JPH105330A

JPH105330A - 細胞由来放出因子の吸着体、それを用いる吸着除去装置および吸着除去方法

Info

Publication number: JPH105330A
Application number: JP8161924A
Authority: JP
Inventors: Akira Kobayashi; 明小林; Satoru Takada; 覚高田
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 1998-01-13

Abstract

(57)【要約】【課題】血球細胞および血管構成細胞由来の放出因子
を効率よく吸着除去しうる吸着体、それを用いる吸着除
去装置ならびに吸着除去方法を提供する。【解決手段】血球細胞および血管構成細胞が活性化さ
れたときに放出される放出因子を含む血液を、ポリアニ
オン性化合物を固定化した水不溶性担体に直接接触させ
ることにより吸着除去することを特徴とする吸着体、そ
れを用いる吸着除去装置および吸着除去方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は血球細胞および／ま
たは血管構成細胞由来の放出因子を、血漿分離すること
なしに、直接血液と接触させることにより吸着除去する
ための吸着体、それを用いる吸着除去装置ならびに吸着
除去方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

［動脈硬化と細胞由来の放出因子］アテローム性動脈硬化の成因として、１−ａ）ＬＤＬレセプターの遺伝的欠損（ブラウン、エ
ムエス（Brown, M. S.）およびゴールドステイン、ジ
ェイエル（Goldstein, J. L.）、サイエンス（Scienc
e）、２３２（４７４６）、３４〜４７頁、１９８６）
および１−ｂ）ＬＤＬレセプターに異常がないばあいで
も食事などにより動物性脂肪成分が過剰になりＬＤＬレ
セプターの発現が抑制されること（ゴールドステイン、
ジェイエルおよびブラウン、エムエス、ホスピタル
・プラクティス・オフ（Hosp. Pract. Off.）、２０
（１１）、３５〜４１頁、１９８５）、２）酸化や糖化された変性ＬＤＬをマクロファージが大
量に取り込み泡沫細胞に変化していくこと（マツモト、
エー（Matsumoto, A.）ら、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ
・ユナイティッド・ステート・オブ・アメリカ（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA）、８７（２３）、９１３３〜９
１３７頁、１９９０、フリーマン、エム（Freeman,
M.）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・
ステート・オブ・アメリカ、８８（１１）、４９３１〜
４９３５頁、１９９１）、ならびに３）種々の障害により内皮細胞が変性、剥離し、内皮下
組織に血小板が粘着・凝集を起こし、血小板のα顆粒か
ら平滑筋細胞の増殖を促進する血小板由来の増殖因子
（以下、ＰＤＧＦという）が放出され（ロス、アール
（Ross, R.）、レインス、イーダブリュー（Raines,
E. W.）、ボウエンポープデーエフ（Bowen Pope
D. F.）、セル（Cell）、４６、１５５〜１６９頁、１
９８６）、平滑筋細胞の増殖が起こり、内膜の肥厚化、
アテローム性の硬化巣が形成される（ロス、アール、ニ
ューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（N.
Engl. J. Med.）、３１４、４８８〜５００頁、１９８
６）ことなど動脈硬化形成のメカニズムが明らかにされ
てきた。

【０００３】現在ではアテローム性動脈硬化の形成を抑
制する方法として、血液中のＬＤＬ濃度を低下させるこ
とが効果的であることが明らかにされており（リピッド
・リサーチ・クリニックス・プログラム、ジェイ・エー
・エム・エー（Lipid Research Clinics Program, J.
A. M. A.）、２６１、３６５頁、１９８４、ダブリュー
ビーカンネル（W. B. Kannel）、ダブリューピー
カステリ（W. P. Castelli）、ティーゴードン（T.
Gordon）およびピーエムマクナマラ（P.M. Mcnama
ra）、アナルス・オブ・インターナル・メディシン（An
n. Intern. Med.）、７４、１頁、１９７１）、すでに
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ＬＤＬ変性抑制剤、Ａ
ＣＡＴ阻害剤などの薬剤やＬＤＬと親和性が高いリガン
ドを固定化した吸着体を用いた体外循環療法（ヨコヤ
マ、エス（Yokoyama, S.）ら、アーテリオスクレローシ
ス（Arteriosclerosis.）、５、６１３頁、１９８５）
などにより血液中ＬＤＬ濃度を低下させる試みが臨床的
にも広く活用されている。しかしながら薬剤を用いたば
あい、患者のタイプにより適応範囲が制限され全く薬効
を発現しないばあいもある。体外循環療法による治療の
ばあい、患者のタイプによる適応制限を受けず、確実に
血液中ＬＤＬ濃度を低下させるが、長期的にみると動脈
硬化の発症予防や進展抑制という面では不完全性を有し
ている。

【０００４】そこで本発明では、前記したアテローム性
動脈硬化の成因の１つと考えられている血小板の粘着・
凝集反応や平滑筋細胞との相互作用に着目した。動脈硬
化の成因３）の機構を抑制するためには、とくに血小板
由来の放出因子を積極的に吸着除去することが効果的で
あると以下の反応機構から判断した。血小板は、動脈硬
化に由来した血管壁異常により血管内壁がむき出しにな
ると、露出した血管内皮下組織のコラーゲン、ラミニ
ン、ビトロネクチン、フィブロネクチンやフォンビィル
ブラント因子（以下、ｖＷｆという）と速やかに結合す
る。この結合には、血小板膜上に存在する数種の糖タン
パク質が関与しており、血管内皮下組織との結合にはＧ
Ｐ１６０−IIIａ、ＧＰＩａ−IIａ、ＧＰＩｃ−IIａ
が、ｖＷｆとの結合にはＧＰＩｂ−IX複合体が関与して
いる（クルメトソン、ケージェー（Clemetson, K.
J.）ら、プレートレッツ・イン・バイオロジィー・アン
ド・パソロジィーIII（Platelets in Biology and Path
ology III）、１〜３６頁、エルセビア、アムステルダ
ム（Elsevier, Amsterdam）、１９８７）。

【０００５】とくにｖＷｆとの結合のシグナルは速やか
に血小板内へ情報伝達され、血小板は活性化される。そ
の結果、活性化された血小板の濃染顆粒からＡＴＰ、Ａ
ＤＰ、セロトニンおよび／またはカルシウムなどの放出
因子が放出される。ＧＰＩｂ−IX複合体との結合や濃染
顆粒からの放出因子に反応し、さらにＧＰIIｂ−IIIａ
の高次構造変化が起こり、これまでは血液中では結合で
きなかったフィブリノーゲンや液相中に存在するフィブ
ロネクチン、ビトロネクチンやｖＷｆと結合可能にな
り、これらタンパク質を介して血小板同士が結合する。
さらに血小板のα顆粒からは、血小板第４因子（以下、
ＰＦ４という）、βトロンボグロブリン（以下、βＴＧ
という）、血小板由来増殖因子、トロンボスポンジン、
フィブロネクチン、フィブリノーゲン、第Ｖ因子、ｖＷ
ｆなどが放出され、血小板同士の結合を強め血小板凝集
へと移行することが明らかになっている（スズキ、エイ
チ（Suzuki, H.）ら、ヒストケミストリー（Histochemi
stry）、９４、３３７および３４４頁、１９９０、スズ
キ、エイチら、ブラッド（Blood）、７１、１３１０〜
１３２０頁、１９８８）。

【０００６】実際、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、閉塞
性動脈硬化症にて血小板機能が亢進していることが報告
され、虚血性心疾患のばあい、血小板凝集能の亢進やβ
ＴＧの血液中濃度の上昇が認められ、また虚血性脳疾患
のばあい、血小板粘着能や凝集能の亢進、βＴＧやＰＦ
４の血液中濃度の上昇が報告されている（フィッシャ
ー、エム（Fisher, M.）ら、アーチブス・オブ・ニュー
ロロジィ（Arch. Neurol.）、３９、６９２〜６９５
頁、１９８２）。また閉塞性動脈硬化症においても血小
板凝集能の亢進（オルコット、シー IV（Olcott, C. I
V）ら、ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（J.
Surg. Res.）、２４、３４３〜３４６頁、１９７８）や
βＴＧの血液中濃度の上昇が報告されている（ボッゼン
タ、エー（Bodzenta, A.）ら、ホリア・ヘマトル・レイ
プジック（Folia Haematol. Leipzig.）、１１５、４７
９〜４８２頁、１９８８）。そこで本発明者らは、とく
に血球細胞および血管構成細胞由来の放出因子を効率的
に吸着除去することの重要性に着目した。ところが現状
ではβＴＧやＰＦ４は、これまでに血小板活性化の指標
としては種々の評価が行なわれているが、前記したよう
に放出因子と動脈硬化症の関係に着目し、放出因子を積
極的に直接血液中から吸着除去しようとする試みは行な
われていない。

【０００７】［多臓器障害と顆粒球エラスターゼ］外傷
後の多臓器障害の発症と白血球からの放出因子である顆
粒球エラスターゼとの関係が注目されている（ニュイチ
ンク、ジェーケーエス（Nuytinck, J.k. s.）ら、
アーチブス・オブ・サージェリー（Arch. Surg.）、１
２１、８８６〜８９０頁、１９８６）。顆粒球から放出
される顆粒球エラスターゼは、白血球が持つアズール顆
粒中の分子量３００００〜３８０００の中性プロテアー
ゼの一種である。本酵素の基質にはエラスチン（ジャノ
フ、エー（Janoff, A.）ら、ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）、１２８、
１１３７頁、１９６８）、コラーゲン（ガデック、ジェ
ーイー（Gadek, J.E.）ら、バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ
（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、９５、１８１５
頁、１９８０）、プロテオグリカン（スターキィ、ピー
（Starkey, P.）ら、バイオケミカル・バイオフィジカ
ル・アクタ（Biochem. Biophys. Acta.）、４８３、３
８６頁、１９７７）、フィブロネクチン（マクドナル
ド、ジェーエー（McDonald, J. A.）ら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Che
m.）、２５５、８８４８頁、１９８０）、補体、免疫グ
ロブリン（ホールズ、ジェーディ（Folds, J. D.）ら、
ラボラトリー・インベスティゲーション（Lab. Inves
t.）、３９、３１３頁、１９７８）、血液凝固因子（ジ
ョクム、エム（Jochum, M.）ら、フィジオロジカル・ケ
ミストリー（Physiol. Chem.）、３６２、１０３頁、１
９８１）などがあり、これらのタンパク質の分解、不活
化を行っている。補体に関しては活性化と同時に、アナ
フィラトキシンとして知られているＣ３ａおよびＣ５ａ
を分解することにより炎症部位への白血球の遊走を抑制
している（ブロンザ、ジェーピー（Bronza, J. P.）
ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲー
ション（J. Clin. Invest.）、６０、１２８０頁、１９
７７）。さらに顆粒球エラスターゼは、ＰＦ４によりそ
の機能がさらに増幅されることが明らかにされている
（レイリー、シーエフ（Reilly, C. F.）ら、フィジ
オロジカル・ケミストリー（Physiol. Chem.）、３６
５、１１３１頁、１９８４）。

【０００８】前記のように顆粒球エラスターゼは多岐に
渡る機能発現を有しているために、血液中濃度の上昇に
より種々の生体反応が助長される。一方で、プロテアー
ゼインヒビターを使用し顆粒球エラスターゼ活性を抑制
することにより、多臓器障害への移行を抑制する可能性
を示した報告がなされ（添田耕司ら、外科治療、５８、
No．４、４７５〜４７６頁、１９８８）、高濃度に上昇
した血液中顆粒球エラスターゼを除去し、血液中濃度を
低下させることにより多臓器障害への移行を抑制する試
みも行なわれている。このように血液中の顆粒球エラス
ターゼを除去することの重要性がクローズアップされる
ようになってきたが、吸着体を用いて直接血液中から積
極的に吸着除去する試みは行なわれていない。

【０００９】［異物接触と血球細胞由来の放出因子］近
年、人工血管、人工心臓、カテーテル、人工肺、血液浄
化膜、吸着体、血液回路などに代表される種々の合成高
分子材料を用いた医療用具が開発され臨床応用されてい
る。このような医療用具は、血液と直接接触するため、
程度の差はあるものの、材質や形状などにより、タンパ
ク質の吸着、血液凝固系、血球細胞（白血球、血小板）
系、補体や線溶系などの活性化や不活化などの様々な生
体反応を引き起こす。

【００１０】とくに血球細胞の活性化にともなう放出因
子は、血液が医療用具と接触することにより血中に放出
され、種々の生体反応を引き起こすことが知られてい
る。放出因子の血中濃度が上昇することは決して好まし
くなく、さらに濃度が高い状態で体内に再び返血するこ
とは避けるべきである。

【００１１】活性化にともない放出因子を放出する細胞
としては、血小板や白血球が代表的であり、とくに血小
板はその活性化の段階に応じ、種々の放出因子を放出し
粘着から凝集反応へと移行する。このような血小板の粘
着や凝集反応は、主に外傷などにより出血した際におけ
る止血のための反応であり、体外循環による治療時など
異物接触が原因で高濃度の放出因子が放出されると、血
小板はそれに反応し血栓形成や血液凝固系の活性化など
を伴い、安定した体外循環による治療を困難にしたり、
通常濃度では存在しない放出因子が体内に入ることによ
り副反応を誘発する。

【００１２】一方、白血球が活性化されると種々のサイ
トカインの産生や顆粒球エラスターゼなどの放出因子が
放出される。前記したように、顆粒球エラスターゼは、
種々の生体反応を引き起こす白血球由来の放出因子とし
て着目され始めた中性プロテアーゼの一種であり、白血
球が持つアズール顆粒中の分子量３００００〜３８００
０の中性プロテアーゼの一種である。このような放出因
子が、前記した医療用具との接触により活性化された白
血球より放出され、通常濃度では存在しない放出因子が
体内に入ることによりさまざまな副反応を誘発する。さ
らに血小板由来の放出因子との相乗効果により、その効
果はさらに増幅される。

【００１３】このように血小板や白血球が、医療用具な
どの異物との接触により活性化され放出される種々の放
出因子は、止血反応の亢進や種々の生理活性を発現する
ことから体外循環時に血中濃度が上昇することは好まし
くない。また血中の放出因子濃度が高い状態で体外循環
処理を持続することは、局所的な血液の凝固や詰まりな
どを発生させる可能性が高く、所定時間安定的な体外循
環による血液処理を困難にしたり、各種生体反応を誘発
する高濃度の放出因子が再び体内に流入することなど安
全面からも避ける必要がある。

【００１４】現在、血液と直接接触する医療用具のばあ
い、素材自体の抗血栓性や血液との接触部位に抗血栓性
を有した合成ポリマーの被覆やヘパリンなどの抗凝固剤
を固定化する方法など、血球細胞の付着や血液凝固系を
活性化しないという血液適合性を重視した研究開発は行
なわれているが、高い血液適合性を有した医療用具の開
発は不充分であり今後の開発に期待が寄せられている。
このように血球細胞を活性化させない研究開発は活発に
行なわれているが、異物との接触により活性化された血
球細胞由来の放出因子を積極的に吸着除去することによ
り、高濃度の放出因子が体内へ流入することを抑制した
り、体外循環を安定的に実施することを目的とした吸着
体、吸着除去装置および吸着除去方法は現時点では開発
されていない。

【００１５】一方で血液を血漿分離したのちに血漿成分
のみを吸着体に接触させ、血中の放出因子を吸着する報
告がある（人工臓器、１８（１）、３３１〜３３４頁、
１９８９）。この報告はデキストラン硫酸を固定化した
担体を充填した吸着体と血漿分離後の血漿を接触させた
結果であり、血漿を対象とした処理に限定されており、
血球細胞が全く接触しない条件での検討である。さらに
この報告は平均粒径が約７０μｍの担体を使用している
が、該粒径では血球細胞を含まない血漿成分のみを通過
させることは可能であるが、全血を通過させることは、
溶血や血小板の付着、活性化などを誘発することから更
に解決すべき問題を残している。しかもこの方法は分離
した血漿を血球細胞成分が多量に存在する血液成分と混
合したのちに、患者に返血しているため、最終的に血中
放出因子の吸着除去効果はほとんどえられていない。こ
の問題を解決するためには、放出因子の吸着能を有する
と同時に直接血液灌流にて血液を処理することが必要で
ある。しかしながら、その条件を同時に満たす吸着体の
開発は行なわれていない。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
前記した課題を解決するために、細胞、とくに血球細胞
および血管構成細胞、あるいはタンパク質の活性化や不
活性化などの過剰反応を引き起こしている放出因子（通
常、血液などの体液中にはほとんど存在していない）に
関して鋭意研究を重ねた結果、かかる疾病由来で非生理
的濃度にまで上昇している血球細胞および血管構成細胞
由来の放出因子、また異物接触により活性化され血球細
胞から放出されたかかる放出因子を直接血液灌流にて血
液中から効率よく急速に除去しうる吸着体、それを用い
る吸着除去装置および吸着除去方法をはじめて見出し、
本発明を完成するに至った。

【００１７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は血球
細胞および／または血管構成細胞由来の放出因子、とく
に、異物接触により活性化された血球細胞由来の放出因
子を含む血液を、ポリアニオン性化合物を固定化した水
不溶性担体に直接接触させて効率的に吸着除去すること
を特徴とする吸着体、該吸着体を収納した吸着部、血液
を該吸着部に流入させるための血液流入部、および該吸
着部に流入された血液を該吸着部外に流出させるための
血液流出部からなる、血球細胞および／または血管構成
細胞由来の放出因子の吸着除去装置、ならびに血球細胞
および／または血管構成細胞由来の放出因子を含む血液
を、前記吸着体に血漿分離することなく直接接触させ
て、血液中から前記放出因子を選択的に吸着除去するこ
とを特徴とする前記放出因子の吸着除去方法に関する。

【００１８】前記吸着体において、前記放出因子が血球
細胞由来であるばあい、前記放出因子が、血球細胞が異
物接触により活性化され放出した血球細胞由来の放出因
子であるばあい、ポリアニオン性化合物が硫酸化多糖類
であるばあい、水不溶性担体が多孔質体であるばあい、
ポリアニオン性化合物の固定化量が水不溶性担体１ｍｌ
あたり０．０２ｍｇ以上２００ｍｇ以下であるばあい、
水不溶性担体が平均粒径８０μｍ以上５０００μｍ以下
の粒子状の担体であるばあい、水不溶性担体の８０容量
％以上の粒子の粒径が平均粒径の±７５％以内に分布し
ているばあい、水不溶性担体が平均粒径８０μｍ以上５
０００μｍ以下の粒子状の担体であって、該担体の８０
容量％以上の粒子の粒径が平均粒径の±７５％以内に分
布しているばあいが好ましい。

【００１９】前記吸着除去方法において、該装置を他の
血液処理用具の血液出口側に設置し、該装置の血液出口
側から患者の返血部までの間には、他の血液処理用具を
設置しないことを特徴とする方法であるばあいが好まし
い。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明に用いるのに適した水不溶
性担体は、１）耐圧性であること、２）比較的大きな径
の細孔を有することが必要であることから、ポリマーハ
ードゲルが好ましい。

【００２１】ここでいうハードゲルとは、デキストラ
ン、アガロース、アクリルアミドなどのソフトゲルに比
較し、溶媒による膨潤が少なく、また圧力により容易に
変形しにくいゲルのことをいう。ハードゲルとソフトゲ
ルは以下の方法により区別することができる。すなわち
ゲルを両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラ
ス製円筒状カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）
に均一に充填し、水性液体を流した際の圧力損失と流量
の関係が、ハードゲルではほぼ直線となるのに対し、ソ
フトゲルでは圧力がある点を超えるとゲルが変形し圧密
化して流量が増加しなくなる。本発明では、前記したカ
ラムを用いたばあい、少なくとも０．３ｋｇ／ｃｍ²ま
で前記直線関係のあるものをハードゲルと称する。

【００２２】つぎに要求される性質は比較的大きな径の
細孔を有することである。細孔径の測定法には種々あ
り、水銀圧入法が最もよく用いられているが、ポリマー
ハードゲルのばあいには適用できないことがある。した
がって細孔径の目安として排除限界分子量を用いるのが
適当である。排除限界分子量とは成書（たとえば波多野
博行ら、実験高速クロマトグラフ、化学同人）などに述
べられているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィーにお
いて細孔内に侵入できない（排除される）分子のうち最
も小さい分子量をもつものの分子量をいう。現象的に
は、排除限界分子量以上の分子は移動相体積Ｖ₀近傍に
溶出されることから、種々の分子量の化合物を用いて溶
出体積との関係を調べれば排除限界分子量を求めること
ができる。排除限界分子量は対象とする化合物の種類に
より異なることが知られており、一般に球状タンパク
質、デキストラン、ポリエチレングリコールなどについ
てよく調べられているが、種々の放出因子についてはほ
とんど調べられていない。したがって最も類似している
球状タンパク質（ビールスを含む）を用いてえられた値
を用いるのが適当である。

【００２３】本発明に用いる担体の好ましい排除限界分
子量は１万以上であり、最も好ましくは３万以上であ
る。

【００２４】担体の多孔構造については表面多孔性より
も全多孔性が好ましく、空孔容積率が２０％以上である
ことが好ましい。担体の形状は、粒状、繊維状、膜状、
ホローファイバー状など任意の形状を選ぶことができ
る。粒子状の担体を用いるばあい、下限平均粒径が８０
μｍ未満では個体差により、直接血液灌流が困難になる
ばあいが生じる。また吸着除去の対象としている放出因
子は活性化に伴い前記した各種生体反応を引き起こすレ
ベルまで上昇しても、その血中濃度は比較的低いために
粒径はさほど小さくなくてもよい。そこでその平均粒径
は８０μｍ以上５０００μｍ以下が好ましく、安定した
直接血液灌流の実施および吸着性能面から１００μｍ以
上１０００μｍ以下がより好ましい。とくに好ましくは
１２０μｍ以上８００μｍ以下である。また直接血液灌
流を安定的に行ない、かつ不用意に血球細胞を活性化し
放出因子を放出させないという意味からも、粒子の平均
粒径分布を限定することは本発明のばあい重要である。
平均粒径分布は広すぎると血球細胞の付着や活性化など
を誘発し、分布が狭いと乱流などによる物理的な付着や
活性化は抑制傾向を示す。そこで本発明では８０容量％
以上の粒子の粒径が平均粒径の±７５％以内に分布して
いることが好ましく、さらに該吸着装置自体による血球
細胞の活性化を抑制し、血中の血球細胞および／または
血管構成細胞由来の放出因子を効率的に吸着除去するた
めには、±５０％以内に分布していることがより好まし
い。とくに好ましくは±２５％以内に分布している。

【００２５】さらに担体表面には固定化反応に用いうる
官能基あるいは容易に活性化しうる官能基が存在してい
ることが望ましい。これらの官能基の代表例としては、
アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール
基、酸無水物基、サクシニルイミド基、塩素原子、アル
デヒド基、アミド基、エポキシ基などがあげられる。

【００２６】本発明に適した担体はアガロース、デキス
トラン、ポリアクリルアミドなどの軟質担体を用いても
よいが、より好ましくはポリマーハードゲルである。ポ
リマーハードゲルの代表例としては、ポリメチルメタク
リレート、ポリビニルアルコール、スチレン−ジビニル
ベンゼン共重合体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポ
リアクリレート、架橋されたビニルエーテル−無水マレ
イン酸共重合体、架橋されたスチレン−無水マレイン酸
共重合体、架橋ポリアミドなどの合成高分子化合物やセ
ルロースなどの天然高分子化合物を原料とする硬質多孔
体、多孔質ガラス、多孔質シリカゲルなどの無機多孔質
体およびこれらの表面に多糖類、合成高分子などをコー
ティングしたものなどがあげられる。これらのポリマー
ハードゲルは単独で用いてもよいし２種類以上混合して
用いてもよい。しかしながら、本発明はこれらのみに限
定されるものではない。

【００２７】本発明に用いるポリアニオン性化合物と
は、化合物１分子内に複数のアニオン性官能基を有する
ものを意味し、本発明に用いるのに適した硫酸化多糖類
の代表例としてはヘパリン、デキストラン硫酸、コンド
ロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパラン硫
酸、ケラタン硫酸、ヘパリチン硫酸、キシラン硫酸、カ
ロニン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸、セルロース硫
酸、アガロース硫酸、アガロペクチン硫酸、ペクチン硫
酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫酸、グリコーゲン硫
酸、ポリラクトース硫酸、カラゲニン硫酸、デンプン硫
酸、ポリグルコース硫酸、ラミナリン硫酸、ガラクタン
硫酸、レバン硫酸、メペサルフェートなどの硫酸化多糖
類、ポリビニルアルコール硫酸、ポリリン酸などがあげ
られる。また、これらのカリウム塩、ナトリウム塩も使
用できる。最も好ましい例としては、ヘパリン、デキス
トラン硫酸およびコンドロイチンポリ硫酸があげられ
る。しかしながら、本発明はこれらのみに限定されるも
のではない。

【００２８】硫酸化多糖類を担体に固定化する方法とし
ては既知の種々の方法を用いることができる。すなわち
物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法などである。
本発明による吸着体または吸着除去装置を治療に用いる
ばあいには、滅菌時あるいは治療中にリガンドが脱離し
ないことが重要であるので、結合の強固な共有結合法が
望ましく、イオン結合法を用いるにしてもリガンドを共
有結合的に架橋しておくことが望ましい。また必要によ
りスペーサーを担体とリガンドの間に導入してもよい。

【００２９】リガンドの固定化量は、リガンドの性状、
活性により異なるが、水不溶性担体１ｍ１あたり０．０
２ｍｇ〜２００ｍｇが好ましく、０．１〜１００ｍｇが
より好ましい。とくに好ましくは水不溶性担体１ｍ１あ
たり０．５〜４０ｍｇである。

【００３０】本明細書でいう放出因子とは、セロトニ
ン、ヒスタミンなどの生理活性アミンや血小板第４因子
（ＰＦ４）、βトロンボグロブリン（βＴＧ）、血小板
由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子
（ｂＦＧＦ）などの塩基性ポリペプチド、およびトロン
ボスポンジン、フィブロネクチン、ＥＧＦ（上皮細胞増
殖因子）などヘパリンと親和性を有するタンパク質、顆
粒球エラスターゼなどの中性プロテアーゼを指し、好ま
しくはＰＦ４、βＴＧおよび顆粒球エラスターゼを指す
が、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

【００３１】さらに、本明細書でいう血球細胞が異物接
触により活性化され放出した血球細胞由来の放出因子と
は、セロトニン、ヒスタミンなどの生理活性アミンや血
小板第４因子（ＰＦ４）、βトロンボグロブリン（βＴ
Ｇ）などの塩基性ポリペプチドおよびトロンボスポンジ
ン、フィブロネクチンなどヘパリンと親和性を有するタ
ンパク質、顆粒球エラスターゼなどの中性プロテアーゼ
を指し、好ましくはＰＦ４、βＴＧおよび顆粒球エラス
ターゼを指すが、これらのみに限定されるものではな
い。

【００３２】また血球細胞の代表例としては、赤血球、
白血球および血小板などの血液中に存在する血球細胞が
あげられる。また血管構成細胞とは血管内皮細胞、平滑
筋細胞、線維芽細胞などがあげられるが、本発明はこれ
らのみに限定されるものではない。

【００３３】本発明による吸着体または吸着除去装置を
治療に用いるには種々の方法がある。最も簡便な方法と
しては患者の血液を体外に導出して血液バッグなどに貯
め、これに本発明の吸着体を混合して放出因子を除去
し、フィルターを通して吸着体を除去し血液を患者に戻
す方法がある。この方法は複雑な装置を必要としない
が、１回の処理量が少なく治療に時間を要し、操作が煩
雑になるという欠点を有する。また血球細胞および血管
構成細胞の活性化にともなう放出因子を含む血液を本発
明による吸着体と接触させることにより該血液より放出
因子を吸着除去することができる。つぎの方法は吸着体
をカラムに充填し、体外循環回路に組み込みオンライン
で吸着除去を行なうものである。体外循環により血液中
の放出因子を取り除くばあいには、該吸着体を血液の入
口と出口を有する容器に充填し、体外循環回路に組み込
んで該容器に血液を流通させる方法が操作性、除去効率
の面で好ましい。処理方法には全血を直接灌流する方法
と、血液から血漿を分離したのち、血漿をカラムに通す
方法がある。本発明による吸着体または吸着除去装置
は、何れの方法にも用いることができるが、オンライン
処理に最も適している。さらに本発明の吸着除去装置の
設置場所は、他の血液処理用具の血液出口側に設定し、
本発明の吸着除去装置の血液出口側から患者の返血部ま
での間には、他の血液処理用具を設置しない方法が最も
適している。

【００３４】以下に実施例にもとづいて本発明の血球細
胞および血管構成細胞からの放出因子の除去方法をさら
に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定
されるものではない。

【００３５】実施例１多孔質セルロースゲル（チッソ（株）製、平均粒径２０
０μｍ、８０容量％以上の粒子が平均粒径の±２０％以
内のもの、排除限界分子量１．０×１０⁷）を沈降体積
で２０ｍｌ分取し、２０ｍｌの逆浸透水（ＲＯ水、ヤマ
トピュアラインアールオー２１（Ｙａｍａｔｏ
ＰｕｒｅＬｉｎｅＲＯ２１）、ヤマト科学
（株）製）を加え内温を４０℃に昇温した。そこに２Ｍ
ＮａＯＨを１１ｍｌ添加し、４０℃にて３０分間振盪
した。つぎにエピクロルヒドリン３．６ｍｌを添加し、
４０℃にて２時間反応させた。反応終了後、約２ＬのＲ
Ｏ水にてゲルの洗浄を行ないエポキシ化ゲルをえた。導
入されたエポキシ基の量は１３μｍｏｌ／ｇであった。

【００３６】エポキシ化ゲルを沈降体積で１５ｍｌ分取
し、そこにデキストラン硫酸（分子量約２，０００）１
０．５ｇを逆浸透水１９ｍｌに溶解してえられた溶液を
添加し撹拌を行なった。つぎに２ＮのＮａＯＨでｐＨを
１０に合わせたのちに、４５℃にて２４時間反応を行な
い、デキストラン硫酸の固定化を行なった。

【００３７】モノエタノールアミン１１５μｌにＲＯ水
を添加し、全量を３．３ｍｌにした。本溶液をさきでえ
られたデキストラン硫酸固定化ゲル（沈降体積１５ｍ
ｌ）に添加し、さらに２３ｍｌのＲＯ水を加えた。４５
℃にて２時間反応を行なうことにより未反応のエポキシ
基の開環反応を行ない吸着体をえた。なおデキストラン
硫酸の固定化量は、２．６０ｍｇ／ｍｌ（ゲル沈降体
積）であった。

【００３８】実施例２［吸着実験］実施例１で作製したデキストラン硫酸固定
化ゲルを生理食塩水で洗浄、平衡化した。ゲルの脱泡を
行なったのち、沈降体積で１ｍｌの前記ゲルをポリプロ
ピレン製ミニカラム（内径９ｍｍ、高さ１６ｍｍ：テル
モ社製）に充填した。カラム入口側にポリ塩化ビニル製
のチューブ（内径１ｍｍ、外径３ｍｍ、長さ１ｍ）を装
着し、血液回路付きミニカラムをえた。

【００３９】血液は抗凝固剤としてヘパリンを用い、健
常人より１８Ｇの注射針を用い注意深く採血した。採取
した血液１００ｍｌを引き続きテフロン製三角フラスコ
（内容量１００ｍｌ、サンワ（株）製）内に入れ、３７
℃の恒温槽内にてスターラーチップにて低速で回転さ
せ、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでカラム内に通血を開始し
た。カラム出口側の血液を所定時間後一定量採取し、カ
ラム入口濃度と比較することにより吸着性能を評価し
た。

【００４０】カラム通過後のＰＦ４およびβＴＧの血中
濃度は、吸着体の出口側から血液が出てきた時点を通血
開始時点とし、通血開始後５分〜９分（以下、この時間
帯に採取した血液中の放出因子濃度を「７分値」とい
う）まで、および１５分〜１９分（以下、この時間帯に
採取した血液中の放出因子濃度を「１７分値」という）
まで血液を連続的に採取したのち、高橋芳右らの方法
（血液と脈管、１８（４）、３２６頁、１９８７）にし
たがい酵素免疫法にて求めた。また顆粒球エラスターゼ
に関しては、通血開始後１１分〜１３分（以下、この時
間帯に採取した血液中の放出因子濃度を「１２分値」と
いう）まで、および２１分〜２３分（以下、この時間帯
に採取した血液中の放出因子濃度を「２２分値」とい
う）まで血液を連続的に採取したのち、櫻林郁之介ら
の方法（臨床病理、３３（１０）、１１１３頁１９８
５）にしたがい酵素免疫法にて求めた。以下にそれぞれ
の測定に用いた方法を記載する。

【００４１】［ＰＦ４の測定方法］抗ＰＦ４ウサギ抗体
を固定化したマルチプレート（固定化量０．６μｇ／ウ
エル、ベーリンガー・マンハイム（株）製）に、検体血
漿２００μｌを添加し室温で１時間静置することにより
検体中のＰＦ４を結合させた。上清を除去し洗浄を行な
ったのちに抗ＰＦ４酵素標識抗体（抗ＰＦ４ペルオキシ
ダーゼ、濃度７．５μｇ／ｍｌ、ベーリンガー・マンハ
イム（株）製）を２００μｌ添加し室温で１時間静置し
た。つぎに上清を除去し洗浄後、基質（オルトフェニレ
ンジアミン、濃度５００μｇ／ｍｌ）を２００μｌ添加
し、室温で約３分間発色反応を行ない、その吸光度を４
９２ｎｍでプレートリーダー（ＥＲ８０００、三光純薬
製）にて測定を行なった。同時に測定した標準品（アセ
ラクロムＰＦ４（ベーリンガー・マンハイム（株）
製））により検量線を作成し試料中のＰＦ４濃度を求め
た。

【００４２】［βＴＧの測定方法］抗βＴＧ抗体を固定
化したマルチプレート（固定化量０．６μｇ／ウエル、
ベーリンガー・マンハイム（株）製）に、検体血漿２０
０μｌを添加し室温で１時間静置することにより検体中
のβＴＧを結合させた。上清を除去し洗浄を行なったの
ちに抗βＴＧ酵素標識抗体（抗βＴＧペルオキシダー
ゼ、濃度５．０μｇ／ｍｌ、ベーリンガー・マンハイム
（株）製）を２００μｌ添加し室温で１時間静置した。
つぎに上清を除去し洗浄後、基質（オルトフェニレンジ
アミン、濃度５００μｇ／ｍｌ）を２００μｌ添加し、
室温で約３分間発色反応を行ない、その吸光度を４９２
ｎｍでプレートリーダー（ＥＲ８０００、三光純薬製）
にて測定を行なった。同時に測定した標準品（アセラク
ロム βＴＧ（ベーリンガー・マンハイム（株）製））
により検量線を作成し試料中のβＴＧ濃度を求めた。

【００４３】［顆粒球エラスターゼの測定方法］抗ヒト
顆粒球エラスターゼ抗体（固相抗体）を結合した９６穴
プレートに、検体血漿を５０μｌ添加し室温で１時間静
置した。１時間後、検体を除去し専用洗浄液３００μｌ
で３回洗浄を行なったのち、酵素標識抗体液を５０μｌ
添加した。室温で１時間静置後、洗浄を行ない基質液を
１００μｌ添加し、室温で１５分間酵素反応を行なっ
た。１５分後反応停止液を１００μｌ添加し、波長４９
０ｎｍにて吸光度測定（マイクロフロー分光光度計、Ｃ
Ｌ−７５０、島津製作所製）を行ない、顆粒球エラスタ
ーゼの標準物質（顆粒球エラスターゼの初期濃度３．２
ｎｇ／ｍｌを専用希釈液にて順次倍数希釈を行ない調整
した溶液にて作成した検量線より検体中の顆粒球エラス
ターゼ濃度を求めた。

【００４４】以上の測定は、血漿中顆粒球エラスターゼ
測定用キット顆粒球エラスターゼＥＩＡ（三和化学研
究所（株）製）を用いて測定した。

【００４５】参考例カラムを結合しないポリ塩化ビニル製のチューブ（内径
１ｍｍ、外径３ｍｍ、長さ１ｍ）のみを用い、実施例２
に記載した実験方法に準じ実施例１のカラム入口側の血
中濃度に相当する血中ＰＦ４、βＴＧおよび顆粒球エラ
スターゼ濃度を求めた。

【００４６】［結果］検体（ｎ＝２）について測定した
結果を以下に示す。

【００４７】ＰＦ４について実施例１のカラム入口側の血中濃度に相当する参考例の
ＰＦ４濃度は、７分値で２６０ｎｇ／ｍｌ、１７分値で
３５８ｎｇ／ｍｌであったのに対し、実施例１の吸着体
通過後では、７分値で９５ｎｇ／ｍｌ、１７分値で１１
３ｎｇ／ｍｌにまで減少していた。表１にカラム入口側
および出口側のＰＦ４濃度を示す。

【００４８】βＴＧについてカラム入口側の血中濃度に相当する参考例のβＴＧ濃度
は、７分値で２８８ｎｇ／ｍｌ、１７分値で７８８ｎｇ
／ｍｌであったのに対し、実施例１の吸着体通過後で
は、７分値で１４０ｎｇ／ｍｌ、１７分値で１５１ｎｇ
／ｍｌにまで減少していた。表２にカラム入口側および
出口側のβＴＧ濃度を示す。

【００４９】顆粒球エラスターゼについてカラム入口側の血中濃度に相当する参考例の顆粒球エラ
スターゼ濃度は、１２分値で４４９ｎｇ／ｍｌ、２２分
値で６３８ｎｇ／ｍｌであったのに対し、実施例１の吸
着体通過後では、１２分値で１４２ｎｇ／ｍｌ、２２分
値で４８９ｎｇ／ｍｌにまで減少していた。表３にカラ
ム入口側および出口側の顆粒球エラスターゼ濃度を示
す。

【００５０】比較例１放出因子の吸着に及ぼすリガンド（デキストラン硫酸）
の効果を検討するために、実施例１で作製した吸着体の
かわりに、リガンド未固定の多孔質セルロースゲル（チ
ッソ（株）製、平均粒径２００μｍ、８０容量％以上の
粒子が平均粒径の±２０％以内、排除限界分子量１．０
×１０⁷）を沈降体積で１ｍｌ用いたこと以外は、実施
例２に記載した実験方法に準じ、ミニカラムを調製しカ
ラム出口側の血中ＰＦ４、βＴＧおよび顆粒球エラスタ
ーゼ濃度を求めた。

【００５１】［結果］比較例１の吸着体通過後では、血
液中のＰＦ４は、７分値で２８８ｎｇ／ｍｌ、１７分値
で３５４ｎｇ／ｍｌであった（表１参照）。βＴＧ濃度
は、７分値で２８２ｎｇ／ｍｌ、１７分値で６７８ｎｇ
／ｍｌであった（表２参照）。また、顆粒球エラスター
ゼ濃度は、１２分値で３９９ｎｇ／ｍｌ、２２分値で６
４５ｎｇ／ｍｌ（表３参照）であり、何れも実施例１の
吸着体通過後の値と比較し高値を示した。

【００５２】比較例２デキストラン硫酸固定化ゲルのかわりにポリヒドロキシ
エチルメタクリレートをコートした活性炭ゲル（クラレ
（株）製）を用いたこと以外は、実施例２に記載した実
験方法に準じ、ミニカラムを調製しカラム出口側の血中
ＰＦ４、βＴＧおよび顆粒球エラスターゼ濃度を求め
た。

【００５３】［結果］比較例２の吸着体通過後では、血
液中のＰＦ４濃度は、７分値で３７７ｎｇ／ｍｌ、１７
分値で６１０ｎｇ／ｍｌであった（表１参照）。βＴＧ
濃度は、７分値で５６３ｎｇ／ｍｌ、１７分値で７１７
ｎｇ／ｍｌであった（表２参照）。また、顆粒球エラス
ターゼ濃度は、１２分値で４８９ｎｇ／ｍｌ、２２分値
で８１５ｎｇ／ｍｌ（表３参照）であり、何れも実施例
１の吸着体通過後の値と比較し高値を示した。

【００５４】比較例３実施例１と同様の方法で平均粒径７０μｍの多孔質セル
ロースゲル（チッソ（株）製）にデキストラン硫酸の固
定化を行なった。なおデキストラン硫酸の固定化量は
２．３ｍｇ／ｍｌ（ゲル沈降体積）であった。

【００５５】実施例３および比較例４［通血実験］実施例１で作製した平均粒径２００μｍの
多孔質セルロースゲルおよび比較例３で作製した平均粒
径７０μｍの多孔質セルロースゲルをそれぞれ充填した
ミニカラムを作製し、実施例２に記した実験系および実
験方法に準じ血小板の通過率を評価した（実験回数ｎ＝
２）。

【００５６】血液がミニカラム出口側から流出してきた
時点を通血開始時とし、以降５分ごとにカラム出口側の
血液を所定量採取し、血液中の血小板数を血球カウンタ
ー（マイクロセル・カウンター（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ
Ｃｏｕｎｔｅｒ）ＣＣ−１８０、シスメックス（株）
製）にて測定し、以下の式にしたがい通過率を算出し
た。

【００５７】

【数１】

【００５８】その結果、平均粒径７０μｍの多孔質セル
ロースゲルを充填したミニカラムに対する血小板の通過
率は通血終了時の３０分まで終始３０％以下と低値を示
した。これに対し、平均粒径２００μｍの多孔質セルロ
ースゲルを充填したミニカラムに対する血小板の通過率
は、通血開始５分後に約６０％であったがその後上昇
し、評価終了時の３０分まで８０％以上の通過率を示し
た。表４に各種吸着体に対する血小板の通過率を示す。
とくに後半２０分以降では血小板の通過率は９０％以上
の値を示した（表４参照）。

【００５９】

【表１】

【００６０】

【表２】

【００６１】

【表３】

【００６２】

【表４】

【００６３】

【発明の効果】本発明の吸着体を用いれば、血球細胞お
よび血管構成細胞由来の放出因子を効率よくかつ迅速に
除去することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリアニオン性化合物を固定化した水不
溶性担体からなり、直接血液中から血球細胞および／ま
たは血管構成細胞由来の放出因子を吸着除去することを
特徴とする吸着体。
【請求項２】前記放出因子が血球細胞由来である請求
項１記載の吸着体。
【請求項３】前記放出因子が、血球細胞が異物接触に
より活性化され放出した血球細胞由来の放出因子である
請求項１または２記載の吸着体。
【請求項４】ポリアニオン性化合物が硫酸化多糖類で
ある請求項１、２または３記載の吸着体。
【請求項５】水不溶性担体が多孔質体である請求項
１、２、３または４記載の吸着体。
【請求項６】ポリアニオン性化合物の固定化量が水不
溶性担体１ｍｌあたり０．０２ｍｇ以上２００ｍｇ以下
である請求項１、２、３、４または５記載の吸着体。
【請求項７】水不溶性担体が平均粒径８０μｍ以上５
０００μｍ以下の粒子状の担体である、請求項１、２、
３、４、５または６記載の吸着体。
【請求項８】水不溶性担体の８０容量％以上の粒子の
粒径が平均粒径の±７５％以内に分布している請求項
１、２、３、４、５、６または７記載の吸着体。
【請求項９】水不溶性担体が平均粒径８０μｍ以上５
０００μｍ以下の粒子状の担体であって、該担体の８０
容量％以上の粒子の粒径が平均粒径の±７５％以内に分
布している請求項１、２、３、４、５または６記載の吸
着体。
【請求項１０】請求項１記載の吸着体を収納した吸着
部、血液を該吸着部に流入させるための血液流入部、お
よび該吸着部に流入された血液を該吸着部外に流出させ
るための血液流出部からなる、血球細胞および／または
血管構成細胞由来の放出因子の吸着除去装置。
【請求項１１】血球細胞および／または血管構成細胞
由来の放出因子を含む血液を、請求項１記載の吸着体に
血漿分離することなく直接接触させて、血液中から前記
放出因子を選択的に吸着除去することを特徴とする前記
放出因子の吸着除去方法。
【請求項１２】該装置を他の血液処理用具の血液出口
側に設置し、該装置の血液出口側から患者の返血部まで
の間には、他の血液処理用具を設置しないことを特徴と
する請求項１１記載の吸着除去方法。