JP4402236B2 - リポ蛋白質の吸着除去方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、直接血液灌流方式で血液中より悪性物質を選択的に吸着除去する方法に適用しうる吸着方法に関する。さらに具体的には、血液の抗凝固条件を限定することにより、直接血液灌流実施時、吸着体への血球の付着やブラジキニンの発生を抑制し、かつ高い吸着性能を発揮するための直接血液灌流方式に適用しうる悪性物質の選択的吸着除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中に存在するリポ蛋白質、なかでも低密度リポ蛋白質（以下、ＬＤＬと略す）および超低密度リポ蛋白質（以下、ＶＬＤＬと略す）はコレステロールを多く含み、動脈硬化の主要な危険因子であることが知られている。一方、高密度リポ蛋白質（以下、ＨＤＬと略す）は動脈硬化の遅延因子であることも知られている。
【０００３】
そこで血中からＨＤＬは極力除去せずに、ＬＤＬおよびＶＬＤＬを選択的に除去することの有効性が広く認められてきた。ＬＤＬおよびＶＬＤＬを血中から選択的に除去する方法として、現在臨床に用いられている方法には、血漿交換療法、二重濾過膜法、吸着体法、沈殿法（ヘルプ（ＨＥＬＰ）システム）などがある。
【０００４】
しかしながら血漿交換療法やヘルプシステムは二重濾過膜や吸着体を用いた方法の普及により稼働率は低く、かつ操作性や安全面などの点で後者に劣る。一方、二重濾過膜による除去方法では、ＬＤＬおよびＶＬＤＬと同時に、ＨＤＬをはじめとする有用な蛋白質をも相当量除去されてしまいこれを補う必要がある。また膜の目詰まりもその操作性を低下させる原因となっている。
【０００５】
吸着体による除去方法としては、たとえば抗体などを固定化したいわゆる免疫吸着体を用いる方法や、アフィニティークロマトグラフの原理を利用し担体にデキストラン硫酸などのリガンドを固定化した吸着体を用いる方法がある。しかしながらこれら吸着体は、血液を血球成分と血漿成分に分離した後に血漿成分のみを吸着体に導入する血漿分離方式のために、血漿分離器と吸着体を同時に稼働させる必要があり、そのための専用装置が必要になることや、回路が煩雑になり操作性が劣るなどの問題点もある。
【０００６】
吸着体による除去方法には、上記血漿分離方式のほか、血漿と血球を分離せずに直接血液を通血する直接血液灌流（以下ＤＨＰと略す）方式がある。ＤＨＰ方式は、血液を血漿に分離する必要がないために、血漿分離膜やそれに付随する回路、専用のマシーンなどが省略できる。そのために、処置に必要な時間の短縮や、体外循環量の軽減、操作性の向上などのメリットがあり、近年その開発が活発化している。
【０００７】
しかしながらＤＨＰ方式は、血液が吸着体という異物に直接接触するために、通常血液凝固系の活性化と同時に、血球、特に血小板の活性化が引き起こされる。吸着体表面に粘着・凝集した血小板は、さらに血小板血栓（白色血栓）を形成し最悪の場合、血流を阻害してしまうといった問題点がある。
【０００８】
そこで血球の付着を抑制し血流を確保するために、１）吸着体に高度の血液適合性（抗血栓性）を付与する、２）粒径を大きくし空隙を確保する、３）抗血液凝固剤を使用するなどの対応がとられている。しかしながら現状では、１）については十分な血液適合性を有する材料は得られておらず、２）については粒径を大きくしても直接血液灌流に対しては有利であるが、吸着体の有効表面積が減少し吸着性能の面からは不利になる。３）については、現在体外循環法で、ＬＤＬ等のリポ蛋白質除去療法に主として使用されている抗血液凝固剤はヘパリンである。
【０００９】
ヘパリンはアンチトロンビンＩＩＩと複合体を形成することにより、アンチトロンビンＩＩＩの抗トロンビン活性を高めることによりフィブリンの形成を抑制する作用を有する。しかしながらヘパリンは、主に液性の凝固系の活性化を抑制する抗血液凝固剤であるために、吸着体への血小板の粘着・凝集は抑制されず、血小板凝集により通血が困難になる場合が多々ある。
【００１０】
一方で、抗トロンビン作用を有さずに抗血液凝固活性を発現する抗血液凝固剤としてクエン酸ナトリウムがある。クエン酸ナトリウムは血中の２価カチオンをキレートすることにより、抗凝固作用を発現する。
【００１１】
しかしながら、クエン酸抗凝固血液であっても、陰性荷電を有した素材と接触すると大量のブラジキニンが発生することが知られている。これはブラジキニンの産生が血中の２価カチオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオンなど）濃度には依存せずに起こるためである。即ち陰性荷電との接触で産生されるブラジキニン濃度は、使用する２価カチオンキレート剤の濃度とは無関係である。
【００１２】
ブラジキニンは、強力な血管拡張作用、血管透過性亢進作用などを有しているため（日本臨床、４８巻、広範囲血液・尿化学検査、免疫学的検査（下巻）、１９９０年増刊）、血中濃度が高くなると急激な血圧低下やめまいなどの症状を引き起こす場合がある。特にアンジオテンシン変換酵素阻害剤（以下ＡＣＥ阻害剤と略す）服用の場合、血中ブラジキニンの分解は抑制され、高濃度状態が維持され非常に危険な状態になるために、通血性と同時にブラジキニンの発生は解決すべき課題となっている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、ＬＤＬやＶＬＤＬの吸着効率を低下させることなく、吸着体表面への赤血球、白血球、血小板などの血球の付着やブラジキニンの発生を抑制できる、直接血液灌流法によるリポ蛋白質の吸着除去方法を提供するものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を行った結果、陰性荷電を有する吸着体に血液が接触しても、血中の２価カチオンをキレートする作用を有する抗血液凝固剤と、抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤を併用することにより、高い血球の通過性を示し、かつブラジキニンの発生が抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、吸着体を用いたリポ蛋白質の吸着除去において、２価カチオンキレート剤、及び、抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤を被処理血中に導入することからなるリポ蛋白質の吸着除去方法である。
【００１５】
【発明の実施形態】
本発明の吸着除去方法においては、２種類の抗血液凝固剤、すなわち、２価カチオンキレート剤（血中の２価カチオンをキレートする作用を有する抗血液凝固剤）と、抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤を併用する。
２価カチオンキレート剤としては、ＥＤＴＡ−２ナトリウム、ＥＤＴＡ−２カリウム、ＥＤＴＡ−３カリウム、シュウ酸アンモニウム、シュウ酸カリウム、クエン酸、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウムなどがあげられる。また上記成分を少なくとも１種類以上含有した抗血液凝固剤が好ましく、より好ましくは市販されている抗血液凝固剤であるＣＰＤ液、ＡＣＤ−Ａ液［クエン酸ナトリウムの濃度が２．２％（ｗ／ｖ）］、ＡＣＤ−Ｂ液［クエン酸ナトリウムの濃度が１．３２％（ｗ／ｖ）］、ＭＡＰ液などである。
【００１６】
抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤としては、メシル酸ナファモスタット、アルガトロバン、ヘパリン、低分子量ヘパリンなどがあげられる。
好ましい組み合わせは、２価カチオンキレート剤がクエン酸塩であり、抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤がヘパリン類である。なお、２価カチオンキレート剤として使用する、ここで言うところのクエン酸塩は、クエン酸、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウムなどを少なくとも１種類以上含有するものを意味する。
【００１７】
２価カチオンキレート剤と抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤の血中への導入量としては、２価カチオンキレート剤濃度が０．１％（ｗ／ｖ）から５．０％（ｗ／ｖ）の２価カチオンキレート剤溶液を、２価カチオンキレート剤溶液と血液の比率（体積比）が１：１０から１：８０未満の割合で使用し、かつ、抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤（例えばヘパリン、低分子量ヘパリンなどのヘパリン類）の血中濃度を０．０１ＩＵ／ｍｌから１．５ＩＵ／ｍｌ（望ましくは、０．０５ＩＵ／ｍｌから１．０ＩＵ／ｍｌ）とすることが好ましい。より好ましくは、１：１５〜１：７０であり、かつ、０．１ＩＵ／ｍｌ〜１．０ＩＵ／ｍｌとする。さらに好ましくは１：２０〜１：６０であり、かつ、０．２ＩＵ／ｍｌ〜１．０ＩＵ／ｍｌとする。
【００１８】
２価カチオンキレート剤は添加量が多いと、血中のイオン化カルシウムを大量にキレートしてしまうことにより、唇や手足のしびれ、吐気などのテタニー症状を引き起こす場合がある。一方で添加量が少なすぎると、吸着体への血小板の粘着などが多くなり、通血に支障をきたす傾向がある。一方、抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤は、添加量が多すぎると止血し難くなり、添加量が少な過ぎるとブラジキニンの発生が多くなる傾向にある。
【００１９】
抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤は、所定血中濃度が低いために、持続注入しても良いが、一度に所定濃度になるようにワンショットしても良い。また２価カチオンキレート剤は、一度に所定量を注入すると、ショック症状を引き起こすため、上記範囲の量を持続的に注入するのが好ましい。
【００２０】
本発明では、血液中のブラジキニンの産生を抑制できるので、吸着体として、陰性荷電を有する吸着体を好適に用いることができるが、好ましくは、硫酸化多糖類及び／又はその塩類を水不溶性担体に固定化してなるものを用いることができる。
【００２１】
硫酸化多糖類としては特に限定されないが、本発明で用いるのに適したものとして、例えば、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリチン硫酸、キシラン硫酸、カロニン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸、セルロース硫酸、アガロース硫酸、アガロペクチン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カラゲニン硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、ラミナリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メペサルフェート等の硫酸化多糖、ポリビニルアルコール硫酸、ポリリン酸等があげられる。好ましい例としては、デキストラン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸があげられる。
【００２２】
固定化する硫酸化多糖類及びその塩類は、極限粘度が０．００５ｄｌ／ｇ以上０．５ｄｌ／ｇ以下であることが好ましく、０．００７ｄｌ／ｇ以上０．４ｄｌ／ｇ以下がより好ましい。特に好ましくは０．００８ｄｌ／ｇ以上０．２ｄｌ／ｇ以下である。
また、固定化する硫酸化多糖類及びその塩類の硫黄含量は、５〜２２重量％が好ましく、８〜２２重量％がより好ましい。特に好ましくは１３〜２２重量％である。
【００２３】
上記水不溶性担体は、無機担体、合成高分子若しくは多糖類からなる有機担体、又は、有機担体及び／若しくは無機担体からなる複合担体のいずれであってもよいが、体液中に存在するリポ蛋白質の存在環境を考慮すれば親水性であることが好ましく、さらに目的物質以外の物質の吸着、いわゆる非特異吸着が少ないものがより好ましい。このような水不溶性担体の例としては、架橋アガロース、架橋デキストラン、架橋セルロース、結晶性セルロース、架橋キチン、架橋キトサンなどの多糖類からなる水不溶性担体、スチレン−ジビニルベンゼン、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアミドなどの合成高分子化合物からなる水不溶性担体、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、さらにはガラスビーズなどの無機担体表面を多糖類または高分子化合物で被覆した有機−無機複合担体、合成高分子化合物よりなる有機担体表面を多糖類で被覆した有機−有機複合担体などがあげられる。
【００２４】
硫酸化多糖類及びその塩類の固定化量は水不溶性担体１ｍｌあたり０．０２ｍｇ以上１００ｍｇ以下になるように結合することが好ましい。固定化量は少なすぎると吸着性能が低く、多すぎると血中ブラジキニン濃度が著しく上昇する傾向にある。０．１ｍｇ以上８０ｍｇ以下がより好ましく、特に好ましくは０．５ｍｇ以上４０ｍｇ以下である。
【００２５】
リガンドである硫酸化多糖類を担体に固定化する方法としては、既知の方法を用いることができる。すなわち物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法などである。リガンドは滅菌時あるいは処置中に脱離しないことが重要であるため、強固な共有結合法が望ましい。具体的には、ハロゲン化シアン法、エピクロルヒドリン法、ビスエポキサイド法、ハロゲン化トリアジン法などがあげられる。
【００２６】
本発明のリポ蛋白質の選択的吸着除去方法は、上記吸着体を収納した吸着部、血液を該吸着部に流入させるための血液流入部、及び、該吸着部に流入された血液を該吸着部外に流出させるための血液流出部からなるリポ蛋白質吸着器を用いて行われることが好ましい。
【００２７】
より好ましくは、硫酸化多糖類固定化吸着体をカラムに充填してなるリポ蛋白質吸着器を体外循環回路に組み込み、患者の血液が回路内に入ってきた時、リポ蛋白質の血液混入部において、血液の先端部にヘパリンをワンショットした後に、ＡＣＤ−Ａ液などを上記範囲の量で、ワンショットではなく少しずつ持続的に注入し、オンラインで直接血液を吸着器内に通血することにより、リポ蛋白質の吸着除去を行う。また予め患者にヘパリンを注入し、全身ヘパリン化した後に、ＡＣＤ−Ａ液などをオンラインで持続注入してもよい。
【００２８】
上記リポ蛋白質吸着器は、流体の流入口、流出口、及び、流体と流体に含まれる成分とは通過できるが吸着体は通過できないフィルターを有する容器、並びに、該容器内に充填された吸着体を有する。吸着体はカラムに充填され、体外循環回路に組み込み、オンラインで直接血液灌流にて行われるため、吸着体の圧密化が生じると充分な体液流量が得られなくなり処置時間の延長さらに処置続行不可能となりうるので、吸着体の圧密化を防ぐためには、吸着体は充分な機械的強度を有するもの（硬質）であることが好ましい。
【００２９】
ここでいう硬質とは、デキストラン、アガロース、アクリルアミド等の軟質な担体に比較し、溶媒による膨潤が少なく、また圧力により変形し難い担体のことをいう。硬質な担体と軟質な担体とは次の方法により区別することができる。すなわち担体を円筒状カラムに均一に充填し、水性液体を流した際の圧力損失と流量の関係が、硬質担体ではほぼ直線となるのに対し、軟質な担体では圧力がある点を越えると担体が変形し圧密化して流量が増加しなくなる。本発明では、少なくとも０．３Ｋｇ／ｃｍ² まで上記直線関係にあるものを硬質と称する。
【００３０】
また、吸着体の微細構造は多孔質または非多孔質のいずれであってもよいが、単位体積当たりの高いＬＤＬおよびＶＬＤＬ吸着能を得るためには、比表面積が大きいこと、すなわち多孔質、特に全多孔質であることが好ましい。多孔質とは、細孔容積がみかけの水不溶性担体の容積の２０％以上で比表面積が３ｍ² ／ｇ以上であることを意味する。これらの条件を満たさないものは、吸着容量が小さく実用に耐えない。このような水不溶性担体に用いる担体の例としては、多孔質セルロース担体、多孔質キトサン担体、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、架橋ポリアクリレート、架橋ポリビニルアルコールなどからなるビニル系多孔質体およびガラス、シリカ、アルミナなどからなる無機多孔質体などがあげられる。
【００３１】
さらに、吸着体が多孔質である場合、その細孔は１００万以上の分子量をもつＬＤＬやＶＬＤＬが容易に細孔内に侵入できる大きさであることが必要であるので、球状蛋白質を用いて測定された排除限界分子量が１００万以上のものであることが好ましい。１００万より小さいものでは吸着容量が小さくなり実用に耐えない場合がある。排除限界分子量とは、たとえば「実験高速液体クロマトグラフィ」（波多野博行および花井俊彦著、（株）化学同人発行）などの成書に記載されているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィにおいて細孔内に侵入できない、すなわち排除される分子のうち最も小さい分子量を有するものの分子量をいう。
【００３２】
一方、細孔の上限は、例えば走査型電子顕微鏡にて湿潤状態にある担体の表面を観察したときの平均細孔径が、０．２μｍ以下が好ましい。平均細孔径が０．２μｍをこえるものは吸着体の機械的強度が弱くなるか、または吸着体の固形分含量が小さすぎて充分な吸着容量が得られないなどの理由から実用に耐えない場合がある。
【００３３】
また吸着体の形状は、粒状、粒子の集合体、繊維状、膜状またはホローファイバー状など任意の形状を選ぶことができる。
粒子状の担体を用いるばあい、下限平均粒径が８０μｍ未満では直接血液灌流が困難になる場合が生じる。また対象とする吸着物質の血中濃度が高いためあまり粒径を大きくできない。そこでその平均粒径は８０μｍ以上８００μｍ以下が好ましく、安定した直接血液灌流の実施および吸着性能面から１００μｍ以上６００μｍ以下がより好ましい。特に好ましくは１２０ｍ以上５００μｍ以下である。また直接血液灌流を安定的に行い、かつ必要以上に血球を活性化させないという意味からも、粒子の平均粒径分布を限定することは本発明のばあい重要である。
【００３４】
平均粒径分布は広すぎると血球の付着や活性化などを誘発し、分布が狭いと乱流などの物理的な要因による付着や活性化は抑制される傾向を示す。そこで本発明では８０容量％以上の粒子の粒径が平均粒径の±７５％以内に分布していることが好ましく、さらに該吸着器自体による血球の活性化やそれに基づく付着を抑制し、安定した直接血液灌流を実施するためには、±５０％以内に分布していることがより好ましい。特に好ましくは±３０％以内に分布していることである。ここで言う平均粒径とは、粒子状の担体を光学顕微鏡などを用いて倍率を上げて撮影し、撮影画像中の粒子の直径を測定し、その直径の総和を測定した粒子の全個数で割ることにより求めた値をいう。
【００３５】
撮影画像中の粒子の粒径を計測する手段としては、同倍率で撮影したスケールを用いて計測する方法、撮影画像中の粒子の直径をノギスなどにより計測した後に撮影時の倍率で補正する方法、撮影画像を画像解析ソフトなどを用いて計測する方法などを用いることが出来る。また測定する粒子の個数は最低１００個以上が好ましい。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
実施例では種々抗凝固条件で抗凝固を行った血液を、デキストラン硫酸固定化セルロース多孔質体を充填したミニカラムに直接通血した際の、血球の通過率と血中ブラジキニン濃度を評価した。血球の通過に関しては、通過率（％）にて評価し、その値が高い方が各種担体と血液細胞との相互作用が弱いことを意味する。通過率が１００％を示した場合、カラム入口側と出口側の血球数に変化がないことを意味し、実質的な上限値になる。またブラジキニンは接触する素材の陰性荷電量依存的に産生されるため、結果は単位（ｍｌ）吸着体あたりの血中ブラジキニン濃度で表記した。ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールの吸着に及ぼす抗血液凝固剤の影響はバッチ実験にて評価した。以下実施例に基づいて本発明のリポ蛋白質の吸着除去方法に関し詳細な説明をする。
【００３７】
実施例１
多孔質セルロース担体（チッソ（株）製、平均粒径約２００μｍ）を沈降体積で４０ｍｌ分取し、４０ｍｌの逆浸透水（Ｙａｍａｔｏ Ｐｕｒｅ ｌｉｎｅ ＲＯ２１、ヤマト科学（株））を加え内温を４０℃に昇温した。２Ｎ ＮａＯＨを２４ｍｌ添加し、４０℃にて３０分間振盪した。次にエピクロルヒドリン８．２ｍｌを添加し４０℃にて２時間反応させた。反応終了後、約４Ｌの水にて担体の洗浄を行いエポキシ化を行った担体を得た（エポキシ導入量；１３．６μｍｏｌ／ｇ）。
【００３８】
エポキシ化担体を沈降体積で３０ｍｌ分取し、デキストラン硫酸（分子量 約４，０００）３０ｇを逆浸透水３８ｍｌに溶解した溶液を添加し撹拌を行った。次に２ＮのＮａＯＨでｐＨを１０に合わせた後に、４５℃にて４８時間反応を行い、デキストラン硫酸の固定化を行った。
【００３９】
モノエタノールアミン２３０μＬに逆浸透水を添加し、全量を６．６ｍｌにした。本溶液を沈降体積３０ｍｌのデキストラン硫酸固定化済み担体に添加し、さらに４６ｍｌの逆浸透水を加え４５℃にて２時間反応を行った。本反応により未反応のエポキシ基の封止反応を行った。なおデキストラン硫酸の固定化量は、３．４ｍｇ／ｍｌ（担体沈降体積）であった。
【００４０】
〔通血実験〕
得られたデキストラン硫酸固定化吸着体をヘパリン（ヘパリンナトリウム注射液、吉富製薬（株））加生理食塩水（ヘパリンの最終濃度が７Ｕ／ｍｌになるように調製）で洗浄を行いヘパリンの平衡化を行った。次に担体の脱泡を行った後、沈降体積で２．５ｍｌをミニカラム（ポリプロピレン製９ｍｍ、テルモ社製）に充填した。カラム入口側にポリ塩化ビニル製のチューブ（内径１ｍｍ、外径３ｍｍ、長さ７０ｃｍ）を装着し、またカラム出口側にも同様のポリ塩化ビニル製のチューブ（長さ３０ｃｍ）を装着した。血液は健常人より１８Ｇの注射針を用い注意深く採血した。抗凝固は、ＡＣＤ−Ａ液をＡＣＤ−Ａ液（クエン酸ナトリウム；２．２０ｇ／ｄｌ、クエン酸；０．８０ｇ／ｄｌ、デキストロース；２．２０ｇ／ｄｌの組成の溶液）：血液＝１：２０（体積比）の割合で加え、及び、ヘパリンを最終濃度で０．５ＩＵ／ｍｌになるように添加することにより行った。抗血液凝固剤を添加した血液は、テフロン製三角フラスコ内（内容量５０ｍｌ、サンワ（株））に３０ｍｌ入れ、３７℃の恒温槽内にてスターラーチップにて低速で回転させ、流速２．９ｍｌ／ｍｉｎ（線速２．６ｃｍ／ｍｉｎ）で通血実験を開始した。カラム出口側から血液が出てきた時点を開始時点として、出口側チューブの先端を血液プールに戻し、灌流実験を１２０分間行った。
【００４１】
［血球数の測定］
所定時間後にカラム入口、及び出口側の血液を採取し、血液中の血球数（赤血球、白血球、血小板）を血球カウンター（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＣＣ−１８０ シスメックス（株））にて測定した。次に式（１）により各種細胞の通過率を求め、その結果を表１に示した。
通過率（％）＝カラム出口の血球数／カラム入口の血球数×１００ （１）
【００４２】
［血中ブラジキニン濃度の測定］
通血開始１０分後に、ミニカラムの出口側から出てきた血液をブラジキニンの分解阻害剤入りの専用容器（トラジロール（６０００ＫＩＵ／ｍｌ）、トリプシン（２ｍｇ／ｍｌ）、硫酸プロタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ−２Ｎａ（２０ｍｇ／ｍｌ））に採取した。つぎに容器内の阻害剤と血液を十分に混和し、４℃に保温した遠心器にて３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離を行い、血漿のみを分取した。分取した血漿中のブラジキニン濃度は、下記の方法にて測定した。
【００４３】
〈ブラジキニン濃度の定量〉
標準曲線用試験管に標準溶液１００μｌ及び緩衝液２００μｌを入れた。また検体用試験管には前処理検体２００μｌ及び緩衝液１００μｌを入れた。各試験管に標識抗原２００μｌを添加した後、抗ブラジキニン抗体２００μｌを各試験管に添加し、さらに不溶化ウサギＩｇＧ抗体をスターラーで攪拌しながらその２００μｌを各試験管に添加した。つぎに各試験管をミキサーで攪拌後、恒温槽（３７±１℃）中で３０分間静置した。所定時間後、恒温槽に入れたまま各試験管に塩化ナトリウム溶液（０．９％ｗ／ｖ）４ｍｌを添加した。前試験管を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、遠心終了後試験管を傾けて上清液を捨てた。各試験管に希釈用緩衝液５００μｌを入れ、ミキサーで攪拌して、沈殿を完全に分散させた。前試験管を恒温槽に入れ、３７±１℃で約３分間予熱後、各試験管に基質溶液（発色性酵素基質、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）１００μｌを添加し、混和後３７±１℃で３０分間静置した。所定時間後、恒温槽に入れたまま各試験管を直ちに反応停止液２．５ｍｌを順次添加し、恒温槽より取り出しミキサーで攪拌した。各試験管を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後に、上清をキュベットに移し、波長４１０ｎｍで吸光度測定を行った。また得られた標準曲線から血中ブラジキニン濃度を求め、単位吸着体あたり（ｍｌ）の産生量を表４に示した。
以上の測定は、キニン定量用キット「マーキットＡブラジキニン」大日本製薬（株）製を用いて測定した。
【００４４】
実施例２
ＡＣＤ−Ａ液と血液の添加比率をＡＣＤ−Ａ液：血液＝１：３０（体積比）にした以外は、実施例１と同様の方法に従って評価し、通血率を実施例１と同様の方法で求めた。その結果を表１に示した。
【００４５】
実施例３
ＡＣＤ−Ａ液と血液の添加比率をＡＣＤ−Ａ液：血液＝１：４０（体積比）にした以外は、実施例１と同様の方法に従って評価し、通血率を実施例１と同様の方法で求めた。その結果を表１に示した。
【００４６】
【表１】

【００４７】
比較例１
実施例１で作製したデキストラン硫酸固定化吸着体を生理食塩液で洗浄した。次にデキストラン硫酸固定化吸着体の脱泡を行った後、沈降体積で１ｍｌミニカラム（テルモ社製シリンジ２．５ｍｌを長さ１６ｍｍに切断し作製）に充填した。カラム入口側にポリ塩化ビニル製のチューブ（内径１ｍｍ、外径３ｍｍ、長さ７７ｃｍ）を装着し実験系を作製した。次に健常人より１８Ｇの注射針を用い注意深く採血した血液に、ＡＣＤ−Ａ液のみを体積比でＡＣＤ−Ａ液：血液＝１：１０になるように添加し、血液の抗凝固を行った。血液を３０ｍｌテフロン製三角フラスコ内（内容量５０ｍｌ、サンワ（株））に入れ、３７℃の恒温槽内でスターラーチップにて低速で回転させ、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでワンパスにて３０分間通血を行った。所定時間後、カラム出口側の血液を所定量採取し、血液中の血球数（赤血球、白血球、血小板）を血球カウンター（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＣＣ−１８０ シスメックス（株））にて測定した。次に式（２）により各種細胞の通過率を求め、その結果を表２、３に示した。また通血開始１０分後に、カラム出口側より血液のサンプリングを行い、実施例１と同様の方法で血中ブラジキニン濃度を求め、単位吸着体あたり（ｍｌ）の産生量を表４に示した。
なお、カラムを結合しないポリ塩化ビニル製のチューブ（内径１ｍｍ、外径３ｍｍ、長さ７７ｃｍ）のみを用い同様の評価を行った系を参考例１（カラム入口値）とした。
通過率（％）＝比較例の血球数／参考例１の血球数×１００ （２）
【００４８】
比較例２
ＡＣＤ−Ａ液の代わりにヘパリン（血中濃度７ＩＵ／ｍｌ）を用いた以外は、比較例１と同様の方法に従って評価し、通血率を比較例１と同様の方法で求めた。その結果を表２、３に示した。
【００４９】
【表２】

【００５０】
【表３】

【００５１】
結果；
〔血球の通過率〕実施例１、２、３の抗凝固条件で血液を抗凝固した場合、灌流を行った１２０分間、血小板の通過率は１００％近い高い値を示した（表１）。
（赤血球、白血球の通過率もほぼ１００％を示した）。
またＡＣＤ−Ａ液：血液＝１：１０でヘパリンを添加しない比較例１の抗凝固条件でも高い血球の通過率を示した。これに対し、ＡＣＤ−Ａ液を用いずにヘパリンのみで抗凝固を行った比較例２の場合、血小板の通過率が大幅に低下することがわかる（表３）。
（赤血球の通過率は、いずれの場合も約１００％であった）。
【００５２】
〔ブラジキニンの産生〕血球の通過率が高かった実施例１及び比較例１について血中ブラジキニン濃度を測定した。
その結果、実施例１の方が比較例１に比べ血中ブラジキニン濃度が低く、ブラジキニンの産生が抑制されていることがわかる。
血中ブラジキニンは、キニナーゼにより数分以内に分解される（半減期約１５秒）。しかしながら、実施例１の場合、循環系であるためプール血液中のブラジキニン濃度は、ワンパスの系に比較し上昇傾向にある。またＡＣＤ−Ａ液と血液の比率が１：２０であるため比較例１より、ＡＣＤ−Ａ液による希釈効果も少ない。それにも関わらず、ＡＣＤ−Ａ液とヘパリンを上記比率で併用することにより、高い通血性とブラジキニン産生抑制効果を発現することがわかる。
【００５３】
【表４】

【００５４】
実施例４
実施例１で作製した吸着体を用い、リポ蛋白質の吸着性能を評価した。
血液は健常人より１８Ｇの注射針を用い注意深く採血した。抗凝固は、ＡＣＤ−Ａ液をＡＣＤ−Ａ液（クエン酸ナトリウム；２．２０ｇ／ｄｌ、クエン酸；０．８０ｇ／ｄｌ、デキストロース；２．２０ｇ／ｄｌの組成の溶液）：血液＝１：２０（体積比）の割合で添加し、及び、ヘパリンを最終濃度で０．５ＩＵ／ｍｌになるように添加し、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ）して血漿を得た。
ポリプロピレン製チューブに予め生理食塩液で平衡化した実施例１で作製したデキストラン硫酸固定化吸着体１容量に対し、上記血漿を６容量添加し、温度３７℃、振盪回数３０回／ｍｉｎ、２時間振盪を行った。振盪後、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ）した後、上清を採取し、リポ蛋白質濃度を測定した。
なお吸着体の代わりに同体積の生理的電解質溶液を添加し同様の処理をしたものを参考例２とした。
【００５５】
［ＬＤＬコレステロールおよびＨＤＬコレステロールの測定］
血漿中の総コレステロール（以下ＴＣと略す。測定キット：コレステロール−ＨＲ（和光純薬工業（株）））、中性脂肪（以下ＴＧと略す。測定キット：クリニメイトＴＧ−２試薬（第一化学薬品（株）））、ＨＤＬ−コレステロール（以下ＨＤＬ−Ｃと略す。測定キット：ＨＤＬ−Ｃオート「第一」（第一化学薬品（株）））濃度の測定をカッコ内に示した各種キットを用いて行った。
またＬＤＬ−コレステロール（以下ＬＤＬ−Ｃと略す）濃度は、式（３）に示したＦｒｉｅｄｅｗａｌｄの式（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ ＷＴら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １８：４９９、１９７２．）より求めた。つぎに吸着体への各種リポ蛋白質の吸着率は式（４）および式（５）にて求めその結果を表５に示した。
（ＬＤＬ−Ｃ）＝ＴＣ−（ＨＤＬ−Ｃ）−（ＴＧ）／５ （３）
ＨＤＬ−Ｃの吸着率＝（（（参考例２のＨＤＬ−Ｃ濃度）−（実施例又は比較例のＨＤＬ−Ｃ濃度））／（参考例２のＨＤＬ−Ｃ濃度））×１００ （４）
ＬＤＬ−Ｃの吸着率＝（（（参考例２のＬＤＬ−Ｃ濃度）−（実施例又は比較例のＬＤＬ−Ｃ濃度））／（参考例２のＬＤＬ−Ｃ濃度））×１００ （５）
【００５６】
比較例３
ＡＣＤ−Ａ液の代わりにヘパリン（血中濃度７ＩＵ／ｍｌ）を用いた以外は、実施例４と同様の方法に従って評価し、リポ蛋白質の吸着率を実施例４と同様の方法で求めた。その結果を表５に示した。
【００５７】
結果；
実施例４、及び比較例３の結果から、リポ蛋白吸着における抗血液凝固剤の影響はなく、ＡＣＤ−Ａ液、およびヘパリンの併用で抗凝固を行っても、高い吸着性能を有していることがわかった。
【００５８】
【表５】

【００５９】
以上のことから、上記抗凝固条件で血液の抗凝固を行うことにより、高い吸着性能を維持しつつ、血小板などの血球の付着やブラジキニンの産生を抑制し、安定した直接血液灌流が可能になることがわかる。
【００６０】
【発明の効果】
本発明をもちいることにより、白血球の付着や血小板の粘着を大幅に抑制し、かつブラジキニン産生を抑制し、高いリポ蛋白質の吸着性能・選択性を発現することが可能になることがわかる。その結果、これまで血球の付着やブラジキニン産生の問題で直接血液灌流方式では使用不可能であった吸着体などを含め、安定した直接血液灌流が可能となり、大幅な処置時間の短縮・装置の簡略化・体外循環量の軽減などが期待できるようになった。

Claims (8)

1. 直接血液灌流法による陰性荷電を有する吸着体を用いたリポ蛋白質の吸着除去において、２価カチオンキレート剤であるクエン酸塩、及び、抗トロンビン作用を有する抗血液凝固剤であるヘパリン類を被処理血中に導入し、吸着体表面への血球付着およびブラジキニン発生を抑制する方法であって、
   クエン酸塩濃度が０．１％（ｗ／ｖ）から５．０％（ｗ／ｖ）のクエン酸塩溶液を、クエン酸塩溶液：血液の体積比率が１：１０から１：８０未満の割合で使用し、かつ、血中ヘパリン類濃度を０．０１ＩＵ／ｍｌから１．５ＩＵ／ｍｌとする抑制方法。
2. 吸着体を収納した吸着部、血液を該吸着部に流入させるための血液流入部、及び、該吸着部に流入された血液を該吸着部外に流出させるための血液流出部からなるリポ蛋白質吸着器を用いて行われる請求項１記載の抑制方法。
3. 血液流入部において、ヘパリン類を持続注入又はワンショットし、クエン酸塩溶液を持続注入する請求項２記載の抑制方法。
4. 吸着体として、水不溶性担体１ｍＬあたりに硫酸化多糖類及びその塩０．０２ｍｇ以上１００ｍｇ以下を固定化してなるものを用いる請求項１、２又は３記載の抑制方法。
5. 硫酸化多糖類が、デキストラン硫酸及びコンドロイチンポリ硫酸から選ばれる少なくとも１種である請求項４記載の抑制方法。
6. 水不溶性担体が、球状蛋白質を用いて測定される排除限界分子量が１００万以上の多孔質のものである請求項４または５記載の抑制方法。
7. 水不溶性担体が粒子状であり、その平均粒径が８０μｍ以上８００μｍ以下である請求項６記載の抑制方法。
8. 水不溶性担体粒子の８０容量％以上が、平均粒径の±７５％以内に分布している請求項７記載の抑制方法。