WO2006025371A1 - 顆粒球吸着材 - Google Patents

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WO2006025371A1
WO2006025371A1 PCT/JP2005/015744 JP2005015744W WO2006025371A1 WO 2006025371 A1 WO2006025371 A1 WO 2006025371A1 JP 2005015744 W JP2005015744 W JP 2005015744W WO 2006025371 A1 WO2006025371 A1 WO 2006025371A1
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granulocyte
fraction
adsorbent
granulocytes
body fluid
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Akira Kobayashi
Shinya Yoshida
Hideo Niwa
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Kaneka Corporation
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    • A61M2202/0441—Granulocytes, i.e. leucocytes containing many granules in their cytoplasm

Definitions

  • the present invention relates to a granulocyte adsorbent for selectively adsorbing and removing granulocytes in a body fluid, a method for producing the adsorbent, a granulocyte adsorption device using the adsorbent, and a granulocyte removal cis And a body fluid from which granulocytes have been removed, prepared using the adsorbent.
  • Japanese Patent Publication No. 58-54126 discloses a technique for increasing the surface area of a granulocyte adsorbent, but it describes that lymphocytes are also adsorbed in addition to granulocytes, increasing the contact area. Just letting go does not express granulocyte selectivity.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2-193069 discloses a granulocyte by using a carrier having higher affinity for granulocytes than lymphocytes as a carrier for adsorbing granulocytes that can be used for judgment of pathological changes in cancer patients and for cancer treatment. Selectively The effect of adsorption is disclosed.
  • This carrier also has a material force with a contact angle with water in the range of 55 to 95 degrees.
  • a material having high affinity with granulocytes polystyrene, cellulose acetate, 6-nylon, polyethylene terephthalate Etc. are illustrated.
  • neutrophils are reported to have a high affinity with materials whose contact angle to the water of the adhesion substrate is about 70 degrees. Report that the impact is significant.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-168706 discloses that the adhesion of granulocytes is defined by the surface roughness of the contact surface which is not related to the contact angle of the material.
  • factors such as the roughness of the adhesion substrate surface and hydrophilicity / hydrophobicity (contact angle), which are not effective simply by increasing the contact area, are involved.
  • contact angle hydrophilicity / hydrophobicity
  • the selectivity of granulocytes is not satisfactory even when using materials with adjusted contact angles and surface roughness.
  • the development of a granulocyte separating material, a granulocyte adsorption device, and a processing method that further improve the selectivity of granulocytes is eagerly desired.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 54-46812
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 57-11920
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 58-54126
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2-193069
  • Patent Document 5 JP-A-5-168706
  • Non-Patent Document 1 Proceedings of 19th Medical Polymer Symposium, p. 51-52, Society of Polymer Science, June 11, 1990
  • the present invention uses a granulocyte adsorbent material that can further improve the efficiency of selectively removing granulocytes, a method for producing the adsorbent material, and the adsorbent material, which could not be achieved by the prior art. It is an object of the present invention to provide a granulocyte adsorption device, and a body fluid prepared by using the adsorbent and from which granulocytes are removed.
  • the present invention also provides granules for extracorporeal circulation that have the ability to selectively adsorb and remove granulocytes in body fluids in extracorporeal circulation and have high fluid compatibility (for example, platelet adhesion action is suppressed). It is an object of the present invention to provide a sphere adsorbent and a granulocyte removal system using the same.
  • the inventors have been reported to have an affinity for granulocytes, such as cellulose acetate!
  • the inventors of the present invention studied diligently about a conjugate of a polymer compound obtained by bonding a polymer compound having a hydroxyl group to another compound through a bond that can be cleaved by contact with an alkaline solution.
  • the removal of a part of the compound from the conjugate significantly increases the specific affinity for granulocytes compared to the affinity for mononuclear cells including lymphocytes and monocytes.
  • the present invention provides the following:
  • the polymer compound is a polybulual alcohol or polybum alcohol having an unsubstituted hydroxyl group and a hydroxyl group in which H in the group is substituted by one or more substituents R.
  • the granulocyte adsorbent according to (1) which is a rubber copolymer or a polysaccharide.
  • a method for preparing a body fluid or cell suspension from which granulocytes have been removed is provided.
  • granulocytes can be selectively removed from body fluids such as peripheral blood and bone marrow with high efficiency.
  • the body fluid from which the granulocytes according to the present invention have been removed can be used as a cell source used in regenerative medicine and cell medicine such as myocardial regeneration and blood vessel regeneration.
  • the polymer compound having a plurality of hydroxyl groups in the present invention may be a synthetic product or a natural product.
  • Examples of the polymer complex having a plurality of hydroxyl groups in the present invention include a crosslinked polybulal alcohol alone or a copolymer with polybulal alcohol, such as an ethylene butyl alcohol copolymer, a styrene butyl alcohol copolymer. , Attalylate butyl alcohol copolymer, acrylamide butyl alcohol copolymer, and polysaccharide.
  • the polysaccharide in the present invention includes, but is not limited to, cellulose, sepharose, dextran, agarose, chitin, chitosan and the like.
  • polybutyl alcohol, ethylene butyl alcohol copolymer, cellulose, chitosan and the like are used.
  • any compound that can react with a hydroxyl group of the polymer compound to form a conjugate of the polymer compound can be used.
  • the bond can be cleaved under alkaline conditions, particularly by contact with a mild alkaline solution.
  • non-limiting examples of “other compounds” include inorganic acids such as phosphoric acid, sulfuric acid; organic acids such as saturated or unsaturated branched or linear aliphatic monovalent, 2 Or carboxylic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, acrylic acid, methacrylic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid; saturated or unsaturated branched or linear aromatic monovalent, divalent Or a polycarboxylic acid such as benzoic acid; an amino acid such as dartami Acids; alcohols such as saturated or unsaturated branched or straight chain aliphatic monovalent, divalent or polyhydric alcohols such as methanol, ethanol, 1 propanol, isopropyl alcohol, cyclohexanol, ethylene glycol, glycerin Saturated or unsaturated branched or straight chain aromatic monovalent, divalent or polyhydric alcohols such as benzoyl alcohol; Pre
  • the reaction between the acid and the polymer compound having a plurality of hydroxyl groups can be achieved by forming an ester bond in the presence of a suitable catalyst such as sulfuric acid.
  • the reaction between the alcohol and the polymer compound having a hydroxyl group can be achieved by forming an ether bond in the presence of a suitable catalyst such as sulfuric acid.
  • substituted R means an arbitrary atomic group capable of substituting H of the hydroxyl group of the polymer compound having a hydroxyl group.
  • the “substituent R” is understood to be a group derived from the “other compound” generated by a reaction (typically a dehydration reaction) between the hydroxyl group and the “other compound”. .
  • a hydroxyl protecting group well known in the art may be used for the substituent R. Hydroxyl protecting groups are described, for example, in T. H. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in urganic Synthesis ⁇ d / 3 ⁇ 4x, John “Wiley & Sons, New York (1999).
  • Examples of the hydroxyl protecting group include an ether protecting group, an acetal protecting group, a silyl protecting group, and an ester protecting group.
  • An ether-based protecting group means a protecting group that forms an ether bond for the purpose of protecting a hydroxyl group, and is a methyl group, an ethyl group, a tert butyl group, an octyl group, an aryl group, or a benzyl group that is substituted with H of the hydroxyl group.
  • the acetal-based protecting group represents a protecting group that forms an acetal bond for the purpose of protecting the hydroxyl group, and examples thereof include a methoxyethyl group, an ethoxyethyl group, a tetrahydrovinyl group, and a tetrahydrofuranyl group.
  • a silyl-based protecting group means a protecting group that forms a silyloxy group bond for the purpose of protecting a hydroxyl group, and includes a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, and a tert-butyldiphenylsilyl group. Etc.
  • the ester-based protecting group protects the hydroxyl group.
  • a protective group which forms an ester bond for the purpose is represented, and examples thereof include a acetyl group, a propionyl group, an isopropyl group, a pivaloyl group, a benzoyl group, a trifluoroacetyl group, and a trichloroacetyl group.
  • substituent R include saturated or unsaturated, linear or branched, aliphatic acyl (eg, alkoxycarbol, acetyl, oleyl, etc.), saturated or unsaturated, Linear or branched aromatic acyl (eg aryloxycarbonyl, benzoyl, cinnamoyl, etc.), saturated or unsaturated, linear or branched, alkyloxy, alkyloxy, alkyloxy More preferred substituents R include aliphatic or aromatic saturated acyl (for example, benzoyl), and most preferably acetyl. The substituent may be replaced with an optional substituent such as halogen.
  • aliphatic acyl eg, alkoxycarbol, acetyl, oleyl, etc.
  • Linear or branched aromatic acyl eg aryloxycarbonyl, benzoyl, cinnamoyl, etc.
  • substituents R include aliphatic or aromatic saturated
  • the granulocyte adsorbent according to the present invention comprises (a) a hydroxyl group of a polymer compound having a plurality of hydroxyl groups and one or more other compounds that can be cleaved under alkaline conditions.
  • Such polymer-compound-compound conjugates are commercially available. It is also possible to obtain a polymer compound / compound conjugate by reacting the polymer compound with another compound according to a method known per se.
  • cellulose acetate can be obtained by adding an acetylating agent containing acetic anhydride or the like to cellulose obtained from pulp or the like.
  • cellulose acetate can also be obtained by reacting a polymer compound having a hydroxyl group (for example, cellulose) with another compound (for example, acetic acid) by a method known per se.
  • poly (acetate butyl) is a powerful mixture of monomeric butyl acetate and triallyl isocyanurate (TAIC).
  • TAIC triallyl isocyanurate
  • the polymer compound compound conjugate includes a plurality of bonds between the hydroxyl group of the polymer compound and the other compound.
  • the conjugate is treated under mild alkaline conditions, whereby a part of the plurality of linkages is cleaved by, for example, a hydrolysis reaction.
  • the degree of cutting can be appropriately adjusted according to the type of the conjugate and the intended use of the granulocyte adsorbent.
  • the proportion of hydroxyl groups substituted by acetyl groups is preferably 35 to 53%, more preferably 35 to 49% of all hydroxyl groups (including unsubstituted hydroxyl groups and substituted hydroxyl groups).
  • Polyacetate bur can be used.
  • the proportion of hydroxyl groups substituted by acetyl groups is preferably 35 to 53%, more preferably 40 to 53%, more preferably all hydroxyl groups (including unsubstituted hydroxyl groups and substituted hydroxyl groups). More preferably, cellulose acetate which is 45 to 51% can be used.
  • the hydroxyl group substituted by the substituent R out of the total hydroxyl groups (including unsubstituted hydroxyl group and substituted hydroxyl group) of the polymer compound is preferably 5 to 53%, more preferably 5 to 50%.
  • the ratio of hydroxyl groups substituted by the substituent R out of all hydroxyl groups (including unsubstituted hydroxyl group and substituted hydroxyl group) of the polymer compound is referred to as "hydroxyl group substituents.” It may be referred to as “substitution rate by R”, “substitution rate by substituent R” or simply “substitution rate”.
  • the substitution rate (%) of the hydroxyl group of cellulose acetate by a acetyl group can be measured, for example, as follows. After sufficiently drying the test substance, measure the dry weight with a precision balance (around 0.5 g) and place it in a flask. Add 50 ml of a solvent (for example, acetone aqueous solution) that can dissolve the test substance and stir with a stirrer at room temperature for 1 hour. Next, add 50 ml of 0.2N sodium hydroxide aqueous solution, stir for 5 minutes, and let stand at room temperature for 3 hours.
  • a solvent for example, acetone aqueous solution
  • an elemental analyzer Mericrocoder JM 10 type manufactured by GA Science Lab can be used.
  • the partial decomposition reaction in step (b) is carried out under the following conditions. It is preferable to be broken.
  • the normality of the alkaline solution is preferably in the range of 0.01N (normative) to 2. ON, more preferably in the range of 0.05N to 1N, and most preferably in the range of 0.0N force and 0.5N.
  • the reaction time is preferably in the range of 1 minute to 120 minutes, more preferably in the range of 1 minute to 100 minutes, more preferably in the range of 5 minutes to 60 minutes, and most preferably in the range of 10 minutes to 40 minutes. .
  • the reaction temperature is preferably in the range of 10 ° C to 90 ° C, more preferably in the range of 15 ° C to 75 ° C, and most preferably in the range of 20 ° C to 58 ° C.
  • the partial decomposition reaction in step (b) is preferably performed under the following conditions. Normality of alkaline solution is from 0.01 N (normative) to 6. ON range is preferred 0.1 N force 5. ON range is more preferred 1N to 3.8 N range is most preferred.
  • the reaction time is preferably in the range of about 1 minute to 10 hours, more preferably in the range of 30 minutes to 6 hours, and most preferably in the range of 1 hour to 5.5 hours.
  • the reaction temperature is preferably in the range of 10 ° C to 90 ° C, more preferably in the range of 15 ° C to 75 ° C, and most preferably in the range of 20 ° C to 58 ° C.
  • alcohol such as methanol, ethanol, or propanol is added. May be.
  • the content of alcohol is 0.1% (V / V), as long as the force is within the range of 99% (V / V). 50% (V / V) is preferred, and 10% (V / V) to 40% (V / V) is more preferred.
  • the cleavage product may be purified after step (b)! /.
  • the purification method is not particularly limited, but the purification can be performed by washing such as washing with water.
  • the granulocyte adsorbent of the present invention is preferably water-insoluble.
  • body fluid includes blood, bone marrow fluid, umbilical cord blood, lymph fluid, diluted solutions thereof and the like.
  • a cell suspension derived from the body fluid can also be used.
  • Cell suspension is blood, bone marrow fluid, umbilical cord blood, lymph fluid, etc., collected from mammals, using ficoll, percoll, batina tube, rifoprep, HES (hydroxyethyl starch), etc.
  • the granulocyte adsorbent of the present invention can be processed into an arbitrary shape such as a spherical shape, a granular shape, a flat membrane shape, a fiber shape, and a hollow fiber shape. If spherical or granular, the average particle size is preferably about 50 / ⁇ ⁇ to 3000 ⁇ m, more preferably about 80 to 2000 ⁇ m, and most preferably about 100 to 1000 m.
  • the granulocyte adsorbent of the present invention which is spherical or granular is prepared, for example, as follows.
  • One or more raw material monomer compounds are dispersed and suspended in an appropriate viscous solvent, such as water, and the suspension is stirred and polymerized under conditions suitable for the polymerization reaction to obtain a predetermined shape.
  • a polymer is obtained.
  • the polymer is dissolved in a solvent, formed into droplets by the method (vibration method) described in JP-A-63-117039, and solidified by capturing in a coagulation bath to obtain a product having a predetermined shape.
  • the step (b) can be performed at one or both times before and after this step.
  • the surface of the granulocyte adsorbent of the present invention may be roughened by physical or chemical means.
  • the surface of the granulocyte-adsorbing material of the present invention can take any kind of structure such as a porous body, a non-porous body, or a skin layer structure.
  • a porous body When the surface is porous, granulocyte adsorption and condyles Accompanied by activation of site-power-ins produced by other blood cells including granulocytes! It is also possible to adsorb and remove substances together, which are preferable for living organisms such as enzymes and provoking substances.
  • the size of the pores is defined by the exclusion limit molecular weight.
  • the exclusion limit molecular weight is preferably 1.5 ⁇ 10 5 or less.
  • a size of 1.4 ⁇ 10 5 or less is used.
  • X 10 5 nonspecific adsorption increases, which may cause loss of useful proteins in body fluids.
  • those with a molecular weight of exclusion limit of 1.3 X 10 5 or less are more preferred 1.
  • those with 2 X 10 5 or less are more preferred 1.
  • 0 X 10 Most preferred is 5 or less.
  • Exclusion limit molecular weight refers to, for example, gel permeation chromatography as described in books such as “Experimental High Performance Liquid Chromatography” (Hiroyuki Hatano and Toshihiko Hanai, published by Chemical Dojin Co., Ltd.) It means the molecular weight of the smallest molecule having a molecular weight that cannot be penetrated, that is, excluded.
  • the porous body is preferably water-insoluble.
  • the granulocyte-adsorbing material of the present invention may be used alone, but can also be used in combination with any hard carrier or soft carrier.
  • any hard carrier or soft carrier for example, it is possible to use the core whose outer surface is coated with the granulocyte adsorbent of the present invention.
  • the carrier include inorganic carriers such as glass, silica gel, activated carbon, and the like, organic carriers made of synthetic polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide and crosslinked polystyrene, and polysaccharides such as crosslinked agarose and crosslinked dextrin.
  • Saponified cellulose polybutyl alcohol, ethylene-butyl acetate copolymer, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymethyl methacrylate, polyacrylic acid grafted polyethylene, polyacrylamide graph toy polyethylene, and these Representative examples include composite carriers such as organic mono-organic and organic-inorganic that can be obtained by the combination of these, but are not limited thereto.
  • the shape of the carrier any of spherical, granular, flat membrane, fiber, hollow fiber and the like can be used effectively. If the support is spherical or granular, the average particle size is about
  • the force is preferably 50 ⁇ m to 3000 ⁇ m.
  • S is preferable, more preferably about 80 to 2000 ⁇ m, and most preferably about 100 to 1000 111.
  • the granulocyte adsorbent of the present invention When using the granulocyte adsorbent of the present invention packed in a column, the It is important not to cause clogging. For this purpose, the granulocyte adsorbent of the present invention is required to have sufficient mechanical strength. Therefore, it is more preferable that the granulocyte adsorbent of the present invention is hard.
  • the granulocyte adsorbent of the present invention is in the form of a granular gel, the pressure loss ⁇ and the flow rate when the aqueous fluid is allowed to flow evenly after the gel is uniformly packed in a cylindrical column as shown in the reference example below. It is preferable that the relationship is a linear relationship up to about 0.3 kgZcm 2 .
  • granulocytes are granulocytes in mammalian peripheral blood, bone marrow, umbilical cord blood, granulocytes in leukocytes concentrated by phalysis, phycol, Batatin tube, HE S (hydroxyethyl)
  • the granulocytes in the leukocyte fraction collected by density gradient centrifugation using a starch) or the leukocyte fraction collected by these methods in a buffer solution, a culture solution or a physiological saline solution This refers to granulocytes in a cell suspension suspended therein.
  • adsorbing granulocytes using the granulocyte adsorbent of the present invention are possible. Typical examples of such a method include the following methods (1) to (3).
  • (1) Adsorbing granulocytes to a container equipped with a filter at the outlet that has a body fluid or cell suspension inlet and outlet, through which the body fluid or cell suspension passes but not the granulocyte adsorbent A method in which a body fluid or cell suspension is brought into contact with a device filled with a material.
  • a body fluid or cell suspension is added to a bag in which the granulocyte adsorbent is previously stored, and the body fluid or cell suspension and the granulocyte adsorbent are brought into contact with each other for a certain period of time. Another way.
  • the contact method include a method in which a body fluid or a cell suspension is contacted for a certain period of time in a perfusion state using a pump, etc., a method in which the body fluid or cell suspension is contacted at a constant flow rate without being perfused, There is a method of extruding at a constant flow rate.
  • the contact time is preferably 1 minute or longer.
  • the contact time is more preferably about 3 minutes to 4 hours, more preferably about 5 minutes to 3 hours, and most preferably about 10 minutes to 2 hours.
  • the method of (2) is a method in which the collected body fluid is added to a bag in which the granulocyte adsorbent is previously stored and the granulocyte adsorbent and the body fluid are brought into contact with each other.
  • Sphere adsorbent Into the bag containing the erythrocytes, the red blood cell removal fraction obtained by removing red blood cells from the blood by centrifugation or the like, or the fraction obtained by further concentrating the red blood cell removal fraction by centrifugation, etc. are added to the granules.
  • a method of bringing the sphere adsorbent into contact with the fraction a method of bringing the leukocyte fraction and granulocyte adsorbent collected by apheresis into the bag and bringing the granulocyte adsorbent into contact with the fraction and so on.
  • the contact time is preferably about 1 minute or longer.
  • the contact time is more preferably about 3 minutes to 4 hours, more preferably about 5 minutes to 3 hours, and most preferably about 10 minutes to 2 hours.
  • a red blood cell removal fraction obtained by removing red blood cells by body fluid or blood force centrifugation is cultured for a certain period of time! / Add the condylar granulocyte adsorbent directly to the system and allow it to coexist, and after a certain period of time, the granulocyte adsorbent does not pass V. Filter the granulocyte adsorbent and cell suspension with a filter A method is mentioned.
  • the methods (1) and (2) are easy to operate, and are particularly preferred as a method for adsorbing and removing granulocytes from body fluids or cell suspensions.
  • the present invention is not limited to these.
  • the present invention also relates to a device comprising a granulocyte adsorbent housed in a container.
  • a container There is no particular limitation on the form, material, and size of the container used for the device.
  • the form may be any form such as a sphere, a container, a bag, a tube, or a column.
  • Preferred specific examples include a transparent or translucent cylindrical container having a volume of about 0.1 to 500 ml and a diameter of about 0.1 to about LOcm.
  • the container can be made using any structural material. Specific structural materials include, for example, non-reactive polymers or biocompatible metals or alloys.
  • polystyrene examples include acrylonitrile polymers (for example, atta-tri-l-butyl styrene terpolymer), halogenated polymers (for example, polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, copolymer tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, etc. ), Polyamide, polysulfone, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polybromyl chloride acrylic copolymer, polycarbonate acrylonitrile butadiene styrene, polystyrene and the like.
  • acrylonitrile polymers for example, atta-tri-l-butyl styrene terpolymer
  • halogenated polymers for example, polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, copolymer tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, etc.
  • Polyamide poly
  • Useful metallic materials for the container include, for example, stainless steel, titanium, platinum, tantalum, gold, and alloys thereof, as well as gold-plated alloy iron, platinum-plated alloy iron, corolet mouth alloy, and titanium nitride coating.
  • stainless steel examples include stainless steel.
  • materials with sterilization resistance are particularly preferred. Examples include recon-coated glass, polypropylene, butyl chloride, polycarbonate, polysulfone, and polymethylpentene.
  • the device is not limited to this, but preferably has an inlet and an outlet for liquid, and passes through body fluid but does not pass through the granulocyte adsorbent. It is characterized in that the container provided is filled or suspended with the water-insoluble granulocyte adsorbent of the present invention.
  • the outflow prevention tool include filters such as mesh, nonwoven fabric, and cotton plug.
  • Anticoagulants include heparin, low molecular weight heparin, nafamostat mesylate, gabexate mesilate, argatroban, acid 'citrate' dextrose solution (ACD solution), citrate 'phosphate' dextrose solution (CPD solution) ) And other anticoagulant-containing anticoagulants may be used. Of these, henolin can be mentioned as the most commonly used anticoagulant.
  • the present invention also provides a bodily fluid or cell suspension from which granulocytes are removed, obtained by contacting a bodily fluid of a mammal or a cell suspension derived from the bodily fluid with the granulocyte adsorbent of the present invention.
  • the body fluid or cell suspension from which the granulocytes have been removed is obtained by (a) bringing the body fluid obtained from the mammal or the cell suspension derived from the body fluid into contact with the granulocyte adsorbent of the present invention, and thereafter (B) It can be prepared by a method comprising a step of recovering a body fluid or cell suspension from which granulocytes have been removed.
  • the recovery in (b) can be carried out by any method such as centrifugal separation, membrane filtration, and chromatography. A person skilled in the art can find a suitable method as a recovery method experimentally or empirically.
  • the concentration of the target cell in the body fluid or cell suspension from which the granulocytes have been removed can be further increased by performing a centrifuge separation operation.
  • the target cells in the body fluid or cell suspension from which the granulocytes have been adsorbed and removed can be concentrated using, for example, Huycol, Huycol-Nipak, Percoll, Batatina Tube, or Lifoprep. You can
  • the cells in the body fluid or cell suspension from which the granulocytes of the present invention have been removed can be used as cells for cell therapy or regenerative medicine.
  • Examples include vascular regeneration, myocardial regeneration, bone regeneration, cartilage regeneration, nerve regeneration, and adipose tissue regeneration.
  • the body fluid or cell suspension from which the granulocytes of the present invention have been removed may be used immediately after preparation, or may be used after thawing after refrigerated storage or cryopreservation.
  • the body fluid or cell suspension from which the granulocytes of the present invention have been removed can be used as a pharmaceutical composition by combining with other pharmaceutically acceptable carriers, excipients and the like.
  • a pharmaceutical composition is typically a pharmaceutical composition for direct administration to an affected area by a method such as blood transfusion, infusion or injection, or for transvascular administration to an affected area.
  • Such pharmaceutical compositions can be manufactured according to acceptable pharmaceutical techniques.
  • the present invention also relates to a disease using a body fluid or cell suspension of a mammal from which granulocytes have been removed, a cell for cell medicine or regenerative medicine prepared therefrom, or the pharmaceutical composition described above.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating. Specifically, this method relates to vascular occlusion such as obstructive arteriosclerosis and vascular regeneration, bone, cartilage regeneration, periodontal ligament, alveolar bone for heart failure such as myocardial infarction. However, it is not limited to these.
  • the granulocyte-adsorbing material of the present invention is particularly suitable for an application for ameliorating a disease by selectively removing granulocytes in a body fluid by extracorporeal circulation, typically by extracorporeal circulation using a blood perfusion method. is there.
  • Diseases treated by this method include those associated with granulocytes that cause inflammation (eg ulcerative colitis, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Behcet's disease). Is not limited.
  • the present invention also relates to a granulocyte removal system for extracorporeal circulation.
  • the granulocyte removal system for extracorporeal circulation of the present invention comprises at least a device containing the granulocyte adsorbent of the present invention in a container, a pump for feeding body fluid, and an anticoagulant infusion pump. Is provided. The device and the anticoagulant are as described above.
  • the contact method there is a method of directly contacting a body fluid with the device.
  • the contact method there is a method in which a body fluid is contacted for a certain period of time in a perfusion state by a liquid feed pump or the like.
  • the contact time is preferably about 3 minutes to 4 hours, more preferably 1 minute or more, and more preferably about 10 minutes to 2 hours, more preferably 5 minutes to 3 hours.
  • Cellulose acetate is dissolved in a mixed solvent of dimethyl sulfoxide and propylene glycol, and this solution is formed into droplets by the method described in JP-A-63-117039 (vibration method) and solidified to form spherical particles of cellulose acetate. Obtained.
  • the obtained spherical particles had a particle size of about 300 m.
  • the particles were mixed with a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution at a ratio of sedimentation volume ratio of 1: 1 (VZV) and brought into contact with each other for 30 minutes to effect partial hydrolysis.
  • Heparin was added to a phosphate buffer solution (PBS) to a final concentration of 22 IUZ ml, and 6 ml of the solution was added to a 50 ml 1 centrifuge tube. About 20 ml of bone marrow fluid collected from the humeral head was collected. The bone marrow fluid was prepared by removing blood clots, bone meal and the like by passing the bone marrow fluid through a 70 m cell strainer.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the granulocyte adsorbent was transferred to a 5 ml falcon tube to absorb the granulocyte adsorbent and remove the physiological saline so that it could not be removed.
  • 2 ml of bone cerebrospinal fluid prepared earlier was added and interacted at 37 ° C and lHr at a rotation speed of 20 rpm (MIX rotor (MIX-ROTAR VMR-5, Iu Chi Co., Ltd.)).
  • MIX rotor MIX-ROTAR VMR-5, Iu Chi Co., Ltd.
  • the ratio of both mononuclear cells and granulocytes fractions was determined using a flow cytometer (FACSCanto Betaton Dickinson).
  • the white blood cell count in the supernatant was 5100 cells / ⁇ 1.
  • the ratio of the granulocyte fraction, which is a constituent cell of the leukocyte, and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction) is 84.6% of the mononuclear cell fraction.
  • the fraction is 4.0%, and the granulocyte fraction cells are It was revealed that the particles were adsorbed significantly and selectively on the adsorbent.
  • the white blood cell count and the mononuclear cell / granulocyte fraction ratio were determined in the same manner as in Example 1 except that the normality of the sodium hydroxide sodium solution was changed to 0.2 normal.
  • the substitution rate of the thus obtained cellulose acetate cell by acetyl group was 46%.
  • the leukocyte count in the supernatant was eiOOcells / zzl.
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, was 79.0% for the mononuclear cell fraction, and the granulocyte fraction The ratio was 9.2%, which revealed that the granulocyte fraction cells were selectively and significantly adsorbed on the granulocyte adsorbent.
  • the obtained polymerization slurry was sampled and weighed, and a polymerization inhibitor was added thereto, and the volatile matter was dried in an oven at 120 ° C. The constant weight was confirmed and the dry weight was measured. Under the drying conditions, the amount of triallyl isocyanurate (TAI C) was negligibly small, and the polymerization conversion rate of vinyl acetate was calculated from the weight before and after drying to be 54%.
  • TAI C triallyl isocyanurate
  • NaOH weight of solids
  • the amount of water was adjusted so that the NaOH concentration relative to water was 2% by weight. This was stirred for 2 hours at a reaction temperature of 30 ° C for 2 hours. The substitution rate of the polyacetate vinyl thus obtained with acetyl groups was 41%. Thereafter, washing with water was carried out until the pH of the washing solution became near neutral, followed by extraction washing with adding warm water and stirring at 80 ° C. for 60 minutes four times. Furthermore, hot water of twice the particle sedimentation volume was added and extraction was performed twice for 20 minutes in an autoclave at 121 ° C to obtain crosslinked spherical particles. The resulting polymer particles had a particle size of about 30 O / z m.
  • the rabbit bone marrow fluid and the condyle granule adsorbent were contacted in the same manner as in Example 1 to determine the white blood cell count and the ratio of both the mononuclear cell and granulocyte fractions.
  • the white blood cell count in the supernatant was 6300 cells Z1.
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is 69.5% of the mononuclear cell fraction, and the granulocyte fraction The ratio was 19.5%, and it was revealed that the granulocyte fraction cells were selectively and significantly adsorbed to the condyle granule adsorbent.
  • the white blood cell count and the ratio of both mononuclear cells and granulocytes were determined in the same manner as in Example 1 except that the normality of the sodium hydroxide sodium solution was changed to 0.4 normal.
  • the substitution rate of the obtained cellulose acetate with a acetyl group was 33%.
  • the white blood cell count in the supernatant was 850 Ocells / zzl.
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is a mononuclear cell fraction ratio of 60.2%. Ratio power S29. 6%, which is equivalent to Reference Example 1 (below).
  • the white blood cell count and the ratio of both mononuclear cells and granulocytes were determined in the same manner as in Example 1 except that the treatment with the sodium hydroxide sodium solution was not performed.
  • the substitution rate of the obtained cellulose acetate by acetyl groups was 55%.
  • the white blood cell count in the supernatant was 7200 cells / l.
  • the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (phosphorocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is 65.6% of mononuclear cell fraction, granulocyte fraction Fraction The force was S23.0%, which was equivalent to Reference Example 1 (below).
  • the white blood cell count and the ratio of both mononuclear cells and granulocytes were determined in the same manner as in Example 1 except that the treatment time of sodium hydroxide was changed to 120 minutes.
  • the substitution rate of the obtained cellulose acetate with a acetyl group was 33%.
  • the leukocyte count in the supernatant was 9500 cells / zzl.
  • the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (phosphorocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is 54.9% for the mononuclear cell fraction.
  • the fraction ratio was 31.3%, which was equivalent to Reference Example 1 (below).
  • the number of leukocytes and the ratio of both fractions of mononuclear cells and granulocytes were determined in the same manner as in Example 1 except that a small maggot bone marrow was used in contact with the granulocyte adsorbent. As a result, the white blood cell count in the supernatant was 10200cellsZ1. In addition, the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is 56.2% of the mononuclear cell fraction, the granulocyte fraction The ratio was 30.9%.
  • the white blood cell count and simpleness were determined in the same manner as in Example 1 except that a mixed solvent (5 (distilled water): 95 (ethanol)) prepared so that the final normality of sodium hydroxide was 0.2% was used. The ratio of the fractions of nuclei and granulocytes was determined. Substitution of cellulose acetate obtained with acetyl group The rate was 44%. As a result, the white blood cell count in the supernatant was 3800 cellsZ1.
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is 85.8% of the mononuclear cell fraction, The ratio was 5.5%, and it became clear that the cells of the condylar granulocyte fraction were selectively and significantly adsorbed on the granulocyte adsorbent.
  • Spherical particles were granulated in the same manner as in Example 1 except that the raw material for the granulocyte adsorbent was changed to polymethylmetatalylate (PMMA) and that the force was not applied. It was.
  • the spherical particle size of the obtained PMMA was about 300 m.
  • the rabbit bone marrow fluid and the granulocyte adsorbent were brought into contact with each other in the same manner as in Example 1, and the white blood cell count and the ratio of both mononuclear cells and granulocytes were determined. As a result, the leukocyte count in the supernatant was 53 OOcellsZ / ⁇ .
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction was 54.6% of the mononuclear cell fraction, the granulocyte fraction The ratio was 37.7%, which was equivalent to Reference Example 2 (below).
  • Spherical particles were granulated in the same manner as in Example 1 except that the raw material of the granulocyte adsorbent was changed to polyacrylonitrile (PAN) and that the alkali treatment was not performed.
  • the spherical particle size of the obtained PAN was about 300 m.
  • the rabbit bone marrow fluid and the granulocyte adsorbent were brought into contact with each other in the same manner as in Example 1, and the white blood cell count and the ratio of both mononuclear cells and granulocytes were determined. As a result, the white blood cell count in the supernatant was 5600 cells.
  • the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (phosphorocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is 54.1% of mononuclear cell fraction, granulocyte fraction The fraction ratio was 36.4%, which was equivalent to Reference Example 2 (below).
  • Spherical particles were granulated by the same method as in Example 1 except that the raw material of the granulocyte adsorbent was changed to polystyrene (PSt) and that the alkali treatment was not performed.
  • PSt polystyrene
  • the obtained PSt spherical particles had a particle size of about 300 m.
  • the rabbit bone marrow fluid and the granulocyte adsorbent are brought into contact with each other in the same manner as in Example 1. The ratio of both sphere fractions was determined. As a result, the leukocyte count in the supernatant was 5100 cells Z / n.
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the white blood cell, is 53.7% of the mononuclear cell fraction, The ratio was 38.3%, which was equivalent to Reference Example 2 (below).
  • Spherical particles were granulated in the same manner as in Example 1 except that the raw material for the granulocyte adsorbent was changed to polysulfone (PS) and that the alkali treatment was not performed.
  • the spherical particle size of the obtained PS was about 300 / zm.
  • the rabbit bone marrow fluid and the granulocyte adsorbent were brought into contact with each other in the same manner as in Example 1, and the white blood cell count and the ratio of both mononuclear cells and granulocytes were determined. As a result, the white blood cell count in the supernatant was 5800 cells Z / n.
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is 54.1% of the mononuclear cell fraction, the granulocyte fraction The ratio was 37.1%, which was equivalent to Reference Example 2 (below).
  • the number of leukocytes and the ratio of both fractions of mononuclear cells and granulocytes were determined in the same manner as in Example 1 except that a small maggot bone marrow was used in contact with the granulocyte adsorbent. As a result, the white blood cell count in the supernatant was 6300cellsZ1.
  • Example 4 the leukocyte count of Example 4, and Comparative Examples 4 to 7, Reference Example 2, and the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction which are constituent cells of the leukocyte (lymphocyte fraction + monocyte) The fractions) are summarized in Table 2.
  • Cellulose acetate is dissolved in a mixed solvent of dimethyl sulfoxide and propylene glycol, and this solution is formed into droplets by the method described in JP-A-63-117039 (vibration method) and solidified to form spherical particles of cellulose acetate. Obtained.
  • the obtained spherical particles had a particle size of about 300 m.
  • the particles were mixed with a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution at a ratio of sedimentation volume ratio of 1: 1 (VZV) and brought into contact with each other for 30 minutes to effect partial hydrolysis.
  • heparin sodium injection solution Yoshitomi Pharmaceutical Co., Ltd.
  • physiological saline prepared so that the final concentration of heparin was 5 IUZml.
  • I did a spear.
  • Oml of a sedimentation volume was packed in a minicolumn (acrylic, inner diameter 10 mm, height 38 mm). Attach a polysalt tube tube (inner diameter 1 mm, outer diameter 3 mm, length 70 cm) to the column inlet side, and a similar polysalt tube tube (length 30 cm) to the column outlet side. Installed. Blood was carefully collected from the upper arm using a 18G needle from a healthy volunteer.
  • Henon was used as the anticoagulant, and the concentration of helium in the blood was 5 IUZml.
  • 40ml of anticoagulant-added blood is placed in a Teflon (registered trademark) Erlenmeyer flask (with a volume of 50ml, Sanryo Co., Ltd.) and placed in a 37 ° C constant temperature bath and gently once every 5min. Stir.
  • a blood flow experiment was started at a flow rate of 0.5 mlZmin.
  • Column outlet side force Start time is the time when blood comes out.
  • the tip of the tube was returned to the blood pool and a perfusion experiment was performed for 120 minutes.
  • the sampling time from the column outlet side was 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes.
  • Table 3 shows the results of measuring blood cell counts (red blood cells, white blood cells, and platelets) with a blood cell counter (K 4500 Sysmetus Co., Ltd.) after a predetermined period of time.
  • Table 4 shows the results of measuring the fraction ratio of granulocytes and mononuclear cells (lymphocytes, monocytes) with a flow cytometer (FACSCanto Betaton Dickinson).
  • the white blood cell count on the column outlet side was about 1500 cellsZ ⁇ 1 on average.
  • the average was about 6500 cells Z 1.
  • the white blood cell count on the column outlet side was remarkably reduced. Little change was observed in erythrocytes and platelets compared to the reference example (Table 3).
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocytes, is the ratio when the adsorbent is packed and an empty column is used.
  • the blood cell count and the ratio of both mononuclear cell and granulocyte fractions were determined in the same manner as in Example 5 except that the normality of the sodium hydroxide sodium solution was changed to 0.2 normal.
  • the substitution rate of the obtained cellulose acetate with acetyl groups was 46%.
  • the white blood cell count on the column outlet side was about 1900 cells Z ⁇ 1 on average, which was found to be significantly reduced compared to Reference Example 3.
  • red blood cells and platelets almost no change was observed (Table 3).
  • the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are leukocyte constituent cells, is about 90% of mononuclear cell fraction and granulocyte fraction ratio. It was about 9%, and it was revealed that granulocytes were selectively and selectively adsorbed on the adsorbent as compared with Reference Example 3 (Table 4).
  • the solution was made into droplets by the method (vibration method) described in JP-A-63-117039 and coagulated to obtain cellulose acetate spherical particles.
  • the obtained spherical particles had a particle size of about 500 m.
  • the particles were treated with an alkali in the same manner as in Example 5 (the substitution rate of the obtained cellulose acetate with a acetyl group was 48.6%), the blood cell count, and the mononuclear cells' granules The ratio of both sphere fractions was determined.
  • the average white blood cell count on the column outlet side was about 2200 cells Z ⁇ 1, which was found to be significantly lower than in Reference Example 3.
  • red blood cells and platelets almost no change was observed (Table 3).
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is approximately 87% of the mononuclear cell fraction, and the granulocyte fraction ratio. It was revealed that granulocytes were selectively and selectively adsorbed on the adsorbent as compared with Reference Example 3 (Table 4).
  • the number of blood cells and the ratio of both fractions of mononuclear cells and granulocytes were determined in the same manner as in Example 5 except that the spherical particles of polyacetic acid bule prepared in Example 3 were used. As a result, it was revealed that the number of leukocytes at the column outlet side was about 2200 cells Z ⁇ 1 on average, which was significantly reduced compared to Reference Example 3. Little change was observed for red blood cells and platelets (Table 3).
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is approximately 90% of the mononuclear cell fraction, and the granulocyte fraction ratio. It was found that the granulocytes were selectively and significantly adsorbed on the adsorbent as compared with Reference Example 3 (Table 4).
  • the white blood cell count and the ratio of both mononuclear cells and granulocytes were determined in the same manner as in Example 5 except that the treatment with the sodium hydroxide sodium solution was not performed.
  • the substitution rate of the obtained cellulose acetate by acetyl groups was 54.0%.
  • the average white blood cell count on the column outlet side was about 3700 cellsZ1. No change in red blood cell count was observed.
  • the number of blood platelets showed a downward trend compared to the Examples (Table 3).
  • the ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is approximately 71% of the mononuclear cell fraction, the granulocyte fraction The ratio is about 25%.
  • granulocytes Although it was selectively adsorbed by the adsorbent, it exerted much power in the above examples (Table 4).
  • Example 8 Except that the particles obtained in Example 8 were not treated with sodium hydroxide! (No hatching reaction), leukocyte count and both mononuclear and granulocyte fractions were treated in the same manner as in Example 5. The ratio was determined. The substitution rate of the obtained polyacetic acid butyl with a acetyl group was 55%. As a result, the white blood cell count on the column outlet side was about 3500 cellsZ1 on average. Although the change in the red blood cell count was not recognized, the platelet count showed a downward trend compared to the Examples (Table 3).
  • the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is about 44% of the mononuclear cell fraction, the proportion of granulocyte fraction was about 52%, and the selectivity of granulocytes was hardly recognized (Table 4).
  • PVA spherical particles were obtained in the same manner as in Example 8, except that the hatching conditions in Example 8 were treated with a NaOH concentration of 4 wt%, a reaction temperature of 40 ° C., and a reaction time of 6 hours.
  • the substitution rate of the resulting polyacetate butyl acetate by a acetyl group was 4%.
  • the particle size was about 300 ⁇ m.
  • blood and granulocyte adsorbent were contacted in the same manner as in Example 5 to determine the white blood cell count and the ratio of both mononuclear cells and granulocytes. As a result, the average white blood cell count on the column outlet side was about 5700 cellsZ1.
  • the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is 31% for the mononuclear cell fraction and the ratio for the granulocyte fraction. 65%, equivalent to Reference Example 3 (Table 4).
  • the white blood cell count and the mononuclear / granulocyte double-sided ratio were obtained in the same manner as in Example 5. It was. As a result, the average white blood cell count on the column outlet side was about 5600 cellsZ 1. No significant change in the number of red blood cells was observed. The number of platelets showed a decreasing trend (Table 3).
  • the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocyte, is about 31% of the mononuclear cell fraction and the ratio of granulocyte fraction Is about 65% This was equivalent to Reference Example 3 (Table 4).
  • the number of leukocytes and the fraction of both mononuclear cells and granulocytes were determined in the same manner as in Example 5 except that the raw material for the particles was changed to polystyrene (PSt) and that the alkali treatment was not performed.
  • PSt polystyrene
  • the average white blood cell count on the column outlet side was about 5200 cells / 1.
  • Forced force with no change in red blood cell count Platelet count decreased significantly (Table 3).
  • the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the white blood cell, is about 32% of the mononuclear cell fraction. The fraction ratio was approximately 63%, which was equivalent to Reference Example 3 (Table 4).
  • the number of white blood cells and the ratio of both fractions of mononuclear cells and granulocytes were determined in the same manner as in Example 5 except that the column was used without packing the particles. As a result, the average white blood cell count on the column outlet side was about 6500 cellsZ1. No change in red blood cell count was observed. The platelet count was markedly reduced (Table 3). The ratio of the granulocyte fraction and the mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the white blood cell, is approximately 35% of the mononuclear cell fraction, and the granulocyte fraction ratio. was about 63% (Table 4).
  • Table 3 summarizes the number of blood cells on the column outlet side at each time point in Examples 5 to 8, Comparative Examples 8 to 12, and Reference Example 3.
  • Table 4 summarizes the ratio of granulocyte fraction and mononuclear cell fraction (lymphocyte fraction + monocyte fraction), which are the constituent cells of the leukocytes.
  • Red blood cells platelets: Ten thousand (eel Is / l)

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Abstract

　本発明は、無置換の水酸基と、基中のＨが１種または２種以上の置換基Ｒによって置換された水酸基とを有する重合体化合物を含有する顆粒球吸着材、この吸着材の製造方法、この吸着材を用いた顆粒球吸着用デバイスおよび顆粒球除去システム、並びにこの吸着材を用いて調製された、顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液に関する。

Description

明 細 書
顆粒球吸着材
技術分野
[0001] 本発明は、体液中の顆粒球を選択的に吸着除去するための顆粒球吸着材、該吸 着材の製造方法、該吸着材を用いた顆粒球吸着用デバイスおよび顆粒球除去シス テム、並びに該吸着材を用いて調製された、顆粒球が除去された体液に関する。 背景技術
[0002] 患者の血液中から選択的に細胞を分離する技術は、癌治療や細胞の成分輸血を 始め、特に近年、細胞医療、再生医療の発展に伴いそのニーズはさらに増大してい る。特に血液中の顆粒球を除去することは、移植後の炎症や GVDH (宿主対移植片 反応)を抑制するためにも重要な課題となっている。従来、血液中の顆粒球を分離す る方法として、フイコール液やパーコール液などを利用し、細胞の比重差を利用して 分離する比重密度勾配遠心法や、顆粒球を選択的に付着させるとされる素材、例え ばポリエステル繊維、ナイロン繊維、綿などを利用した方法が開示されている（特開 昭 54— 46812号、特開昭 57— 11920号など）。
[0003] し力しながら、比重密度勾配遠心法の場合、密度勾配に使用する液の細胞毒性な どの安全性の問題、また遠心洗浄操作などに時間を要し、開放系での操作であるた めにコンタミネーシヨンを起こしやす 、など操作性の問題、リンパ球の混入が生じるな どして分離効率が悪いという問題など多くの課題を残している。一方、比重密度勾配 遠心法に比べ、顆粒球を選択的に吸着させる方法は、閉鎖系での操作が可能など 安全面、操作性に優れており、さらに接触面積、材質や形状を工夫して分離効率を 向上させる試みもなされて 、る。
[0004] 特公昭 58— 54126号には、顆粒球吸着材の表面積を増加させる技術が開示され ているが、顆粒球以外にリンパ球も吸着する旨が記載されており、接触面積を増加さ せただけでは、顆粒球の選択性は発現されない。また特開平 2— 193069号には、 癌患者の病態変化の判断や癌治療に用い得る顆粒球吸着用担体として、リンパ球 に比べて顆粒球に対する親和性が高い担体を用いることにより、顆粒球を選択的に 吸着させる旨が開示されて 、る。
[0005] この担体は、水に対する接触角が 55度から 95度の範囲にある物質力もなるとされ ており、顆粒球と高い親和性を有する材質として、ポリスチレン、酢酸セルロース、 6 —ナイロン、ポリエチレンテレフタレートなどが例示されている。また顆粒球の主構成 細胞である好中球について、接触角と付着率に関する同様の報告がある（第 19回医 用高分子シンポジウム講演予稿集、 P. 51— 52、高分子学会、 1990年 6月 11日）。 本報告では、好中球は、接着基質の水に対する接触角が約 70度である材質と高い 親和性を有することを報告しており、顆粒球の選択性を発現させるためには、材質の 影響が大き 、ことを報告して 、る。
[0006] また一方で、特開平 5— 168706には、顆粒球の付着性は、材質の接触角には関 係なぐ接触表面の表面粗さに規定される旨が開示されている。このように顆粒球に 対する選択性を発現させるためには、単に接触面積を増カロさせただけでは効果がな ぐ接着基質表面の粗さ、親疎水性 (接触角）などの要因が関与していることが明らか になっている。しかしながら、接触角や表面粗さを調整した材質を用いても、顆粒球 の選択性は満足の 、くものではな ヽ。顆粒球の選択性をさらに向上させた顆粒球分 離材、顆粒球吸着装置、および処理方法の開発が切望されている。
[0007] また、従来市販されている顆粒球吸着カラムや白血球吸着カラムに関しては、血小 板が粘着するという体液適合性上の問題があった。血小板力カラム入口付近に多く 粘着することにより、圧力上昇が発生したり、血液中の血小板濃度の低下をまねく。 特許文献 1 :特開昭 54— 46812号公報
特許文献 2：特開昭 57— 11920号公報
特許文献 3：特公昭 58 - 54126号公報
特許文献 4：特開平 2— 193069号公報
特許文献 5 :特開平 5— 168706公報
非特許文献 1 :第 19回医用高分子シンポジウム講演予稿集、 p. 51— 52、高分子学 会、 1990年 6月 11日
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0008] 本発明は、前記の従来技術では達成され得なかった、顆粒球を選択的に除去する 効率をより一層向上させた顆粒球吸着材、該吸着材の製造方法、該吸着材を用いた 顆粒球吸着デバイス、並びに該吸着材を用いて調製された、顆粒球が除去された体 液を提供することを目的とする。
[0009] 本発明はまた、体外循環において体液中の顆粒球を選択的に吸着除去する能力 を有しかつ高い体液適合性を有する (例えば血小板粘着作用が抑制された)、体外 循環用の顆粒球吸着材、およびそれを用いた顆粒球除去システムを提供することを 目的とする。
課題を解決するための手段
[0010] 発明者らは、酢酸セルロースのような、顆粒球と親和性があることが報告されて!、る
、水酸基を有する重合体化合物を、アルカリ溶液との接触により切断可能な結合を 介して他の化合物と結合させた重合体化合物 化合物の結合体について、鋭意検 討した。その結果、前記結合体から前記化合物の一部が除去されることにより、顆粒 球に対する特異的親和性が、リンパ球および単球を含む単核球細胞に対する親和 性と比較して、著しく上昇すること、および、血小板との相互作用が軽減するために 安定した直接血液灌流が可能になることを見出した。よって、本発明が提供するのは 以下の通りである：
(1)無置換の水酸基と、基中の Hが 1種または 2種以上の置換基 Rによって置換され た水酸基とを有する重合体化合物を含有する顆粒球吸着材。
[0011] (2)前記重合体化合物が、無置換の水酸基と、基中の Hが 1種または 2種以上の置 換基 Rによって置換された水酸基とを有するポリビュルアルコール、ポリビュルアルコ ール共重合体または多糖類である（1)記載の顆粒球吸着材。
[0012] (3)置換基 Rがァシルである（1)または（2)記載の顆粒球吸着材。
[0013] (4)水不溶性である（1)〜（3) V、ずれか 1項記載の顆粒球吸着材。
[0014] (5)置換基 Rによって置換されて 、る水酸基の割合が全水酸基の 35〜53%である（
1)〜 (4) Vヽずれか 1項記載の顆粒球吸着材。
[0015] (6)前記重合体化合物が、ァセチル基によって置換されて 、る水酸基の割合が全水 酸基の 35〜53%である酢酸セルロースである（5)記載の顆粒球吸着材。 [0016] (7) (1)〜（6)いずれか 1項記載の顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバイス。
[0017] (8)前記容器が液体の入口および出口を備えたものである（7)記載のデバイス。
[0018] (9)体外循環のための（1)〜（4)の 、ずれか 1項記載の顆粒球吸着材。
[0019] (10)置換基 Rによって置換されている水酸基の割合が全水酸基の 5〜53%である（
9)記載の顆粒球吸着材。
[0020] (11)前記重合体化合物が、ァセチル基によって置換されている水酸基の割合が全 水酸基の 5〜53%である酢酸セルロースである（10)記載の顆粒球吸着材。
[0021] (12) (9)〜（11)のいずれか 1項記載の顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバ イスと、体液を送液するためのポンプと、抗凝固剤注入用ポンプとを備える体外循環 用の顆粒球除去システム。
[0022] (13) (a)複数の水酸基を有する重合体化合物の水酸基と 1種または 2種以上の他の 化合物とがアルカリ性条件下で切断可能な様式で結合して形成された重合体化合 物 化合物の結合体を得る工程、および
(b)前記結合体をアルカリ性条件下で処理して、前記重合体化合物の水酸基と前 記他の化合物との結合の一部を切断する工程
を含む顆粒球吸着材の製造方法。
[0023] (14)前記他の化合物がカルボン酸である（13)記載の方法。
[0024] (15)前記重合体化合物がポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール共重合体ま たは多糖類である（13)または（14)記載の方法。
[0025] (16)哺乳動物の体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、（1)〜（6)のいずれ 力 1項記載の顆粒球吸着材に接触させることにより得られる、顆粒球が除去された体 液または細胞懸濁液。
[0026] (17) (a)哺乳動物から取得された体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、 (1) 〜（6)の 、ずれか 1項記載の顆粒球吸着材に接触させる工程、および
(b)顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液を回収する工程
を含む、顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液の調製方法。
発明の効果
[0027] 本発明により得られる顆粒球吸着材を使用することにより、従来技術では達成され 得な力つた著しく高い顆粒球分離効率を達成することが可能になる。
[0028] 本発明に係るデバイスを用いることにより末梢血や骨髄などの体液中から顆粒球を 高い効率で選択的に除去することが可能となる。
[0029] 本発明に係る顆粒球が除去された体液は、心筋再生や血管再生などの再生医療 や細胞医療で用いる細胞ソースとして用いることができる。
[0030] また本発明により得られる顆粒球吸着材を体外循環において用いることにより、血 小板の損失を軽減しつつ体液中から顆粒球を高い効率で選択的に除去することが 可能となる。
[0031] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004— 250745号およ び 2005— 91445号の明細書に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
[0032] 本発明における複数の水酸基を有する重合体化合物は合成物であっても天然物 であってもよ 、。本発明における複数の水酸基を有する重合体ィ匕合物の例としては、 架橋ポリビュルアルコール単独、あるいはポリビュルアルコールとの共重合体、例え ばエチレン ビュルアルコール共重合体、スチレン ビュルアルコール共重合体、 アタリレート ビュルアルコール共重合体、アクリルアミドービュルアルコール共重合 体、および多糖類が挙げられる。また本発明における多糖類としては、これらに限定 されるものではないが、セルロース、セファロース、デキストラン、ァガロース、キチン、 キトサンなどが挙げられる。好ましくは、ポリビュルアルコール、エチレン ビュルアル コール共重合体、セルロース、キトサンなどを使用する。
[0033] 本発明における「他の化合物」としては、前記重合体化合物の水酸基と反応し、重 合体化合物 化合物の結合体を形成し得る任意の化合物を使用し得る。ここで、該 結合は、アルカリ性条件下で、特に温和なアルカリ溶液との接触により、切断され得 るものが好ましい。具体的には、「他の化合物」の非限定的な例としては、無機酸、例 えばリン酸、硫酸;有機酸、例えば、飽和または不飽和の分枝または直鎖脂肪族 1価 、 2価または多価カルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、アクリル酸、メ タクリル酸、ォレイン酸、リノール酸、リノレン酸;飽和または不飽和の分枝または直鎖 芳香族 1価、 2価または多価カルボン酸、例えば安息香酸;アミノ酸、例えばダルタミ ン酸;アルコール、例えば、飽和または不飽和の分枝または直鎖脂肪族 1価、 2価ま たは多価アルコール、例えばメタノール、エタノール、 1 プロパノール、イソプロピル アルコール、シクロへキサノール、エチレングリコール、グリセリン；飽和または不飽和 の分枝または直鎖芳香族 1価、 2価または多価アルコール、例えばベンゾィルアルコ ール；が挙げられる。好ましくは、飽和脂肪族カルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピ オン酸、酪酸、パルミチン酸、ステアリン酸;または安息香酸を使用することができる。
[0034] 前記酸と、複数の水酸基を有する重合体化合物との反応は、適切な触媒、例えば 硫酸の存在下、エステル結合を形成させることによって達成し得る。前記アルコール と、水酸基を有する重合体化合物との反応は、適切な触媒、例えば硫酸の存在下、 エーテル結合を形成させることによって達成し得る。
[0035] 本発明における「置換基 R」は、前記水酸基を有する重合体化合物の水酸基の Hを 置換しうる任意の原子団を意味する。具体的には、「置換基 R」は、水酸基と前記「他 の化合物」との反応 (典型的には脱水反応）により生じる、前記「他の化合物」に由来 する基であると理解される。あるいは、置換基 Rのために、当業界周知の水酸基の保 護基を利用してもよい。水酸基の保護基は、例えば、 T. H. Greeneおよび P. G. M . Wuts, Protective Groups in urganic Synthesis ^第 d/¾x、 John "Wiley & So ns、ニューヨーク（1999年）に記載されている。
[0036] 水酸基の保護基の例としては、エーテル系の保護基、ァセタール系の保護基、シリ ル系の保護基またはエステル系の保護基が挙げられる。エーテル系の保護基とは水 酸基を保護する目的でエーテル結合を形成する保護基を意味し、水酸基の Hと置換 されたメチル基、ェチル基、 tert ブチル基、ォクチル基、ァリル基、ベンジル基、 p —メトキシメチル基、フルォレニル基、トリチル基、ベンズヒドリル基等を挙げることが できる。ァセタール系の保護基とは水酸基を保護する目的でァセタール結合を形成 する保護基を表わし、例えば、メトキシェチル基、エトキシェチル基、テトラヒドロビラ -ル基、テトラヒドロフラ-ル基等を挙げることができる。シリル系の保護基とは、水酸 基を保護する目的でシリルォキシ基結合を形成する保護基を意味し、トリメチルシリ ル基、トリェチルシリル基、 tert—ブチルジメチルシリル基、 tert—ブチルジフヱ-ル シリル基等を挙げることができる。また、エステル系の保護基とは、水酸基を保護する 目的でエステル結合を形成する保護基を表わし、ァセチル基、プロピオニル基、イソ プロピオ-ル基、ピバロイル基、ベンゾィル基、トリフルォロアセチル基、トリクロロアセ チル基等を挙げることができる。
[0037] 前記水酸基の保護基の前駆体化合物は、前記「他の化合物」に含まれることが理 解される。
[0038] 好ま 、置換基 Rの例としては、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の、脂肪 族ァシル（例えばアルコキシカルボ-ル、ァセチル、ォレイルなど）、飽和または不飽 和の、直鎖または分枝鎖の芳香族ァシル (例えばァリールォキシカルボニル、ベンゾ ィル、シンナモイルなど）、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の、アルキルォキ シ、ァルケ-ルォキシ、アルキ-ルォキシなどが挙げられ、より好ましい置換基 Rとし ては脂肪族または芳香族の、飽和ァシル (例えばベンゾィルなど）が挙げられ、最も 好ましくはァセチルが挙げられる。前記置換基は任意の置換基例えばハロゲンで置 換されてもよい。
[0039] 本発明に係る顆粒球吸着材は、 (a)複数の水酸基を有する重合体化合物の水酸 基と 1種または 2種以上の他の化合物とがアルカリ性条件下で切断可能な様式で結 合して形成された重合体化合物 化合物の結合体を得る工程、および (b)前記結合 体をアルカリ性条件下で処理して、前記重合体化合物の水酸基と前記他の化合物と の結合の一部を切断する工程を含む方法により製造することができる。
[0040] 工程 (a)について。前記重合体ィ匕合物-化合物結合体 (例えば酢酸セルロース、 ポリ酢酸ビニル）は商業的に入手可能である。また前記重合体化合物と他の化合物 とを自体公知の方法にしたがって反応させて重合体化合物 化合物結合体を入手 することも可能である。例えばパルプ等より得られるセルロースに、無水酢酸等を含 むァセチル化剤を添加することによって酢酸セルロースを得ることができる。或 、は、 水酸基を有する重合体化合物（例えばセルロース）を、 自体公知の方法により、他の 化合物（例えば酢酸）と反応させることによつても酢酸セルロースを得ることができる。 更にまた、水酸基を有する単量体化合物と他の化合物とが結合したものを重合させ ることにより前記結合体を得ることも可能である。例えば、ポリ酢酸ビュルは、単量体 酢酸ビュル、トリアリルイソシァヌレート (TAIC)など力 なる混合物を、水、ポリビュル アルコールなどを含む水相に仕込み、平板状の撹拌翼と 2枚の邪魔板を有するセパ ラブルフラスコ中で室温にて、十分な撹拌混合および窒素置換を行い、内温を 65°C に 5時間保持して懸濁重合することにより得ることができる。
[0041] 工程 (b)について。前記重合体化合物 化合物結合体には、前記重合体化合物 の水酸基と前記他の化合物との結合が複数含まれて!/、る。工程 (b)では前記結合体 を温和なアルカリ性条件下で処理することにより、前記複数の結合の一部を例えば 加水分解反応により切断する。切断の程度は結合体の種類および顆粒球吸着材の 使用目的に応じて適宜調整できる。本発明の顆粒球吸着材としては、ァセチル基に よって置換されて ヽる水酸基の割合が全水酸基 (無置換水酸基と置換水酸基を含む )の好ましくは 35〜53%、より好ましくは 35〜49%であるポリ酢酸ビュルが使用でき る。本発明の顆粒球吸着材としては、ァセチル基によって置換されている水酸基の 割合が全水酸基 (無置換水酸基と置換水酸基を含む)の好ましくは 35〜53%、より 好ましくは 40〜53%、より一層好ましくは 45〜51%である酢酸セルロースが使用で きる。また、本発明の顆粒球吸着材を体外循環の用途で用いる場合には、重合体化 合物の全水酸基 (無置換水酸基と置換水酸基を含む)のうち置換基 Rにより置換され ている水酸基の割合は 5〜53%であることが好ましぐ 5〜50%であることがより好ま しい。
[0042] 本明細書にお!ヽて「重合体化合物の全水酸基 (無置換水酸基と置換水酸基を含 む)のうち置換基 Rにより置換されている水酸基の割合」を、「水酸基の置換基 Rによ る置換率」、「置換基 Rによる置換率」または単に「置換率」と称することがある。
[0043] 酢酸セルロースの水酸基のァセチル基による置換率（％)は、例えば以下のように 測定することができる。被検物質を十分に乾燥させた後、乾燥重量を精密天秤にて 測定し (0. 5g前後）、フラスコに入れる。被検物質を溶解し得る溶媒 (例えばアセトン 水溶液)を 50ml添加し、室温にて 1時間、スターラーにて攪拌する。次に 0. 2規定水 酸ィ匕ナトリウム水溶液 50mlを添加し、 5分間攪拌後、 3時間室温にて静置する。次に 0. 2規定塩酸 50mlを該フラスコ中に入れ 5分間攪拌後、 1時間室温にて静置する。 次にフエノールフタレイン液 2, 3滴をフラスコ中に入れ、 0. 1規定水酸ィ匕ナトリウム水 溶液をビュレットにて滴下し、溶液が淡い赤色に変化したときを終点として、滴定量（ A (ml) )を求める。また被検物質を入れな!/、以外は前記と同様の操作を行って同様 に滴定量 (B (ml) )を求める。以上の測定力も酢酸セルロースのァセチル基による置 換率（％) )は、下式により求めることができる。
[0044] 置換率（％) = (A— B) F X O. 6005Z被検物質重量 (g)
F：滴定に使用した 0. 1規定水酸化ナトリウム水溶液のファクター
温和なアルカリ性条件は、当業者が過度の実験なくして達成できる。
[0045] 酢酸セルロース以外の他の重合化合物（ポリ酢酸ビニル等）の水酸基の置換基尺に よる置換率（％)は、元素分析や赤外吸収スペクトルなどによる分析により、或いは、 公知の方法でケンィ匕率を求めた後にその数値力も逆算（置換率 = 100—ケンィ匕率（ %) )することにより求められる。元素分析により水酸基の置換率を求める場合は、ジ エイ ·サイエンス ·ラボ製の元素分析装置 (マイクロコーダー JM 10型)等を使用するこ とがでさる。
[0046] 工程 (a)で得られる重合体ィ匕合物 化合物の結合体が酢酸セルロース等の水酸 基置換多糖類である場合、工程 (b)における部分的分解反応は次の条件で行われ ることが好ましい。アルカリ溶液の規定度は 0. 01N (規定)から 2. ONの範囲が好ま しぐ 0. 05Nから 1Nの範囲がより好ましぐ 0. 07N力ら 0. 5Nの範囲が最も好ましい 。反応時間は 1分間から 120分間の範囲が好ましぐ 1分間から 100分間の範囲がよ り好ましぐ 5分間から 60分間の範囲がより好ましぐ 10分間から 40分間の範囲が最 も好ましい。反応温度は 10°Cから 90°Cの範囲が好ましぐ 15°Cから 75°Cの範囲がよ り好ましぐ 20°Cから 58°Cの範囲が最も好ましい。
[0047] 工程 (a)で得られる重合体ィ匕合物 化合物の結合体がポリ酢酸ビニルである場合 、工程 (b)における部分的分解反応は次の条件で行われることが好ましい。アルカリ 溶液の規定度は 0. 01N (規定）から 6. ONの範囲が好ましぐ 0. 1N力 5. ONの範 囲がより好ましぐ 1Nから 3. 8Nの範囲が最も好ましい。反応時間は約 1分間から 10 時間の範囲が好ましぐ 30分間から 6時間の範囲がより好ましぐ 1時間から 5. 5時間 の範囲が最も好ましい。反応温度は 10°Cから 90°Cの範囲が好ましぐ 15°Cから 75 °Cの範囲がより好ましぐ 20°Cから 58°Cの範囲が最も好ましい。
[0048] アルカリ溶液中には、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコールが添カロ されていてもよい。この場合、アルコールの含有率は、 0. 1% (V/V)力も 99% (V/ V)の範囲内にあれば、いずれの含有率で処理してもよいが、 5% (VZV)力も 50% ( V/V)が好ましぐ 10% (V/V)から 40% (V/V)がより好まし 、。
[0049] 所望であれば工程 (b)の後、前記切断生成物を精製してもよ!/、。精製方法は特に 限定されないが、例えば水洗等の洗浄により精製を行うことができる。
[0050] 本発明の顆粒球吸着材は水不溶性であることが好ま 、。
[0051] 本発明にお ヽて「体液」には血液、骨髄液、臍帯血、リンパ液、それらの希釈液等 が包含される。本発明には前記体液に由来する細胞懸濁液も使用できる。細胞懸濁 液とは、血液、骨髄液、臍帯血、リンパ液などを哺乳動物から採取し、所望によりフィ コール、パーコール、バタティナ一チューブ、リフオプレップ、 HES (ヒドロキシェチル スターチ)などを使用し、比重密度遠心分離法により赤血球を除去した画分 (単核球 画分、間葉系幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞 (EPC)、顆粒球などの細胞 が含まれる画分)や、さらにこれらの画分を再度遠心分離して濃縮したものなどを指 す。
[0052] 本発明の顆粒球吸着材は、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等の任意の形 状に加工することができる。球状または粒状の場合、平均粒径は約 50 /ζ πι〜3000 μ mであることが好ましぐより好ましくは約 80〜2000 μ m、最も好ましくは約 100〜 1000 mである。球状または粒状である本発明の顆粒球吸着材は例えば以下の通 り調製される。 1種または 2種以上の原料モノマー化合物を、適当な粘性の溶媒、例 えば水中に分散、懸濁させ、懸濁液を攪拌しつつ重合反応に適当な条件下で重合 化させ所定の形状の重合体を得る。あるいは、ポリマーを溶媒に溶解し、特開昭 63 — 117039号公報に記載された方法 (振動法）により液滴化し、凝固浴で捕捉するこ とにより凝固させ所定の形状のものを得る。前記工程 (b)はこの工程の前後一方また は両方の時点で行うことができる。
[0053] 所望により本発明の顆粒球吸着材の表面を、物理的あるいは化学的手段によって 粗面化する処理を行ってもょ ヽ。
[0054] 本発明の顆粒球吸着材の表面は多孔質体、非多孔質体、あるいはスキン層構造な ど、あらゆる種類の構造をとり得る。表面が多孔質体の場合、顆粒球吸着と同時に顆 粒球を含む他の血液細胞が産生するサイト力イン類、活性化に伴！ヽ産生される酵素 、惹起物質などの生体にとって好ましくな 、物質を合わせて吸着除去することもでき る。細孔の大きさは、排除限界分子量で規定され、本発明の顆粒球吸着材が多孔質 体である場合は、排除限界分子量が 1. 5 X 105以下であることが好ましい。より好ま しくは 1. 4 X 105以下のものが用いられる。 1. 4 X 105より大きくなると非特異吸着が 大きくなり、体液中の有用蛋白質の損失が起こる場合がある。非特異吸着の影響をよ り少なくするためには、排除限界分子量 1. 3 X 105以下のものがより好ましぐ 1. 2 X 105以下のものが更に好ましぐ 1. 0 X 105以下のものが最も好ましい。排除限界分 子量とは、例えば「実験高速液体クロマトグラフィ」（波多野博行および花井俊彦著、 ( 株)化学同人発行)などの成書に記載されているごとぐゲル浸透クロマトグラフィに ぉ 、て細孔内に侵入できな 、、すなわち排除される分子のうち最も小さ 、分子量を 有するものの分子量をいう。本発明のためには、多孔質体は水不溶性であるのが好 ましい。
[0055] 本発明の顆粒球吸着材はそれ自体単独で用いてもよ!、が、任意の硬質担体、軟 質担体と組み合わせて用いることもできる。例えば核となる担体の外表面を本発明の 顆粒球吸着材で被覆したものを用いることができる。担体としては、ガラス、シリカゲ ル、活性炭などの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアタリレート、架橋 ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や架橋ァガロース、架橋デキ ストリンなどの多糖類からなる有機担体、セルロース、ポリビュルアルコール、ェチレ ンー酢酸ビュル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル 酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフトイ匕ポリエチレン、ポリアクリルアミドグ ラフトイ匕ポリエチレン、さらにはこれらの組み合わせによって得られ得る有機一有機、 有機 無機などの複合担体などが代表例として挙げられるが、これらのみには限定 されない。担体の形状としては、この場合も、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸 状等いずれも有効に用いられる。担体が球状または粒状である場合、平均粒径は約
50 μ m〜3000 μ mであること力 S好ましく、より好ましくは約 80〜2000 μ m、最も好ま しくは約100〜1000 111でぁる。
[0056] 本発明の顆粒球吸着材をカラムに充填して使用する場合は、通液する際などに目 詰まりを生じないことが重要である。そのためには、本発明の顆粒球吸着材は充分な 機械的強度が要求される。したがって本発明の顆粒球吸着材は硬質のものであるこ とがより好ましい。例えば本発明の顆粒球吸着材が粒状ゲルの形態である場合、後 記参考例に示すごとぐゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の 圧力損失 Δ Ρと流量の関係が約 0. 3kgZcm2までの直線関係にあるものであること が好ましい。
[0057] 本発明において「顆粒球」は、哺乳類末梢血、骨髄、臍帯血中の顆粒球、ァファレ 一シスにより濃縮された白血球中の顆粒球、フイコール、バタティナ一チューブ、 HE S (ヒドロキシェチルスターチ）などを用いた密度勾配遠心法にて分取された白血球 画分中の顆粒球、または、これらの方法にて分取された白血球画分を緩衝液中や培 養液、生理食塩液中に懸濁した細胞懸濁液中の顆粒球などを指す。
[0058] 本発明の顆粒球吸着材を用いた顆粒球の吸着方法としては種々の方法が可能で ある。このような方法としては代表的には次の（1)〜（3)の方法が挙げられる。（1)体 液または細胞懸濁液の流入口および流出口を有し、体液または細胞懸濁液は通過 するが顆粒球吸着材は通過しないフィルターを流出口に装着した容器へ顆粒球吸 着材を充填してなるデバイスに、体液または細胞懸濁液を通液して接触させる方法。 (2)予め顆粒球吸着材が収容されたバッグに、体液または細胞懸濁液を加え、体液 または細胞懸濁液と顆粒球吸着材とを一定時間接触させた後、顆粒球吸着材を濾 別する方法。（3)細胞培養系に顆粒球吸着材を共存させ、培養の途中、あるいは終 了時に細胞と顆粒球吸着材を濾別する方法。
[0059] (1)の方法にぉ 、ては種々の接触方法が可能である。接触方法としては例えば、 体液または細胞懸濁液を送液ポンプなどにより灌流状態で一定時間接触させる方法 や、灌流せずに一定の流速で接触させる方法、灌流せずに一定時間接触させた後 に一定流速で押し出す方法などがある。接触時間は、 1分間以上であることが好まし い。顆粒球吸着を十分に行うためには、接触時間はより好ましくは約 3分間〜 4時間 、より好ましくは約 5分間〜 3時間、最も好ましくは約 10分間〜 2時間である。
[0060] (2)の方法としてはより具体的には、予め顆粒球吸着材が収容されたバッグに、採 取された体液を加えて顆粒球吸着材と体液とを接触させる方法、予め顆粒球吸着材 が収容されたバッグに、血液から遠心分離などで赤血球を除去して得られた赤血球 除去画分、または該赤血球除去画分を更に遠心分離等で濃縮して得られた画分を 加えて顆粒球吸着材と前記画分とを接触させる方法、ァフェレ一シス等で分取した 白血球画分と顆粒球吸着材をバッグ内に注入して顆粒球吸着材と前記画分とを接 触させる方法などがある。接触時間は、約 1分間以上であることが好ましい。顆粒球 吸着を十分に行うためには、接触時間はより好ましくは約 3分間〜 4時間、より好まし くは約 5分間〜 3時間、最も好ましくは約 10分間〜 2時間である。
[0061] (3)の方法としてはより具体的には、体液あるいは血液力 遠心分離などで赤血球 を除去して得られた赤血球除去画分 (細胞懸濁液)を一定期間培養して!/、る系に顆 粒球吸着材を直接に添加して共存させ、所定時間後に、顆粒球吸着材は通過しな V、フィルタ一にて、顆粒球吸着材と細胞懸濁液を濾別する方法が挙げられる。
[0062] 前記（1)及び（2)の方法は操作も簡単であり、体液または細胞懸濁液中から顆粒 球を吸着除去する方法として特に好ましい。ただし本発明はこれらに限定されない。
[0063] 本発明はまた顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバイスに関する。前記デバ イスに用いる容器の形態、材質、大きさには特に限定はない。形態は、球、コンテナ、 バッグ、チューブ、カラムなど任意の形態であってよい。好ましい具体例としては、例 えば容量約 0. l〜500ml程度、直径約 0. 1〜： LOcm程度の透明または半透明の筒 状容器などが挙げられる。容器は、任意の構造材料を使用して作成することができる 。具体的な構造材料としては例えば非反応性ポリマーまたは生物親和性金属もしく は合金が挙げられる。該ポリマーとしては、アクリロニトリルポリマー（例えばアタリ口- トリルブタジエンスチレンターポリマー等）、ハロゲン化ポリマー（例えばポリテトラフル ォロエチレン、ポリクロロトリフノレオ口エチレン、コポリマーテトラフノレォロェチレ、へキ サフルォロプロピレン等）、ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、 ポリプロピレン、ポリビュルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリル ブタジエンスチレン、ポリスチレン等が挙げられる。容器のために有用な金属材料とし ては、例えばステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並び に金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コノ レトク口ミゥム合金、および窒化チタン被 覆ステンレス鋼が挙げられる。耐滅菌性を有する素材が特に好ましぐ具体的にはシ リコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビュル、ポリカーボネート、ポリサルフォ ン、ポリメチルペンテンなどが挙げられる。
[0064] 前記デバイスは、これに限定されるものではな 、が、好ましくは、液の入口および出 口を有し、かつ体液は通過するが顆粒球吸着材は通過しな 、流出防止手段を備え た容器内に、水不溶性である本発明の顆粒球吸着材を充填、あるいは懸濁してなる ものからなることを特徴とする。前記流出防止具としては、メッシュ、不織布、綿栓など のフィルターが挙げられる。
[0065] 前記デバイスを使用する際には抗凝固剤が用いられることが好ましい。抗凝固剤と しては、へパリン、低分子量へパリン、メシル酸ナファモスタツト、メシル酸ガべキサー ト、アルガトロバン、アシッド'シトレート'デキストロース液 (ACD液）ゃシトレート'フォ スフェート'デキストロース液 (CPD液)などのクェン酸含有抗凝固剤など ヽずれを用 いてもよい。なかでもへノ リンは一般的に最も好ましく用いられる抗凝固剤として挙げ ることがでさる。
[0066] 本発明はまた、哺乳動物の体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、本発明の 顆粒球吸着材に接触させることにより得られる、顆粒球が除去された体液または細胞 懸濁液に関する。顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液は、（a)哺乳動物から 取得された体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、本発明の顆粒球吸着材に 接触させる工程、およびその後の (b)顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液を 回収する工程を含む方法により調製することができる。前記 (b)における回収は、遠 心分離、メンブラン濾過、クロマトグラフ等の任意の方法で実施することができる。当 業者は回収方法として実験的または経験的に適当な方法を見出すことができる。
[0067] 顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液中の目的とする細胞の濃度は、更に遠 心分離操作を行うことにより高めることができる。或いはまた、顆粒球が吸着除去され た体液または細胞懸濁液中の目的とする細胞を、フイコール、フイコールノヽィパック（ FicoU- Hypaque)、パーコール、バタティナ一チューブ、リフオプレップなどを使用して 濃縮することちできる。
[0068] 本発明の顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液中の細胞は、細胞治療や再 生医療のための細胞として使用することができる。細胞治療や再生医療の目的として は、血管再生、心筋再生、骨再生、軟骨再生、神経再生、脂肪組織再生などが挙げ られる。本発明の顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液は、調製後に直ちに使 用してもよいし、冷蔵保存、凍結保存後に解凍して使用してもよい。
[0069] 本発明の顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液は、薬学的に許容される他 の担体、賦形剤等と組み合せることにより、医薬組成物として使用することができる。 かかる医薬組成物は、典型的には、輸血、点滴、注射等の方法により患部に直接投 与する、或いは経血管的に患部に投与するための医薬組成物である。かかる医薬組 成物は、許容される薬学的手法に従って製造可能である。
[0070] 本発明はまた、顆粒球が除去された哺乳動物の体液または細胞懸濁液、それらか ら調製された細胞医療または再生医療のための細胞、あるいは上記医薬組成物を 用いた、疾患の予防または治療方法に関する。本方法は、具体的には、閉塞性の動 脈硬化症などの血管閉塞症や、心筋梗塞などの心不全を対象とした血管再生、骨、 軟骨再生、歯根膜、歯槽骨の再生などに関するものであるが、これらには限定されな い。
[0071] 本発明の顆粒球吸着材は体外循環、典型的には血液灌流方式の体外循環により 体液中の顆粒球を選択的に除去して疾患を改善するための用途に特に適したもの である。本方法により治療される疾患としては顆粒球が関与して炎症が惹起される疾 患 (例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、ベー チェット病）などが挙げられる力 これらには限定されない。
[0072] 本発明はまた体外循環用の顆粒球除去システムに関する。本発明の体外循環用 の顆粒球除去システムは、少なくとも、本発明の顆粒球吸着材を容器内に収容して なるデバイスと、体液を送液するためのポンプと、抗凝固剤注入用ポンプとを備える。 デバイスおよび抗凝固剤についてはさきに説明した通りである。
[0073] 本発明の顆粒球除去システムの体外循環における代表的な使用方法としては、前 記デバイスに体液を直接接触させる方法がある。該接触方法としては、体液を送液 ポンプなどにより灌流状態で一定時間接触させる方法がある。十分な顆粒球吸着の ためには接触時間は 1分間以上が好ましぐ約 3分〜 4時間がより好ましぐ 5分〜 3 時間が更に好ましぐ約 10分〜 2時間が最も好ましい。 実施例
[0074] 以下、本発明の方法を実施例に基づいて具体的に説明する。
[0075] (実施例 1)
1.顆粒球吸着材の調製
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し 、この溶液を特開昭 63— 117039号広報に記載された方法 (振動法）により液滴化し 、凝固させて酢酸セルロースの球形の粒子を得た。得られた球形粒子の粒径は、約 300 mであった。この粒子を沈降体積比で、 0. 1規定水酸化ナトリウム水溶液と 1 : l (VZV)の割合で混合し、 30分間接触させることにより、部分加水分解反応を行つ た。吸着体沈降体積の約 200倍量の蒸留水にて洗浄後、生理食塩液 (最終濃度で 5 IUZmlのへパリンを含む）にて置換を行った。こうして得られた酢酸セルロースのァ セチル基による置換率は、 49%であった。
[0076] 2.ゥサギ骨髄液の調製
へパリンを最終濃度 22 IUZmlになるようにリン酸緩衝溶液 (PBS)に添加し、 50m 1遠沈管に該溶液を 6ml添加した。そこにゥサギ (メス 3. 5kg)上腕骨頭部より採取し た骨髄液を約 20mlカ卩えた。該骨髄液を 70 mセルストレーナ一を通過させることに より血餅、骨粉などを取り除くことにより骨髄液を調製した。
[0077] 3.骨髄液 顆粒球吸着材の接触条件
顆粒球吸着材を沈降体積で lml計量した後に、 5mlファルコンチューブに移送し、 顆粒球吸着材を吸 、取らな ヽように生理食塩液を除去した。直後に先に調製した骨 髄液を 2ml添カ卩し、回転数 20rpm (MIXローター（MIX—ROTAR VMR—5, iu chi (株)））、 37°C、 lHr相互作用した。所定時間後、上清を約 lml採取し自動血液 細胞数カウンター（シスメッタス K4500)にて細胞数を測定した。また、フローサイトメ 一ター（FACSCanto ベタトンディッキンソン）にて単核球 ·顆粒球両画分比率を求 めた。
[0078] その結果、上清中の白血球数は、 5100cells/ μ 1であった。また該白血球の構成細 胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率は、単核 球画分比率が 84. 6%、顆粒球画分比率が 4. 0%となり、顆粒球画分の細胞が該顆 粒球吸着材に、選択的に著しく吸着されていることが明らかになった。
[0079] (実施例 2)
水酸ィ匕ナトリウム溶液の規定度を 0. 2規定に変えたほかは、実施例 1と同様の方法 で白血球数、及び単核球 ·顆粒球両画分比率を求めた。こうして得られた酢酸セル口 一スのァセチル基による置換率は 46%であった。その結果、上清中の白血球数は、 eiOOcells/ zz lであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球 画分（リンパ球画分 +単球画分）の比率は、単核球画分比率が 79. 0%、顆粒球画 分比率が 9. 2%となり、顆粒球画分の細胞が該顆粒球吸着材に、選択的に著しく吸 着されていることが明らかになった。
[0080] (実施例 3)
酢酸ビュル単量体 100重量部、トリアリルイソシァヌレート（TAIC) 24重量部、酢酸 ェチル 131. 5重量部、ヘプタン 48. 2重量部、ポリ酢酸ビュル（PVAc) (平均重合 度 800) 12. 8重量部、 2, 2，—ァゾビス（2, 4—ジメチルバレ口-トリル）（V— 65) 5. 0重量部よりなる単量体混合物 501. 6gを、水 691. 5重量部、ポリビュルアルコール 0. 103重量部、アルファオレフインスルホン酸ナトリウム 0. 023重量部、微粒子状の 第三リン酸カルシウム 5. 15重量部（固形分）、亜硝酸ナトリウム 0. 039重量部を含む 水相 1045. 2gがあらかじめ仕込まれた、平板状の撹拌翼と 2枚の邪魔板を有する 2 Lセパラブルフラスコ中に室温で添加した。十分な撹拌混合および窒素置換を行つ た後、内温を 65°Cに 5時間保持して懸濁重合させた。所定時間の重合の後、セパラ ブルフラスコの内容物を室温まで冷却した。得られた重合スラリーをサンプリングして 重量を測定し、重合禁止剤を添加して 120°Cのオーブンで揮発分を乾燥させ、恒量 を確認して乾燥重量を測定した。当該乾燥条件では、トリアリルイソシァヌレート (TAI C)の減量はわずかであることから、乾燥前後の重量より酢酸ビニルの重合転化率を 計算したところ 54%であった。
[0081] 次いでセパラブルフラスコの内容物に塩酸をカ卩えて pHを 2以下に調整し第三リン 酸カルシウムを溶解させ、その後水で良く洗浄した。洗浄液の pHが中性付近になつ たことを確認した後、水をアセトンで置換し、アセトンをカ卩えて室温で 30分間撹拌す る抽出洗浄を 2回繰り返した。次いでアセトンを水で置換した後、酢酸ビニル単位に 対して過剰量となるよう下式の量の水酸ィ匕ナトリウム (NaOH)を水溶液としてカ卩えた
[0082] NaOH (固形分重量） =粒子乾燥重量 Z86. 09 X 40 X 1. 5
なお水に対する NaOH濃度が 2重量％になるように水量は調整した。これを撹拌下 、反応温度 30°Cで 2時間保持して部分鹼化を行った。こうして得られたポリ酢酸ビ- ルのァセチル基による置換率は 41%であった。その後、洗浄液の pHが中性付近に なるまで水洗し、次 、で温水を加えて 80°Cで 60分間撹拌する抽出洗浄を 4回繰り返 した。さらに粒子沈降体積の 2倍量の温水をカ卩えて 121°Cのオートクレーブで 20分 間の抽出を 2回行い、架橋球形粒子を得た。得られたポリマー粒子の粒径は、約 30 O /z mであった。該顆粒球吸着材を用い、実施例 1と同様の方法でゥサギ骨髄液と顆 粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び単核球 ·顆粒球両画分比率を求めた。その 結果、上清中の白血球数は、 6300cellsZ 1であった。また該白血球の構成細胞 である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率は、単核球 画分比率が 69. 5%、顆粒球画分比率が 19. 5%となり、顆粒球画分の細胞が該顆 粒球吸着材に、選択的に著しく吸着されていることが明らかになった。
[0083] (比較例 1)
水酸ィ匕ナトリウム溶液の規定度を 0. 4規定に変えたほかは、実施例 1と同様の方法 で白血球数、及び単核球 '顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースの ァセチル基による置換率は、 33%であった。その結果、上清中の白血球数は、 850 Ocells/ zz lであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 ( リンパ球画分 +単球画分）の比率は、単核球画分比率が 60. 2%、顆粒球画分比率 力 S29. 6%となり、参考例 1 (下記）と同等であった。
[0084] (比較例 2)
水酸ィ匕ナトリウム溶液による処理を行わな力つた以外は、実施例 1と同様の方法で 白血球数、及び単核球 '顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのァ セチル基による置換率は、 55%であった。その結果、上清中の白血球数は、 7200c ells/ 1であった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リ ンパ球画分 +単球画分）の比率は、単核球画分比率が 65. 6%、顆粒球画分比率 力 S23. 0%となり、参考例 1 (下記）と同等であった。
[0085] (比較例 3)
水酸ィ匕ナトリウムの処理時間を 120分に変えたほかは、実施例 1と同様の方法で白 血球数、及び単核球 '顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのァセ チル基による置換率は、 33%であった。その結果、上清中の白血球数は、 9500cell s/ zz lであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リン パ球画分 +単球画分）の比率は、単核球画分比率が 54. 9%、顆粒球画分比率が 3 1. 3%となり、参考例 1 (下記)と同等であった。
[0086] (参考例 1)
顆粒球吸着材と接触させて ヽな ヽゥサギ骨髄液を使用した以外は実施例 1と同様 の方法で白血球数、及び単核球'顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の 白血球数は、 10200cellsZ 1であった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画 分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率は、単核球画分比率が 56. 2%、顆粒球画分比率が 30. 9%であった。
[0087] なお、実施例 1〜3、及び比較例 1〜3、参考例 1の白血球数、及び該白血球の構 成細胞である顆粒球画分、単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率を表 1にま とめた。
[表 1] 吸着剤接触後の白血球数、 及び各種細胞画分比率
Figure imgf000020_0001
(実施例 4)
水酸化ナトリウムの最終規定度が 0. 2Νになるように調製した混合溶媒 (5 (蒸留水) ： 95 (エタノール)）を使用した以外は、実施例 1と同様の方法で白血球数、及び単核 球 ·顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのァセチル基による置換 率は、 44%であった。その結果、上清中の白血球数は、 3800cellsZ 1であった。 また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球 画分）の比率は、単核球画分比率が 85. 8%、顆粒球画分比率が 5. 5%となり、顆 粒球画分の細胞が該顆粒球吸着材に、選択的に著しく吸着されていることが明らか になった。
[0089] (比較例 4)
顆粒球吸着材の原料をポリメチルメタタリレート (PMMA)に変えた点およびアル力 リ処理を行わな力つた点以外は実施例 1と同様の方法にて、球形粒子の造粒を行つ た。得られた PMMAの球形粒子の粒径は、約 300 mであった。該顆粒球吸着材 を用い、実施例 1と同様の方法でゥサギ骨髄液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球 数、及び単核球'顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、 53 OOcellsZ /Πであった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画 分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率は、単核球画分比率が 54. 6%、顆粒球画分 比率が 37. 7%となり、参考例 2 (下記）と同等であった。
[0090] (比較例 5)
顆粒球吸着材の原料をポリアクリロニトリル (PAN)に変えた点およびアルカリ処理 を行わな力つた点以外は実施例 1と同様の方法にて、球形粒子の造粒を行った。得 られた PANの球形粒子の粒径は、約 300 mであった。該顆粒球吸着材を用い、 実施例 1と同様の方法でゥサギ骨髄液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び 単核球'顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、 5600cells であった。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リン パ球画分 +単球画分)の比率は、単核球画分比率が 54. 1%、顆粒球画分比率が 3 6. 4%となり、参考例 2 (下記）と同等であった。
[0091] (比較例 6)
顆粒球吸着材の原料をポリスチレン (PSt)に変えた点およびアルカリ処理を行わな カゝつた点以外は実施例 1と同様の方法にて、球形粒子の造粒を行った。得られた PS tの球形粒子の粒径は、約 300 mであった。該顆粒球吸着材を用い、実施例 1と同 様の方法でゥサギ骨髄液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び単核球 '顆粒 球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、 5100cellsZ/nであつ た。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 + 単球画分）の比率は、単核球画分比率が 53. 7%、顆粒球画分比率が 38. 3%となり 、参考例 2 (下記)と同等であった。
[0092] (比較例 7)
顆粒球吸着材の原料をポリスルホン (PS)に変えた点およびアルカリ処理を行わな カゝつた点以外は実施例 1と同様の方法にて、球形粒子の造粒を行った。得られた PS の球形粒子の粒径は、約 300 /z mであった。該顆粒球吸着材を用い、実施例 1と同 様の方法でゥサギ骨髄液と顆粒球吸着材を接触させ、白血球数、及び単核球 '顆粒 球両画分比率を求めた。その結果、上清中の白血球数は、 5800cellsZ/nであつ た。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 + 単球画分）の比率は、単核球画分比率が 54. 1%、顆粒球画分比率が 37. 1%となり 、参考例 2 (下記)と同等であった。
[0093] (参考例 2)
顆粒球吸着材と接触させて ヽな ヽゥサギ骨髄液を使用した以外は、実施例 1と同 様の方法で白血球数、及び単核球'顆粒球両画分比率を求めた。その結果、上清 中の白血球数は、 6300cellsZ 1であった。また該白血球の構成細胞である顆粒 球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率は、単核球画分比率が 54. 7%、顆粒球画分比率が 37. 8%であった。
[0094] なお、実施例 4、及び比較例 4〜7、参考例 2の白血球数、及び該白血球の構成細 胞である顆粒球画分、単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率を表 2にまとめ た。
[表 2] 吸着剤接触後の白血球数， 及び各種細胞画分比率
Figure imgf000023_0001
[0095] (実施例 5)
1.顆粒球吸着材の調製
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し 、この溶液を特開昭 63— 117039号公報に記載された方法 (振動法）により液滴化し 、凝固させて酢酸セルロースの球形の粒子を得た。得られた球形粒子の粒径は、約 300 mであった。この粒子を沈降体積比で、 0. 1規定水酸化ナトリウム水溶液と 1 : l (VZV)の割合で混合し、 30分間接触させることにより、部分加水分解反応を行つ た。吸着体沈降体積の約 200倍量の蒸留水にて洗浄後、生理食塩液 (最終濃度で 5 IUZmlのへパリンを含む）にて置換を行った。こうして得られた酢酸セルロースのァ セチル基による置換率は、 49%であった。
[0096] 2.血液 顆粒球吸着カラムの接触条件
得られた上記吸着材をへパリン (へパリンナトリウム注射液、吉富製薬 (株)）加生理 食塩水（へパリンの最終濃度が 5 IUZmlになるように調製）により洗浄し、へパリンの 平衡ィ匕を行った。次に担体の脱泡を行った後、沈降体積で 3. Omlをミニカラム (ァク リル製，内径 10mm,高さ 38mm)に充填した。カラム入口側にポリ塩ィ匕ビュル製の チューブ（内径 lmm,外径 3mm,長さ 70cm)を装着し、またカラム出口側にも同様 のポリ塩ィ匕ビュル製のチューブ (長さ 30cm)を装着した。血液は健常人ボランティア より 18Gの注射針を用い上腕部より注意深く採血した。抗凝固剤としてはへノ^ンを 使用し、血液中のへノ^ン濃度は 5 IUZmlとした。抗凝固剤を添加した血液は、テ フロン (登録商標)製三角フラスコ内（内容量 50ml,サンヮ (株)）に 40ml入れ、 37°C の恒温槽内に静置し、 5minに一度穏やかに攪拌した。次に流速 0. 5mlZminで通 血実験を開始した。カラム出口側力 血液が出てきた時点を開始時点として、出口側 チューブの先端を血液プールに戻し、灌流実験を 120分間行った。なおカラム出口 側からのサンプリング時間は、 30分、 60分、 120分とした。
[0097] [血球数の測定]
所定時間後にカラム出口側の血液を採取し、血球数 (赤血球， 白血球，血小板)を 血球計数装置 (K 4500 シスメッタス (株)）にて測定した結果を表 3に示した。また 顆粒球と単核球（リンパ球，単球）の両画分比率をフローサイトメーター（FACSCant o ベタトンディッキンソン）にて測定した結果を表 4に示した。
[0098] その結果、カラム出口側の白血球数は平均で約 1500cellsZ μ 1であった。一方、 吸着材を充填して ヽな 、空のカラムを用いた場合 (参考例 3)は平均で約 6500cells Z 1であった。このように本発明の実施例ではカラム出口側の白血球数が著しく減 少した。赤血球、血小板に関しては参考例と比較してほとんど変化は認められなかつ た (表 3)。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球 画分 +単球画分)の比率は、吸着材を充填して 、な 、空のカラムを用いた場合 (参 考例 3)が単核球画分比率が約 35%顆粒球画分比率が約 63%であったのに対して 、カラム通過後は単核球画分比率が約 96%、顆粒球画分比率が約 3%であり、顆粒 球が該吸着材に選択的に著しく吸着されていることが明らかになった (表 4)。
[0099] (実施例 6)
水酸ィ匕ナトリウム溶液の規定度を 0. 2規定に変えたほかは、実施例 5と同様の方法 で血球数、及び単核球 '顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのァ セチル基による置換率は 46%であった。その結果、カラム出口側の白血球数は平均 で約 1900cellsZ μ 1であり、参考例 3に比較して大幅に減少していることが明らかに なった。赤血球、血小板に関しては、ほとんど変化は認められな力つた (表 3)。また 白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分） の比率は、単核球画分比率が約 90%、顆粒球画分比率が約 9%であり、参考例 3に 比較して、顆粒球が該吸着材に選択的に著しく吸着されていることが明らかになった (表 4)。
[0100] (実施例 7)
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し 、この溶液を特開昭 63— 117039号公報に記載された方法 (振動法）により液滴化し 、凝固させて酢酸セルロースの球形の粒子を得た。得られた球形粒子の粒径は、約 500 mであった。この粒子を実施例 5と同様の方法にてアルカリ処理を行い (得ら れた酢酸セルロースのァセチル基による置換率は、 48. 6%であった）、血球数、及 び単核球'顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側の白血球数は平均 で約 2200cellsZ μ 1であり、参考例 3に比較して大幅に減少していることが明らかに なった。赤血球、血小板に関しては、ほとんど変化は認められな力つた (表 3)。また 該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画 分)の比率は、単核球画分比率が約 87%、顆粒球画分比率が約 10%であり、参考 例 3に比較して、顆粒球が該吸着材に選択的に著しく吸着されていることが明らかに なった (表 4)。
[0101] (実施例 8)
実施例 3で調製したポリ酢酸ビュルの球形粒子を用いた以外は実施例 5と同様の 方法で血球数、及び単核球'顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側 の白血球数は、平均で約 2200cellsZ μ 1と参考例 3に比較して大幅に減少している ことが明らかになった。赤血球、血小板に関しては、ほとんど変化は認められなかつ た (表 3)。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球 画分 +単球画分)の比率は、単核球画分比率が約 90%、顆粒球画分比率が約 9% であり、参考例 3に比較して、顆粒球が該吸着材に選択的に著しく吸着されているこ とが明らかになった (表 4)。
[0102] (比較例 8)
水酸ィ匕ナトリウム溶液による処理を行わな力つた以外は、実施例 5と同様の方法で 白血球数、及び単核球 '顆粒球両画分比率を求めた。得られた酢酸セルロースのァ セチル基による置換率は、 54. 0%であった。その結果、カラム出口側の白血球数は 、平均で約 3700cellsZ 1であった。赤血球数の変化は認められなかった力 血小 板数は実施例に比較して、低下傾向を示した (表 3)。また該白血球の構成細胞であ る顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率は、単核球画分 比率が約 71%、顆粒球画分比率が約 25%であり、参考例 3に比較して、顆粒球が 該吸着材に選択的に吸着されて 、るものの上記実施例には及ばな力つた (表 4)。
[0103] (比較例 9)
実施例 8で得られた粒子を、水酸化ナトリウム処理しな!ヽ（鹼化反応せず)こと以外 は、実施例 5と同様の方法で白血球数、及び単核球 ·顆粒球両画分比率を求めた。 得られたポリ酢酸ビュルのァセチル基による置換率は 55%であった。その結果、カラ ム出口側の白血球数は、平均で約 3500cellsZ 1であった。赤血球数の変化は認 められなカゝつたが、血小板数は実施例に比較して、低下傾向を示した (表 3)。また該 白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分） の比率は、単核球画分比率が約 44%、顆粒球画分比率が約 52%であり、顆粒球の 選択性はほとんど認められな力 た (表 4)。
[0104] (比較例 10)
実施例 8の鹼化条件を、 NaOH濃度が 4重量％、反応温度 40°C、反応時間 6時間 で処理した以外は実施例 8と同様の方法にて、 PVAの球形粒子を得た。得られたポ リ酢酸ビュルのァセチル基による置換率は 4%であった。粒径は、約 300 μ mであつ た。該顆粒球吸着材を用い、実施例 5と同様の方法で血液と顆粒球吸着材を接触さ せ、白血球数、及び単核球'顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側 の白血球数は、平均で約 5700cellsZ 1であった。赤血球数の変化は認められな かったが、血小板数は実施例に比較して、低下傾向を示した (表 3)。また該白血球 の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率 は、単核球画分比率が 31%、顆粒球画分比率が 65%であり、参考例 3と同等であつ た (表 4)。
[0105] (比較例 11)
粒子の原料をポリメチルメタタリレート (PMMA)に変えた点およびアルカリ処理を 行わな力つた点以外は実施例 5と同様の方法で白血球数、及び単核球 ·顆粒球両面 分比率を求めた。その結果、カラム出口側の白血球数は、平均で約 5600cellsZ 1 であった。赤血球数の変化は認められなカゝつた力 血小板数は減少傾向を示した（ 表 3)。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分）の比率は、単核球画分比率が約 31%、顆粒球画分比率が約 65%であ り、参考例 3と同等であった (表 4)。
[0106] (比較例 12)
粒子の原料をポリスチレン (PSt)に変えた点およびアルカリ処理を行わな力つた点 以外は実施例 5と同様の方法で白血球数、及び単核球 ·顆粒球両画分比率を求め た。その結果、カラム出口側の白血球数は、平均で約 5200cells/ 1であった。赤 血球数の変化は認められな力つた力 血小板数は著しく減少した (表 3)。また該白血 球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比 率は、単核球画分比率が約 32%、顆粒球画分比率が約 63%であり、参考例 3と同 等であった (表 4)。
[0107] (参考例 3)
粒子を充填して 、な 、カラムを用いた以外は、実施例 5と同様の方法で白血球数、 及び単核球'顆粒球両画分比率を求めた。その結果、カラム出口側の白血球数は、 平均で約 6500cellsZ 1であった。赤血球数の変化は認められなかった力 血小板 数は著しく減少した (表 3)。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、及び単核 球画分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率は、単核球画分比率が約 35%、顆粒球画 分比率が約 63%であった (表 4)。
[0108] 以上のことから、本発明の顆粒球吸着材及び顆粒球除去システムを用いることによ り、直接血液灌流方式の体外循環にて、体液中カゝら血小板のロスを軽減しつつ顆粒 球を高い効率で選択的に除去することが可能となることが明ら力となった。
[0109] なお、実施例 5から 8、及び比較例 8から 12、参考例 3の各時点でのカラム出口側 の血球数を表 3にまとめた。また該白血球の構成細胞である顆粒球画分、単核球画 分 (リンパ球画分 +単球画分)の比率を表 4にまとめた。
[表 3] カラム出口側血球濃度
血球種 30min 60min 120rain
赤血球 522 518 513
実施例 5 白血球 15 16 15
血小板 20.1 17.6 16.8
赤血球 513 518 528
実施例 6 白血球 20 18 19
血小板 11.3 18.8 17.4
赤血球 521 516 518
実施例 7 白血球 22 24 21
血小板 21.7 19.8 18.6
赤血球 520 516 519
実施例 8 白血球 23 22 20
ifc小板 20.8 18.7 18.5
赤血球 508 511 519
比較例 8 白血球 39 37 36
血小板 18.6 16.6 15.3
赤血球 517 522 514
比較例 9 白血球 37 34 35
血小板 17.8 16.3 14.3
赤血球 509 526 518
比較例 10 白血球 58 57 56
血小板 16.4 15.1 13.8
赤血球 506 515 513
比較例 1 1 白血球 57 56 54
血小板 15.6 13.4 12.7
赤血球 524 504 515
比蛟咧 12 白血球 55 52 49
血小板 8.9 5.5 4.3
赤血球 512 508 521
参考例 3 白血球 67 65 64
Jfil小板 23.3 22.1 21.8
単位：
赤血球， 血小板： 万 （eel Is/ l)
白血球： 百 （cells/ l)
[表 4] カラム出口側白血球两分比率 （単位： ！¾)
循環時間 60min 120ιία
単核球 顆粒球 単核球 頼粒球 単核球 顆粒球 幽分 画分 画分 画分 画分 画分 実施例 ti 95.3 3.1 96.1 2.8 96.3 2.9 実施例 6 87.9 9.3 91.2 8.7 90.8 8.2 実施例 7 84. B 10.3 89. 9.8 88.5 9.3 実施例 8 87.4 8.8 90.3 9.4 91.3 9.5 比較例 8 70.9 25.7 70.2 5.3 71.5 23.4 比較例 9 5 E2.6 45.2 50.5 44.6 51.4 比較例 10 32.1 64.8 32.2 64.4 29.8 66.3 比較例 1 1 30.7 63.5 30.2 65.7 32.4 U.5 比較例 12 •i'L 1 62.6 31.4 61.8 32.3 65.2 参考例 3G.1 62.9 33.9 64.3 35.1 62.1 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[I] 無置換の水酸基と、基中の Hが 1種または 2種以上の置換基 Rによって置換された 水酸基とを有する重合体化合物を含有する顆粒球吸着材。
[2] 前記重合体化合物が、無置換の水酸基と、基中の Hが 1種または 2種以上の置換 基 Rによって置換された水酸基とを有するポリビュルアルコール、ポリビュルアルコー ル共重合体または多糖類である請求項 1記載の顆粒球吸着材。
[3] 置換基 Rがァシルである請求項 1または 2記載の顆粒球吸着材。
[4] 水不溶性である請求項 1〜3いずれか 1項記載の顆粒球吸着材。
[5] 置換基 Rによって置換されている水酸基の割合が全水酸基の 35〜53%である請 求項 1〜4 ヽずれか 1項記載の顆粒球吸着材。
[6] 前記重合体化合物が、ァセチル基によって置換されて 、る水酸基の割合が全水酸 基の 35〜53%である酢酸セルロースである請求項 5記載の顆粒球吸着材。
[7] 請求項 1〜6 ヽずれか 1項記載の顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバイス。
[8] 前記容器が液体の入口および出口を備えたものである請求項 7記載のデバイス。
[9] 体外循環のための請求項 1〜4の 、ずれか 1項記載の顆粒球吸着材。
[10] 置換基 Rによって置換されて 、る水酸基の割合が全水酸基の 5〜53%である請求 項 9記載の顆粒球吸着材。
[II] 前記重合体ィ匕合物が、ァセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸 基の 5〜53%である酢酸セルロースである請求項 10記載の顆粒球吸着材。
[12] 請求項 9〜11のいずれか 1項記載の顆粒球吸着材を容器内に収容してなるデバィ スと、体液を送液するためのポンプと、抗凝固剤注入用ポンプとを備える体外循環用 の顆粒球除去システム。
[13] (a)複数の水酸基を有する重合体化合物の水酸基と 1種または 2種以上の他の化 合物とがアルカリ性条件下で切断可能な様式で結合して形成された重合体化合物 化合物の結合体を得る工程、および
(b)前記結合体をアルカリ性条件下で処理して、前記重合体化合物の水酸基と前 記他の化合物との結合の一部を切断する工程
を含む顆粒球吸着材の製造方法。
[14] 前記他の化合物がカルボン酸である請求項 13記載の方法。
[15] 前記重合体ィ匕合物がポリビュルアルコール、ポリビニルアルコール共重合体または 多糖類である請求項 13または 14記載の方法。
[16] 哺乳動物の体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、請求項 1〜6のいずれか
1項記載の顆粒球吸着材に接触させることにより得られる、顆粒球が除去された体液 または細胞懸濁液。
[17] (a)哺乳動物から取得された体液または該体液に由来する細胞懸濁液を、請求項 1〜6の 、ずれか 1項記載の顆粒球吸着材に接触させる工程、および
(b)顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液を回収する工程
を含む、顆粒球が除去された体液または細胞懸濁液の調製方法。
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