous alkali solution to a low temperature in advance.
  • the raw material cellulose powder may be suspended in water before mixing with the alkaline aqueous solution. Thereby, generation
  • the ratio of cellulose in the suspension may be adjusted as appropriate, and may be, for example, 1% by weight or more and 40% by weight or less.
  • the temperature of the raw cellulose powder or the suspension of the raw cellulose powder Before mixing with the alkaline aqueous solution, it is also preferable to adjust the temperature of the raw cellulose powder or the suspension of the raw cellulose powder to a low temperature similarly to the alkaline aqueous solution. At this time, the temperature of the aqueous alkali solution and the raw material cellulose powder or the suspension of the raw material cellulose powder may not be the same temperature.
  • the aqueous alkali solution to which the raw material cellulose or the raw material cellulose powder suspension is added and the raw cellulose powder suspension to which the aqueous alkaline solution is added be stirred.
  • the stirring power Pv value at this time is preferably 0.01 kW / m 3 or more and 100 kW / m 3 or less. If the stirring power is 0.01 kW / m 3 or more, both can be efficiently mixed. Further, if the stirring power is excessively high, it may be difficult to mix, and therefore the stirring power is preferably 100 kW / m 3 or less.
  • the present inventors have found that when a raw cellulose powder is suspended in water and adjusted to a low temperature and then an aqueous alkali solution is added with stirring, a uniform cellulose dispersion can be instantaneously prepared.
  • this method can be preferably used.
  • the aqueous alkali solution to be added has a low temperature. It is preferable to keep it at a low temperature during the preparation and storage of the cellulose dispersion.
  • the said temperature can be made to be the same as the temperature demonstrated with aqueous alkali solution.
  • the cellulose concentration in the cellulose dispersion is preferably 1 to 10% by weight. If it is 1% by weight or more, the mechanical strength of the resulting porous beads is preferably increased, and if it is 10% by weight or less, the viscosity of the cellulose dispersion is low, and the portion that cannot be dispersed / swelled is reduced. preferable. More preferred is 3 to 10% by weight, still more preferred is 4 to 8% by weight, particularly preferred is 5 to 7% by weight, and most preferred is 5 to 6% by weight.
  • the cellulose concentration in this cellulose dispersion does not include the amount that cannot be dispersed and swollen and has not become uniform.
  • Emulsion Preparation Step After preparing an emulsion by dispersing a cellulose dispersion in a dispersion medium, the emulsion may be contacted with a coagulation solvent. Preparation of such an emulsion is optional, but through this process, it becomes easier to obtain porous cellulose beads from a cellulose dispersion having a relatively high cellulose content, and porous cellulose beads having high mechanical strength can be obtained. It becomes easy to be done.
  • dispersion medium any dispersion medium having low compatibility with the cellulose dispersion can be suitably used.
  • edible oils such as medium chain fatty acid triglycerides (MCT); natural oils such as palm oil, coconut oil and squalane; higher alcohols such as isostearyl alcohol and oleyl alcohol; higher esters such as 2-octyldodecanol; dichlorobenzene and the like
  • MCT medium chain fatty acid triglycerides
  • natural oils such as palm oil, coconut oil and squalane
  • higher alcohols such as isostearyl alcohol and oleyl alcohol
  • higher esters such as 2-octyldodecanol
  • a surfactant such as sorbitan fatty acid ester such as sorbitan laurate, sorbitan stearate, sorbitan oleate, sorbitan trioleate may be added to the dispersion medium.
  • the amount of the dispersion medium used may be an amount that can sufficiently disperse the droplets of the cellulose dispersion. For example, it can be 1 mass times or more with respect to the cellulose dispersion. On the other hand, if the amount of the dispersion medium is too large, the amount of waste liquid may increase excessively, and the ratio is preferably 10 times by mass or less. The ratio is more preferably 2 times by mass or more, more preferably 4 times by mass or more, more preferably 8 times by mass or less, still more preferably 7 times by mass or less, and particularly preferably 6 times by mass or less.
  • the temperature during dispersion is preferably adjusted to be the same as that of the cellulose dispersion. That is, it is preferable that the temperature of the dispersion medium, the temperature at the time of mixing the dispersion medium and the cellulose dispersion, and the temperature at the time of dispersing the cellulose dispersion in the dispersion medium are low as in the case of the alkaline aqueous solution.
  • the stirring power Pv value at this time is preferably 0.1 kW / m 3 or more and 12 kW / m 3 or less. If the stirring power is 0.1 kW / m 3 or more, good sphericity and pore characteristics can be easily obtained. In addition, if the stirring power is excessively high, the flow state of the emulsion may be difficult to stabilize. Therefore, the stirring power is preferably 12 kW / m 3 or less. As the agitation power, more preferably 1.1 kW / m 3 or more, more preferably 3.1 kW / m 3 or more, 5.5 kW / m 3 or more is particularly preferable.
  • the cellulose is made porous by bringing the cellulose dispersion into contact with a coagulation solvent.
  • any coagulation solvent can be suitably used as long as the cellulose beads can be obtained by contact with the cellulose dispersion.
  • water and alcohol have high affinity with an alkaline aqueous solution that is a good solvent for the cellulose dispersion, and can be suitably used.
  • the use of alcohol is preferable because the pores of the cellulose beads can be made smaller than when water is used.
  • it is preferable to use alcohol because the sphericity is improved.
  • the alcohol that can be used in the present invention is not particularly limited, but an alcohol having 6 or less carbon atoms is preferable because of its high affinity with an alkaline aqueous solution, more preferably 4 or less carbon atoms, and most preferably methanol.
  • the coagulation solvent may be an aqueous alcohol solution.
  • the coagulation solvent is preferably acidic. If the coagulation solvent is acidic, it is preferable because the aqueous alkali solution can be neutralized. If this neutralization can be performed quickly, chemical damage to the resulting cellulose beads is reduced, which is preferable. Surprisingly, the inventors have found that by making the coagulation solvent acidic, the pore size distribution of the resulting porous beads is narrowed, and when such pore size characteristics are desired. It is particularly preferable to keep the coagulation solvent acidic.
  • the chemicals used for acidification there are no particular restrictions on the chemicals used for acidification, and they can be used widely, including inorganic acids such as sulfuric acid and hydrochloric acid, organic acids such as acetic acid, citric acid, and tartaric acid, and those that have a buffering effect such as phosphoric acid and carbonic acid. Can do.
  • the coagulation solvent is acidic means that the pH of the coagulation solvent is less than 7.0.
  • the pH is preferably 5.0 or less, more preferably 4.0 or less, still more preferably 3.0 or less, and particularly preferably 2.0 or less.
  • the lower limit of the pH is not particularly limited, but is preferably 0.0 or more.
  • the amount of coagulation solvent used is not particularly limited and may be adjusted as appropriate. For example, it can be about 0.001 volume or more and 100 volume or less with respect to the cellulose dispersion. Moreover, with respect to an emulsion, it can be about 0.01 times volume or more and 10 times volume or less. Within these ranges, it is easy to obtain porous cellulose beads. In addition, good pores and surface pores are easily obtained.
  • the use amount of the coagulation solvent is more preferably 0.025 times volume or more, more preferably 0.05 times volume or more, particularly preferably 0.07 times volume or more, and 0.4 times volume or less with respect to the emulsion. Is more preferable, 0.2 volume or less is further preferable, and 0.15 volume or less is particularly preferable. The amount used is considerably smaller than the amount of coagulation solvent that is usually considered, but in this method, porous cellulose beads can be obtained well even if the amount of coagulation solvent is reduced.
  • the temperature of the coagulation solvent is not particularly limited, but when the cellulose dispersion freezes in the coagulation solvent and then melts, the cellulose beads are not deformed or the cellulose is easily crushed, so the cellulose dispersion does not freeze. Temperature is preferred. Moreover, it is preferable that the temperature of a coagulation solvent is more than the temperature of the said cellulose dispersion liquid. Usually, the coagulation solvent is at a lower temperature than the cellulose dispersion due to the effect of increasing the coagulation rate, etc., but the present inventors surprisingly, the temperature of the coagulation solvent is more than the temperature of the cellulose dispersion, It was found that coagulation progresses quickly.
  • the specific temperature is not particularly limited, but the temperature of the coagulation solvent is preferably 0 ° C. or higher and 150 ° C. or lower, more preferably 25 ° C. or higher and 100 ° C. or lower, more preferably 45 ° C. or higher and 80 ° C. Although it is below, it is preferable to adjust appropriately in view of the boiling point of the coagulation solvent and the like.
  • the temperature of a cellulose dispersion shall say the temperature of an emulsion, when using an emulsion. It is also a preferred embodiment that the temperature of the coagulation solvent is, for example, 0 ° C. or higher and 10 ° C. or lower, particularly 2 ° C. or higher and 6 ° C. or lower.
  • the crosslinking method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • the cross-linking agent include halohydrins such as epichlorohydrin, epibromohydrin, dichlorohydrin; bifunctional bisepoxides (bisoxiranes); polyfunctional polyepoxides (polyoxiranes).
  • halohydrins such as epichlorohydrin, epibromohydrin, dichlorohydrin
  • bifunctional bisepoxides bisoxiranes
  • polyfunctional polyepoxides polyoxiranes
  • a stirring operation In the cellulose dispersion preparation process, the emulsion preparation process and the coagulation process, it is preferable to use a stirring operation.
  • a stirring blade A paddle blade and a turbine blade can be mentioned.
  • inclined paddle blades, inclined paddle blades, disc turbine blades, and the like can be suitably used.
  • the porous cellulose beads obtained as described above preferably have a pore structure that exhibits excellent IgG binding properties when an affinity ligand such as protein A is immobilized.
  • the IgG accessible specific surface area is, for example, about 1 ⁇ 10 7 to 30 ⁇ 10 7 m 2 / m 3 , preferably 3 ⁇ 10 7 to 20 ⁇ 10 7 m 2 / m 3 , more preferably 5 ⁇ 10 7 to 15 ⁇ 10 7 m 2 / m 3 .
  • the porous cellulose beads with enhanced IgG binding have a theoretical IgG saturated adsorption amount of, for example, 50 to 200 g / L, preferably 60 to 150 g / L, more preferably 70 to 120 g / L.
  • Test Example 1 SEM Observation of Bead Surface
  • the porous cellulose beads or adsorbents obtained in each production example and reference example were washed with 5 times volume of 30% ethanol, and 30 parts of the liquid contained in the porous cellulose beads were washed. Replaced with% ethanol. Subsequently, the porous cellulose beads were similarly treated using 50% ethanol, 70% ethanol, 90% ethanol, special grade ethanol, special grade ethanol, and special grade ethanol in this order, and the liquid portion was replaced with ethanol. Further, the porous cellulose beads were treated in the same manner using a mixed solution of t-butyl alcohol / ethanol 3/7.
  • the porous cellulose beads that had been freeze-dried were subjected to vapor deposition treatment, and SEM images were taken.
  • Test Example 2 Measurement of exclusion limit molecular weight and maximum pore diameter (1) Column packing Porous cellulose beads or adsorbents were dispersed in RO water and deaerated for 1 hour. The degassed porous cellulose beads or adsorbent were packed in a column (Tricorn 10/300 manufactured by GE Healthcare Japan) at a linear speed of 105 cm / h. Thereafter, an eluate having a pH of 7.5 (129 mL) was passed through the column at a linear velocity of 26 cm / h.
  • Test Example 3 Calculation of Average Pore Diameter
  • the molecular weight corresponding to the maximum K av / 2 of the portion showing linearity is expressed as a correlation equation between the diameter of the globular protein in the neutral buffer and the molecular weight. The value obtained by substitution was used as the average diameter of the pores of the porous cellulose beads or the adsorbent.
  • Test Example 2 and Test Example 3 when measuring the K av of the adsorbent with respect to the target adsorbent, the target adsorbent is adsorbed and there is a possibility that accurate measurement cannot be performed.
  • the K av of the adsorbent with respect to the target adsorbed substance was obtained by calculating the K av of two or more proteins having molecular weights close to that of the target adsorbed substance and calculating the data.
  • K av was obtained from ferritin and albumin data.
  • Test Example 4 Calculation of IgG Accessible Specific Surface Area (hereinafter, also simply referred to as “specific surface area”) Assuming that the pore structure of the porous cellulose beads is a cylindrical pore corresponding to the diameter of each marker molecule, the IgG accessible specific surface area was calculated.
  • the molecular weight of IgG from the exclusion limit molecular weight (this test)
  • a straight line obtained by plotting the Kav and the pore diameter up to 146,000 was obtained. This straight line is arbitrarily divided, and the wall area of the cylindrical pore of each section is obtained from each section Kav (considered as the cylindrical pore volume of each section), and this is accumulated up to the point corresponding to IgG to obtain an IgG accessible ratio. Surface area.
  • Test Example 6 Measurement of Median Particle Size Using a laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer (LA-950, manufactured by Horiba), the volume-based particle size distribution of porous cellulose beads was measured to determine the median particle size. .
  • LA-950 laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer
  • Test Example 7 Strength Evaluation Using AKTA explorer 10S (manufactured by GE Healthcare Bioscience), a 22 ⁇ m mesh was attached to a column with a diameter of 0.5 cm and a height of 15 cm, and 3 mL of each of porous cellulose beads or adsorbent was added to the linear velocity. A 20% aqueous ethanol solution (prepared with ethanol and distilled water manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was passed at 450 cm / h for 1 hour and filled. Next, pH 7.4 phosphate buffer (manufactured by Sigma) was passed at an arbitrary linear velocity, and the linear velocity at which consolidation occurred was determined and evaluated for strength.
  • AKTA explorer 10S manufactured by GE Healthcare Bioscience
  • Test Example 8 Dynamic adsorption amount (DBC) measurement at RT 3 minutes (1) Solution preparation The following solutions were prepared. Liquid A: pH 7.4 phosphate buffer (manufactured by Sigma) Solution B: 35 mM sodium acetate at pH 3.5M (prepared with acetic acid, sodium acetate, RO water manufactured by Nacalai Tesque) Liquid C: 1M acetic acid (prepared with acetic acid and RO water manufactured by Nacalai Tesque) D liquid: 1 mg / mL human polyclonal IgG solution (prepared with 1500 mg / 10 mL gamma globulin NICHIYAKU manufactured by NICHIYAKU and A liquid) Liquid E: 6M urea (prepared with urea and RO water manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) Each solution was degassed before use.
  • Liquid A pH 7.4 phosphate buffer (manufactured by Sigma)
  • Solution B 35 mM sodium acetate at pH 3.5M (prepared
  • AKTAexplorer 100 manufactured by GE Healthcare Bioscience
  • a 22 ⁇ m mesh was attached to a column having a diameter of 0.5 cm and a height of 15 cm, and the adsorbent of the present invention was attached.
  • 3 mL of each was added and filled with a 20% ethanol aqueous solution (adjusted with ethanol and RO water manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 1 hour at a linear velocity of 450 cm / h.
  • a 15 ml collection tube was set in the fraction collector.
  • a neutralizing solution was put in advance in a tube for collecting the eluate.
  • Test Example 9 Dynamic Adsorption Amount Measurement at RT 6 Minutes The linear velocity in Test Example 8 (3) was determined as 150 cm / h.
  • Test Example 10 Dynamic adsorption amount measurement at RT 9 minutes The linear velocity in (3) of Test Example 8 was determined as 100 cm / h.
  • Epoxidized porous cellulose beads were suction filtered (suction dry) for 15 minutes on a glass filter (3G-2 manufactured by TOP), and 1.5 g of the porous carrier after suction drying was screwed ( Was added to a 1.3M sodium thiosulfate aqueous solution (adjusted with sodium thiosulfate and RO water manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After heating at 45 ° C for 30 minutes, add RO water to make the volume 50 mL, transfer to a 100 mL glass beaker, 1% phenolphthalein solution (adjusted with phenolphthalein and ethanol manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) A few drops of were added. Titration was carried out with 0.01N hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for volumetric analysis) to determine the epoxy group content.
  • Test Example 12 Determination of Dextran Sulfate Introduced Amount Dextran sulfate and toluidine blue were measured using the affinity. That is, 120 mL of an aqueous solution of Basic Blue 17 (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) adjusted to about 90 mg / L was added to 1 mL of adsorbent, stirred for 10 minutes, allowed to stand for 60 minutes, and then the basic blue of the supernatant was absorbed at 630 nm. And determined from the amount of decrease.
  • Basic Blue 17 manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Production Example 1 (1) Preparation of Alkaline Aqueous Solution A A 33% by weight aqueous sodium hydroxide solution was prepared using sodium hydroxide and distilled water manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and adjusted to 4 ° C. (2) Preparation of Cellulose Dispersion A A mixture of 9.2 parts by weight of Asahi Kasei Chemicals Pharmacopoeia cellulose PH-F20JP (median particle size: 21 ⁇ m) and 104 parts by weight of distilled water was adjusted to 4 ° C. with stirring. Next, 40 parts by weight of alkaline aqueous solution A adjusted to 4 ° C. while maintaining the set temperature and stirring was added and stirred for 30 minutes.
  • the time required for adding the coagulation solvent was 2 seconds. Then, it stirred for 20 minutes, maintaining the number of stirring and preset temperature. After performing suction filtration, washing was performed using 240 parts by weight of ethanol, and then washing with 500 parts by weight of water to obtain porous cellulose beads. As shown in FIG. 1, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. The obtained porous cellulose beads were wet classified using 38 ⁇ m and 90 ⁇ m sieves. (4) Crosslinking-Method A (Reference method of JP2008-279366) Distilled water was added to 11 parts by volume of the porous cellulose beads to make 16.5 parts by volume and transferred to a reaction vessel.
  • the obtained cross-linked beads were transferred to a container, distilled water was added to make the total volume 10 times the volume of the cross-linked porous beads, and the mixture was heated at 120 ° C. for 1 hour using an autoclave. After allowing to cool to room temperature, it was washed with 5 times or more volume of RO water of beads to obtain autoclaved once crosslinked beads in which the epoxy group was changed to glyceryl group. Subsequently, distilled water was added to 11 parts by volume of the autoclaved once crosslinked beads to make 16.5 parts by volume and transferred to a reaction vessel.
  • Unoriented Protein A used in the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. This is a part of the protein A derived from Staphylococcus aureus excluding the signal sequence (S domain) and cell wall binding domain (X domain), and is described as SPA ′ in WO2006 / 004067.
  • the non-oriented protein A was prepared according to the method described in the examples of WO2006 / 004067. The entire contents of this WO2006 / 004067 are incorporated herein by reference.
  • Example 1 An adsorbent with non-oriented protein A immobilized thereon was prepared according to the following procedure.
  • RO water is added to 11.0 mL of the crosslinked porous cellulose beads obtained in Production Example 1 to make a total volume of 17.0 mL, and the mixture is placed in a 50 mL centrifuge tube. This is mixed rotor at 25 ° C. (mix rotor manufactured by ASONE). After mounting on MR-3), the mixture was stirred.
  • sodium periodate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in RO water to prepare 6.0 mL of an 8.64 mg / mL sodium periodate aqueous solution, and the above-mentioned crosslinked porous cellulose beads are put therein.
  • the mixture was stirred at 25 ° C. for 1 hour.
  • the filtrate was washed with RO water until the electric conductivity of the filtrate was 1 ⁇ S / cm or less on a glass filter (11GP100 manufactured by Shibata Co., Ltd.) to obtain formyl group-containing crosslinked porous cellulose beads.
  • the electrical conductivity of the washing filtrate is determined by the conductivity meter (EUTECH) Measured by INSTRUMENTS, ECTester 10 Pure +). 9.0 mL of the obtained formyl group-containing crosslinked porous cellulose beads was placed on a glass filter (11GP100 manufactured by Shibata), pH 8 buffer (0.5 M trisodium citrate dihydrate (Kanto Chemical Co., Ltd.), 0.15 M).
  • the acid was washed while stirring at 25 ° C. for 30 minutes. After acid washing, the beads were washed on a glass filter (Shibata 11GP100) with 3 times the volume of RO water of the beads, and then 3 times the volume of the beads aqueous solution (0.05 M sodium hydroxide, 1 M sodium sulfate). (Nacalai Tesque sodium hydroxide, Kanto Chemical sodium sulfate and RO water) were added. Next, an aqueous solution (0.05 M sodium hydroxide, 1 M sodium sulfate) was added to the beads to make the total volume 30 mL or more, put into a centrifuge tube, and washed with alkali while stirring at room temperature for 30 minutes.
  • aqueous solution 0.05 M sodium hydroxide, 1 M sodium sulfate
  • the beads were washed on a glass filter (11GP100 manufactured by Shibata) with 20 times volume RO water of beads. Next, add 3 times the volume of beads 0.5N trisodium citrate aqueous solution (prepared with trisodium citrate dihydrate and RO water manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), and confirm that the filtrate is neutral. After confirmation, it was washed with RO water until the conductivity of the washing filtrate was 1 ⁇ S / cm or less to obtain an adsorbent on which the target protein A was immobilized. The conductivity of the washing filtrate was measured with a conductivity meter (manufactured by EUTECH INSTRUMENTS, ECTester 10 Pure +).
  • Production Example 3 Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Production Example 1 except that the coagulation solvent was 15 wt% citric acid monohydrate methanol solution. As shown in FIG. 2, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Moreover, classification was performed in the same manner as in Production Example 1, and then crosslinked porous cellulose beads were obtained. The median particle diameter was 75 ⁇ m, the average pore diameter was 190 mm, the maximum pore diameter was 718 mm, and the exclusion limit molecular weight was 3.2 ⁇ 10 7 . The specific surface area was 1.04 ⁇ 10 8 m 2 / m 3 , and the theoretical IgG saturated adsorption amount was 114 g / L.
  • Example 2 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 3, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 33 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 43 g / L (adsorbent packed volume)
  • Production Example 4 (1) Production of porous cellulose beads Porous cellulose beads were produced in the same manner as in Production Example 1 except that the stirring speed was 500 rpm (Pv value: 1.1 kW / m 3 ). As shown in FIG. 3, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Further, classification was performed in the same manner as in Production Example 1 except that the 90 ⁇ m sieve was changed to a 63 ⁇ m sieve. (2) Crosslinking-Method B Distilled water was added to 20 parts by volume of the porous cellulose beads to make 30 parts by volume and transferred to a reaction vessel.
  • the solution was washed with distilled water at least 20 times the volume of the beads while performing suction filtration to obtain once crosslinked beads.
  • the obtained once crosslinked beads were transferred to a container, distilled water was added to make the total volume 10 times the volume of the crosslinked porous cellulose beads, and the mixture was heated at 120 ° C. for 1 hour using an autoclave. After allowing to cool to room temperature, it was washed with 5 times or more volume of RO water of beads to obtain autoclaved once crosslinked beads in which the epoxy group was changed to glyceryl group. Subsequently, distilled water was added to 20 parts by volume of the autoclaved once crosslinked beads to make 30 parts by volume and transferred to a reaction vessel.
  • the mixture was washed with distilled water at a volume 20 times or more of the beads while suction filtration to obtain beads twice after crosslinking.
  • the obtained twice-crosslinked beads were transferred to a container, distilled water was added to make the total volume 10 times the volume of the crosslinked porous cellulose beads, and the mixture was heated at 120 ° C. for 60 minutes using an autoclave. After allowing to cool to room temperature, it was washed with 5 times or more volume of distilled water of the beads to obtain autoclaved twice crosslinked beads.
  • (3) Physical property test of crosslinked porous cellulose beads The median particle size of the crosslinked beads was 56 ⁇ m.
  • the average pore size was 336 mm, the maximum pore size was 3400 mm, and the exclusion limit molecular weight was 3.8 ⁇ 10 9 .
  • the specific surface area was 6.88 ⁇ 10 7 m 2 / m 3 , and the theoretical IgG saturated adsorption amount was 75 g / L. This bead was not consolidated even at a linear velocity of 3057 cm / h.
  • Example 3 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 4, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 36 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 70 g / L (adsorbent filling volume)
  • Production Example 5 Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Production Example 1 except that the coagulation solvent was 15% by weight citric acid monohydrate ethanol solution. As shown in FIG. 4, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Moreover, classification was performed in the same manner as in Production Example 1, and then crosslinked porous cellulose beads were obtained. The median particle size was 75 ⁇ m, the average pore size was 163 mm, the maximum pore size was 1040 mm, and the exclusion limit molecular weight was 1.0 ⁇ 10 8 . The specific surface area was 7.85 ⁇ 10 7 m 2 / m 3 , and the theoretical IgG saturated adsorption amount was 86 g / L.
  • Example 4 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 5, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 36 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 8 g / L (adsorbent packed volume)
  • Production Example 6 Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Production Example 4 except that the 63 ⁇ m sieve was changed to a 90 ⁇ m sieve. As shown in FIG. 5, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Further, classification was performed in the same manner as in Production Example 4, and then crosslinked porous cellulose beads were obtained. The median particle size was 75 ⁇ m. The beads were not consolidated even at 3057 cm / h, which is the maximum linear speed at which liquid can pass through the apparatus.
  • Example 5 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 6, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 36 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 42 g / L (adsorbent packed volume)
  • Production Example 7 Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Production Example 6 except that the stirring speed was 700 rpm (Pv value: 3.1 kW / m 3 ). As shown in FIG. 6, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Further, classification was performed in the same manner as in Production Example 6, and then crosslinked porous cellulose beads were obtained. The median particle size was 75 ⁇ m. The beads were not consolidated even at a linear speed of 3057 cm / h.
  • Example 6 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 7, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 38 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 49 g / L (adsorbent packed volume)
  • Production Example 8 Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Production Example 6 except that the stirring speed was 250 rpm (Pv value: 0.1 kW / m 3 ). As shown in FIG. 7, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Further, classification was performed in the same manner as in Production Example 6, and then crosslinked porous cellulose beads were obtained. The median particle size was 75 ⁇ m, the average pore size was 130 mm, the maximum pore size was 562 mm, and the exclusion limit molecular weight was 1.5 ⁇ 10 7 . The specific surface area was 8.72 ⁇ 10 7 m 2 / m 3 , and the theoretical IgG saturated adsorption amount was 96 g / L.
  • Example 7 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 8, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 37 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 36 g / L (adsorbent packed volume)
  • Example 8 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 9, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 35 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 29 g / L (adsorbent filling volume)
  • Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Production Example 6 except that the time required for adding the coagulation solvent was 60 seconds. As shown in FIG. 9, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Further, classification was performed in the same manner as in Production Example 6, and then crosslinked porous cellulose beads were obtained. The median particle size was 75 ⁇ m. The average pore diameter was 194 mm, the maximum pore diameter was 747 mm, and the exclusion limit molecular weight was 3.7 ⁇ 10 7 . The specific surface area was 1.02 ⁇ 10 8 m 2 / m 3 , and the theoretical IgG saturated adsorption amount was 112 g / L.
  • Example 9 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 10, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 31 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 55 g / L (adsorbent filling volume)
  • Production Example 11 Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Production Example 7 except that the stirring blades were two inclined paddle blades. As shown in FIG. 10, it was confirmed that good holes were formed on the surface. Further, classification was performed in the same manner as in Production Example 7, and then crosslinked porous cellulose beads were obtained. The median diameter was 75 ⁇ m. The average pore diameter was 221 mm, the maximum pore diameter was 2407 mm, and the exclusion limit molecular weight was 1.3 ⁇ 10 9 . The specific surface area was 6.42 ⁇ 10 7 m 2 / m 3 , and the theoretical IgG saturated adsorption amount was 70 g / L.
  • Example 10 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 11, an adsorbent on which protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 34 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 36 g / L (adsorbent packed volume)
  • Production Example 12 Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Production Example 11 except that the adjustment temperature was 9 ° C. As shown in FIG. 11, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Further, classification was performed in the same manner as in Production Example 11, and then crosslinked porous cellulose beads were obtained.
  • Example 11 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 12, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 34 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 22 g / L (adsorbent packed volume)
  • Production Example 13 Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Production Example 11 except that the adjustment temperature was 0 ° C. As shown in FIG. 12, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Further, classification was performed in the same manner as in Production Example 11, and then crosslinked porous cellulose beads were obtained.
  • Example 12 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 13, an adsorbent having Protein A immobilized thereon was obtained in the same manner as in Example 1. As a result, the physical properties were as follows. Protein A introduced amount: 35 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 14 g / L (adsorbent filling volume)
  • the mixture was stirred at 460 rpm (Pv value: 5.0 kW / m 3 ) at 4 ° C. for 15 minutes in a stainless steel container equipped with two rushton turbine blades to prepare an emulsion.
  • 592 g of methanol adjusted to 4 ° C. was added as a coagulation solvent.
  • the time required for adding the coagulation solvent was 5 seconds.
  • washing was performed using 3000 g of methanol as a washing liquid, and then washing with 3000 g of water to obtain porous cellulose beads. As shown in FIG. 13, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface.
  • porous cellulose beads were wet-classified using 38 ⁇ m and 90 ⁇ m sieves. Thereafter, in the same manner as in Production Example 4, crosslinked porous cellulose beads were obtained. The median particle size was 75 ⁇ m.
  • Example 13 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 14, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 35 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 57 g / L (adsorbent packed volume)
  • Production Example 15 Porous cellulose beads were prepared in the same manner as in Production Example 14, except that 1212 g of cellulose dispersion B, 8238 g of orthodichlorobenzene, 85 g of sorbitan monooleate (equivalent to span 80), and 740 g of methanol as a coagulation solvent were used. Obtained. As shown in FIG. 14, it was confirmed that favorable holes were formed on the surface. Classification and crosslinking were carried out in the same manner as in Production Example 14.
  • Example 14 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Production Example 15, an adsorbent on which Protein A was immobilized was obtained in the same manner as in Example 1, and physical properties were evaluated. The results are shown below. Protein A introduced amount: 30 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 60 g / L (adsorbent packed volume)
  • Oriented Protein A used in the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the oriented protein A was prepared according to the method for preparing the C domain mutant and its conjugate described in WO2011 / 118699. The entire contents of WO2011 / 118699 are incorporated herein by reference.
  • Example 15 3.5 mL of the crosslinked porous cellulose beads obtained in Production Example 14 was placed in a centrifuge tube, and RO water was added to make the total volume 6 mL. This was mounted on a mix rotor (mix rotor MR-3 manufactured by ASONE) at 25 ° C. and stirred. Next, 2.0 mL of an 11.16 mg / mL sodium periodate aqueous solution in which sodium periodate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in RO water was added and stirred at 25 ° C. for 1 hour.
  • Mix rotor MR-3 manufactured by ASONE
  • the filtrate was washed with RO water until the electric conductivity of the filtrate was 1 ⁇ S / cm or less on a glass filter (11GP100 manufactured by Shibata Co., Ltd.) to obtain formyl group-containing crosslinked porous cellulose beads.
  • the electrical conductivity of the washing filtrate was measured with a conductivity meter (manufactured by EUTECH INSTRUMENTS, ECTester 10 Pure +).
  • the obtained formyl group-containing crosslinked porous cellulose beads (3.5 mL) were placed on a glass filter (11GP100, manufactured by Shibata Co., Ltd.), pH 0.6 0.6 M citrate buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., trisodium citrate dihydrate, (Adjusted with sodium hydroxide and RO water).
  • pH 0.6 0.6 M citrate buffer pH 0.6 M citrate buffer having a pH of 12
  • the substituted formyl group-containing crosslinked porous cellulose beads were placed in a centrifuge tube, and the liquid volume was adjusted to a total volume of 7.5 mL.
  • reaction solution 1 aqueous solution containing oriented protein A prepared in Production Example 16 (protein A concentration: 63.7 mg / mL) was added, and then mixed rotor (manufactured by ASONE Co., Ltd.) at 6 ° C. for 23 hours.
  • the reaction was carried out with stirring using a mixed rotor MR-3).
  • reaction solution 1 was recovered (reaction solution 1) and replaced with a 0.1 M aqueous sodium citrate solution at pH 8 (adjusted using Wako Pure Chemical Industries, Ltd. trisodium citrate dihydrate, RO water).
  • the mixture was stirred at 6 ° C. for 4 hours using a mix rotor (mix rotor MR-3 manufactured by ASONE).
  • reaction solution 2 1.93 mL of a 5.5 wt% aqueous dimethylamine borane solution (prepared with Wako Pure Chemical Industries, Ltd. dimethylamine borane and RO water) was added and stirred at 6 ° C. for 1 hour, and then the reaction temperature was 25 ° C. The mixture was reacted at 25 ° C. for 18 hours with stirring using a mix rotor (mix rotor MR-3 manufactured by ASONE). After the reaction, the reaction solution was recovered (reaction solution 2). The amount of protein A immobilized was calculated by measuring the UV absorbance of reaction solutions 1 and 2 at the absorption maximum near 278 nm and subtracting from the amount of ligand charged.
  • the beads after the reaction were washed with 3 times volume RO water of beads on a glass filter (Shibata 11GP100). Next, 3 times volume of 0.1N citric acid monohydrate (prepared with citric acid monohydrate and RO water manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) was added, and 0.1N citric acid monohydrate was added to the beads. The total amount was 30 mL or more, put into a centrifuge tube, and washed with acid while stirring at 25 ° C. for 30 minutes.
  • the beads were washed on a glass filter (Shibata 11GP100) with 3 times the volume of RO water of the beads, and then 3 times the volume of 0.05M sodium hydroxide + 1M sodium sulfate aqueous solution (manufactured by Nacalai Tesque) Sodium hydroxide, sodium sulfate manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd. and RO water) was added.
  • 0.05 M sodium hydroxide + 1 M sodium sulfate aqueous solution was added to the beads to make the total volume 30 mL or more, put into a centrifuge tube, and washed with alkali while stirring at room temperature for 30 minutes.
  • the beads were washed on a glass filter (11GP100 manufactured by Shibata) with 20 times volume RO water of beads.
  • a glass filter 11GP100 manufactured by Shibata
  • RO water 3 times the amount of beads, and confirming that the filtrate is neutral
  • the washing filtrate was washed until the electric conductivity became 1 ⁇ S / cm or less to obtain an adsorbent on which the target protein A was immobilized.
  • the conductivity of the washing filtrate was measured with a conductivity meter (manufactured by EUTECH INSTRUMENTS, ECTester 10 Pure +).
  • Example 16 The target adsorbent was produced in the same manner as in Example 15 except that the amount of ligand to be added was 1.64 mL.
  • the physical properties are as follows. Protein A introduced amount: 17 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 61 g / L (adsorbent filling volume) 5% DBC at RT 6 minutes: 79 g / L (adsorbent packed volume)
  • Comparative production example 1 (1) Preparation of Cellulose Solution 6.4 g of crystalline cellulose (Ceolus PH101 manufactured by Asahi Kasei Chemicals Corporation, median particle size: 73 ⁇ m) was added to 100 g of a 60% by weight calcium thiocyanate aqueous solution, and dissolved by heating to 120 ° C. Since it was difficult to store at this temperature, it was adjusted for use. (2) Production of cross-linked porous cellulose beads Porous cellulose beads produced using calcium thiocyanate were produced as follows with reference to the examples of WO2010 / 095573.
  • sorbitan monooleate as a surfactant was added to the cellulose solution, dropped into 480 mL of orthodichlorobenzene preheated to 140 ° C., and stirred at 300 rpm. The dispersion was then cooled to 40 ° C., poured into 190 mL of methanol and allowed to solidify. After performing suction filtration, it was washed with 190 mL of methanol. This methanol washing was performed several times. Further, after washing with a large amount of distilled water, suction filtration was performed to obtain porous cellulose beads.
  • Comparative Example 1 Using the crosslinked porous cellulose beads produced in Comparative Production Example 1, an adsorbent having protein A immobilized thereon was obtained in the same manner as in Example 1. As a result, the physical properties were as follows. Protein A introduced amount: 32 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 41 g / L (adsorbent packed volume)
  • Comparative Example 2 Aligned protein A was fixed in the same manner as in Example 15 except that the cross-linked porous cellulose beads prepared in Comparative Production Example 1 were used and the amount of the aqueous solution containing oriented protein A was 0.51 mL. Adsorbed adsorbent was prepared. The physical properties are as follows. Protein A introduced amount: 8 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 35 g / L (adsorbent packed volume) 5% DBC at RT 6 minutes: 41 g / L (adsorbent packed volume)
  • Comparative Example 3 An adsorbent having immobilized oriented protein A was prepared in the same manner as Comparative Example 2 except that the amount of the aqueous solution containing oriented protein A was 0.76 mL.
  • the physical properties are as follows. Protein A introduced amount: 10 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 41 g / L (adsorbent packed volume) 5% DBC at RT 6 minutes: 48 g / L (adsorbent packed volume)
  • Comparative Example 4 An adsorbent having immobilized oriented protein A was prepared in the same manner as in Comparative Example 2 except that the amount of the aqueous solution containing oriented protein A was 1.01 mL.
  • the physical properties are as follows. Protein A introduced amount: 15 g / L (adsorbent volume) 5% DBC at RT 3 minutes: 44 g / L (adsorbent packed volume) 5% DBC at RT 6 minutes: 52 g / L (adsorbent packed volume)
  • Reference example 1 The average pore size of MabSelect SuRe LX (manufactured by GE Healthcare), a cross-linked porous agarose bead introduced with protein A, which is sold as a type with a relatively large amount of monoclonal antibody adsorption, is 425 mm, and the maximum pore size is The exclusion limit molecular weight was 2.5 ⁇ 10 9 at 2970 kg. An SEM image of the bead surface is shown in FIG. The adsorption performance was as follows. 5% DBC at RT 3 minutes: 46 g / L (adsorbent packed volume) 5% DBC at RT 6 minutes: 61 g / L (adsorbent packed volume)
  • Example 17 (1) Epoxidation The porous cellulose beads produced in Example 14 were subjected to wet classification using 38 ⁇ m and 150 ⁇ m sieves. 1 part by volume of RO water was added to 1 part by volume of the beads after classification, and 0.53 part by volume of 2N aqueous sodium hydroxide solution was further added, followed by heating at 45 ° C. for 30 minutes. Next, 0.18 part by volume of epichlorohydrin was added and stirred at 45 ° C. for 2 hours. Filtration was performed on a glass filter, and the beads were washed with a large amount of RO water to obtain epoxy group-containing porous cellulose beads. The epoxy content was 17 ⁇ mol / g wet weight.
  • the amount of dextran sulfate introduced was 14 mg per mL of beads.
  • (3) Sealing of residual epoxy group 1 part by volume of RO water and 0.25 part by volume of monoethanolamine were added to 1 part by volume of dextran sulfate-immobilized beads, and the mixture was stirred at 45 ° C for 2 hours to seal the residual epoxy group. Went. Filtration was performed on a glass filter, and the beads were washed with a large amount of RO water to obtain a target adsorbent.
  • LDL cholesterol adsorption test Human blood was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to obtain plasma having an LDL cholesterol concentration of 93 mg / dL.
  • Example 18 An LDL cholesterol adsorption test was performed in the same manner as in Example 17 except that the amount of plasma added in Example 17 was 6 mL. However, since the LDL concentration of the supernatant when using physiological saline instead of beads was 87 mg / dL, this was used for the calculation. As a result, it was found that 63% of LDL cholesterol was adsorbed on the adsorbent. That is, the amount of LDL cholesterol adsorbed on the adsorbent was 7.0 g per 1 L of the adsorbent.
  • Reference example 2 An LDL cholesterol adsorption test was performed in the same manner as in Example 17 except that the adsorbent packed in the adsorption plasma purifier Liposorber LA-15 (manufactured by Kaneka) was used. As a result, it was found that 80% of LDL cholesterol was adsorbed on the adsorbent. That is, the amount of LDL cholesterol adsorbed on the adsorbent was 3.9 g per liter of the adsorbent.
  • Reference example 3 An LDL cholesterol adsorption test was conducted in the same manner as in Example 18 except that the adsorbent filled in the adsorption plasma purifier Liposorber LA-15 (manufactured by Kaneka) was used. As a result, it was found that 53% of LDL cholesterol was adsorbed on the adsorbent. That is, the amount of LDL cholesterol adsorbed on the adsorbent was 5.5 g per liter of the adsorbent.
  • the adsorbent of the present invention can be used for purification and treatment.

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Abstract

　本発明は、毒性、腐食性が高い副原料を使わずに、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく得られる多孔質セルロースビーズを用いた、高吸着量で高強度な吸着体を得ることを目的とする。　本発明は低温のアルカリ水溶液とセルロースの原料粉末とを混合して作製したセルロース分散液を、凝固溶媒に接触させて得られた多孔質セルロースビーズに、リガンドを固定化することを特徴とする。

Description

吸着体
　本発明は吸着体に関する。詳しくは、特定の製造方法により得られる多孔質セルロースビーズを用いた、吸着量に優れる吸着体に関する。
　多孔質セルロースビーズを用いた吸着体は、他の合成系高分子を用いる場合に比べて安全性が高く、非特異的吸着が少なく、広いｐＨ域で使用でき、また多糖類でありながら機械的強度が大きいという利点がある。用途の例として各種医療用吸着体やクロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体が挙げられる。なかでも、アフィニティー吸着体は、効率よく目的物を精製、または不要物濃度を低減できることから、医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体として利用されてきている。特に、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用（医療用）吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている（例えば非特許文献１、非特許文献２）。一方、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体（抗体医薬品精製用吸着体）が注目されている。また、高コレステロール血漿治療用に硫酸デキストランを多孔質セルロースビーズに結合した吸着体が市販されている（例えば、カネカ社製リポソーバーなど）。吸着体に用いられる多孔質セルロースビーズの製造は、原料のセルロース粉末を溶解できる溶媒がほとんどないため、現在はチオシアン酸カルシウム水溶液などの腐食性、毒性が高く、設備化の難易度を高くしてしまう溶媒に溶解し、凝固することによって得られている（例えば特許文献１）。一方、セルロースの溶解性を上げるためにセルロースの水酸基に置換基を付与し、汎用の溶媒に溶解させて造粒を行い、造粒後に置換基を脱離させて多孔質セルロース系担体を得る方法が例示されている（例えば特許文献２）が、工程が煩雑であり、置換基を付与したり脱離させたりする過程で分子量の低下が起こり、近年求められている高速処理や大スケールで使用するのに適切な強度が得られ難い傾向がある。
　また、ごく最近になって、セルロースを容易に溶解できる溶媒としてイオン液体が注目されており、非特許文献３においては、イオン液体にセルロースを溶解してセルロースビーズを得る方法が開示されている。しかしながら、イオン液体はかなり高価であり、産業レベルで副原料として使用するには不適であるし、微量とはいえ残留するであろうイオン液体の安全性については、毒性データ等が少なく、医療用や医薬品精製用の吸着体製造用として使用する場合は、安全性確認の検討を相当要することが予想される。
ＵＳ２００９／００６２１１８ ＷＯ２００６／０２５３７１
Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　２００５．　Ｖｏｌ．１０５１　Ｐ．６３５－６４６ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｖｏｌ．１５２，　Ｎｕｍｂｅｒ　４　２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，１２１７（２０１０）１２９８－１３０４
　本発明は従来の技術が有する上記課題を鑑みてなされたものであり、毒性、腐食性が高い副原料を使わず、簡便な方法により得られた、機械的強度が高い多孔質セルロースビーズを用いた、吸着量の大きい吸着体を提供することを目的とする。　　
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、多孔質セルロースビーズを製造する工程において、原料のセルロース粉末が低温アルカリに完全に溶解していない状態で、凝固液に接触させて得られた多孔質セルロースビーズを用いた吸着体は、特異的に吸着量が多いことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の吸着体は、低温のアルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合して作製したセルロース分散液を、凝固溶媒に接触させて得られた多孔質セルロースビーズを用いることを特徴とする。
　また、本発明に係る吸着体は、アフィニティーリガンドを含有することが好ましい。アフィニティーリガンドの導入量は、吸着体１ｍＬあたり、例えば、１ｍｇ以上５００ｍｇ以下である。
　前記アフィニティーリガンドとしてはプロテインＡであることが好ましい場合がある。
　また、前記プロテインＡがアルカリ耐性を持つことが好ましい。
　さらに、前記プロテインＡが配向制御型であることが好ましい。
　例えば、ＩｇＧを吸着する場合、ＲＴが３分の時のＩｇＧの５％ＤＢＣが６０ｇ/Ｌ以上であることが好ましい。
　また、ＲＴが６分の時のＩｇＧの５％ＤＢＣが７０ｇ/Ｌ以上であることが好ましい。
　また、本発明は、デキストラン硫酸をリガンドとして含有することを特徴とする吸着体に関する。
　例えば、ＬＤＬコレステロールを吸着する場合、吸着量が７ｇ／Ｌ以上であることが好ましい。
　本発明で用いる多孔質セルロースビーズを得るにあたり、前記低温とは、好ましくは２０℃以下である。前記セルロース分散液中のセルロース濃度は１～１０重量％であることが好ましく、前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度は５～１５重量％であることが好ましい。
　本発明は、前記吸着体を用いる精製方法に関する。
　また、本発明は、前記吸着体を用いる治療方法に関する。　　
　本発明によれば、毒性、腐食性が高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく得られた多孔質セルロースを用いた、高吸着量で高強度な吸着体を得ることができる。
本発明の実施例１に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例２に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例３に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例４に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例５に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例６に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例７に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例８に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例９に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例１０に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例１１に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例１２に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例１３，１５，１６に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の実施例１４，１７，１８に係る多孔質セルロースビーズ表面のＳＥＭ像である。 本発明の参考例１に係る吸着体表面のＳＥＭ像である。 製造例１で使用した撹拌翼の概略斜視図である。 製造例９で使用した撹拌翼の概略斜視図である。
　本発明に係る吸着体は、低温のアルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合してセルロース分散液を調製する工程、および、当該セルロース分散液を凝固溶媒に接触させることにより得られた多孔質セルロースビーズを用いることを特徴とする。
　低温のアルカリ水溶液に通常の大きさの原料セルロース粉末を投入すると、よく知られているように透明の溶解状態とは言い難い分散液が得られるが、このようなセルロース分散液からでさえ、多孔質セルロースビーズがより簡便に安価に製造でき、また、得られる多孔質セルロースビーズは、強度に優れている。
　前記多孔質セルロースビーズにリガンドを結合させた本発明の吸着体は、従来技術により得られる多孔質セルロースビーズを用いた吸着体に比較して吸着量に優れている。セルロースがアルカリ水溶液に溶解しなくても、水とアルカリ成分が低温下で形成する特殊なクラスタにセルロースが配位されて膨潤し、かかるクラスタが凝固溶媒に吸収および置換され、セルロースが凝固しながら多孔質化し、吸着体として利用できる構造となるものと考えられる。しかも、形成される孔が従来法により製造される多孔質セルロースビーズと異なっているため、吸着性に優れている。
　本発明の吸着体は、標的となる分子（目的物）を吸着または溶出（解離）する機能を利用できる用途であれば、特に限定されないが、広範囲なｐＨ域で使用できる特徴を存分に生かせる、アフィニティークロマトグラフィーに好ましく用いることが出来る。
　アフィニティークロマトグラフィー用の吸着体として用いるためには、多孔質セルロースビーズに吸着の目的物と特異的に結合するアフィニティーリガンドを導入することができる。
　本発明のアフィニティーリガンドの導入量は、吸着体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上５００ｍｇ以下であることが好ましい。アフィニティーリガンドの導入量が吸着体１ｍＬ当り１ｍｇ以上であれば、目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、５００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。より好ましいアフィニティーリガンドの導入量は、吸着体１ｍＬ当り２ｍｇ以上１２０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは３ｍｇ以上６０ｍｇ以下であり、特に好ましくは４ｍｇ以上３０ｍｇ以下であり、最も好ましくは４ｍｇ以上１５ｍｇ以下である。なおアフィニティーリガンドが無配向型である場合、吸着体１ｍＬ当たりのリガンド導入量が、例えば、１０ｍｇ以上８０ｍｇ以下、好ましくは２０ｍｇ以上５０ｍｇ以下であってもよい。
　または、本発明の吸着体のアフィニティーリガンドの導入量は、吸着体１ｍＬ当り、０．０１μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下であることが好ましい。アフィニティーリガンドの導入量が吸着体１ｍＬ当り０．０１μｍｏｌ以上であれば、精製目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１５μｍｏｌ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。より好ましいアフィニティーリガンドの導入量は、吸着体１ｍＬ当り０．０３μｍｏｌ以上５μｍｏｌ以下であり、さらに好ましくは０．０５μｍｏｌ以上２μｍｏｌ以下であり、特に好ましくは０．１μｍｏｌ以上０．７５μｍｏｌ以下であり、最も好ましくは０．１μｍｏｌ以上０．５μｍｏｌ以下である。
　アフィニティーリガンドの導入量は、固定化反応後の反応液上清中のアフィニティーリガンド由来の吸光度を測定する方法やＢＣＡ法（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 191, 343-346(1990)）等の方法により求めることができる。例えば、アミノ基含有アフィニティーリガンドであれば、吸着体のＮ含量分析を行うことにより、アフィニティーリガンドの導入量を求めることができる。
　治療用（医療用）吸着体や抗体医薬品精製用吸着体などに用いられる場合のアフィニティーリガンドとしては、抗体に特異性の高い抗原や、プロテインＡ、プロテインＧ、Ｌ等のタンパク質やその変異体、抗体結合活性を有するペプチド等を挙げることができる。特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）等を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして担体に固定化した吸着体が注目されている。プロテインＡを固定化した吸着体は、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体として注目されている。また、抗体医薬精製の分野においては、ＩｇＧ等の抗体の精製を大スケール、高速、及び低コストで行える吸着体が望まれている。このような観点から、本発明の吸着体は、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入された吸着体であることが好ましい。
　本発明に用いることができるプロテインＡは、特に限定は無く、天然物、遺伝子組み換え物等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン及びその変異体を含むものや融合蛋白質等であってもよい。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡを用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０に記載されている方法で得られたプロテインＡを好ましく用いることが出来る。
　吸着体は吸着量が大きいだけでなく、用途に応じて様々な特性が求められる。例えば、精製用途においては、目的物を高濃度に回収する必要がある。一般的に回収工程や溶出工程と呼ばれるが、この工程において、リガンドに求められる特性は、目的物を解離しやすいという点である。プロテインＡをリガンドとした場合、回収工程において、抗体を解離しやすい特性が好ましく、本発明にも好適に用いることができる。例えば、ＷＯ２０１１／１１８６９９に記載のプロテインＡが挙げられる。また、吸着体は再利用される場合が多く、再利用するためには、洗浄処理または再生処理を行う必要がある。抗体精製においては、尿素やグアニジン等を含有する溶液が用いられるが、溶液の調製が煩雑であることから、水酸化ナトリウム水溶液にて洗浄・再生を行う方法が主流となりつつある。
　本発明においても、アルカリ耐性リガンドを好適に用いることができる。プロテインＡにおいても同様にアルカリ耐性を持つものを好ましく用いることができる。例えば、ＷＯ２０１１／１１８６９９に記載のプロテインＡが挙げられる。
　また前記プロテインＡは、配向制御型であることが好ましい。配向制御型とは、セルロースビーズに固定化される際、プロテインＡの末端部位とビーズとが結合しやすいような配列を有しているものを指す。
　一方、プロテインＡをはじめとする、種々のアフィニティーリガンドを多孔質ビーズに固定化する方法としては、例えば臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法等の、様々な固定化法の中から選択することができ、中でも、安全性の観点や、固定化反応の容易さ、比較的容易な方法で産生されたタンパク質やペプチドが使用できる等の理由から、多孔質ビーズのホルミル基と、アフィニティーリガンドのアミノ基との反応を固定化に用いることが、産業上好ましいとされている（例えばＷＯ２０１０／０６４４３７）。このような観点から前記配向制御型プロテインＡは、プロテインＡのＥ，Ｄ，Ａ，Ｂ，および、Ｃドメインのいずれかのドメインに由来したアミノ酸配列の全てのＬｙｓ（リジン残基）にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有し、かつ、末端にＬｙｓを付与された配列を有するものであることが望ましい。
　また、このようなプロテインＡはビーズへの導入量が少なくなる場合があることから、リガンドを固定化するためのビーズの活性基量は、ビーズ１ｍＬあたり１μｍｏｌ以上であることが好ましい。また、活性基量が多すぎると、リガンド固定化後の不活化処理が煩雑になることから、ビーズ１ｍＬあたり５００μｍｏｌ以下であることが好ましい。より好ましい活性基量はビーズ１ｍＬあたり５μｍｏｌ以上２５０μｍｏｌ以下、さらに好ましくは１０μｍｏｌ以上１２５μｍｏｌ以下、特に好ましくは２０μｍｏｌ以上６０μｍｏｌ以下、最も好ましくは３０μｍｏｌ以上５０μｍｏｌ以下である。
　リガンドを結合させやすい、または、活性基を有する化合物を結合させて多くの活性基を簡便に付与できる点で、ビーズ上の活性基はホルミル基であることが好ましい。
　本発明の吸着体の、目的物の吸着量は、カラムに吸着体を充填された状態で５％ダイナミックバインディングキャパシティー（ＤＢＣ）を測定する方法で求めることができる。
　目的物の吸着量は、滞留時間（レジデンスタイム、以下、ＲＴと略す。）３分で吸着処理を行う場合、吸着体１Ｌあたり１ｇ以上であることが好ましい。目的物の吸着量が、吸着体１Ｌあたり１ｇ以上であれば、効率よく精製が行えるため好ましい。また目的物の吸着量が、吸着体１Ｌあたり２００ｇ以下であれば、吸着した目的物が吸着体から溶出しやすいため好ましい。より好ましい吸着体での目的物の吸着量は、吸着体１Ｌあたり１０ｇ以上１５０ｇ以下であり、さらに好ましくは３０ｇ以上１００ｇ以下であり、特に好ましくは５０ｇ以上９０ｇ以下であり、最も好ましくは６０ｇ以上８０ｇ以下である。
　ＲＴ６分で吸着処理を行う場合、目的物の吸着量は、吸着体１Ｌあたり２０ｇ以上２００ｇ以下が好ましく、さらに好ましくは４０ｇ以上１５０ｇ以下であり、特に好ましくは６０ｇ以上１００ｇ以下であり、最も好ましくは７０ｇ以上９０ｇ以下である。
　本発明の吸着体のその他のリガンドとしてデキストラン硫酸を好ましく用いることができる。デキストラン硫酸を用いた場合、各種イオン交換クロマトグラフィーに好適な吸着体を得ることができる。また、ＬＤＬコレステロールを吸着する吸着体としても好適であり、さらにＬＤＬコレステロールを吸着除去する医療用吸着体として用いることができる。
　ＬＤＬコレステロールの吸着量としては、吸着体１Ｌあたり１ｇ以上５０ｇ以下が好ましい。１ｇ以上であれば、治療用吸着体に用いた場合に好適な治療が行える。５０ｇ以下であれば、ＬＤＬコレステロールの急激な低下による副作用を抑制することができる。さらに好ましくは２ｇ以上２０ｇ以下であり、特に好ましくは４ｇ以上１５ｇ以下であり、最も好ましくは６ｇ以上１０ｇ以下である。
　以下、本発明で用いる多孔質セルロースビーズの製法について、工程ごとに説明する。
　（１）　セルロース分散液の調製工程
　本発明で用いる多孔質セルロースビーズの製造工程では、低温のアルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合する。原料セルロース粉末が低温アルカリ水溶液に溶媒和される反応は発熱反応であるので、高温のアルカリ水溶液にセルロースを加えても均一で着色の無い分散液は得られない。そこで、セルロースとアルカリ水溶液の混合時には、低温を維持する。
　ここで低温とは、常温より低い温度を指す。常温より低ければ大きな問題は無いが、－２０℃以上であれば温調設備が簡便でランニングコストも低くなるため好ましい。また１０℃以下であればセルロース分散液の着色が少なくなり、またセルロースの分散性・膨潤性が高くなるため好ましい。当該温度としては、－１０℃以上、２０℃以下が好ましい。－１０℃以上であればアルカリ水溶液の凍結を抑制することができる。一方、２０℃以下であれば、セルロース分散液を効率的に調製でき、また、セルロース分散液の着色を抑制することができる。当該温度としては、－５℃以上がより好ましく、－２℃以上がさらに好ましく、－１℃以上が特に好ましく、また、１５℃以下がより好ましく、９℃以下がさらに好ましく、５℃以下がさらに好ましく、４℃以下がさらに好ましく、１℃以下がさらに好ましい。また、当該温度が９℃以下であれば、得られる多孔質セルロースビーズの真球度が高くなるため好ましい。
　アルカリは、水溶液となった際にアルカリ性を示すものであれば特に限定なく用いることができる。入手のしやすさから水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、製品安全性や価格の面から水酸化ナトリウムが最も好ましい。
　前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度に特に限定は無いが、３～２０重量％であることが好ましい。アルカリの濃度がこの範囲であれば、セルロースのアルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなるため好ましい。より好ましいアルカリの濃度は５～１５重量％であり、さらに好ましくは７～１０重量％、最も好ましくは８～１０重量％である。
　前記原料セルロース粉末の種類には特に限定は無い。例えば、本発明方法では、セルロースを溶解させなくてもよいので、溶解性を上げるための置換基を導入したセルロースなど、置換セルロースを用いる必要はなく、通常の無置換セルロースの粉末を原料として用いることができる。
　原料セルロースの分子量は特に制限されないが、重合度としては１０００以下であることが好ましい。重合度が１０００以下であれば、アルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなり、好ましい。また重合度が１０以上であれば、得られる多孔質セルロースビーズの機械的強度が大きくなるため好ましい。より好ましい重合度の範囲は５０以上５００以下、さらに好ましくは１００以上４００以下、特に好ましくは２００以上３５０以下、最も好ましくは２５０以上３５０以下である。
　前記原料セルロース粉末としては、そのメジアン粒径が１０μｍ以上、５００μｍ以下のものを用いることが好ましい。本発明方法ではセルロースを溶解しなくてもよいため、溶解性向上のため原料セルロース粉末を特殊な方法で粉砕する必要が無い。また、原料セルロース粉末を過剰に粉砕すると、全体の製造効率が低下する。即ち、従来、セルロースを低温アルカリ水溶液に溶解するために爆砕処理や湿式粉砕などにより原料セルロース粉末を極端に微細化することが行われていたが、これらの処理は製造コストを上げる原因となる。よって、原料セルロース粉末のメジアン粒径は、１０μｍ以上が好ましい。また、メジアン粒径が１０μｍ以上であれば、セルロース分散液中にダマが発生し難くなるという効果もある。一方、当該メジアン粒径が過剰に大きな原料セルロース粉末を用いると、安定的な分散液が得られず、ひいては多孔質セルロースビーズを良好に製造できない場合があり得るので、当該メジアン粒径としては５００μｍ以下が好ましい。当該メジアン粒径としては、１５μｍ以上がより好ましく、２０μｍ以上がさらに好ましく、４５μｍ以上が特に好ましく、また、２００μｍ以下がさらに好ましい。また原料セルロース粉末のメジアン粒径を、例えば、５μｍ以上、５０μｍ以下、特に１０μｍ以上、３０μｍ以下にすることも好ましい態様である。
　その他、溶解性が向上された原料セルロースの例としては、溶解パルプを挙げることができる。溶解パルプは前記セルロース分散液を作製するのに適した原料であることを否めないが、従来から知られているように、溶解パルプを得るためには環境負荷が大きい製法を採る場合が多く、また現在では、セルロース関連産業の構造上の問題のせいか、多孔質セルロースビーズを製造するための原料としては非常に入手困難な原料であることを本発明者らは知るに至っている。本発明方法では、溶解パルプを使用しなくても、多孔質セルロースビーズを良好に製造することができる。即ち本発明に用いられる多孔質セルロースビーズを得るためには、全体的な製造コストや製造効率から、一般的に入手容易なセルロースを用いることが好ましい。
　アルカリ水溶液と原料セルロース粉末との混合条件に特に限定は無い。例えば、アルカリ水溶液へ原料セルロース粉末を加えてもよいし、原料セルロース粉末へアルカリ水溶液を加えてもよい。予めアルカリ水溶液を低温に調節してから原料セルロース粉末を投入することが好ましい。
　原料セルロース粉末は、アルカリ水溶液と混合する前に、水へ懸濁しておいてもよい。それにより、セルロースのダマの発生を抑制でき、セルロース分散液の作製に要する時間を短縮でき、また、より均一なセルロース分散液が得られ易い。当該懸濁液におけるセルロースの割合は適宜調整すればよいが、例えば、１重量％以上、４０重量％以下とすることができる。
　アルカリ水溶液と混合する前に、原料セルロース粉末または原料セルロース粉末の懸濁液の温度をアルカリ水溶液と同様に、低温に調節しておくことも好ましい。この際、アルカリ水溶液と、原料セルロース粉末または原料セルロース粉末の懸濁液の温度は、同温度でなくてもよい。
　原料セルロースまたは原料セルロース粉末の懸濁液を加えるべきアルカリ水溶液、および、アルカリ水溶液を加える原料セルロース粉末の懸濁液は、攪拌しておくことが好ましい。この際の攪拌動力Ｐｖ値としては、０．０１ｋＷ／ｍ3以上、１００ｋＷ／ｍ3以下が好ましい。当該攪拌動力が０．０１ｋＷ／ｍ3以上であれば、両者を効率的に混合することが可能になる。また、当該攪拌動力が過剰に高いと、かえって混合し難くなるおそれがあり得るので、当該攪拌動力としては１００ｋＷ／ｍ3以下が好ましい。
　また驚くべきことに、原料セルロース粉末を水に懸濁して低温に調節した後、攪拌しながらアルカリ水溶液を添加すると、均一なセルロース分散液が瞬時に調製できることを本発明者らは見出しており、特にこの方法を好ましく用いることができる。このとき、添加するアルカリ水溶液が低温であることがより好ましい。セルロース分散液の作製中および貯蔵中も低温に保持しておくことが好ましい。当該温度は、アルカリ水溶液で説明した温度と同様にすることができる。
　またセルロース分散液中のセルロースの濃度は１～１０重量％であることが好ましい。１重量％以上であれば、得られる多孔質ビーズの機械的強度が大きくなるため好ましく、１０重量％以下であれば、セルロース分散液の粘度が低く、また分散・膨潤できない部分が少なくなるため、好ましい。より好ましくは３～１０重量％、さらに好ましくは４～８重量％、特に好ましくは５～７重量％、最も好ましくは５～６重量％である。なお、このセルロース分散液中のセルロース濃度は、分散・膨潤しきれず均一にならなかった分を含めない。
　（２）　エマルションの調製工程
　セルロース分散液を分散媒に分散することによりエマルションを作製した後、当該エマルションを凝固溶媒に接触させてもよい。かかるエマルションの調製は任意であるが、当該工程を経ることによって、セルロース含量が比較的多いセルロース分散液から多孔質セルロースビーズを得られ易くなり、また、機械的強度の高い多孔質セルロースビーズが得られ易くなる。
　分散媒に特に限定は無く、セルロース分散液と相溶性が低いものであれば、好適に用いることができる。例えば、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）等の食用油；パーム油、ヤシ油、スクワランなどの天然油；イソステアリルアルコールやオレイルアルコールなどの高級アルコール；２－オクチルドデカノールなどの高級エステル；ジクロロベンゼンなどの親油性有機溶媒などを用いることができる。また、分散媒には、ソルビタンラウレート、ソルビタンステアレート、ソルビタンオレエート、ソルビタントリオレエートなどのソルビタン脂肪酸エステルなどの界面活性剤を適量添加してもよい。
　分散媒の使用量は、セルロース分散液の液滴を十分に分散できる量とすればよい。例えば、セルロース分散液に対して１質量倍以上とすることができる。一方、分散媒の量が多過ぎると廃液量が過剰に増えるおそれがあり得るので、当該割合としては１０質量倍以下が好ましい。当該割合としては、２質量倍以上がより好ましく、４質量倍以上がより好ましく、また、８質量倍以下がより好ましく、７質量倍以下がさらに好ましく、６質量倍以下が特に好ましい。
　分散時の温度はセルロース分散液と同等に調節しておくことが好ましい。即ち、分散媒の温度や、分散媒とセルロース分散液との混合時における温度、分散媒中へセルロース分散液を分散させる際の温度は、アルカリ水溶液と同様に低温にすることが好ましい。
　エマルションを調製する際は、通常、攪拌した分散媒へセルロース分散媒を加えることが好ましい。この際の攪拌動力Ｐｖ値としては、０．１ｋＷ／ｍ3以上、１２ｋＷ／ｍ3以下が好ましい。当該攪拌動力が０．１ｋＷ／ｍ3以上であれば、良好な真球性と細孔特性を得られ易い。また、当該攪拌動力が過剰に高いとエマルションの流動状態が安定し難くなるおそれがあり得るので、当該攪拌動力としては１２ｋＷ／ｍ3以下が好ましい。当該攪拌動力としては、１．１ｋＷ／ｍ3以上がより好ましく、３．１ｋＷ／ｍ3以上がさらに好ましく、５．５ｋＷ／ｍ3以上が特に好ましい。
　（３）　凝固工程
　次に、セルロース分散液を凝固溶媒に接触させることにより、セルロースを多孔質化する。
　本工程に用いられる凝固溶媒には特に限定は無く、セルロース分散液と接触してセルロースビーズが得られるものであれば、好適に用いることができる。中でも水とアルコールはセルロース分散液の良溶媒であるアルカリ水溶液との親和性が高く、好適に用いることができる。特にアルコールを用いると、水を用いた場合に比べてセルロースビーズの孔を小さくできるため好ましい。またアルコールを用いると真球性が向上するため好ましい。また水とアルコールの混合溶媒を用いると、混合比によってセルロースビーズの孔の大きさを任意に調整できるため、より好ましい。
　本発明に用いることができるアルコールには特に限定は無いが、炭素数６以下のアルコールがアルカリ水溶液との親和性が高いため好ましく、炭素数４以下がより好ましく、最も好ましいのはメタノールである。また、凝固溶媒は、アルコール水溶液であってもよい。
　また前記の凝固溶媒は酸性であることも好ましい。凝固溶媒が酸性であれば、アルカリ水溶液を中和できるため好ましい。この中和が早く行なえると、得られるセルロースビーズへの化学的ダメージが軽減されるため好ましい。また、驚くべきことに、本発明者らは凝固溶媒を酸性とすることによって、得られる多孔質ビーズの細孔径分布が狭くなることを見出しており、こういった細孔径特性が所望される場合、凝固溶媒を酸性にしておくことが特に好ましい。酸性にするための薬剤には特に限定は無く、硫酸、塩酸などの無機酸や、酢酸、クエン酸、酒石酸などの有機酸や、リン酸、炭酸などの緩衝効果を持つものなど、幅広く用いることができる。なお、凝固溶媒が酸性であるとは、凝固溶媒のｐＨが７．０未満であることをいう。当該ｐＨとしては、５．０以下が好ましく、４．０以下がより好ましく、３．０以下がさらに好ましく、２．０以下が特に好ましい。なお、当該ｐＨの下限は特に制限されないが、０．０以上であることが好ましい。
　凝固溶媒の使用量は特に制限されず、適宜調整すればよい。例えば、セルロース分散液に対して０．００１倍体積以上、１００倍体積以下程度とすることができる。また、エマルションに対しては、０．０１倍体積以上、１０倍体積以下程度とすることができる。これら範囲内であれば、多孔質セルロースビーズを得られやすい。また、良好な細孔や表面孔が得られやすい。凝固溶媒の使用量としては、エマルションに対して０．０２５倍体積以上がより好ましく、０．０５倍体積以上がさらに好ましく、０．０７倍体積以上が特に好ましく、また、０．４倍体積以下がより好ましく、０．２倍体積以下がさらに好ましく、０．１５倍体積以下が特に好ましい。上記使用量は、通常考えられる凝固溶媒量に比べてかなり少ないが、本方法では、凝固溶媒の使用量を低減しても多孔質セルロースビーズを良好に得ることができる。
　前記凝固溶媒の温度については特に限定は無いが、凝固溶媒中でセルロース分散液が凍結し、その後融解すると、セルロースビーズが変形したり、セルロースが破砕しやすくなるため、前記セルロース分散液が凍結しない温度であることが好ましい。また、凝固溶媒の温度は前記セルロース分散液の温度以上であることが好ましい。通常、凝固溶媒は、凝固速度を速める等の効果から、セルロース分散液より低温であるが、本発明者らは驚くべきことに、凝固溶媒の温度をセルロース分散液の温度以上にした方が、凝固が速く進行することを見出した。具体的な温度については特に限定は無いが、凝固溶媒の温度は０℃以上、１５０℃以下であることが好ましく、より好ましくは２５℃以上、１００℃以下、さらに好ましくは４５℃以上、８０℃以下であるが、凝固溶媒の沸点等を鑑みて、適切に調整することが好ましい。なお、セルロース分散液の温度は、エマルションを使用する場合ではエマルションの温度をいうものとする。
　また凝固溶媒の温度を、例えば、０℃以上、１０℃以下、特に２℃以上６℃以下にすることも好ましい態様である。
　（４）　架橋工程
　上記方法により得られる多孔質セルロースビーズの強度をさらに高めるため、架橋剤を用いて強度をさらに向上させることが可能である。架橋されている多孔質セルロースビーズは特に強度に優れているため、高線速下や高圧力下の使用にも耐えることができる。なお、本工程は任意である。
　架橋方法としては特に限定は無く、従来公知の方法を用いることができる。架橋剤や架橋反応条件に特に限定は無く、公知の技術を用いて行うことができる。例えば、架橋剤としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）を挙げることができる。なかでも、特開２００８―２７９３６６に示される方法を特に好適に用いることができる。本発明者らは特開２００８―２７９３６６に示される方法をさらに発展させ、架橋反応を促進するアルカリ水溶液を分割添加することにより、さらに強度が向上することを見出しており、本発明における最も好適な架橋方法として用いることができる。これら公報は、本願に参考文献として援用される。
　上記セルロース分散液の調製工程、エマルションの調製工程および凝固工程においては、攪拌操作を用いることが好ましい。攪拌翼としては特に限定は無いが、パドル翼、タービン翼を挙げることができる。なかでも傾斜パドル翼、傾斜パドル翼、ディスクタービン（rushton turbine）翼等を好適に用いることができる。
　上記のようにして得られる多孔質セルロースビーズは、プロテインＡなどのアフィニティーリガンドを固定化した時にＩｇＧの結合性に優れたものとなる様な細孔構造を有していることが好ましい。ＩｇＧ結合性を高めた多孔質セルロースビーズでは、ＩｇＧアクセシブル比表面積は、例えば、１×１０7～３０×１０7ｍ2／ｍ3程度、好ましくは３×１０7～２０×１０7ｍ2／ｍ3、より好ましくは５×１０7～１５×１０7ｍ2／ｍ3である。またＩｇＧ結合性を高めた多孔質セルロースビーズでは、理論ＩｇＧ飽和吸着量が、例えば、５０～２００ｇ／Ｌ、好ましくは６０～１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは７０～１２０ｇ／Ｌである。
　本発明の吸着体を用いることにより、効率的な精製や治療を行うことができる。
　本願は、２０１２年９月１０日に出願された日本国特許出願第２０１２－１９８３５２号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１２年９月１０日に出願された日本国特許出願第２０１２－１９８３５２号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。先ず、製造された多孔質セルロースビーズまたは吸着体の物性の試験方法につき説明する。
　なお実施例の欄では、１重量部に相当する具体的量を１ｋｇとした時、１体積部に相当する具体的量は１Ｌになるものとする。
　試験例１　ビーズ表面のＳＥＭ観察
　各製造例、参考例で得られた多孔質セルロースビーズ、または吸着体を５倍体積量の３０％エタノールで洗浄し、多孔質セルロースビーズに含まれる液体部分を３０％エタノールで置換した。次いで、５０％エタノール、７０％エタノール、９０％エタノール、特級エタノール、特級エタノール、特級エタノールを順に用いて多孔質セルロースビーズを同様に処理し、液体部分をエタノールで置換した。さらにｔ－ブチルアルコール／エタノールが３／７の混合液を用いて多孔質セルロースビーズを同様に処理した。次いで、ｔ－ブチルアルコール／エタノール＝５／５、７／７、９／１、１０／０、１０／０、１０／０の混合液を順に用いて多孔質セルロースビーズを処理し、液体部分をｔ－ブチルアルコールで置換した後、凍結乾燥した。凍結乾燥を行なった多孔質セルロースビーズに蒸着処理を行い、ＳＥＭ像を撮影した。
　試験例２　排除限界分子量と最大細孔径の測定
　（１）カラム充填
　多孔質セルロースビーズまたは吸着体をＲＯ水に分散させ、１時間脱気した。脱気した多孔質セルロースビーズまたは吸着体を、線速１０５ｃｍ／ｈでカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製Ｔｒｉｃｏｒｎ　１０／３００）に充填した。その後、ｐＨ７．５の溶出液（１２９ｍＬ）を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液した。
　（２）マーカー添加
　マーカーとして以下のものを用いた。
　・Ｂｌｕｅ　Ｄｅｘｔｒａｎ　２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦＩｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
　・Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ３，０００，０００
　・Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ６６０，０００
　・フェリチン（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ４４０，０００
　・Ａｌｄｏｌａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ１５８，０００
　・ＩｇＧ　ヒト由来（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ１１５，０００（参考例１には不使用）
　・Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｗａｋｏ社製），ＭＷ６７，０００
　・Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ（Ｗａｋｏ社製），ＭＷ１２，４００
　・Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ　（Ｗａｋｏ社製），ＭＷ１，４００
　前記溶出液を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液しながら、上記マーカーをｐＨ７．５のバッファーにて５ｍｇ／ｍＬに薄めたものを、各々１２μＬずつ注入した。なお、マーカーの濃度は都度微調整した。
　（３）測定
　測定器として、ＤＧＵ－２０Ａ３、ＳＣＬ－１０Ａ、ＳＰＤ－１０Ａ、ＬＣ－１０ＡＤ、ＳＩＬ－２０ＡＣ、ＣＴＯ－１０ＡＣ（それぞれＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用い、測定ソフトウェアとして、ＬＣＳｏｌｕｔｉｏｎを用いた。液量測定には５０ｍＬメスシリンダーを用いた。
　マーカー注入と同時にＵＶモニターおよび液量の測定を開始し、
　１）ブルーデキストランの最初のピークに対応する液量をＶ0（ｍＬ）とした。
　２）各マーカーのピークに対応する液量をＶR（ｍＬ）とした。
　３）カラム内の多孔質セルロースビーズまたは吸着体のトータルボリュームをＶt（ｍＬ）とした。
　（４）算出
　各マーカーのゲル相分配係数（Ｋav）を次式で算出した。
　　　　　Ｋav＝（ＶR－Ｖ0）／（Ｖt－Ｖ0）
　（５）排除限界分子量と最大細孔径の算出
　各マーカーのＫavと分子量の対数をプロットし、直線性を示す部分から下記式の傾きと切片を求めた。
　　　　　Ｋav＝ｋ×Ｌn（分子量）＋ｂ
　次いで、求めた傾きと切片からＫavが０の時の分子量、つまり排除限界分子量を求めた。次に、中性緩衝液中の球状タンパク質の直径と分子量の下記相関式に排除限界分子量を代入し、求まった値を試料粒子の細孔の最大径とした。
　球状タンパク質の中性緩衝液中の直径（Å）＝２．５２３×分子量0.3267
　　試験例３　平均細孔径の算出
　上記試験例２（５）において、直線性を示す部分の最大Ｋav／２に相当する分子量を前記中性緩衝液中の球状タンパク質の直径と分子量の相関式に代入し、求まった値を多孔質セルロースビーズまたは吸着体の細孔の平均径とした。
　なお、試験例２および試験例３において、吸着体の目的吸着物質に対するＫavを測定する場合、目的吸着物質が吸着されてしまい、正確な測定ができなくなるおそれがある。よって、吸着体の目的吸着物質に対するＫavは、目的吸着物質と近い分子量を有する２種以上のタンパク質のＫavを測定し、それらのデータから計算で求めた。例えば、目的吸着物質がＩｇＧの場合、フェリチンとアルブミンのデータからＫavを求めた。
　試験例４　ＩｇＧアクセシブルな比表面積(以下、単に比表面積ともいう）の算出
　多孔質セルロースビーズの細孔構造を、各マーカー分子の直径に相当する円筒型の孔と仮定し、ＩｇＧアクセシブルな比表面積を算出した。具体的には、上記試験例２（５）で求めた直線の式と、前記中性緩衝液中の球状タンパク質の直径と分子量の相関式を利用し、排除限界分子量からＩｇＧの分子量（本試験例では１４万６千とした）までの間におけるＫａｖと細孔径をプロットして得られる直線を得た。この直線を任意に区割りし、各区間Ｋａｖ（各区間の円筒型細孔容量とみなす）から各区間の円筒型細孔の壁面積を求め、これをＩｇＧ相当点まで累積し、ＩｇＧアクセシブルな比表面積とした。
　試験例５　理論ＩｇＧ飽和吸着量の算出
　試験例４で算出したＩｇＧアクセシブルな比表面積から理論ＩｇＧ飽和吸着量を算出した。具体的には、下記式で多孔質セルロースビーズ中の単位体積当たりのＩｇＧ個数を求めた。
　単位体積当たりのＩｇＧ個数＝ＩｇＧアクセシブルな比表面積÷ＩｇＧ占有面積
　算出されたＩｇＧ個数から単位体積（ビーズの沈降体積）あたりのＩｇＧ重量を算出し、理論ＩｇＧ飽和吸着量とした（沈降時のビーズの充填率を６０％と仮定）。
　尚、ＩｇＧ占有面積は前記中性緩衝液中の球状タンパク質の直径と分子量の相関式から求めた。
　試験例６　メジアン粒径の測定
　　レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置（堀場社製ＬＡ－９５０）を用いて、多孔質セルロースビーズの体積基準の粒度分布を測定し、メジアン粒径を求めた。
　試験例７　強度評価
　ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ　１０Ｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、多孔質セルロースビーズまたは吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４５０ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールと蒸留水で調製）を１時間通液して充填した。次いでｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ製）を任意の線速で通液し、圧密化がおきる線速を求めて強度評価とした。
　試験例８　ＲＴ３分での動的吸着量（ＤＢＣ）測定
　（１）溶液作成
　以下の溶液を調製した。
　　Ａ液：ｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ製）
　　Ｂ液：ｐＨ３．５Ｍの３５ｍＭ酢酸ナトリウム（ナカライテスク社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調製）
　　Ｃ液：１Ｍ酢酸（ナカライテスク社製の酢酸とＲＯ水で調製）
　　Ｄ液：１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（ニチヤク社製ガンマグロブリンニチヤク１５００ｍｇ／１０ｍＬとＡ液で調製）
　　Ｅ液：６Ｍ尿素（関東化学社製の尿素とＲＯ水で調製）
　各溶液は、使用前に脱泡した。
　（２）充填、準備
　カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ　１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４５０ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調整）を１時間通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍｌの採取用チューブをセットした。この溶出液の採取用チューブには、あらかじめ中和液を入れておいた。
　（３）ＩｇＧ精製
　Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液を、ＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液した。ここで、５％破過した時のＩｇＧ負荷量をＲＴ３分での５％ＤＢＣとした。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ，Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、再生処理を行った。
　試験例９　ＲＴ６分での動的吸着量測定
　試験例８の（３）における線速を１５０ｃｍ／ｈとして求めた。
　試験例１０　ＲＴ９分での動的吸着量測定
　試験例８の（３）における線速を１００ｃｍ／ｈとして求めた。
　試験例１１　エポキシ基定量
　エポキシ化多孔質セルロースビーズを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製３Ｇ－２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）し、サクションドライ後の多孔質担体１．５ｇをスクリュー菅（マルエム社製）に秤量し、１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製チオ硫酸ナトリウムとＲＯ水で調整）４．５ｍＬを加えた。４５℃で３０分間加温した後、ＲＯ水を加えて液量を５０ｍＬとし、１００ｍＬのガラス製ビーカーに移し、１％フェノールフタレイン溶液（和光純薬工業社製フェノールフタレインとエタノールで調整）を数滴添加した。０．０１Ｎ塩酸（和光純薬工業社製、容量分析用）で滴定し、エポキシ基含量を求めた。
　試験例１２　デキストラン硫酸導入量の定量
　デキストラン硫酸とトルイジンブルーが親和性を有することを利用して測定した。すなわち１ｍＬの吸着体に対し、約９０ｍｇ／Ｌに調整したベーシック・ブルー１７（東京化成社製）水溶液を１２０ｍＬ加え、１０分間攪拌、６０分間静置後、上清のベーシック・ブルーを６３０ｎｍにおける吸光度により定量し、その減少量から求めた。
　製造例１
　（１）アルカリ水溶液Ａの作製
　和光純薬社製の水酸化ナトリウムと蒸留水を用いて、３３重量％の水酸化ナトリウム水溶液を作製し、４℃に調整した。
　（２）セルロース分散液Ａの作製
　旭化成ケミカルズ社製局方セルロースＰＨ－Ｆ２０ＪＰ（メジアン粒径：２１μｍ）９．２重量部と蒸留水１０４重量部を混合し、攪拌しながら４℃に調整した。次いで設定温度と攪拌を維持しながら４℃に調整したアルカリ水溶液Ａを４０重量部投入し、３０分間攪拌した。
　（３）多孔質セルロースビーズの作製
　４℃に調整されたセルロース分散液Ａ１５４重量部と、４℃に調整されたオルトジクロロベンゼン７７６重量部と、４℃に調整されたソルビタンモノオレエート（ｓｐａｎ８０相当品）７．８重量部を混合し、ディスクタービン（rushton turbine）翼２枚（図１６参照。以下、同様）を取り付けたセパラブルフラスコ内にて、３００ｒｐｍ（Ｐｖ値：０．２ｋＷ／ｍ3）で４℃、３０分間攪拌し、エマルションを作製した。設定温度と攪拌を維持しながら４℃に調整されたメタノール５７重量部を凝固溶媒として加えた。また凝固溶媒の添加所要時間は２秒であった。その後、攪拌数と設定温度を維持しながら２０分間攪拌した。吸引濾過を行なった後、エタノール２４０重量部を用いて洗浄を行い、次いで５００重量部の水で洗浄を行い、多孔質セルロースビーズを得た。図１に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。得られた多孔質セルロースビーズを、３８μｍと９０μｍの篩を用いて湿式分級した。
　（４）架橋　－　方法Ａ（特開２００８－２７９３６６参考法）
　上記多孔質セルロースビーズ１１体積部に蒸留水を加えて１６．５体積部として、反応容器に移した。ここに４Ｎ　ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製のＮａＯＨと蒸留水で調製）を３．８６体積部加え、４０℃に調整した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ－３１４（ナガセケムテックス社製）を１．７７重量部投入し、４０℃で４時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋１回ビーズを得た。
　得られた架橋１回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質ビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて、１２０℃で１時間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化したオートクレーブ済みの架橋１回ビーズを得た。
　次いで、このオートクレーブ済みの架橋１回ビーズ１１体積部に蒸留水を加えて１６．５体積部とし、反応容器に移した。これに４Ｎ　ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製のＮａＯＨと蒸留水で調製）を３．８６体積部加え、４０℃に調整した。ここにデナコールＥＸ－３１４（ナガセケムテックス社製）を１．７７重量部投入し４０℃で４時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過しながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋２回ビーズを得た。
　得られた架橋２回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質ビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて１２０℃で６０分間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、オートクレーブ済みの架橋２回ビーズを得た。
　（５）架橋多孔質セルロースビーズの物性試験
　上記架橋多孔質セルロースビーズのメジアン粒径は７５μｍであった。また、平均細孔径は２１５Å、最大細孔径は１７５６Åで、排除限界分子量は５．０×１０8であった。また、比表面積は７．１７×１０７ｍ２／ｍ３、理論ＩｇＧ飽和吸着量は７９ｇ／Ｌであった。
　製造例２　無配向型プロテインＡの調製
　本発明で使用した無配向型プロテインＡは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来プロテインＡからシグナルシーケンス（Ｓドメイン）及び細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）を除いた部分にあたり、ＷＯ２００６／００４０６７においてＳＰＡ’として記載されているものである。当該無配向型プロテインＡを、ＷＯ２００６／００４０６７の実施例に記載の方法に準じて調製した。なおこのＷＯ２００６／００４０６７の全内容が、本願に参考のため援用される。
　実施例１
　下記手順に従って、無配向型プロテインＡを固定化した吸着体を作製した。製造例１で得られた架橋多孔質セルロースビーズ１１．０ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を１７．０ｍＬとし、５０ｍＬの遠沈管に入れ、これを２５℃にてミックスローター（アズワン社製　ミックスローターＭＲ－３）上に取り付けた後、攪拌した。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解させて、８．６４ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を６．０ｍＬ作成し、先程の架橋多孔質セルロースビーズを入れた遠沈管に加え、２５℃で１時間攪拌した。反応後、グラスフィルター（シバタ社製　１１ＧＰ１００）上で、濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ
　ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製、ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０　Ｐｕｒｅ＋）で測定した。
　得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ９．０ｍＬをグラスフィルター（シバタ社製　１１ＧＰ１００）上でｐＨ８のバッファー（０．５Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物（関東化学社製）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（関東化学社製））３０ｍＬで置換した。ｐＨ８のバッファー（０．５Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）を用いて、置換後のホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを、遠沈管に移し入れ、総体積量１４．０ｍＬとなるように液量を調整した。ここに、上記製造例２で調製した、無配向型プロテインＡの濃度が６７．５８ｍｇ／ｍＬの溶液を５．３２７ｇ加えた後、６℃にて、０．０８ＮＮａＯＨ（ナカライテスク社製のＮａＯＨとＲＯ水で調製）を用いて、ｐＨを１２に調整した後、６℃にて２３時間、ミックスローター（アズワン社製　ミックスローターＭＲ－３）を用い、攪拌させながら反応させた。
　２３時間反応後、２．４Ｎクエン酸（関東化学社製クエン酸とＲＯ水で調製）を用いて反応液のｐＨを５．０に調整した後、６℃で４時間、ミックスローター（アズワン社製　ミックスローターＭＲ－３）を用いて、攪拌させた。引き続き、５．５％ジメチルアミンボラン（ＤＭＡＢ）水溶液（キシダ化学社製ジメチルアミンボランとＲＯ水で調整）を０．３９ｍＬ加えて、６℃で１時間攪拌した後、反応温度を２５℃に上昇させ、２５℃で１８時間、ミックスローター（アズワン社製　ミックスローターＭＲ－３）を用いて攪拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７８ｎｍ付近の吸収極大のＵＶ吸光度を測定しプロテインＡの導入量を求めた。
　反応後のビーズをグラスフィルター（シバタ製　１１ＧＰ１００）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次いで、３倍体積量の０．１Ｎクエン酸水溶液（関東化学社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調製）を加え、当該ビーズに０．１Ｎクエン酸一水和物を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、２５℃で３０分間攪拌しながら、酸洗浄を行った。
　酸洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ製１１ＧＰ１００）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、ビーズの３倍体積量の水溶液（０．０５Ｍ水酸化ナトリウム、１Ｍ硫酸ナトリウム（ナカライテスク製水酸化ナトリウム、関東化学社製硫酸ナトリウム及びＲＯ水で調製））を加えた。次に、当該ビーズに水溶液（０．０５Ｍ水酸化ナトリウム、１Ｍ硫酸ナトリウム）を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、室温で３０分間攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。
　アルカリ洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ製　１１ＧＰ１００）上で、ビーズの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、ビーズの３倍体積量の０．５Ｎクエン酸三ナトリウム水溶液（関東化学社製クエン酸三ナトリウム二水和物とＲＯ水で調製）を加え、濾液が中性になっていることを確認した後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が１μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄濾液の電導度は導電率計（ＥＵＴＥＣＨ　ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製、ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０　Ｐｕｒｅ＋）で測定した。
　得られたプロテインＡを固定化した吸着体について、試験例８～１０に従って物性評価を行った。結果を以下に示す。
 　 プロテインＡ導入量:３５ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：４３ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　　ＲＴ６分での５％ＤＢＣ：４９ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　　ＲＴ９分での５％ＤＢＣ：５１ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例３
　凝固溶媒を１５重量％クエン酸一水和物メタノール溶液とした以外は製造例１と同様に多孔質セルロースビーズを得た。図２に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例１と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍ、平均細孔径は１９０Å、最大細孔径は７１８Åで、排除限界分子量は３．２×１０7であった。また、比表面積は１．０４×１０8ｍ2／ｍ3、理論ＩｇＧ飽和吸着量は１１４ｇ／Ｌであった。
　実施例２
　製造例３で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量:３３ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：４３ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例４
　（１）多孔質セルロースビーズの作製
　攪拌速度を５００ｒｐｍ（Ｐｖ値：１．１ｋＷ／ｍ3）とした以外は、製造例１と同様に、多孔質セルロースビーズを作製した。図３に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また９０μｍの篩を６３μｍの篩に変更した以外は、製造例１と同様に分級を行った。
　（２）架橋　－　方法Ｂ
　上記多孔質セルロースビーズ２０体積部に蒸留水を加えて３０体積部とし、反応容器に移した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ－３１４（ナガセケムテックス社製）を２．３重量部投入し、４０℃に調整しながら攪拌を続けた。４０℃に調整後、３０分間攪拌した。次いで、２Ｎ　ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製と蒸留水で調製）７．１体積部を用意し、１時間に１／４ずつ加えた。この間、温度を４０℃に維持し、攪拌も継続した。最後の１／４量を添加後、同温度で１時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋１回ビーズを得た。
　得られた架橋１回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質セルロースビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて、１２０℃で１時間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化したオートクレーブ済みの架橋１回ビーズを得た。
　次いで、このオートクレーブ済みの架橋１回ビーズ２０体積部に蒸留水を加えて３０体積部とし、反応容器に移した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ－３１４（ナガセケムテックス社製）を２．３重量部投入し、４０℃に調整しながら攪拌を続けた。４０℃に調整後、３０分間攪拌した。次いで、２ＮＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製と蒸留水で調製）７．１体積部を用意し、１時間に１／４ずつ加えた。この間、温度を４０℃に維持し、攪拌も継続した。最後の１／４量を添加後、同温度で１時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋２回ビーズを得た。
　得られた架橋２回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質セルロースビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて１２０℃で６０分間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、オートクレーブ済みの架橋２回ビーズを得た。
　（３）架橋多孔質セルロースビーズの物性試験
　上記架橋ビーズのメジアン粒径は５６μｍであった。また、平均細孔径は３３６Å、最大細孔径は３４００Åで、排除限界分子量は３．８×１０9であった。また、比表面積は６．８８×１０7ｍ2／ｍ3、理論ＩｇＧ飽和吸着量は７５ｇ／Ｌであった。
このビーズは線速３０５７ｃｍ／ｈでも圧密化しなか・BR>チた。
　実施例３
　製造例４で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３６ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：７０ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例５
　凝固溶媒を１５重量％クエン酸一水和物エタノール溶液とした以外は製造例１と同様に、多孔質セルロースビーズを得た。図４に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例１と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍ、平均細孔径は１６３Å、最大細孔径は１０４０Åで、排除限界分子量は１．０×１０8であった。また、比表面積は７．８５×１０7ｍ2／ｍ3、理論ＩｇＧ飽和吸着量は８６ｇ／Ｌであった。
　実施例４
　製造例５で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３６ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：８ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例６
　６３μｍの篩を９０μｍの篩に変更した以外は、製造例４と同様に、多孔質セルロースビーズを得た。図５に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例４と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍであった。このビーズは装置で通液可能な最大線速である３０５７ｃｍ／ｈでも圧密化しなかった。
　実施例５
　製造例６で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３６ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：４２ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例７
　攪拌速度を７００ｒｐｍ（Ｐｖ値：３．１ｋＷ／ｍ3）とした以外は、製造例６と同様に、多孔質セルロースビーズを得た。図６に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例６と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍであった。このビーズは線速３０５７ｃｍ／ｈでも圧密化しなかった。
　実施例６
　製造例７で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３８ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：４９ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例８
　攪拌速度を２５０ｒｐｍ（Ｐｖ値：０．１ｋＷ／ｍ3）とした以外は、製造例６と同様に、多孔質セルロースビーズを得た。図７に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例６と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍ、平均細孔径は１３０Å、最大細孔径は５６２Åで、排除限界分子量は１．５×１０7であった。また、比表面積は８．７２×１０7ｍ2／ｍ3、理論ＩｇＧ飽和吸着量は９６ｇ／Ｌであった。
　実施例７
　製造例８で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３７ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：３６ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例９
　攪拌翼を図１６に示すＨ字形状部を２つ有する大型翼（本明細書ではＷＨ型大型翼という）１枚とし攪拌速度を３５０ｒｐｍ（Ｐｖ値：１．１ｋＷ／ｍ3）とした以外は、製造例６と同様に、多孔質セルロースビーズを得た。図８に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例６と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。造粒直後の粒度分布は、実施例５と比べて広かった。メジアン粒径は７５μｍであった。平均細孔径は４１８Å、最大細孔径は１１３７Åで、排除限界分子量は１．３×１０8であった。また、比表面積は８．３８×１０7ｍ2／ｍ3、理論ＩｇＧ飽和吸着量は９２ｇ／Ｌであった。
　実施例８
　製造例９で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３５ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：２９ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例１０
　凝固溶媒の添加所要時間を６０秒とした以外は、製造例６と同様に、多孔質セルロースビーズを得た。図９に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例６と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍであった。平均細孔径は１９４Å、最大細孔径は７４７Åで、排除限界分子量は３．７×１０7であった。また、比表面積は１．０２×１０8ｍ2／ｍ3、理論ＩｇＧ飽和吸着量は１１２ｇ／Ｌであった。
　実施例９
　製造例１０で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３１ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：５５ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例１１
　攪拌翼を傾斜パドル翼２枚とした以外は、製造例７と同様に、多孔質セルロースビーズを得た。図１０に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例７と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン径は７５μｍであった。平均細孔径は２２１Å、最大細孔径は２４０７Åで、排除限界分子量は１．３×１０9であった。また、比表面積は６．４２×１０7ｍ2／ｍ3、理論ＩｇＧ飽和吸着量は７０ｇ／Ｌであった。
　実施例１０
　製造例１１で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３４ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：３６ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例１２
　調整温度を９℃とした以外は、製造例１１と同様に、多孔質セルロースビーズを得た。図１１に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例１１と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。
　実施例１１
　製造例１２で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３４ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：２２ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例１３
　調整温度を０℃とした以外は、製造例１１と同様に、多孔質セルロースビーズを得た。図１２に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例１１と同様に、分級を行い、次いで架橋された多孔質セルロースビーズを得た。
　実施例１２
　製造例１３で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得た結果、物性は以下の通りとなった。
　　プロテインＡ導入量：３５ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：１４ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例１４
　（１）　セルロース分散液Ｂの作製
　旭化成ケミカルズ社製局方セルロースＰＨ－Ｆ２０ＪＰ（メジアン粒径：２１μｍ）７６ｇと蒸留水８００ｇを混合し、攪拌しながら４℃に調整した。次いで設定温度と攪拌を維持しながら４℃に調整したアルカリ水溶液Ａを４００ｇ投入し、３０分間攪拌した。
　（２）　多孔質セルロースビーズの作製
　４℃に調整されたセルロース分散液Ｂ１２７６ｇと、４℃に調整したオルトジクロロベンゼン７８０１ｇと、４℃に調整したソルビタンモノオレエート（ｓｐａｎ８０相当品）７８ｇを混合し、ディスクタービン（rushton turbine）翼２枚を取り付けたステンレス容器内にて４６０ｒｐｍ（Ｐｖ値：５．０ｋＷ／ｍ3）で４℃、１５分間攪拌し、エマルションを作製した。設定温度と攪拌を維持しながら４℃に調整されたメタノール５９２ｇを凝固溶媒として加えた。また凝固溶媒の添加所要時間は５秒であった。その後、攪拌数と設定温度を維持しながら３０分間攪拌した。加圧濾過を行なった後、洗浄液としてメタノール３０００ｇを用いて洗浄を行い、次いで３０００ｇの水で洗浄を行い、多孔質セルロースビーズを得た。図１３に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。また、製造例１と同様に、得られた多孔質セルロースビーズを、３８μｍと９０μｍの篩を用いて湿式分級した。
　その後、製造例４と同様に、架橋された多孔質セルロースビーズを得た。メジアン粒径は７５μｍであった。
　実施例１３
　製造例１４で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３５ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：５７ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例１５
　セルロース分散液Ｂを１２１２ｇ、オルトジクロロベンゼンを８２３８ｇ、ソルビタンモノオレエート（ｓｐａｎ８０相当品）を８５ｇ、凝固溶媒としてのメタノールを７４０ｇとした以外は、製造例１４と同様にして、多孔質セルロースビーズを得た。図１４に示す通り、表面に良好な孔が空いていることが確認できた。製造例１４と同様に分級と架橋を行った。
　実施例１４
　製造例１５で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、その後、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得て、物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ導入量：３０ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：６０ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　製造例１６　配向型プロテインＡの調製
　本発明で用いた配向型プロテインＡは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。これは、Ｃドメインの４、７、３５、４２、４９、５０、５８番目のＬｙｓをＡｒｇに、２９番目のＧｌｙをＡｌａに置換したＣドメイン変異体を、４つ連結させた（ただし、Ｃ末端のＬｙｓだけは無置換である）構造に相当する。当該配向型プロテインＡを、ＷＯ２０１１／１１８６９９に記載されたＣドメイン変異体、およびその連結体の調製方法に準じて調製した。なおこのＷＯ２０１１／１１８６９９の全内容が、本願に参考のため援用される。
　実施例１５
　製造例１４で得られた架橋多孔質セルロースビーズ３．５ｍＬを遠沈管に入れ、ＲＯ水を加えて、全量を６ｍＬとした。これを２５℃にてミックスローター（アズワン社製　ミックスローターＭＲ－３）上に取り付けた後、撹拌した。次に過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解した、１１．１６ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を２．０ｍＬ加え、２５℃で１時間撹拌した。反応後、グラスフィルター（シバタ社製　１１ＧＰ１００）上で、濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ　ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製、ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０　Ｐｕｒｅ＋）で測定した。
　得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ３．５ｍＬをグラスフィルター（シバタ社製　１１ＧＰ１００）上で、ｐＨ１２の０．６Ｍクエン酸 バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）で置換した。ｐＨ１２の０．６Ｍクエン酸バッファーを用い、置換後のホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを、遠沈管に入れ、総体積量７．５ｍＬとなるように液量を調整した。ここに、製造例１６で調製した配向型プロテインＡが入った水溶液（プロテインＡの濃度が６３．７ｍｇ／ｍＬ）を０．８２ｇ加えた後、６℃にて２３時間、ミックスローター（アズワン社製　ミックスローターＭＲ－３）を用い、攪拌させながら反応した。
　その後、反応液を回収（反応液１）し、ｐＨ８の０．１Ｍクエン酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、ＲＯ水を用いて調整）で置換して、６℃で４時間ミックスローター（アズワン社製　ミックスローターＭＲ－３）を用いて、攪拌した。引き続き、５．５重量％濃度のジメチルアミンボラン水溶液（和光純薬工業社製ジメチルアミンボランとＲＯ水で調製）を１．９３ｍＬ加えて、６℃で１時間攪拌した後、反応温度を２５℃に上昇し、２５℃で１８時間、ミックスローター（アズワン社製　ミックスローターＭＲ－３）を用いて攪拌しながら反応した。反応後、反応液を回収した（反応液２）。反応液１及び２の２７８ｎｍ付近の吸収極大のＵＶ吸光度を測定し、仕込んだリガンド量から差し引くことで、プロテインＡ固定化量を算出した。
　反応後のビーズをグラスフィルター（シバタ製　１１ＧＰ１００）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次いで、３倍体積量の０．１Ｎクエン酸一水和物（関東化学社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調製）を加え、当該ビーズに０．１Ｎクエン酸一水和物を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、２５℃で３０分間攪拌しながら、酸洗浄を行った。
　酸洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ製１１ＧＰ１００）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ナカライテスク製水酸化ナトリウム、関東化学社製硫酸ナトリウム及びＲＯ水で調製）を加えた。次に、当該ビーズに、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、室温で３０分間攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。
　アルカリ洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ製　１１ＧＰ１００）上で、ビーズの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、ビーズの３倍量の０．１Ｎクエン酸ナトリウム水溶液（関東化学社製クエン酸三ナトリウム二水和物＋ＲＯ水で調製）を加え、濾液が中性になっていることを確認した後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が１μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄濾液の電導度は導電率計（ＥＵＴＥＣＨ　ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製、ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０　Ｐｕｒｅ＋）で測定した。
　得られたプロテインＡを固定化した吸着体について、試験例８～９に従って物性評価を行った。結果を以下に示す。
　　プロテインＡ固定化量：９ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：５６ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　　ＲＴ６分での５％ＤＢＣ：６４ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　実施例１６
　加えるリガンドの量を１．６４ｍＬとした以外は、実施例１５と同様の方法で目的とする吸着体を作製した。物性は以下の通りとなった。
　　プロテインＡ導入量：１７ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：６１ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　　ＲＴ６分での５％ＤＢＣ：７９ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　比較製造例１
　（１）　セルロース溶液の作製
　１００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に６．４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ社製セオラスＰＨ１０１，メジアン粒径：７３μｍ）を加え、１２０℃に加熱して溶解した。この温度で貯蔵することが困難なため、用時調整とした。
　（２）　架橋多孔質セルロースビーズの作製
　チオシアン酸カルシウムを用いて作製される多孔質セルロースビーズを、ＷＯ２０１０／０９５５７３の実施例を参考に、以下のように作製した。具体的には、上記セルロース溶液に界面活性剤としてソルビタンモノオレエート６ｇを添加し、１４０℃に予め加熱したオルトジクロロベンゼン４８０ｍＬ中に滴下し、３００ｒｐｍにて攪拌した。次いで上記分散液を４０℃まで冷却し、メタノール１９０ｍＬ中に注ぎ、凝固させた。吸引濾過を行なった後、メタノール１９０ｍＬにて洗浄した。このメタノール洗浄を数回行なった。さらに大量の蒸留水で洗浄した後、吸引濾過を行い、多孔質セルロースビーズを得た。濾過後の多孔質セルロースビーズ１００ｇを１２１ｇの蒸留水に６０ｇの硫酸ナトリウムを溶解した液に加え、５０℃で２時間攪拌した。次いで、４５重量％の水酸化ナトリウム水溶液３．３ｇと水素化ホウ素ナトリウム０．５ｇを加えて攪拌した。５０℃で攪拌を継続しながら、４５重量％の水酸化ナトリウム水溶液４８ｇとエピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きに添加した。添加終了後、５０℃で１６時間反応させた。反応後、４０℃に冷却し、酢酸２．６ｇを加えて中和し、吸引濾過を行い、蒸留水で洗浄した。５３μｍと９０μｍの篩を用いて湿式分級を行ない、平均粒子径７８μｍの架橋された多孔質セルロースビーズを得た。
　（３）　物性試験
　上記架橋多孔質セルロースビーズの表面孔径は１６４９Åで、平均細孔径は７９３Å、最大細孔径は１４１００Åで、排除限界分子量は２．９×１０11であった。このビーズは線速３０５７ｃｍ／ｈでも圧密化しなかった。
　このように、比較製造例１で得られた架橋多孔質セルロースは、かなり大き過ぎる細孔を有するものであった。また、毒性の高いチオシアン酸カルシウムを含む溶液が廃液として残ってしまった。
　比較例１
　比較製造例１で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いて、実施例１と同様にプロテインＡを固定化した吸着体を得た結果、物性は以下の通りとなった。
　　プロテインＡ導入量：３２ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：４１ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　比較例２
　比較製造例１で作製した架橋多孔質セルロースビーズを用いた点と、配向型プロテインＡが入った水溶液の量を０．５１ｍＬとした点以外は、実施例１５と同様に配向型プロテインＡを固定化した吸着体を作製した。物性は以下の通りとなった。
　　プロテインＡ導入量：８ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：３５ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　　ＲＴ６分での５％ＤＢＣ：４１ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　比較例３
　配向型プロテインＡが入った水溶液の量を０．７６ｍＬとした点以外は、比較例２と同様に配向型プロテインＡを固定化した吸着体を作製した。物性は以下の通りとなった。
　　プロテインＡ導入量:１０ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：４１ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　　ＲＴ６分での５％ＤＢＣ：４８ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　比較例４
　配向型プロテインＡが入った水溶液の量を１．０１ｍＬとした点以外は、比較例２と同様に配向型プロテインＡを固定化した吸着体を作製した。物性は以下の通りとなった。
　　プロテインＡ導入量：１５ｇ／Ｌ（吸着体体積）
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：４４ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　　ＲＴ６分での５％ＤＢＣ：５２ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　参考例１
　比較的、モノクローナル抗体の吸着量が大きいタイプとして販売されている、プロテインＡが導入された架橋多孔質アガロースビーズ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　ＬＸ（ジーイーヘルスケア社製）の平均細孔径は４２５Å、最大細孔径は２９７０Åで、排除限界分子量は２．５×１０9であった。ビーズ表面のＳＥＭ像を図１５に示す。吸着性能は以下の通りであった。
　　ＲＴ３分での５％ＤＢＣ：４６ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　　ＲＴ６分での５％ＤＢＣ：６１ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）
　実施例１７
（１）エポキシ化
　実施例１４で作製した多孔質セルロースビーズを３８μｍと１５０μｍの篩を用いて湿式分級を行った。この分級後のビーズ１体積部にＲＯ水１体積部を加え、さらに２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を０．５３体積部加えて４５℃で３０分間加温した。次にエピクロロヒドリンを０．１８体積部加えて４５℃２時間攪拌した。グラスフィルター上で濾過を行い、大量のＲＯ水でビーズを洗浄し、エポキシ基含有多孔質セルロースビーズを得た。エポキシ含有量は湿潤重量１ｇあたり１７μｍｏｌであった。
（２）デキストラン硫酸の固定化
　エポキシ基含有多孔質セルロースビーズ０．７体積部に２６ｗｔ／ｖｏｌ％のデキストラン硫酸（硫黄含量約１８％、分子量約４０００）水溶液を添加して、液量を１．０体積部とした。次いで２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ＰＨを９．５に調整した。その後、４０℃１６時間攪拌した。グラスフィルター上で濾過を行い、大量のＲＯ水でビーズを洗浄し、デキストラン硫酸が固定化されえたビーズを得た。デキストラン硫酸導入量はビーズ１ｍＬあたり１４ｍｇであった。
（３）残存エポキシ基の封止
　デキストラン硫酸固定化ビーズ１体積部にＲＯ水１体積部とモノエタノールアミン０．２５体積部を添加し、４５℃２時間攪拌し、残存エポキシ基の封止反応を行った。グラスフィルター上で濾過を行い、大量のＲＯ水でビーズを洗浄し、目的とする吸着体を得た。
（４）ＬＤＬコレステロール吸着試験
　ヒト血液を３０００ｒｐｍで１５分間遠心処理を行い、ＬＤＬコレステロール濃度が９３ｍｇ／ｄＬの血漿を得た。この血漿３ｍＬを生理食塩水で洗浄した吸着体０．５ｍＬに加えて、３７℃で２時間振盪した。振盪後の上清のＬＤＬコレステロール量をＬＤＬコレステロールキット（積水メディカル社製コレステストＬＤＬ）を用いて測定し、吸着体に吸着されたＬＤＬコレステロール量を求めた。ただし、ビーズの替わりに生理食塩水を用いた場合の上清のＬＤＬ濃度が８１ｍｇ／ｄＬであったので、これを計算に用いた。８９％のＬＤＬコレステロールが吸着体に吸着されたことが分かった。すなわち、吸着体へのＬＤＬコレステロール吸着量は吸着体１Ｌあたり、５．０ｇであった。
　実施例１８
　実施例１７で加えた血漿量を６ｍＬとした以外は、実施例１７と同様にＬＤＬコレステロール吸着試験を行った。ただし、ビーズの替わりに生理食塩水を用いた場合の上清のＬＤＬ濃度が８７ｍｇ／ｄＬであったので、これを計算に用いた。その結果、６３％のＬＤＬコレステロールが吸着体に吸着されたことが分かった。すなわち、吸着体へのＬＤＬコレステロール吸着量は吸着体１Ｌあたり、７．０ｇであった。
　参考例２
　吸着型血漿浄化器リポソーバー ＬＡ－１５（カネカ社製）に充填されている吸着体を用いた以外は、実施例１７と同様にＬＤＬコレステロール吸着試験を行った。その結果、８０％のＬＤＬコレステロールが吸着体に吸着されたことが分かった。すなわち、吸着体へのＬＤＬコレステロール吸着量は吸着体１Ｌあたり、３．９ｇであった。
　参考例３
　吸着型血漿浄化器リポソーバー ＬＡ－１５（カネカ社製）に充填されている吸着体を用いた以外は、実施例１８と同様にＬＤＬコレステロール吸着試験を行った。その結果、５３％のＬＤＬコレステロールが吸着体に吸着されたことが分かった。すなわち、吸着体へのＬＤＬコレステロール吸着量は吸着体１Ｌあたり、５．５ｇであった。
　本発明の吸着体は、精製や治療に利用できる。

Claims (15)

  1. 　低温のアルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合して作製したセルロース分散液を、凝固溶媒に接触させて得られた多孔質セルロースビーズを用いることを特徴とする吸着体。
  2. 　アフィニティーリガンドを含有することを特徴とする請求項１に記載の吸着体。
  3. 　アフィニティーリガンドの導入量が、吸着体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上５００ｍｇ以下である請求項１または２に記載の吸着体。
  4. 　前記アフィニティーリガンドがプロテインＡであることを特徴とする請求項２または３に記載の吸着体。
  5. 　前記プロテインＡがアルカリ耐性を持つことを特徴とする請求項４に記載の吸着体。
  6. 　前記プロテインＡが配向制御型であることを特徴とする請求項５に記載の吸着体。
  7. 　ＲＴが３分の時のＩｇＧの５％ＤＢＣが６０ｇ/Ｌ以上であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の吸着体。
  8. 　ＲＴが６分の時のＩｇＧの５％ＤＢＣが７０ｇ/Ｌ以上であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の吸着体。
  9. 　デキストラン硫酸をリガンドとして含有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の吸着体。
  10. 　ＬＤＬコレステロールの吸着量が７ｇ／Ｌ以上であることを特徴とする、請求項１～３および９のいずれか一項に記載の吸着体。
  11. 　前記低温が２０℃以下である請求項１～１０のいずれか一項に記載の吸着体。
  12. 　前記セルロース分散液中のセルロース濃度が１～１０重量％である請求項１～１１のいずれか一項に記載の吸着体。
  13. 　前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度が５～１５重量％であることを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の吸着体。
  14. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載の吸着体を用いることを特徴とする精製方法。
  15. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載の吸着体を用いることを特徴とする治療方法。
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