KR20170020749A

KR20170020749A - 고유속을 이용한 혈액으로부터 세균의 제거방법

Info

Publication number: KR20170020749A
Application number: KR1020167032452A
Authority: KR
Inventors: 키이스 맥크리어; 로버트 워드
Original assignee: 엑스테라 메디컬 코퍼레이션
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2017-02-24
Also published as: CN106255520A; DE15782250T1; JP2022125040A; AU2020200029A1; WO2015164198A1; MX2016013873A; AU2020200029B2; US20200171233A1; EP3134146A4; BR112016024569A2; ES2625351T1; JP7184864B2; US11844895B2; BR112016024569A8; CA2946294C; CA2946294A1; BR112016024569B1; AU2015250107A1; JP2017513636A; US20170035956A1

Abstract

본 발명은 흡착 매체를 이용하여 전혈, 혈청 또는 혈장으로부터 (예를 들어, 헤파란 설페이트에 대해 친화성을 갖지 않거나 낮은 친화성을 갖는 세균을 포함한 그람 음성 세균 및 그람 양성 세균) 세균의 상당량을 제거하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 높은 부피 유속과 높은 선유속을 수반하는 체외 치료에 사용될 수 있다.

Description

고유속을 이용한 혈액으로부터 세균의 제거방법{METHOD FOR REMOVING BACTERIA FROM BLOOD USING HIGH FLOW RATE}

본 출원은 2014년 4월 24일자로 출원된 미국 임시특허출원 제61/984,013호를 우선권으로 주장하며, 그의 교시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.

발명의 배경

혈류 감염 또는 균혈증은 집중 치료실 (ICU)의 큰 과제이다. 균혈증은 신속하게 패혈성 쇼크, 뇌수막염, 심내막염, 골수염 및 기타 전이성 합병증으로 이어질 수 있다. 황색포도상구균, 녹농균 및 장내세균이 균혈증 및 병원내 감염에 관여하는 가장 흔한 세균이다. 균혈증 환자의 병세 진행 중증도는 세균 부하 및 균혈증 지속기간 모두에 연관된다. 예를 들어, 대장균 및 황색포도상구균 균혈증 환자의 정량적 RT-PCR 연구는 rDNA의 수가 1,238 카피수/ml 이상으로 증가하면, 사망률이 14.3%에서 42.9%로 증가하고, 패혈성 쇼크가 31.4%에서 85.7%로 증가한다고 나타내었다. 또한 수막염균 (N. meningitides)의 높은 혈중 농도는 장기간 입원, 사지 또는 조직 손실, 투석의 필요성 및 환자 사망률과 상관관계가 있음을 발견하였다. 다른 연구는 다음과 같이 폐렴구균성 폐렴의 심각성이 혈중 세균 부하와 상관됨을 나타내었다: 1000 초과 폐렴구균 DNA 카피수/혈액 ml를 가진 환자의 사망률 25.9% 대 1000 미만 카피수/ml를 나타내는 환자의 사망률 6.1%. 또 다른 연구에서, 초기 진단 후 48 내지 96시간 사이의 추적 양성 혈액 배양이 복잡한 황색포도상구균 균혈증의 가장 강력한 예측 인자인 것으로 입증되었다. 효과적인 균혈증 치료를 더 어렵게 하는 것은 종종 적절한 항생제 치료의 지연 투여이다. 치료가 한 시간 지연될 때마다 사망 위험은 7% 이상 증가한다.

세균 감염을 퇴치하기 위한 종래의 전략은 숙주 조직의 손상을 최소화하면서 세균을 특정적으로 죽이는 활성 약물을 투여하는 것이다. 오늘날 이용가능한 보다 효과적인 일부 항생제는 매우 독성적이기 때문에 이것은 큰 과제이다. 예를 들어, 반코마이신은 신독성이며, 체외 산소화를 경험한 환자에게는 바로 사용을 금할 수 있다. 새로운 항생제가 현재 약제 내성을 해결하기 위해 성공적으로 개발된 경우에도, 새로운 슈퍼버그가 등장할 것이다. 분명히, 신약 개발 외에도, 감염을 퇴치하기 위한 새로운 전략이 필요하다.

약물 내성 병원균은 건강관리 시스템에 대한 위협을 증가시키고 있다. CDC는 최근 카바페넴 내성 장내세균의 출현을 경고하였다 (CRE; "슈퍼버그"). CRE 균혈증의 사망률은 50% 정도로 높을 수 있다. 심지어 가장 강력한 이용가능한 항생제에 대한 CRE의 저항은 임상의에게 몇가지 치료 옵션을 남긴다. 병원 획득 CRE 감염의 발생 빈도는 지난 10년 동안 400% 증가했다. 현재, CRE의 균혈증은 주로 병원내 감염이지만, 지역 사회에서 획득한 CRE의 발생 빈도가 증가할 수 있다는 우려가 있다. 오늘날, 유일한 전략은 교육과 예방을 통해 CRE 감염을 감소시키는 것이다.

세균 부하를 신속히 감소시키고, 균혈증의 기간을 단축할 수 있는 안전하고 광범위한 스펙트럼의 기술에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 전혈 또는 전체 혈청에서 병원균을 신속하고 안전하게 제거할 수 있는 고표면적 체외 친화성 흡착 매체를 제공함으로써, 상기의 요구 및 기타 요구를 만족시킨다.

발명의 개요

본 발명은 심지어 혈액 내에 존재하는 세균 종류의 일차 식별없이도 세균 부하를 신속히 감소시키고, 균혈증의 기간을 단축할 수 있는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, 세균으로 감염된 것으로 의심되는 대상체로부터 채취한 샘플에서 세균을 제거하기 위한 생체외 방법이 본원에 제공된다. 이 방법은 대상체로부터 채취한 샘플을 흡착 매체와 접촉시켜 세균 및 흡착 매체를 포함하는 부착 복합체가 형성되도록 하는 단계; 및 상기 부착 복합체에서 샘플을 분리하여 세균의 양이 감소된 샘플을 생성하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 이 단계로 이루어지거나, 또는 이 단계로 이루어진다. 전형적으로, 흡착 매체는 칼럼, 컨테이너 또는 카트리지 내에 포함된다.

일부 구체예에서, 샘플은 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 샘플은 전혈이다.

일부 구체예에서, 흡착 매체는 다당류 흡착제가 없는 친수성 표면을 갖는 고표면적 고체 기질이다. 일부의 경우, 고체 기질은 다수의 경질 폴리머 비드를 포함한다. 일부 구체예에서, 경질 폴리머 비드는 폴리우레탄, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 에틸렌과 다른 단량체의 코폴리머, 폴리에틸렌 이민, 폴리프로필렌, 폴리이소부틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 고체 기질은 하나 또는 다수의 중공 섬유 또는 실 (yarn)을 포함한다.

일부 구체예에서, 친수성 표면은 양이온성 표면이다. 다른 구체예에서, 친수성 표면은 중성 전하의 표면이다.

일부 구체예에서, 샘플내 세균은 약 20% 내지 약 99.9% 감소된다. 다른 구체예에서, 샘플내 세균은 약 20% 내지 약 40% 감소된다.

일부 구체예에서, 세균은 그람 음성 세균이다. 다른 구체예에서, 세균은 그람 양성 세균이다. 다른 구체예에서, 세균은 대장균, 폐렴간균, 카바페넴 내성 대장균, 카바페넴 내성 폐렴간균 및 광범위 베타-락타마제 폐렴간균, 엔테로코쿠스 패시움 (Enterococcus faecium), 아시네토박터 바우만니 (Acinetobacter baumannii) 및 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 세균은 황색포도상구균, 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 흡착 매체의 양이온 표면은 대장균, 폐렴간균, 카바페넴 내성 대장균, 카바페넴 내성 폐렴간균, 및 광범위 베타-락타마제 폐렴간균, 엔테로코쿠스 패시움, 아시네토박터 바우만니 및 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA)으로 이루어진 군에서 선택된 세균과 부착 복합체를 형성한다. 다른 구체예에서, 중성 전하의 표면은 황색포도상구균, 메티실린 내성 황색포도상구균 (MSA) 및 대장균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세균과 부착 복합체를 형성한다.

일부 양태에서, 헤파란 설페이트에 대해 낮은 친화성 또는 무친화성을 가지는 것으로 알려진 세균에 감염된 것으로 의심되는 대상체로부터 채취한 샘플로부터 세균을 제거하기 위한 생체외 방법이 본원에 제공된다. 이 방법은 대상체로부터 채취한 샘플을 그의 표면 상에 적어도 하나의 다당류 흡착제를 갖는 고표면적의 고체 기질인 흡착 매체와 접촉시켜 부착 복합체가 형성되도록 하는 단계; 및 상기 부착 복합체에서 샘플을 분리하여 세균의 양이 감소된 샘플을 생성하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 이 단계로 이루어지거나, 또는 이 단계로 이루어진다. 부착 복합체는 세균 및 흡착 매체를 포함한다. 전형적으로, 흡착 매체는 칼럼, 컨테이너 또는 카트리지 내에 포함된다. 특정 양태에서, 샘플은 칼럼, 컨테이너 또는 카트리지에서 배출되고 부착 복합체는 잔류한다.

일부 구체예에서, 고체 기질은 다수의 경질 폴리머 비드를 포함한다. 일부 경우, 경질 폴리머 비드는 폴리우레탄, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 에틸렌과 다른 단량체의 코폴리머, 폴리에틸렌 이민, 폴리프로필렌 및 폴리이소부틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 일원이다. 다른 구체예에서, 고체 기질은 하나 또는 다수의 중공 섬유를 포함한다.

일부 구체예에서, 적어도 다당류 흡착제는 헤파린, 헤파란 설페이트, 히알루론산, 시알산, 만노스 배열을 가지는 탄수화물 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 일원이다. 다른 구체예에서, 적어도 다당류 흡착제는 헤파린 또는 헤파란 설페이트이다. 일부의 경우, 적어도 다당류 흡착제는 헤파린이다.

일부 구체예에서, 비드는 비드 그램 당 약 0.27 mg 내지 10 mg의 헤파린으로 코팅된다. 다른 구체예에서, 비드는 비드 그램 당 2±0.5 mg의 헤파린으로 코팅된다.

일부 구체예에서, 세균은 그람 음성 세균이다. 다른 구체예에서, 세균은 그람 양성 세균이다. 또 다른 구체예에서, 세균은 대장균, 폐렴간균, 아시네토박터 바우만니, 엔테로코쿠스 패시움, 카바페넴 내성 대장균, 카바페넴 내성 폐렴간균 및 광범위 베타-락타마제 폐렴간균으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 양태에서, 투석 또는 체외 산소공급을 받고 있는 대상체로부터 채취한 샘플로부터 세균을 제거하기 위한 생체외 방법이 본원에 제공된다. 이 방법은 대상체로부터 채취한 샘플을 투석 카트리지 또는 산소공급기와 직렬 연결된, 흡착 매체를 포함하는 흡착 카트리지와 접촉시켜 부착 복합체가 형성되도록 하는 단계; 및 상기 부착 복합체에서 샘플을 분리하여 세균의 양이 감소된 샘플을 생성하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 이 단계로 이루어지거나, 또는 이 단계로 이루어진다. 전형적으로, 흡착 매체는 칼럼, 컨테이너 또는 카트리지 내에 포함된다. 특정 양태에서, 샘플은 칼럼, 컨테이너 또는 카트리지에서 배출되고 부착 복합체는 잔류한다.

일부 구체예에서, 샘플은 200 ml 미만의 전혈량을 갖는다.

일부 구체예에서, 흡착 카트리지는 1 cm 내지 50 cm의 칼럼 높이를 갖는다. 일부 구체예에서, 흡착 카트리지는 1 cm 내지 50 cm의 칼럼 직경을 갖는다.

일부 구체예에서, 흡착 카트리지는 투석 카트리지에 비해 대상체에 근접한다. 다른 구체예에서, 흡착 카트리지는 투석 카트리지에 비해 대상체에 대해 원위에 있다.

이들 및 다른 양태, 목적 및 이점은 도면 및 이어지는 상세한 설명을 읽을 때 더 명확해질 것이다.

도 1A-B는 흡착 매체와 인간 혈액을 비교하여 나타낸 것이다. 도 1A는 흡착 매체를 나타내고, 도 1B는 인간의 혈액 도말 이미지를 나타낸다.
도 2는 세균, 예를 들어 황색포도상구균 및 클라미디아, 및 바이러스, 예를 들면, 수두 바이러스, 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 및 피코르나바이러스 (소아마비)의 크기 비교를 나타낸다.
도 3은 직경 (d)를 가지는 비드 및 직경 (a)를 가지는 셀을 함유하는 흡착 매체의 단면도를 도시한다.
도 4는 강제 대류에 적용된 경질 매체에 대한 흡착 카트리지 칼럼의 높이 및 선형 흐름의 함수로서 최소 비드 크기를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 부분적으로, 혈액 (예를 들어 전혈 및 혈청)으로부터 세균 (예를 들어, 헤파란 설페이트에 대해 저 친화성을 갖거나 친화성을 갖지 않는 것으로 알려진 세균을 포함한 그람 음성 세균 및 그람 양성 세균)의 상당량을 제거하는데 효과적인 흡착 매체의 발견에 기초한다. 또한 흡착 매체는 높은 체적 유속 및 높은 선유속을 수반하는 체외 치료에 사용될 수 있다. 전형적으로, 흡착 매체는 칼럼, 컨테이너 또는 카트리지 내에 포함된다. 특정 양태에서, 샘플은 칼럼, 컨테이너 또는 카트리지에서 배출되고 부착 복합체는 잔류한다.

본 발명의 제1 측면은 혈액을 고체 기질과 접촉시켜 포유동물의 혈액과 같은 혈액에서 세균을 제거하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 고체 기질의 표면 구조가 세균성 병원균 또는 바이러스와 같은 병원균을 제거하는데 효과가 있음을 발견하였다.

본 발명의 기질은 큰 압력 강하없이 기질 상에 혈액의 높은 유속을 허용하기에 충분히 큰 간극 크기를 갖는다. 예를 들어, 혈액은 포유동물 환자에서 취해짐으로써, 흡착층의 표면에 흡착질의 전달이 주로 강제 대류에 의해 특정되는 유속으로 기질을 통과한다. 대류 수송에 적합한 기질은, 일반적으로 입자, 비드, 섬유, 실, 망상 폼, 또는 선택적으로 나선형으로 감긴 조밀막과 같은 고체의 필수 비다공성 물질 사이에 거시적인 "채널" 또는 가시적인 작은 틈새에 좌우된다.

이것은 고다공성 흡착 매체 (예를 들면, 다공성 실리카, Sephadex^®, 가교 폴리스티렌 및 다른 크기 배제 매체) 및 훨씬 느린 분자 확산 과정을 이용하는 많은 다른 미세다공성 매체와 대조적이다. 확산 수송에 의존하는 흡착 기질은 일반적으로 미세 기공과 매우 높은 내부 표면적을 갖는 다공성 물질로 구성된다.

I. 정의

용어 "체외 치료"는 신체 밖, 즉 생체외에서 수행되는 의료 절차를 포함한다. 일부 경우, 체외 치료는 혈액과 같은 체액을 개체에서 채취하고, 체액을 개체에 복귀시키기 전에 산소, 혈액 항응고제, 마취제 등을 예로 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 목적 산물을 그에 첨가하는 방법을 포함한다. 다른 경우, 체외 치료는 신체 또는 체액에서 자연스럽게 발생하는 독소, 독 또는 바이러스 등과 같은 바람직하지 않은 산물을 제거하는 단계를 포함한다. 체외 치료의 비제한적인 예는 성분 채집, 자가수혈, 혈액투석, 혈액여과, 세포원형질분해, 체외순환 (ECC), 체외 생명유지장치 (ECLS), 체외 막 산소화 (ECMO) 및 심폐 바이패스를 포함한다.

용어 "고 유속" 또는 "고 유동 조건"은 확산 한계 위에 있는 혈액의 유량 또는 속도를 포함한다.

용어 "흡착 매체"는 세포, 유기체, 바이러스, 병원균, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 화학 분자, 생체 분자가 그 표면에 부착하고 혈액과 같은 샘플에서 제거될 수 있는 물질을 포함한다.

용어 "부착 복합체"는 제1 분자가 기질과 같은 표면에 부착 (예를 들어, 링크, 커플링 또는 결합)되고, 제2 분자가 제1 분자에 부착되어 있는 적어도 두 분자의 복합체를 포함한다. 예를 들어, 병원균 또는 바이러스는 헤파린에 부착하여 부착 복합체를 형성할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법에서, 부착 복합체는 잔류하고, 샘플로부터 병원균 또는 바이러스가 정화된다.

용어 "고표면적"은 체적비에 대해 큰 비표면적을 가지는 성질을 포함한다.

용어 "흡착제"는 화합물, 생체 분자, 또는 물질이 부착 (예를 들어, 링크, 커플링 또는 결합)되는 고체 기질을 포함한다. 특정의 경우, 흡착제는 고체 기질 자체이다. 일 구체예에서, 흡착제는 그에 결합된 헤파린과 같은 다당류를 가지는 폴리머 수지이다. 기질은 폴리머 비드, 섬유 또는 실일 수 있다.

용어 "경질 폴리머 비드"는 폴리머 수지로 제조되는 비드, 과립, 펠렛, 구체, 입자, 마이크로캡슐, 구체, 미세구체, 나노구체, 마이크로비드, 나노비드, 미소입자, 나노입자 등을 가리킨다. 폴리머 비드는 기질로서 유용하다.

용어 "섬유" 또는 "실"이 고체 기질로서 유용하다. 섬유 또는 실은 합성 폴리머 또는 천연 폴리머 또는 이들의 혼합물로 제조될 수 있다. 특정 예에서, 원래 다공성인 중공 섬유 또는 실은 헤파린 또는 기타 흡착제가 그의 외부 및/또는 내부 표면에 결합하기 전, 그 동안 또는 그 후에 조밀화되거나 비다공성으로 된다.

용어 "탄수화물"은 탄소, 수소 및 산소 원자를 함유하고, 일반적으로 실험식 C_x(H₂O)_y (여기서, x 및 y는 서로 다른 수이다)를 가지는 분자를 지칭한디. 탄수화물의 예는 단당류, 이당류, 올리고당 및 다당류를 포함한다.

용어 "다당류"는 단당류 단위가 글리코시드 결합에 의해 함께 결합되어 있고 실험식 C_x(H₂O)_y(여기서, x는 200 내지 약 3000)를 가지는 분자를 지칭한디.

용어 "친수성 표면"은 표면이 평평한 경우 90°미만의 수접촉각을 가지는 표면을 포함한다.

세균의 맥락에서 용어 "헤파란 설페이트에 대한 저친화성"은 헤파란 설페이트에 대한 세균의 결합 친화성이 낮은 것을 가리킨다. 일부 구체예에서, 결합 친화성은 헤파란 설페이트에 대해 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)과 같은 표준 분석법을 이용하여 결정된다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 예측 분석, 예컨대 병원균, 예를 들어, 세균에 의해 발현되는 추정 헤파란 설페이트 결합 단백질의 분석에 기초하여 결정된다. 용어 "헤파란 설페이트에 대한 무친화성"이란 헤파란 설페이트에 대해 결합 친화성이 없거나, 검출한계 미만의 친화성을 가지거나, 또는 헤파란 설페이트에 대한 결합이 알려지지 않은 세균을 가리킨다. 일부의 경우, 헤파란 설페이트에 대한 무친화성은 헤파란 설페이트에 대해 예측되는 결합 친화성을 가지지 않는 것을 포함한다.

II. 구체예의 상세 설명

A. 대류 수송에 의한 세균성 병원균의 결합

대류 수송 동안, 본 발명의 본질적으로 비다공성인 흡착 기질에 대한 세균성 병원균의 결합은 전형적으로 체외 혈액 회로의 안전한 작동에 사용되는 상대적으로 높은 유동 조건하, 예를 들어 선유속으로 측정할 때 ≥8 cm/분, 바람직하게는 약 ≥30 cm/분,보다 바람직하게는 약 30-1,000 cm/분에서 특히 효과적이다

일부 구체예에서, 흡착 매체는 약 8 cm/분 내지 약 1,000 cm/분, 예를 들어, 약 8 cm/분 내지 약 30 cm/분, 약 25 cm/분 내지 약 100 cm/분, 약 50 cm/분 내지 약 200 cm/분, 약 100 cm/분 내지 약 1000 cm/분, 약 200 cm/분 내지 약 1000 cm/분, 약 400 cm/분 내지 약 1000 cm/분, 약 500 cm/분 내지 약 1000 cm/분, 약 600 cm/분 내지 약 1000 cm/분, 약 100 cm/분 내지 약 500 cm/분 또는 약 300 cm/분 내지 약 800 cm/분의 선유속으로 체외 회로의 전혈에서 병원균을 제거한다. 특정 예에서, 유속은 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 100 cm/분 또는 약 25-40 cm/분이다.

다른 구체예에서, 흡착 매체는 약 50 mL/분 내지 약 5 L/분, 예를 들어, 50 mL/분, 100 mL/분, 150 mL/분, 200 mL/분, 250 mL/분, 300 mL/분, 350 mL/분, 400 mL/분, 500 mL/분, 550 mL/분, 600 mL/분, 650 mL/분, 700 mL/분, 750 mL/분, 800 mL/분, 850 mL/분, 900 mL/분, 950 mL/분, 1.0 L/분, 1.5 L/분, 2.0 L/분, 2.5 L/분, 3.0 L/분, 3.5 L/분, 4.0 L/분, 4.5 L/분, 및 5 L/분의 체적 유속으로 체외 회로의 전혈에서 병원균을 제거한다. 특정 예에서, 유속은 바람직하게는 >150 mL/분이다.

이에 반해 고다공성 흡착제 매체는 1 mL/분 미만 내지 약 50 mL/분 미만의 훨씬 더 낮은 유속을 필요로 한다. 또한, 결합 부위에 대해 흡착질의 강제 대류를 사용하는 매체에 비해서, 매체내 흡착 부위에 흡착질의 확산 수송을 필요로 하는 매체는 흡착 기질 상에서의 체류 시간 (예를 들어, 흡착질 (예를 들어, 세균)이 흡착 매체와 접촉하는 시간의 양)을 훨씬 더 길게 요구하며, 아는 표준 체외 혈액 시스템에 적합하지 않다.

전형적으로, 강제 대류에 의해 흡착질을 결합 부위 (본질적으로 비다공성 매체 상의)로 전달하는데 필요한 낮은 체류 시간에 비해서, 매체내 흡착 부위에 흡착질의 확산 수송을 필요로 하는 매체는 흡착 칼럼 상에서의 "체류 시간"을 더 길게 요구한다. 그러나, 특히 포함될 수 있는 혈액의 최대 보유 부피, 및 흡착 매체를 통과하는 혈액 또는 혈청의 유속에 대하여 안전하고 효과적인 흡착 카트리지, 칼럼, 필터 등의 크기는 실질적인 제한이 있다. 이러한 이유 때문에, 흡착 장치를 통한 평균 유속은 설계 변수로 간주된다.

높은 유속 및 더 짧은 체류 시간이 요구되는 경우 훨씬 더 느린 확산 수송에 의존하는 기질이 훨씬 덜 효과적이지만, 강제 대류 수송에 의존하는 기질이 일반적으로 고유속에 더 적합하다. 그 때문에, 체외 혈액 정화 장치에서, 흡착질은 흡착 매체 내의 구멍을 통해 빠르게 확산되는 것이 바람직하다. 혈액은 인공 물질로부터 제조된 회로를 통해 펌핑되는 경우, 정체를 예방하고 혈액 응고 위험을 감소시키기 위해 상대적으로 높은 혈류 속도를 사용하는 것이 일반적인 관행이다. 한편, 이들은 혈액 세포를 파열시키거나 다르게 손상시키는 고전단속도 또는 충돌 피해에 노출시킬 수 있기 때문에 매우 높은 유속은 회피될 수 있다. 따라서, 본 발명은 대류 수송 및 그의 바람직한 더 빠른 동역학의 바람직한 특성을 이용하여 혈액으로부터 세균성 병원균을 제거하기 위한 방법 및 장치를 제공한다. 이것은 혈액을 원하는 사이토카인, 병원균 또는 세균에 결합하여 이들을 혈액으로부터 제거할 수 있는 실질적으로 비-마이크로다공성 기질 (예를 들면, 고체 기질)을 통해 통과/유동시킴으로써 달성된다.

흡착 매체는 >50 mL/분, 바람직하게는 약 150 mL/분 내지 5L/분의 유속으로 기존의 체외 혈액 순환에서 사용될 수 있다. 선유속에 의해 측정되는 경우에, 유속은 ≥8 cm/분, 바람직하게는 약 ≥24 cm/분, 더 바람직하게는 약 24-329 cm/분, 또는 그 이상이다. 예를 들어, 유속은 25, 50, 75, 100, 125, 150,175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800 cm/분 또는 그 이상일 수 있다. 이러한 높은 유속은 흡착 칼럼 내 짧은 체류 시간을 만들고, 대류 수송은 브라운 확산 수송보다 우세하다. 이는 바이러스, 세균 및 기생충과 같은 더 큰 입자와 천천히 확산하는 기타 단백질 및 병원균과 결합하는데 특히 중요하다.

세균성 병원균의 제거를 위해 이용가능한 주 흡착 부위는 그를 통해 혈액이 흐르거나, 또는 강제 대류에 의해 전달되는 매체 베드, 컨테이너 또는 카트리지의 간극 내 표면에 위치한다. 혈액을 치료하기 위해, 간극 채널은 직경이 평균 6 미크론인 적혈구의 수송을 허용하기에 충분히 커야할 필요가 있다. 팩킹된 흡착 카트리지가 고 혈액 유속을 가지고 체외 회로에 배치될 수 있도록, 간극 채널은 적혈구의 직경보다 수 배 더 클 수 있다. 이는 패키징 베드 또는 카트리지를 통해 흐르는 혈액의 압력 강하를 최소화하는 동시에 용혈로 이어지는 고전단을 방지하거나 실질적으로 제거할 수 있다. 또한, 매체는 바람직하게는 압축에 의해 필터 카트리지를 봉쇄할 수 있는 변형을 최소화하기 위해 경질이다. 이러한 바람직한 설정에 기초해, 최적화된 경질 매체는 예를 들어, 고유속 체외 혈액 회로에서 병원균 및/또는 사이토카인의 효율적인 제거를 위해 간극 채널 크기와 총 표면적에 균형을 이루게 한다.

청구된 방법은 체외 치료 또는 절차, 및 또한 이식 장치에 주로 적용되도록 의도된다.

포유동물 유래 전혈 및 혈청이 본 발명에서 사용될 수 있다. 청구된 방법에서 사용할 수 있는 혈액 또는 혈청의 양은 제한되지 않는다. 이는 환자에게 다시 연속 재순환이 사용되는 경우 환자 또는 대상체의 전혈량까지 포함하여, 1 mL 미만 내지 1 L 초과의 범위일 수 있다. 필요하다면, 흡착 베드를 통한 1회 이상의 통과가 이용될 수 있다. 혈액은 인간 또는 동물의 혈액일 수 있다.

일부 구체예에서, 샘플, 예를 들어, 전혈 또는 혈청내 세균 또는 병원균은 약 20% 내지 약 90% 까지, 예를 들어, 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, 90% 또는 99.9% 감소된다. 다른 구체예에서, 샘플내 세균은 약 20% 내지 약 90% 까지 감소되며, 예를 들어, 세균 또는 병원균이 약 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 세균 또는 병원균이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99.9% 감소된다.

일부 구체예에서, 샘플내 세균은 그람 음성 세균, 예컨대 크리스탈 바이올렛 염료를 보유하지 않는 임의의 세균이다. 그람 음성 세균의 비제한적인 예로는 폐렴간균, 아시네토박터 바우만니, 녹농균, 대장균, 살모넬라, 이질균, 스테노트로포모나스 말토필리아, 모락셀라, 보렐리아, 부르콜데리아, 캄필로박터, 클라미디아, 헤모필루스, 헬리코박터, 스트렙토포모나스, 비브리오, 레지넬라, 기타 장내 세균, 및 이들의 약물 내성 균주를 들 수 있다. 다른 구체예에서, 샘플내 세균은 그람 양성 세균, 예컨대 크리스탈 바이올렛 염료를 보유하는 임의의 세균이다. 그람 양성 세균의 비제한적인 예로는 방선균, 간균, 장내구균, 젖산간균, 리스테리아 모노사이토게네스, 미코박테리움, 노카르디아, 프로피오니박테리아, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 스타필로코커스 사프로파이티커스, 스트렙토마이세스, 폐렴연쇄상구균, 화농연쇄구균, 녹색연쇄구균, 장구균, 클로스트리듐 디피실리균, 엔테로코쿠스 패시움, 엔테로코쿠스 패칼리스, 및 이들의 약물 내성 균주를 들 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 전혈 또는 혈청 샘플에서 그람 음성 세균을 제거하기 위해 사용된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 샘플에서 그람 양성 세균을 제거하기 위해 사용된다. 또 다른 구체예에서, 그의 표면 상에 다당류 흡착제를 갖는 본원에 기재된 흡착 매체는 샘플로부터 대장균, 폐렴간균, 아시네토박터 바우만니, 엔테로코쿠스 패시움, 카바페넴-내성 대장균, 카바페넴-내성 폐렴간균, 및/또는 광범위 베타-락타마제 폐렴 구균을 제거하기 위해 사용된다.

일부 구체예에서, 중성 전하의 친수성 표면을 가지는 흡착 매체는 전혈 또는 혈청 샘플로부터 황색포도상구균, 메티실린-내성 황색포도상구균 (MRSA) 및/또는 대장균을 제거하기 위해 사용된다. 다른 구체예에서, 양이온 표면 (친수성 표면)을 가지는 흡착 매체는 샘플로부터 대장균, 폐렴간균, 카바페넴-내성 대장균, 카바페넴-내성 폐렴간균, 및 광범위 베타-락타마제 폐렴간균, 엔테로코쿠스 패시움, 아시네토박터 바우만니, 및 메티실린-내성 황색포도상구균 (MRSA)을 제거하기 위해 사용된다.

A. 흡착 매체

다양한 모양 및 조성을 가지는 재료들이 본 발명의 기질로서 사용될 수 있다. 모든 적절한 흡착성 기질은 강제 대류 전달을 통해 (1차적으로) 결합 부위로의 흡착질의 수송을 촉진함과 동시에 높은 표면적을 제공한다. 흡착 매체를 만드는 데에 유용한 기질은 비공성 경질 비드, 입자, 팩킹, 그물 모양의 폼, 경질의 일체 베드 (예를 들어 소결된 비드 또는 입자로 형성된 것), 직물 또는 부직물로 채워진 칼럼, 실 또는 고체로 채워진 칼럼 또는 중공 비-마이크로다공성 모노필라멘트 섬유, 평 필름 또는 조밀 막으로 형성된 나권형 카트리지, 또는 혼합 비드/직물 카트리지와 같은 매체의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 기질은 처음에는 마이크로다공성이었다가, 흡착 부위가 생성되기 전, 생성되는 동안 또는 생성된 다음에 근본적으로 비공성으로 된다.

유용한 기질 중 하나는 고체 비드 또는 입자의 형태이다. 비드는 접하는 유속 하에서 변형 또는 압축을 막기 위해서 충분히 단단한 재료로 만들어진다. 일부 구체예에서는, 충분한 기질 강도는 물 또는 식염수를 전형적인 임상 유속으로 약 1시간 동안 흘려보내는 동안 흡착 베드를 가로지르는 압력 강하의 현저한 증가 부재이다. 예를 들면, 예컨대 식염수의 유사한 유속에서 측정되었을 때 (예를 들어, 흐름의 첫 1 분동안 측정된 경우), 적합한 기질 강도는 초기 압력 강하와 비교하여 압력 강하의 <10-50% 증가이다.

흡착 기질 비드는 수 종의 상이한 생체 적합성 재료, 예를 들어 천연 또는 합성 폴리머 또는 유리, 세라믹 및 금속을 포함하는 비폴리머성 재료로 만들어질 수 있고, 이는 침출성 불순물이 실질적으로 없다. 몇몇 예시적인 폴리머는 폴리우레탄, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌 또는 에틸렌과 다른 단량체의 코폴리머, 폴리에틸렌 이민, 폴리프로필렌 및 폴리이소부틸렌이다. 유용한 기질의 예는 비공성 초고분자량 폴리에틸렌 (UHMWPE)을 포함한다. 다른 적합한 비드는 폴리스티렌, 고밀도 및 저밀도 폴리에틸렌. 실리카, 폴리우레탄 및 키토산이다.

비드, 섬유, 실 및 이와 유사한 기질은 흡착 표면적을 증가시키기 위한 표면거칠기 또는 표면형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 표면적 대 부피 비율을 증가시킴으로써 표면적을 증가시킬 수 있다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 평평하지 않고 굽은 모양의 표면이 세균과 병원균이 더 많이 결합할 수 있도록 결합 부위를 만든다. 전형적으로 자유로운 형태, 모양 또는 기하학적인 형태가 표면적을 더 많이 만들어내며 유리하다. 도 1A은 반응기 외에서 얻어진 UHMWPE 비드를 나타낸다.

비드의 제조 방법은 종래 기술에서 알려져 있다. 예를 들어, 적합한 폴리에틸렌 비드와 기타 폴리올레핀 비드는 합성 과정에서 직접 생성된다. 일부 경우에, 비드는 필요로 하는 크기와 모양으로 가공된다. 또 다른 폴리머들은 필요로 하는 크기 분포와 모양의 비드를 만들기 위해서 분쇄 또는 분무 건조, 및 분류되거나 또 다른 절차를 거칠 수 있다.

일부 측면에서, 본 발명의 흡착 매체는 박테리아 병원균과 결합할 수 있는 다당류 흡착제를 부착하기 위한 표면을 제공한다. 일부 구체예에서, 흡착 매체는 표면에 적어도 하나의 다당류 흡착제를 가지는 고표면적 고체 기질을 포함한다.

다른 측면에서는, 본 발명의 흡착 매체는 다당류 흡착제가 없는 친수성 표면 ("맨 표면")을 제공한다. 일부 구체예에서 흡착 매체는 높은 표면적과 친수성 양이온을 가지는 고체 기질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 흡착 매체는 높은 표면적과 친수성 중성 표면을 가지는 고체 기질을 포함한다.

고체 기질은, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 실리카, 라텍스, 유리, 셀룰로스, 가교된 아가로스, 키틴, 키토산, 가교된 덱스트란, 가교된 알기네이트, 실리콘, 플루오로폴리머, 및 기타 합성 폴리머로 만들어질 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 고표면적을 가지는 고체 기질은 복수의 단일층, 필터, 막, 고체섬유, 중공 섬유, 입자 또는 비드일 수 있다. 선택적으로, 고체 기질은 다른 큰 표면적을 제공하는 기타 형태나 모양으로 나타날 수 있다.

특정의 경우, 고체 기질은 복수의 경질 폴리머 비드, 예를 들면 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 실리카, 라텍스, 유리, 폴리아크릴로니트릴, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 실리카, 라텍스, 유리, 셀룰로스, 가교된 아가로스, 키틴, 키토산, 가교된 덱스트란, 가교된 알기네이트, 실리콘, 플루오로폴리머, 및 합성 폴리머 비드일 수 있다. 바람직하게 경질 폴리머 비드는 폴리에틸렌 비드이다.

고체 기질의 크기는 분석에 사용된 시험 샘플의 부피 또는 다른 매개변수에서 따라서 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 경질 폴리머 비드에서 각 비드는 1 ㎛ 내지 약 1 mm, 예를 들어 1 ㎛, 2 ㎛, 3 ㎛, 4 ㎛, 5 ㎛, 6 ㎛, 7 ㎛, 8 ㎛, 9 ㎛, 10 ㎛, 15 ㎛, 20 ㎛, 25 ㎛, 30 ㎛, 35 ㎛, 45 ㎛, 55 ㎛, 60 ㎛, 65 ㎛, 70 ㎛, 75 ㎛, 80 ㎛, 85 ㎛, 90 ㎛, 95 ㎛, 100 ㎛, 200 ㎛, 300 ㎛, 400 ㎛, 500 ㎛, 600 ㎛, 700 ㎛, 800 ㎛, 900 ㎛, 또는 1 mm의 평균 외경을 갖는다. 다른 구체예에서, 복수의 경질 폴리머 비드에서 각 비드는 10 ㎛ 내지 약 200 ㎛, 예를 들어, 10 ㎛, 15 ㎛, 20 ㎛, 25 ㎛, 30 ㎛, 35 ㎛, 45 ㎛, 55 ㎛, 60 ㎛, 65 ㎛, 70 ㎛, 75 ㎛, 80 ㎛, 85 ㎛, 90 ㎛, 95 ㎛, 100 ㎛, 105 ㎛,110 ㎛, 115 ㎛, 120 ㎛, 125 ㎛, 130 ㎛, 135 ㎛, 140 ㎛,145 ㎛, 150 ㎛,155 ㎛, 160 ㎛, 165 ㎛, 170 ㎛, 175 ㎛, 180 ㎛, 185 ㎛, 190 ㎛ 195 ㎛, 또는 200 ㎛ 평균 직경을 갖는다.

일부 구체예에서, 유용한 비드 크기는 직경이 약 100 미크론(㎛) 내지 500 ㎛ 또는 그 이상, 예를 들어 100 ㎛, 150 ㎛, 200 ㎛, 250 ㎛, 300 ㎛, 350 ㎛, 400 ㎛, 450 ㎛, 500 ㎛, 또는 그 이상의 직경을 갖는다. 비드의 평균 크기는 직경이 약 150 ㎛ 내지 450 ㎛, 예를 들어 150 ㎛, 200 ㎛, 250 ㎛, 300 ㎛, 350 ㎛, 400 ㎛, 또는 450 ㎛이다. 예를 들어, 평균 직경 300 ㎛의 Polymer Technology Group(Berkeley, CA)제 폴리에틸렌 비드가 본 발명에 적합하다.

일부 구체예에서, 기질은 장벽 막, 예를 들면 비다공성 필름이다. 대안적으로, 마이크로다공성 막은 기공을 본질적으로 비다공성 재료, 예를 들어 폴리머로 채워 비공성이 제공될 수 있다. 시트, 솔리드 또는 중공 섬유 미소공성의 막이 하우징 또는 컨테이너 내에 배열될 수 있다.

흡착 매체는 칼럼, 카트리지, 튜브, 원심분리관, 베드 등과 같은 베슬, 또는 흡착 매체에 부착된 세균성 병원균을 방해하지 않고 다당류에 결합된 흡착 매체에 포착되지 않은 혈액 세포를 제거할 수 있는 임의의 베슬에 들어있을 수 있다.

기질은 전형적으로 기질을 컨테이너 내에서 유지하고 혈액 또는 혈청을 기질 또는 베드의 표면 위에 흐르도록 허용하는 하우징 또는 컨테이너, 예를 들어 칼럼에 패키징되어 제공된다. 기질은 기질의 흡착면에 결합되는 흡착질을 최대로 하도록 컨테이너 내에 배열될 수 있다. 하우징 또는 컨테이너는 혈액 또는 혈청에 큰 표면적을 제공하는 대공성 (macroporous) 표면 구조를 가질 수 있다.

칼럼 또는 다른 하우징 모양은 하우징이 기질 매체로 충전된 후, 직조 또는 부직 헤파린화 직물로 팩킹될 수 있거나, 또는 헤파린, 헤파란 설페이트 또는 임의적인 비-헤파린 흡착 부위가 예를 들어 공유, 이온 또는 다른 화학적 또는 물리적 결합에 의해 부착될 수 있다. 제직 또는 편직 동안, 또는 부직웹의 형성 동안 섬유 데니어 및 직물의 밀도를 제어함으로써, 간극 기공 크기를 제어할 수 있다. 유용한 부직포는 섬유 얽힘 및/또는 교차 섬유의 접착 또는 응집에 의해 함께 유지되는 랜덤 배향을 갖는 펠트, 용융 취입물 또는 정전 방사웹 형태일 수 있다. 유용한 직물은 더 한정적이고 비랜덤의 구조를 가질 수 있다.

칼럼 또는 하우징은 섬유 또는 섬유로 만들어진 실로 팩킹될 수 있다. 폴리에틸렌 및 기타 섬유들을 뽑아서 얇은 중공 또는 솔리드 모노필라멘트 섬유 또는 멀티필라멘트 실로 만들 수 있고, 이들은 중공 섬유 멤브레인이 종래 혈액투석 카트리지 또는 혈액 산소 공급기 내에 설치되는 것과 동일한 방식으로 카트리지 안에 채워질 수 있다. 본 발명에서, 원래 다공성인 중공 섬유는 외측 및/또는 내측 표면에 헤파린이나 다른 흡착제를 결합시키기 전, 동안 또는 후에 조밀 또는 비다공성으로 된다. Royal DSM 제인 Dyneema Purity^®은 UHMWPE로 만들어진 고강도 솔리드 파이버이다. 초고분자량 폴리에틸렌 (UHMWPE, UHMW)은 열경화성 폴리에틸렌의 소집단이다. Dyneema는 헤파린화되고, 사이토카인, 세균 및 병원균의 제거를 위한 고표면적 지지체를 제공하기 위해 카트리지에 채워질 수 있다.

나선형으로 감긴 카트리지는 인접 표면의 접촉을 방지하기 위해 임의적인 스페이서 재료와 함께 단단히 감긴 박막 또는 멤브레인을 함유한다. 멤브레인은 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리카보네이트, PET, PBT 등의 폴리머로 제조될 수 있다.

전술한 바와 같이, 특정의 경우, 본 발명의 방법에 사용하기 위해, 체외 혈액 여과를 위한 개별 비드 사이의 채널 또는 간극 공간의 크기는 카트리지의 입구와 출구 사이의 높은 압력 강하를 방지하고, 고유동 환경에서 개별 비드 사이에 혈액 세포의 안전한 통과를 허용하고, 혈중 사이토카인 또는 병원균에 다당류 흡착제의 결합에 적합한 간극 표면적을 제공하도록 최적화된다. 예를 들어, 300 미크론의 거의 구형인 비드의 밀접하게 팩킹된 층에서 적절한 간극 기공 크기는 직경이 약 68 미크론이다.

일부 구체예에서, 흡착 매체의 경질 비드는 표 5에 나타낸 평균 직경을 가진다. 일부 구체예에서, 직조 실 또는 섬유와 같은 흡착 매체의 비-비드 기질은 표 6에 나타낸 거시적 기공 크기를 가진다.

C. 흡착 매체의 제조방법

본원에 기술된 고체 기질의 표면은 본 명세서에 기술된 다당류 흡착제의 공유 부착을 허용하도록 기능할 수 있다. 일부 구체예에서, 고체 기질의 표면은 아민기와 같은 적어도 하나의 화학적 기를 가진다.

헤파린 또는 헤파란 설페이트와 같은 다당류 또는 다른 다당류가 공유 종점 부착에 의해 흡착 매체의 표면에 연결될 수 있다 (예를 들어, 헤파린 분자의 말단 잔기를 통해 공유 부착). 비-공유 부착에 비해 공유 부착은 유리하게는 고정화된 분자의 배향 및 그의 표면 밀도를 더 잘 제어하도록 해준다. 특히, 이들 장쇄 탄수화물의 종점 부착은 병원균 결합에 이용가능한 접근 탄수화물 올리고머를 고농도에 이르게 하는 스페이서 기능을 제공한다. 사실, 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이, 특정 병원균은 헤파린 단편으로 코팅된 종래의 표면보다 훨씬 더 효율적으로 전장 헤파린 (예를 들어, 10 kDa 초과의 평균 분자량을 가지는 헤파린) 코팅 표면에 부착된다.

일부 구체예에서, 고정화 전장 헤파린 분자는 10 kDa 초과의 평균 분자량을 갖는다. 다른 구체예에서, 고정화 헤파린 분자는 15 kDa 초과의 평균 분자량을 갖는다. 다른 구체예에서, 고정화 헤파린 분자는 21 kDa 초과의 평균 분자량을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 고정화 헤파린 분자는 30 kDa 초과의 평균 분자량을 갖는다. 바람직하게, 고정화 헤파린 분자는 15 내지 25 kDa의 범위 내의 평균 분자량을 갖는다. 평균 분자량은 25 내지 35 kDa의 범위와 같이 더 높을 수도 있다.

일부 구체예에서, 고체 기질 상의 헤파린 흡착제의 표면 농도는 1 ㎍/cm² 내지 20 ㎍/cm²의 범위, 예를 들어, 1 ㎍/cm², 2 ㎍/cm², 3 ㎍/cm², 4 ㎍/cm², 5 ㎍/cm², 6 ㎍/cm², 7 ㎍/cm², 8 ㎍/cm², 9 ㎍/cm², 10 ㎍/cm², 11 ㎍/cm², 12 ㎍/cm², 13 ㎍/cm², 14 ㎍/cm², 15 ㎍/cm², 16 ㎍/cm², 17 ㎍/cm², 18 ㎍/cm², 19 ㎍/cm², 및 20 ㎍/cm²이다. 다른 구체예에서, 고체 기질 상의 헤파린 흡착제의 표면 농도는 5 ㎍/cm² 내지 15 ㎍/cm²의 범위, 예를 들어, 5 ㎍/cm², 6 ㎍/cm², 7 ㎍/cm², 8 ㎍/cm², 9 ㎍/cm², 10 ㎍/cm², 11 ㎍/cm², 12 ㎍/cm², 13 ㎍/cm², 14 ㎍/cm², 및 15 ㎍/cm²이다.

기질 그램 당 다당류 흡착제의 양은 달라질 수 있다. 특정 일 구체예에서, 비드가 사용되는 경우, 비드 그램 당 헤파린과 같은 다당류의 양은 사용되는 층의 수 및 비드의 크기에 의해 결정된다. 비드가 클수록 비드 그램 당 더 적은 헤파린과 같은 다당류가 달성된다. 바람직한 양 중 하나는 MBTH 방법에 대해 2.0±0.5 mg 헤파린/g 비드이다 (Larm et al., Biomater Med Devices Artif Organs, 1983, 11:161-173 및 Riesenfeld and Rosen, Anal Biochem, 1990, 188:383-389).

표면에 전장 헤파린 분자의 공유 부착은 흡착 매체의 표면에 존재하는 일차 아미노기와 헤파린 분자의 알데하이드 그룹의 반응에 의해 달성될 수 있다. 모든 탄수화물의 고유한 특성은 이들의 환원 말단에 헤미아세탈을 가지고 있다는 것이다. 이러한 아세탈은 알데하이드 형태와 평형을 이루며 일차 아민과 쉬프 (Schiff) 염기를 형성할 수 있다. 이어 이들 쉬프 염기는 안정한 이차 아민으로 환원될 수 있다. 일부 구체예에서, 전장 헤파린은 공유 접착에 의해 고체 기질 상에 표면 고정화된다. 다른 구체예에서, 전장 헤파린은 안정한 이차 아미노기를 통해 상기 흡착 매체에 공유적으로 부착된다.

특정의 경우, 흡착제를 제조하는 다양한 방법 및 흡착제 자체가 미국특허 제8,663,148호 및 미국특허출원 공보 제US2009/0136586호, US2010/0249689호, US2011/0184377호, 및 US2012/0305482호에 개시되어 있으며, 그 전체는 본원에서 모든 목적을 위해 참조로 원용된다.

일부 구체예에서, 흡착 매체는 다당류, 예컨대 헤파린 또는 다른 화합물의 부착 전에 친수성화된다. 기질의 친수성 표면을 만드는 방법은 산 에칭, 플라즈마 처리, 및 강산화제에의 노출을 포함한다. 예를 들어, 폴리에틸렌 (PE) 비드와 같은 폴리머 표면은 일부 반응성 작용기 (예를 들면, 설포닐기, 하이드록실기, 카복실기, 카보닐기 또는 탄소 이중 결합)와 함께 친수 특성을 도입하기 위해 과망간산칼륨, 암모늄 퍼옥시디설페이트 등과 같은 산화제로 에칭될 수 있다. 표면은 플라즈마 또는 코로나에 의해 에칭될 수 있다. 예를 들어, PE 비드는 하이드록실기 및 탄소 이중 결합을 함유한 친수성 표면을 가지는 비드를 제공하기 위해 황산 중의 과망간산칼륨으로 에칭될 수 있다.

D. 흡착 매체의 혼합물

특정의 경우, 본 발명의 방법은 항혈전성인 헤파린화 매체 및 본질적으로 혈전성인 다른 매체의 혼합물로부터 흡착 베드를 제조한다. 헤파린화 표면, 및 예를 들어 친수성 표면 (양이온성 또는 중성 표면)을 모두 가지는 흡착 카트리지를 조립함으로써, 혈액 또는 다른 생물학적 유체로부터 세균성 병원균을 모두 안전하게 제거할 수 있다. 예를 들어, 헤파린화 매체는 흡착 베드의 1% 내지 99%일 수 있고 본질적으로 혈전성인 기질은 흡착 베드의 99% 내지 1%일 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 흡착 매체는 혈전성 표면과 긴밀하게 접촉하고 있거나 밀접하게 놓인 항혈전성 표면을 제공한다. 이 흡착 매체는 본질적으로 혈전성인 표면이 단독으로 사용된 경우 발생할 수 있는 임상적으로 유의적인 혈전 형성을 방지할 수 있다.

비드 또는 입자 형태의 흡착 매체의 경우에, 본 발명의 바람직한 적용은 카트리지 또는 다른 하우징 내로 이들을 팩킹하기 전에 서로 다른 흡착 매체를 함께 블렌딩하는 것이다. 이는 흡착 카트리지 또는 필터의 효율적인 제조를 허용하면서 인접한 비드에 다양한 표면 화학 간 친밀한 접촉을 제공하다. 이와 관련된 방법은 하우징 내에서 '파르페 형' 배열로 상이한 매체를 층화하여 혈액이 직렬 또는 병렬 흐름으로 다른 매체와 접촉하도록 하는 것이다. 카트리지 내 상이한 매체의 배열 중 하나는 카트리지의 입구 및/또는 출구에 블렌드되지 않은 항혈전성 매체를 배치하는 것으로, 임의로 블렌드된 영역은 입구와 출구 영역에 사이에 삽입된 더 많은 혈전성 매체를 함유한다.

섬유형, 혼합 직물, 니트 또는 부직 구조의 매체의 경우는 섬유 업계에서 혼합 섬유로부터 직물을 형성하기 위해 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 대안적으로, 실은 서로 다른 상이한 표면 화학을 가지는 2 이상의 섬유로 만들어진 미세 멀티필라멘트 또는 모노필라멘트로부터 제조될 수 있으되, 하나의 섬유 형태는 접촉 시 혈액 응고를 능동적으로 방지하는 표면을 포함하고 있어야 한다. 이어, 혼합-섬유실을 이용하여 혈액 접촉용 직물을 제조할 수 있다. 중공 섬유 또는 솔리드 파이버 흡착 매체를 블렌딩하고 중공 섬유 투석기 또는 산소 공급기와 유사한 카트리지를 만드는데 사용할 수 있다. 나선형으로 감긴 흡착 카트리지에 사용되는 종류의 멤브레인 또는 필름형 흡착 매체의 경우, 혈액이 (거의) 동시에 둘 다의 표면 화학과 접촉하도록 2 이상의 표면 화학이 서로 근접하여 사용될 수 있다. 이는 멤브레인 막의 표면층 내 각종 결합기의 규칙적 또는 랜덤 배열에 의해, 또는 두 개의 밀접하게 간격을 두고 있는 멤브레인 막 (이중 하나는 항혈전성이다) 사이에 혈액의 유동로를 형성함으로써 이루어질 수 있다.

E. 체외 혈액 필터

특정 측면에서, 본원에서 제공되는 방법은 포유동물의 혈액, 예를 들면 인간 혈액에서 병원균을 체외 제거하기 위한 흡착 매체를 포함하는 장치에 이용될 수 있다. 예를 들어, 장치는 환자, 예를 들어 신부전으로 고통받는 대상체로부터 혈액 및 혈청을 체외 치료하기 위한 통상적인 장치일 수 있다.

체외 순환을 위해 혈액과 접촉하는 의료 장치에서 국소적 혈류 패턴은 정체 존에서 혈소판의 응집 및 전단 활성화를 통해 혈전 형성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 본원에 제공된 흡착 매체를 포함하는 장치는, 예를 들면 다음과 같은 특성 중 하나 이상을 가지고 있다: a) 혈류 150-5,000 ml/분, 또는 선유속에 의해 측정된 경우, ≥8 cm/분; b) 낮은 유동 저항; c) 이에 고정된 탄수화물을 가지는 기질의 큰 표면적, 예를 들어 약 0.1-1 m²; d) 안정한 코팅 (예를 들어, 접촉 시 혈액으로 임상적으로 유의적인 탄수화물의 누출없음); e) 장치에 적절한 혈류역학적 특성 (예를 들어, 정체 존); 및 f) 최적의 생체적합성.

본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 장치의 비제한적인 예로서는 체외 멤브레인 산소공급 (ECMO) 장치, 사이토카인 분자를 제거하기 위한 체외 혈액 여과 장치인 소아 혈류 투석기 또는 높은 유속을 수용할 수 있는 다른 체외 장치를 들 수 있다.

본 발명의 방법은 통상적인 치료, 예컨대 항생제 투여 전 또는 후에 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 방법은 샘플, 예를 들어 전혈을 체내에서 추출하고, 본원에 제공된 방법에 따라 처리한 후, 생성된 샘플 (예를 들어, 감소된 양의 세균 병원균을 함유하는 샘플)을 체내로 재도입함으로써 환자의 혈류의 일부를 포함하는 루프를 형성하도록 연속 루프에서 수행된다.

다른 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 포유동물의 혈액을 여과 또는 처리하기 위한 다른 기술과 결합될 수 있다. 예를 들어, 대류 동력학에 기초한 카트리지가 심폐 바이패스 (CPB), 혈액 투석, 체외 혈액 산소공급 및 오존화 (EBOO) 등과 같은 통상적인 체외 회로와 직렬로 사용될 수 있다.

본 발명의 다양한 측면들이 하기 실시예에 추가로 기재되어 있다. 이들 실시예는 제한하고자 하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 실시예에서는 헤파린이 사용된다. 그러나, 다른 탄수화물 및 다당류 흡착제가 단독으로 또는 아래 예시되는 헤파린-코팅 기질과 더불어 사용될 수 있다.

III. 실시예

하기 실시예는 설명을 목적으로 제공되는 것이며, 청구된 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1. 헤파란 설페이트에 대해 낮은 또는 검출불가능한 친화성를 가지는 세균의 제거

본 실시예는 전혈로부터 헤파란 설페이트에 대해 낮은 친화성 또는 검출불가능한 친화성를 가지는 세균을 제거하기 위한 헤파린으로 코팅된 비드의 용도를 설명한다.

50개 이상의 상이한 병원균이 발병 동안 초기 부착 부위로서 신데칸에서 발견된 헤파란 설페이트 프로테오글리칸을 표적으로 하는 것으로 문헌에 보고되었다. 놀랍게도, 표면에 결합된 헤파린은 헤파란 설페이트 결합 생물에 대용체로서 작용할 수 있다.

본 연구는 헤파린 흡착 매체가 전혈로부터 고농도의 황색포도상구균 및 MRSA를 제거할 수 있음을 입증하였다. 또한, 본 연구는 헤파린화 표면에 부착된 세균이 죽지않고 혈액으로 잠재적인 염증 독소 및 그 부산물을 방출하지 않음을 보여주었다. 따라서, 헤파린 결합 매체는 감염된 혈액으로부터 약물 내성 균주를 포함한 순환 세균을 효과적이면서 안전하게 제거하기 위해 체외 장치에 사용될 수 있다.

본 실시예는 헤파란 설페이트 결합 병원균, 및 헤파린에 결합하는 것이 알려지지 않았거나 예상되지 않는 병원균 둘 다를 시험하였다. 또한, 양이온성 또는 중성 전하의 친수성 대조군은 병원균에 결합하기에 효과적인 표면으로서 기능할 수 있다는 것을 발견하였다. 일반적으로 중성적으로 하전된 표면은 병원균을 제거하는데 헤파린화 표면만큼 효과적이진 않지만, 일반적인 친수성 표면들을 사용하여 병원균 감소 기술을 개발할 수 있는 것은 가능하다. 친수성 양이온 표면도 마찬가지로 병원균을 제거하는데 적절한 능력을 나타내었다.

본 실시예는 표면에 결합된 헤파린을 포함하는 흡착 매체가 예상되는 헤파란 설페이트 결합 병원균, 예컨대 황색포도상구균, 메티실린-내성 황색포도상구균 (MRSA), 장구균, 반코마이신-내성 장구균, HSV-1 및 HSV-2, 및 칸디다 알비칸스를 제거하기 위해 사용될 수 있음을 입증한다.

본 실시예는 표면에 결합된 헤파린을 포함하는 흡착 매체가 혈액으로부터 저 (예를 들어, 0의) 친화성 헤파란 설페이트 결합 병원균, 예컨대 대장균, 카바페넴-내성 대장균, 폐렴구균, 카바페넴-내성 폐렴구균, 광범위 베타-락타마제 폐렴구균, 장알균, 아시네토박터 바우만니, 및 폐렴구균을 제거하기 위해 사용될 수 있음을 입증한다.

특히, 중성의 친수성 표면을 포함하는 흡착 매체는 예를 들어, 황색포도상구균, 메티실린-내성 황색포도상구균 (MRSA), 및 대장균을 제거할 수 있다. 또한 양이온성 친수성 표면을 포함하는 흡착 매체는 예를 들어, 대장균, 폐렴구균, 카바페넴-내성 폐렴구균, 광범위 베타-락타마제 폐렴구균, 장알균, 아시네토박터 바우만니, 및 메티실린-내성 황색포도상구균 (MRSA)을 제거할 수 있다.

황색포도상구균 또는 메티실린-내성 황색포도상구균 (MRSA)은 헤파린 및 헤파린 설페이트 (HS)에 대해 자연 친화성을 나타낸다. 혈액에서 세균을 제거하기 위해 이러한 자연적인 메카니즘에 의존하는 친화성 흡착 기술이 개발되었다. 주 리간드는 종점 부착된 헤파린, 헤파란 설페이트 유사체이다. 헤파린은 전혈로부터 세균을 제거하는 작용 메카니즘을 제공할 뿐만 아니라, 체외 회로의 안전성을 향상시키는 항혈전성 표면도 제공한다.

초기 부착을 위한 탄수화물 및 프로테오글리칸의 표적화가 대부분의 병원균의 공통 메카니즘이다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스는 많은 당단백질에서 발견되는 탄수화물인 시알산에 결합할 것이다. 많은 그람 음성 세균은 핌브리아 끝에 위치한 만노스 결합 부착소를 가진다. 세균의 표적이 되는 것으로 입증된 기타 탄수화물은 L-푸코스, 갈락토스, 및 다양한 글루코사민 또는 갈락토아민을 포함한다. 탄수화물에 결합하는 병원균의 공통 주제는 세포 표면 상에 글리코칼릭스의 유비쿼터스 특성이다.

본 실시예에서 대상이 된 세균은 대장균, 폐렴간균, 및 그의 카바페넴-내성 균주, 및 또한 녹농균이다. 그람 음성 세균에 대해 많은 상이한 부착소가 보고되었다. 대부분의 연구는 타입 1, 타입 3, 타입 P 및 타입 S의 핌브리아, 및 또한 외막 단백질 A (OmpA)이다. 타입 1 핌브리아 및 OmpA는 내피세포 부착에 관여하고 있다. 타입 1 핌브리아는 만노스에 부착을 중재하고 (만노스-민감성), 장내세균의 대부분에서 발현된다. 기타 핌브리아는 상이한 탄수화물에 대한 부착소를 가지고 있고 만노스-저항성인 것으로 간주된다. 전형적으로, 다수 타입의 핌브리아가 동시에 발현된다.

또한, 만노스-민감성 부착소는 핌브리아가 발현되지 않더라도 세균 세포의 표면 상에 존재하는 것으로 나타났다. 타입 1 핌브리아는 인간 뇌 미세혈관 내피 세포와 상호 작용하는 것으로 나타났고, 이는 핌브리아가 혈액에서 발현될 수 있음을 제안한다. 폐렴간균의 약물 내성 균주는 더 높은 농도의 타입 1 및 타입 3 핌브리아 양자를 발현한다.

황색포도상구균, MRSA, 폐렴구균, 장구균, 장알균, 단순 포진 바이러스, 특이적 외독소 및 기타 HS 표적 병원균의 제거를 목표로 하는 헤파린화 표면을 조사하였다. 시험관내 연구에 의해 헤파린화 매체에 대한 많은 이들 병원균 및 독소의 친화성을 확인하였다.

개발된 이들 이차 흡착 매체는 그람 음성 세균, 예컨대 대장균, 폐렴구균, 및 아시네토박터 바우만니를 표적으로 하는 만노스 작용화 표면이었다. 시험관내 연구에서 만노스 매체는 이러한 병원균과 결합할 수 있는 것으로 확인되었다. MRSA는 만노스 매체에 친화성이 없는 것으로 증명되었다. 그러나 헤파린화 매체는 또한 헤파린에 대해 높은 친화성을 가질 것으로 예상되지 않는 이들 그람 음성 세균을 제거하는데 매우 효과적이었다. 이러한 결과는 예상치 못한 것이었고, 따라서 세균이 헤파린화 표면에 의해 혈액으로부터 제거될 수 있다는 것을 문헌 단독에 기초하여 예측하는 것은 가능하지 않다.

결과

A. 결과

전혈에서 세균을 성공적으로 제거한 첫 번째 보고서가 2011년에 공개되었다 (Mattsby-Baltzer et al., J. Microbiol . Biotechnol ., 2011, 21(6), 659-664). 이 연구에서는, 헤파린 매체를 사용하여 전혈에서 고농도의 황색포도상구균 및 MRSA가 제거된 것으로 증명되었다. 또한, PCR을 사용하여 세균이 죽지않고 혈액으로 잠재적인 염증 독소 및/또는 그 부산물을 방출하지 않는다는 것이 입증되었다. 헤파린화 매체의 사용은 약물 내성에 관계없이 혈액으로부터 순환하는 세균을 안전하게 제거할 수 있는 매우 넓은 스펙트럼의 디바이스를 생성한다.

헤파린 흡착 매체는 처리된 혈액 또는 혈액 산물에 임의의 검출가능한 화학 물질을 첨가함으로써 작용하는 것이 아니다. 그 대신, 이는 확산에 의해 제한되지 않는 신속한 흡착 과정에서 리간드로서 (비침출) 공유결합된 종점 부착 헤파린을 사용한다.

본원에서 논의된 바와 같이 황색포도상구균 및 MRSA가 헤파린 매체를 사용하여 전혈로부터 제거될 수 있다. 황색포도상구균 및 MRSA의 다수 균주가 본 연구에서 시험되었다. 결과를 표 1에 나타내었다. 황색포도상구균 및 MRSA의 다수 균주가 전혈로부터 고수율로 제거되었다. 균주에 따라, MRSA 세균의 최대 85%가 헤파린화 매체에 의해 제거되었다.

전혈로부터 황색포도상구균 및 MRSA 균주의 제거

시험한 황색포도상구균 및 MRSA 균주
	SA1800T	MRSA485	MRSA251	MRSA860
단일 통과에서 제거된 %	62%	85%	59%	70%

시험관내 혈액 연구에서, MRSA의 85%가 매체를 통한 단일 통과에 의해 제거되었다 (표 2).

두 약물 감수성 및 약물 내성 병원균의 제거

세균	감소 %	용량 ( CFU /g)
그람 양성 세균
MRSA	91.57%	3.69E+05
*폐렴구균*	53.06%	1.73E+05
*장구균*	99.04%	2.12E+06
*장구균(VRE)*	91.25%	1.88E+06
*장알균*	56.38%	1.72E+06

세균의 출발 농도는 5×10⁶CFU/mL이었다. MRSA 결합 이외에, PCR 분석은 헤파린화 표면이 살균성이 아님을 나타냈다. 이는 세균이 매체에 부착되는 경우 수용체에 염증 및 독성을 가질 수 있는 (죽은) 세균의 세포 성분이 혈액으로 방출되지 않음을 제시하는 중요한 발견이다.

헤파린화 매체에 대한 다양한 병원균의 친화성을 시험하기 위해 추가 연구를 수행하였다. 이러한 연구에서, 다양한 그람 음성 및 그람 양성 세균의 제거를 시험하기 위해 2.5 ml의 필터 주사기에 헤파린화 매체 또는 대조 매체를 채웠다. 세균을 표준 방법을 사용하여 배양하고, 탈섬유소 말 혈액으로 희석하였다. 이어 혈액을 식염수로 세정한 매체를 통해 총 3번 통과시킨 후, CPU 계수를 위해 플레이팅하였다. 표적화 CFU/ml 농도는 항균 시험에 일반적인 것이고 10⁵ 내지 10⁶ CFU/ml의 범위였다.

헤파린 매체를 사용하여 병원균의 제거를 보고한 요약표를 표 2에 나타내었다.

B. 예기치않은 결과

헤파린 또는 헤파린 설페이트에 대해 친화성이 거의 없거나, 전혀 없거나 알려지지 않은 것으로 문헌에 보고된 여러 병원균을 헤파린 결합 병원균에 대해 사용된 것과 동일한 프로토콜을 이용하여 시험하였다. 표 3에 이들 세균 및 결과를 나타내었다. 놀랍게도, 많은 그람 음성 세균 및 약물 내성 균주가 혈액으로부터 높은 농도로 제거되었다.

헤파린화 표면의 사용에 의한 그람 음성 세균의 예기치않은 제거

그람 음성 세균	감소 %	용량 (CFU/g)
*폐렴구균 (* *CRE* )	99.94%	4.66E+05
*폐렴구균*	36.57%	4.90E+05
*대장균 (* *CRE* )	99.93%	8.56E+05
*대장균*	99.75%	2.04E+06
*아시네토박터* *바우만니*	79.13%	4.83E+05

결론

결과는 헤파린화 매체가 혈액으로부터 광범위 스펙트럼의 세균을 제거하는데 매우 높은 용량을 갖는 것으로 나타났다. 예기치 않게, 헤파린 또는 헤파린 설페이트에 대한 친화성이 알려지지 않았거나 거의 없는 다수의 세균도 제거되었다. 따라서, 친화성과 관련하여 많은 병원균이 헤파린화 표면 화학을 향할 수도 있고 향하지 않을 수도 있다는 것을 예측하는 것은 거의 가능하지 않다. 보고된 헤파린 결합 병원균을 비롯한 여러 그람 양성 세균의 흡착은 이들 병원균이 헤파린화 표면에 특이적으로 결합한다는 것을 제안하다. 어떤 특정 이론에 구애없이, 흡착 매체 상의 중성 또는 양이온성 표면과 같은 친수성 표면은 헤파린 또는 헤파린 설페이트에 대한 친화성이 알려지지 않은 (또는 저 친화성) 세균을 제거하는 데 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 다른 한편으로, 상술된 그람 음성 세균의 결합은 특정 부위의 상호작용을 통해 또는 비-특이적 결합을 통할 수 있다. 흡착 매체의 표면형태는 이러한 결합에 중요할 수 있다.

실시예 2. 친수성 표면을 가지는 흡착 매체

본 실시예에서는 전혈 또는 혈청으로부터 세균을 제거하는데 이용될 수 있는 친수성 표면을 포함하는 흡착 매체를 나타낸다.

본원에 기술된 흡착 매체는 헤파린에 대해 친화성이 없거나 친화성이 낮은 것과 같은 병원균에 대한 그의 결합을 가능케 하는 표면 표면형태을 포함한다 (도 1A).

어떤 특정 이론에 구애없이, 거친 표면, 고르지 않은 표면 또는 유제형(ungulating) 표면이 흡착 매체에 대한 세균의 친화성에 기여할 수 있다고 생각된다.

도 1B는 비교를 위한 인간의 혈액 도말 검사의 이미지를 나타낸다. 도 2는 세균, 예를 들어 황색포도상구균 및 클라미디아, 및 바이러스, 예를 들면, 수두 바이러스, 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 및 피코르나바이러스 (소아마비)의 크기 비교를 나타낸다.

실시예 3. 고 선유속 체외 치료에 사용하기 위한 혈액 필터

본 실시예는 고 선유속을 수용하기 위해 사용되는 체외 필터 카트리지의 예시적인 디자인을 제공한다.

체외 혈액 필터는 일반적인 펌프 시스템과 함께 사용되는 특정 유속에서 안전하게 작동하도록 설계될 수 있다. 혈액 필터를 가로지르는 압력 강하가 너무 높으면 용혈이 발생할 수 있다. 전형적으로, 투석 시스템은 용혈의 위험을 피하기 위해 34 kPa 아래의 압력으로 작동된다.

팩킹된 흡착 매체로 채워진 카트리지에 대해, 카트리지를 가로지르는 압력 강하는 유속, 입자 크기, 입자 계수, 팩킹된 매체의 높이 및 혈액 점도에 의존한다. 필터 매체가 충분히 강성이 아닌 경우, 혈류 증가에 따라 위험한 압력을 초래할 수 있는 다공성 감소로 매체의 압축이 발생할 수 있다.

결정하기 위한 제1 변수는 특정 칼럼 높이 및 선유속에 허용가능한 최소 입자 크기이다. 투석 시스템에 전형적인 유속은 100 내지 400 ml/분이며, 이는 카트리지 직경에 따라 대략 8 내지 30 cm/분의 선유속과 같다. 심폐 바이패스 (CPB) 및 체외 막 산소 공급장치 (ECMO)의 전형적인 체적 유속은 최대 5,000 ml/분일 수 있다. 따라서, 카트리지의 폭에 따라, 선유속은 1,000 cm/분 정도 높을 수 있다. 카트리지가 더 넓게 되면, 선유속은 압력을 줄이기 위해 감소될 수 있다.

선유속 및 입자 크기에 준한 최소 입자 크기를 결정하는데 있어서, 용혈을 일으킬 수 있는 압력을 초과하지 않는 것이 필요하다. 블레이크-코제니 (Blake-Kozeny) 방정식은 경질 고체의 팩킹된 매체를 가로지른 압력 강하를 설명한다.

상기 식에서, μ는 혈액의 점도이고; K_o는 상수이고; d_p는 입자의 직경이고; ε은 간극 베드 공극도 또는 보이드 부피이고; L은 팩킹 매체의 높이이고; u는 선유속이다.

상기 방정식을 d_p에 대해 풀 수 있다:

34 kPa가 허용가능한 최대 압력인 경우는, 다음 변수가 유속 및 칼럼 높이의 함수로서 입자 크기를 결정하기 위해 사용된다.

칼럼 높이 및 주어진 선속도에 대한 최소 비드 직경은 표 4에 제시되어있다.

그러나, 유효 기공 크기는 너무 작아서 혈액 세포의 통과를 차단할 수 없기 때문에, 혈액 세포의 크기도 고려될 수 있다. 대식세포는 혈액에서 가장 세포로서, 약 21 미크론이고, 따라서 이들 세포가 필터 매체를 통과하도록 허용하는 것이 중요하다 (도 3).

도 3에서 "a"로 표시된 목의 크기, 즉, 팩킹된 매체내 비드 사이에서 가장 작은 개구는 이하에 보다 상세히 설명한다. 목 크기는 다음 식으로 산출할 수 있다.

최소 목 크기는 적어도 21 미이크론이어야 한다. 따라서, 최소 비드 크기는 다음과 같다:

d_pmin = 136 미크론

따라서, 허용가능한 최소 크기는 136 미크론이다. 표 5는 직경이 136 ㎛ 이상인 비드에 유용한 선유속 및 칼럼 높이를 나타낸다.

칼럼 높이 및 선유속에 대한 비드 크기

비드 직경 (미크론)						비드 직경 (미크론)
	L (칼럼 높이, cm)							L (칼럼 높이, cm)
u (cm/분)	3	5	10	20	30		u (cm/분)	3	5	10	20	30
1	136	136	136	136	136		1	136	136	136	136	136
3	136	136	136	136	136		76	188	243	343	485	594
5	136	136	136	136	152		151	265	342	484	684	838
7	136	136	136	147	180		226	324	418	592	837	1025
9	136	136	136	167	205		301	374	483	683	966	1183
11	136	136	136	185	226		376	418	540	763	1079	1322
13	136	136	142	201	246		451	458	591	836	1182	1448
15	136	136	152	216	264		526	494	638	903	1277	1564
17	136	136	162	230	281		601	529	682	965	1365	1671
19	136	136	172	243	297		676	561	724	1023	1447	1773
21	136	136	180	255	312		751	591	763	1079	1525	1868
23	136	136	189	267	327		826	620	800	1131	1600	1959
25	136	139	197	278	341		901	647	835	1181	1671	2046
27	136	145	205	289	354		976	674	870	1230	1739	2130
29	136	150	212	300	367		1051	699	902	1276	1805	2210
31	136	155	219	310	380		1126	723	934	1321	1868	2288

도 4는 표 5의 플롯을 나타낸다. 플롯은 y 축 상에 최소 비드 크기를, x 축 상에 선유속을, z 축 상에 칼럼 높이를 표시한다. 도 4는 비드 크기 컷-오프가 136 미크론이기 때문에, 6개의 뚜렷한 회색의 음영을 가진다. 따라서, 그 크기 아래에 비드를 나타내는 음영은 표시되지 않았다 (예: 0-50 및 50-100).

데이터는 직조 실 또는 섬유와 같은 비-비드 재료의 최소 기공 개구 크기를 결정하는데 사용되었다. 다음 표 (표 6)는 칼럼 높이와 선유속에 대해 상응하는 기공 개구의 최소 크기를 제공한다.

비-비드 재료의 거시적 기공 크기

거시적 기공 크기						거시적 기공 크기
	L (칼럼 높이, cm)						L (칼럼 높이, cm)
u (cm/분)	3	5	10	20	30	u (cm/분)	3	5	10	20	30
1	21	21	21	21	21	1	21	21	21	21	21
3	21	21	21	21	21	76	29	38	53	75	92
5	21	21	21	21	24	151	41	53	75	106	130
7	21	21	21	23	28	226	50	65	92	129	159
9	21	21	21	26	32	301	58	75	106	149	183
11	21	21	21	29	35	376	65	83	118	167	205
13	21	21	22	31	38	451	71	91	129	183	224
15	21	21	24	33	41	526	76	99	140	197	242
17	21	21	25	36	43	601	82	106	149	211	259
19	21	21	27	38	46	676	87	112	158	224	274
21	21	21	28	39	48	751	91	118	167	236	289
23	21	21	29	41	51	826	96	124	175	247	303
25	21	22	30	43	53	901	100	129	183	258	317
27	21	22	32	45	55	976	104	135	190	269	329
29	21	23	33	46	57	1051	108	140	197	279	342
31	21	24	34	48	59	1126	112	144	204	289	354

흡착 매체가 압축성인 경우, 거시적인 기공 크기는 흐르는 혈액의 전단 응력으로 인해 유속의 함수로서 감소할 것이다. 압축성 매체는 바람직한 유속을 위해 표 6에서 계산된 최소 기공 크기를 달성하기 위해 "예비-압축"될 수 있다. 느슨하게 팩킹된 압축성 매체에 대해, 거시적 기공 크기는 유동 조건 하에서 표 6의 값 이하로 감소되면 안되고, 그렇지 않은 경우에는 시스템의 압력이 증가하여 용혈이 이어질 수 있고 대식세포가 걸러질 수 있다.

입자 크기 및/또는 거시적 기공 크기의 측정 외에, 체외 필터 카트리지의 직경 (예컨대, 내경)이 측정될 수 있다. 표 7은 특정한 체적 유속에서 요구되는 선유속을 달성하기 위해 필요한 유용한 카트리지 직경을 제공한다.

고려해야 할 또 다른 인자는 체외 장치와 함께 사용되는 총 혈류량이다. 예를 들어, 체외 순환 처리 동안 체내로부터 제거된 총 부피는 전형적으로 환자 혈액의 8-10%를 넘지 않는다. 평균 성인에 대해, 이는 혈액 500 ml에 해당한다. 전형적인 투석 카트리지 및 튜브 혈액 부피는 250-300 ml의 범위일 수 있다. 투석 카트리지가 흡착 카트리지와 직렬로 사용되는 경우, 흡착 카트리지의 혈액 부피는 200 ml를 넘지 않아야 한다. 본 발명의 흡착 카트리지의 실제 치수가 표 8에 제공되었다.

본 실시예에서는 상술된 흡착 매체 및 흡착 카트리지의 예시적인 구체예를 제공한다. 흡착 매체는 최대 5000 ml/분의 체적 유속 및 최대 1000 cm/분의 선유속을 가지는 체외 치료에 사용될 수 있다.

실시예 4. C형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스를 제거하기 위한 혈액 필터

본 실시예에서는 C형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스를 제거하기 위해 사용되는 체외 필터 카트리지를 제공한다. 본 실시예에서는, 흡착 매체가 혼합된다. 혼합된 매체는 헤파린화 폴리에틸렌 비드:셀룰로스 겔에 고정된 단백질 A를 70:30의 비율로 포함한다.

헤파린화 PE 비드는 아민화 PE 비드 상에 아질산 분해된 헤파린의 공유 종점 부착을 가진다. 헤파린화 PE 비드는 2.6 mg의 헤파린/g 비드를 포함한다.

아민화 PE 비드 상에 아질산 분해된 헤파린의 공유 종점 부착은 0.1 M 아세테이트 완충액 pH 4.0 (100 ml) 및 아질산 분해된 헤파린 (1.6 g)을 사용하여 제조한다. 15분 동안 진탕한 후, 0.1 M 아세테이트 완충액 pH 4 (10 ml)에 용해한 NaBH₃CN (100 mg)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 진탕하고, 0.1 M 아세테이트 완충액 pH 4 (10 ml)에 용해한 NaBH₃CN (100 mg)을 추가한 후, 진탕을 실온에서 24시간 더 계속하여 헤파린의 공유 종점 부착을 생성한다.

0.05 M 보레이트 완충액 (pH 10.0) 0.5 mL에 단백질 A (Sigma) 4 mg을 용해시키고, 0.01 N NaOH/물을 첨가하여 pH를 10으로 조정하고 총 1.0 mL의 부피 (단백질 A 용액)로 만들었다. 이 단백질 용액 (총량)을 에폭시-활성화 셀룰로스 겔 1 mL에 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 16시간 동안 진탕한 후, 충분량의 PBS (150 mM 염화나트륨이 보충된 10 mM 포스페이트 완충액)로 세척하여 GCL 2000m-단백질 A를 제공한다.

혼합된 흡착 매체는 혈액에서 C형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스를 제거하는데 사용된다.

본원에 기재된 실시예 및 구체예는 단지 예시하기 위한 것이며, 그에 비추어 다양한 변형이나 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 이는 본 출원의 취지 및 범위와 하기 청구범위의 영역 내에 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 원용된다.

Claims

대상체로부터 채취한 샘플을 흡착 매체와 접촉시켜 세균 및 흡착 매체를 포함하는 부착 복합체가 형성되도록 하는 단계; 및
상기 부착 복합체에서 샘플을 분리하여 세균의 양이 감소된 샘플을 생성하는 단계;
를 포함하는, 세균으로 감염된 것으로 의심되는 대상체로부터 채취한 샘플에서 세균을 제거하기 위한 생체외 방법.
제1항에 있어서, 샘플이 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제2항에 있어서, 샘플이 전혈인, 방법.
제1항에 있어서, 흡착 매체가 다당류 흡착제가 없는 친수성 표면을 갖는 고표면적 고체 기질인, 방법.
제4항에 있어서, 고체 기질이 다수의 경질 폴리머 비드를 포함하는, 방법.
제5항에 있어서, 경질 폴리머 비드가 폴리우레탄, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 에틸렌과 다른 단량체의 코폴리머, 폴리에틸렌 이민, 폴리프로필렌 및 폴리이소부틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제4항에 있어서, 고체 기질이 하나 또는 다수의 중공 섬유를 포함하는, 방법.
제4항에 있어서, 고체 기질이 솔리드 파이버 또는 솔리드 파이버로 이루어진 직조 실 (yarn)을 포함하는, 방법.
제4항에 있어서, 친수성 표면이 양이온성 표면인, 방법.
제1항에 있어서, 흡착 매체가 표면 또는 거친 표면형태의 결과 높은 표면적을 갖는, 방법.
제4항에 있어서, 친수성 표면이 중성 전하의 표면인, 방법.
제1항에 있어서, 샘플내 세균이 약 20% 내지 약 99.9% 감소되는, 방법.
제12항에 있어서, 샘플내 세균이 약 20% 내지 약 40% 감소되는, 방법.
제1항에 있어서, 세균이 그람 음성 세균인, 방법.
제1항에 있어서, 세균이 그람 양성 세균인, 방법.
제1항에 있어서, 세균이 대장균, 폐렴간균, 카바페넴 내성 대장균, 카바페넴 내성 폐렴간균 및 광범위 베타-락타마제 폐렴간균, 엔테로코쿠스 패시움 (Enterococcus faecium), 아시네토박터 바우만니 (Acinetobacter baumannii) 및 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 세균이 황색포도상구균, 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 샘플이 약 8 cm/분 내지 약 1000 cm/분의 선유속을 가지는, 방법.
제1항에 있어서, 샘플이 약 50 ml/분 내지 약 5 L/분의 체적 유속을 가지는, 방법.
대상체로부터 채취한 샘플을 그의 표면 상에 적어도 하나의 다당류 흡착제를 갖는 고표면적의 고체 기질인 흡착 매체와 접촉시켜 부착 복합체가 형성되도록 하는 단계; 및
상기 부착 복합체에서 샘플을 분리하여 세균의 양이 감소된 샘플을 생성하는 단계;
를 포함하는, 헤파란 설페이트에 대해 낮은 친화성 또는 무친화성을 가지는 것으로 알려진 세균으로 감염된 것으로 의심되는 대상체로부터 채취한 샘플에서 세균을 제거하기 위한 생체외 방법.
제20항에 있어서, 샘플이 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제21항에 있어서, 샘플이 전혈인, 방법.
제20항에 있어서, 고체 기질이 다수의 경질 폴리머 비드를 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 부착 복합체가 세균 및 흡착 매체를 포함하는, 방법.
제23항에 있어서, 경질 폴리머 비드가 폴리우레탄, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 에틸렌과 다른 단량체의 코폴리머, 폴리에틸렌 이민, 폴리프로필렌 및 폴리이소부틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제20항에 있어서, 고체 기질이 하나 또는 다수의 중공 섬유를 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 적어도 다당류 흡착제가 헤파린, 헤파란 설페이트, 히알루론산, 시알산, 만노스 배열을 가지는 탄수화물 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제27항에 있어서, 적어도 다당류 흡착제가 헤파린 또는 헤파란 설페이트인, 방법.
제28항에 있어서, 적어도 다당류 흡착제가 헤파린인, 방법.
제29항에 있어서, 비드가 비드 그램 당 약 0.27 mg 내지 10 mg의 헤파린으로 코팅된, 방법.
제30항에 있어서, 비드가 비드 그램 당 2±0.5 mg의 헤파린으로 코팅된, 방법.
제20항에 있어서, 샘플내 세균이 약 20% 내지 약 99.9% 감소된, 방법.
제20항에 있어서, 샘플내 세균이 약 20% 내지 약 40% 감소된, 방법.
제20항에 있어서, 샘플내 세균이 시험관내 헤파린 결합 분석에 실패한, 방법.
제16항에 있어서, 세균이 그람 음성 세균인, 방법.
제16항에 있어서, 세균이 그람 양성 세균인, 방법.
제20항에 있어서, 세균이 대장균, 폐렴간균, 아시네토박터 바우만니, 엔테로코쿠스 패시움, 카바페넴 내성 대장균, 카바페넴 내성 폐렴간균 및 광범위 베타-락타마제 폐렴간균으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제20항에 있어서, 샘플이 약 8 cm/분 내지 약 1000 cm/분의 선유속을 가지는, 방법.
제20항에 있어서, 샘플이 약 50 ml/분 내지 약 5 L/분의 체적 유속을 가지는, 방법.
대상체로부터 채취한 샘플을 투석 카트리지와 직렬 연결된, 흡착 매체를 포함하는 흡착 카트리지와 접촉시켜 부착 복합체가 형성되도록 하는 단계; 및
상기 부착 복합체에서 샘플을 분리하여 세균의 양이 감소된 샘플을 생성하는 단계;
를 포함하는, 투석을 받고 있는 대상체로부터 채취한 샘플에서 세균을 제거하기 위한 생체외 방법.
제40항에 있어서, 샘플이 200 ml 미만의 전혈량을 갖는, 방법.
제40항에 있어서, 흡착 카트리지가 1 cm 내지 50 cm의 칼럼 높이를 갖는, 방법.
제40항에 있어서, 흡착 카트리지가 1 cm 내지 50 cm의 칼럼 직경을 갖는, 방법.
제40항에 있어서, 흡착 카트리지가 투석 카트리지에 비해 대상체에 근접해 있는, 방법.
제40항에 있어서, 흡착 카트리지가 투석 카트리지에 비해 대상체에 원위에 있는, 방법.
제40항에 있어서, 부착 복합체가 세균 및 흡착 매체를 포함하는, 방법.
제40항에 있어서, 샘플이 약 8 cm/분 내지 약 1000 cm/분의 선유속을 가지는, 방법.
제40항에 있어서, 샘플이 약 50 ml/분 내지 약 5 L/분의 체적 유속을 가지는, 방법.