CN105518059B - 多孔性纤维素粒子的制造方法、多孔性纤维素粒子及色谱法用填充剂 - Google Patents

多孔性纤维素粒子的制造方法、多孔性纤维素粒子及色谱法用填充剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多孔性纤维素粒子的制造方法、多孔性纤维素粒子及色谱法用填充剂，根据一实施形态，多孔性纤维素粒子的制造方法包括：(a)将二醋酸纤维素溶解在溶剂中，制备二醋酸纤维素溶液；(b)使所述二醋酸纤维素溶液分散在不与所述二醋酸纤维素溶液互溶的介质中，获得分散体系；(c)将所述分散体系冷却；(d)在经冷却的所述分散体系中添加不良溶剂，由此使二醋酸纤维素粒子析出；以及(e)将所述二醋酸纤维素粒子皂化。本发明可在不使用有害溶剂的情况下利用更简便的方法获得多孔性纤维素粒子。

Description

多孔性纤维素粒子的制造方法、多孔性纤维素粒子及色谱法 用填充剂
技术领域
本发明涉及一种多孔性纤维素粒子的制造方法、多孔性纤维素粒子及色谱法用填充剂。
背景技术
多孔性纤维素粒子对酸性溶剂及碱性溶剂具有耐性，另外可通过进行修饰而加成各种取代基。因此，作为对各种物质的吸附体而被用于各种物质的分离、纯化、脱盐等广泛的领域中。多孔性纤维素粒子的利用领域例如可举出凝胶过滤法(利用分子尺寸的差来区分物质的方法)。凝胶过滤法对于水溶液及有机溶剂均可应用，另外无论对哪种分子量的化合物均可适用。因此，不仅被广泛地用于实验室规模，而且也被广泛地用于工业规模(专利文献1)。
另外，多孔性纤维素粒子由于吸附特性优异、且机械强度相对较大，因此对于工业上可利用的抗体药品纯化用吸附体(专利文献2)、或流行性感冒等的病毒吸附体(专利文献3)的应用也受到关注。
关于制造多孔性纤维素粒子时的原料，通常使用结晶性纤维素或三醋酸纤维素。然而，可溶解这些原料的溶剂有限，因此现状下，在制造工序中制备纤维素溶液时，不得不使用有害性高的溶剂。例如结晶性纤维素的溶剂可举出硫氰酸钙水溶液(专利文献4)，三醋酸纤维素的溶剂可举出氯化烃(专利文献5)，这些溶剂均有害性高。
鉴于这种状况，近年来也报告有使用离子性液体等来作为原料纤维素的溶剂的方法(专利文献6)。然而，新提出的溶剂昂贵，且操作也困难。
进而，也报告有使用二醋酸纤维素作为原料纤维素的制造方法(专利文献5、专利文献7、专利文献8)。然而，专利文献5中记载的方法使用有害性高的物质作为醋酸纤维素的溶剂。专利文献7中记载的方法需要特殊的设备或特殊的条件。另外，专利文献8中记载的方法也在非常高的温度下将由纤维素酯所制作的长丝熔融，需要特殊的设备。像这样，以前的方法在成本或环境负荷的方面有问题，因此现状下不容易制成设备。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开昭56-24430号公报
专利文献2：国际公开第08/146906号
专利文献3：日本专利特开2011-220992号公报
专利文献4：日本专利特开昭55-44312号公报
专利文献5：日本专利特开平6-254373号公报
专利文献6：日本专利特开2012-87202号公报
专利文献7：日本专利特开平1-277570号公报
专利文献8：日本专利特开昭55-40618号公报
发明内容
发明所要解决的问题
在像上文所述那样的背景下，谋求一种可在不使用有害溶剂的情况下更简便地制造多孔性纤维素粒子的方法。进而，为了获得可适用于各种物质的吸附体，理想的是可容易地控制多孔性纤维素粒子的粒径及孔隙径的方法。
解决问题的技术手段
本发明例如像以下所述那样。
[1]一种多孔性纤维素粒子的制造方法，包括：
(a)将二醋酸纤维素溶解在溶剂中，制备二醋酸纤维素溶液；
(b)使所述二醋酸纤维素溶液分散在不与所述二醋酸纤维素溶液互溶的介质中，获得分散体系；
(c)将所述分散体系冷却；
(d)在经冷却的所述分散体系中添加不良溶剂，由此使二醋酸纤维素粒子析出；以及
(e)将所述二醋酸纤维素粒子皂化。
[2]根据[1]所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素溶液的溶剂是选自由以下溶剂所组成的组群中：醋酸水溶液、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等水性溶剂；环己酮、醋酸乙酯、醋酸丁酯等有机溶剂；以及这些溶剂的混合物。
[2-1]根据[2]所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素溶液的溶剂为醋酸水溶液或环己酮。
[3]根据[2-1]所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素溶液的溶剂为醋酸水溶液，相对于所述醋酸水溶液，所述醋酸水溶液中的醋酸的含量为80重量％～95重量％。
[4]根据[1]至[3]中任一项所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(d)中，所述不良溶剂为水、醇类、二醇类或这些溶剂的混合液。
[5]根据[1]至[4]中任一项所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(b)中，所述不与二醋酸纤维素溶液互溶的介质为水或有机介质。
[6]根据[5]所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(b)中，所述不与二醋酸纤维素溶液互溶的介质为有机介质，所述有机介质为甲苯或邻二氯苯。
[6-1]根据[5]所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素溶液的溶剂为醋酸水溶液、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等水性溶剂，在(b)中，所述不与二醋酸纤维素溶液互溶的介质为甲苯、邻二氯苯、二甲苯等有机介质。
[6-2]根据[5]所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素溶液的溶剂为环己酮、醋酸乙酯、醋酸丁酯等有机溶剂，在(b)中，所述不与二醋酸纤维素溶液互溶的介质为水等水性介质。
[7]根据[1]至[6-2]中任一项所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素的乙酰化度(acetylation degree)为45％～57％。
[8]根据[1]至[7]中任一项所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，相对于所述二醋酸纤维素溶液，所述二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素的含量为3重量％～20重量％。
[9]根据[1]至[8]中任一项所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素在25℃～100℃的温度下溶解在所述溶剂中。
[10]根据[9]所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素在40℃～100℃的温度下溶解在所述溶剂中。
[10-1]根据[1]至[10]中任一项所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(b)中，所述分散介质的温度为40℃～100℃。
[11]根据[1]至[10-1]中任一项所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(c)中，所述冷却是通过冷却到0℃～40℃的温度而进行。
[12]一种多孔性纤维素粒子，其是由根据[1]至[11]中任一项所记载的多孔性纤维素粒子的制造方法制造而成。
[13]根据[12]所记载的多孔性纤维素粒子，其中相对于所述二醋酸纤维素溶液，(a)中的所述二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素的含量为6重量％～12重量％，(c)中的所述冷却是通过冷却到0℃～30℃的温度而进行，使用分子量8000的聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)所测定的Kav值为0.01以上且0.52以下，并且使用分子量12000的PEG所测定的Kav值为0.001以上且0.45以下。
[14]一种色谱法用填充剂，其含有根据[12]或[13]所记载的多孔性纤维素粒子或经修饰的所述多孔性纤维素粒子。
[14-1]根据[14]所记载的色谱法用填充剂，其中所述修饰是利用含硫酸基或磺酸基的基团来进行。
[15]根据[14]或[14-1]所记载的色谱法用填充剂，其是用于将病毒粒子分离纯化。
[16]根据[15]所记载的色谱法用填充剂，其是用于流行性感冒病毒粒子或乙型(B型)肝炎病毒粒子的分离纯化，且所述色谱法用填充剂含有经含硫酸基或磺酸基的基团修饰、且相对于经修饰的多孔性纤维素粒子的S含量为800μg/g～5000μg/g的经修饰的多孔性纤维素粒子。
[16-1]一种色谱法用填充剂的制造方法，制造根据[16]所记载的色谱法用填充剂，且所述色谱法用填充剂的制造方法包括：
(a)将二醋酸纤维素溶解在溶剂中，制备二醋酸纤维素溶液；
(b)使所述二醋酸纤维素溶液分散在不与所述二醋酸纤维素溶液互溶的介质中，获得分散体系；
(c)将所述分散体系冷却；
(d)在经冷却的所述分散体系中添加不良溶剂，由此使二醋酸纤维素粒子析出；
(e)将所述二醋酸纤维素粒子皂化而获得多孔性纤维素粒子；以及
(f)利用含硫酸基或磺酸基的基团对所述多孔性纤维素粒子进行修饰。
发明的效果
根据本发明，可在不使用有害溶剂的情况下利用更简便的方法获得多孔性纤维素粒子。另外，根据本发明的方法，可容易地控制多孔性纤维素粒子的粒径及孔隙径。
附图说明
图1为表示实施例1～实施例3中所得的多孔性纤维素粒子的Kav值的图。
图2为表示实施例6～实施例9中所得的多孔性纤维素粒子的Kav值的图。
图3为表示冷却温度与多孔性纤维素粒子的粒径的关系的图。
图4为表示实施例2、实施例6、实施例8及实施例9中所得的多孔性纤维素粒子的Kav值的图。
图5为表示实施例2以及比较例1及比较例2中所得的多孔性纤维素粒子的Kav值的图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施形态加以详细说明。
首先，对本发明的一个实施方式的多孔性纤维素粒子的制造方法加以说明。本发明的多孔性纤维素的制造方法依次包括以下的(a)～(e)的工序：
(a)将二醋酸纤维素溶解在溶剂中，制备二醋酸纤维素溶液；
(b)使所述二醋酸纤维素溶液分散在不与所述二醋酸纤维素溶液互溶的介质中，获得分散体系；
(c)将所述分散体系冷却；
(d)在经冷却的所述分散体系中添加不良溶剂，由此使醋酸纤维素粒子析出；以及
(e)将所述醋酸纤维素粒子皂化。
以下，对所述各工序依次进行说明。
[(a)工序]
(a)中，将作为原料的二醋酸纤维素溶解在溶剂中，制备二醋酸纤维素溶液。醋酸纤维素是通过将作为天然高分子的纤维素加以醋酸酯化而获得的半合成高分子。工业上广泛地使用的醋酸纤维素大致可分为二醋酸纤维素与三醋酸纤维素两种，其一般的乙酰化度分别为约50％～57％及约60％～62％。本发明的方法中，使用二醋酸纤维素作为原料。本发明中使用的二醋酸纤维素只要通常可定义为二醋酸纤维素，则并无特别限定，乙酰化度优选45％～57％，更优选53％～56％。通过使用乙酰化度为45％～57％的二醋酸纤维素，可溶解在更多种类的溶剂中。
具体来说可使用通过以下方式所得的二醋酸纤维素：利用醋酸及/或醋酸酐将棉绒浆(linter pulp)、木材浆等乙酰化，进而进行部分皂化。此时，可适当调节酯化的程度以使乙酰化度成为所述范围。例如请参照日本专利特开昭62-000501号公报。
溶解二醋酸纤维素的溶剂只要可溶解二醋酸纤维素，则并无特别限定，优选有害性低的溶剂。二醋酸纤维素与三醋酸纤维素不同，可使用的溶剂的范围广，可从其中选择使用有害性低的溶剂。溶剂可单独使用一种，也可混合使用两种以上的溶剂。具体来说可举出：醋酸水溶液、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等水性溶剂；环己酮、醋酸乙酯、醋酸丁酯等有机溶剂；及这些溶剂的混合物。其中，由于获取的容易程度及容易操作等原因，特别优选醋酸水溶液或环己酮。
在使用醋酸水溶液作为二醋酸纤维素的溶剂的情况下，醋酸的含量优选的是相对于醋酸水溶液而为80重量％～95重量％。从溶解性及操作时的温度管理等方面来看，优选的是将醋酸水溶液的浓度设定为所述范围。即，通过将醋酸水溶液的浓度设定为所述范围，可始终良好地溶解二醋酸纤维素。
像上文所述那样，根据本发明，可使用有害性低的溶剂，因此可更安全地制造多孔性纤维素粒子。另外，使用有害性低的溶剂从环境保护的观点来看也可谓优选。
二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素的量是根据作为最终产物的多孔性纤维素粒子的所需粒径、孔隙径及强度而决定。所需粒径、孔隙径及强度视多孔性纤维素粒子的用途而不同。例如相对于二醋酸纤维素溶液100重量％，二醋酸纤维素的量优选3重量％～20重量％，更优选4重量％～15重量％，特别优选4重量％～12重量％。通过将二醋酸纤维素的含量设定为所述范围，可获得具有机械强度且具有多孔性的粒子。另外，容易获得球状粒子。
二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素的量越多，溶液的粘度越变高，固体成分含量及所得的纤维素粒子的强度变高。然而，若二醋酸纤维素的含量过高，则可能产生以下问题：粘度变得过高而操作性劣化，或并非球状而是鳞片状的纤维素粒子析出。另一方面，若二醋酸纤维素的含量过低，则有时纤维素并未以粒子的形式析出，或纤维素粒子的机械强度变小。
(a)中，二醋酸纤维素优选的是在25℃～100℃的温度下溶解在溶剂中，更优选40℃～100℃，特别优选40℃～90℃。通过设定为25℃以上，可将二醋酸纤维素迅速地溶解在溶剂中。另一方面，若超过100℃，则接近溶剂的沸点，因此视所使用的溶剂不同而有时欠佳。另外，通过将操作温度设定为25℃～100℃，也有容易控制多孔性纤维素粒子的粒径及孔隙径等优点。
[(b)工序]
(b)中，将(a)中所得的二醋酸纤维素溶液添加到不与所述二醋酸纤维素溶液互溶的介质(以下也称为分散介质)中，进行搅拌。由此获得二醋酸纤维素溶液的液滴分散在分散介质中的分散体系。
分散介质只要为可在不与(a)中所得的二醋酸纤维素溶液互溶的情况下使二醋酸纤维素溶液分散的介质，则可使用任意的介质。可使用的分散介质取决于(a)中使用的对二醋酸纤维素的溶剂。即，在使用水性溶剂(例如醋酸水溶液)作为对二醋酸纤维素的溶剂的情况下，使用不与其互溶的有机介质作为分散介质。这里的有机介质例如可举出甲苯、邻二氯苯、二甲苯等，优选甲苯或邻二氯苯。甲苯及邻二氯苯容易获取，另外通过使用这些介质作为分散介质而容易获得球状粒子。也可将两种以上的有机介质混合使用。
另一方面，在使用有机溶剂(例如环己酮)作为对二醋酸纤维素的溶剂的情况下，使用作为不与其互溶的介质的水性介质来作为分散介质。水性介质可举出水等，另外出于调节分散介质的粘度等目的，也可使用含有聚乙烯醇等的水溶液。这些水性介质容易获取，从环境负荷的方面来看也优选。也可将两种以上的水性介质混合使用。
分散介质的温度优选40℃～100℃，更优选60℃～95℃。从二醋酸纤维素溶液在分散介质中的分散性的观点来看，优选的是设定为所述温度范围。另外，通过设定为所述温度范围，可将分散介质中的二醋酸纤维素溶液的形态保持为球形，因此优选。另一方面，若操作温度超过100℃，则接近分散介质的沸点，因此视所使用的分散介质不同而有时欠佳。
(b)中，也可任意地添加表面活性剂。通过添加表面活性剂，可进一步将二醋酸纤维素溶液的液滴维持为球形，另外可控制粒径。只要为表面活性剂，则可无特别限制地使用，优选非离子性表面活性剂、硅酮系表面活性剂。例如可举出山梨醇酐单油酸酯、聚乙二醇、聚乙烯醇、烷基糖苷、聚氧乙烯-甲基聚硅氧烷共聚物等。
也可通过所使用的表面活性剂的种类及/或量来控制二醋酸纤维素溶液的液滴的尺寸。例如在欲减小二醋酸纤维素溶液的液滴的尺寸的情况下，优选的是添加山梨醇酐单油酸酯，在欲增大液滴的尺寸的情况下，优选的是添加聚氧乙烯-甲基聚硅氧烷共聚物。另外，相对于介质，表面活性剂的添加量优选0.03重量％～3.0重量％，更优选0.05重量％～1.0重量％，特别优选0.06重量％～0.6重量％。这里，在欲增大二醋酸纤维素溶液的液滴的尺寸的情况下，只要减少表面活性剂的添加量即可，在欲减小液滴的尺寸的情况下，只要增加表面活性剂的添加量即可。
[(c)工序]
(c)中，将所述(b)中所得的分散体系冷却。通过冷却，可控制所得的纤维素粒子的孔隙径及粒径。
冷却温度只要为在以下将说明的(d)中通过添加不良溶剂而二醋酸纤维素析出的温度，则并无特别限定。但是，从容易控制作为最终产物的多孔性纤维素粒子的粒径及孔隙径等观点来看，冷却温度优选40℃以下。另外，更优选0℃～40℃，特别优选0℃～30℃。在冷却到低于0℃的温度的情况下，可能分散体系整体冷冻。
[(d)工序]
(d)中，在所述(c)中经冷却的分散体系中添加不良溶剂。由此可使二醋酸纤维素粒子析出。
这里使用的不良溶剂只要为对二醋酸纤维素的溶解性低、通过进行添加而二醋酸纤维素粒子析出的溶剂，则并无特别限定。具体来说，例如可使用水、醇类、二醇类及这些溶剂的混合液。醇类优选低级醇类，更优选碳数1～3的醇类。具体来说可举出甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇等。二醇类可举出乙二醇、丙二醇、二乙二醇、三亚甲基二醇等。
在使用混合溶剂作为不良溶剂的情况下，优选水与醇类的混合液或水与二醇类的混合液。更优选水与醇类的混合液，特别优选水与甲醇的混合液、水与乙醇的混合液、或水与2-丙醇的混合液。
所析出的二醋酸纤维素粒子是通过本领域技术人员众所周知的任意方法而分离，并供于后续的(e)。分离例如可利用过滤等来进行。
[(e)工序]
(e)中，将所述(d)中析出的二醋酸纤维素粒子皂化。由此，二醋酸纤维素的酯部分发生水解，可获得纤维素粒子。这里所得的纤维素粒子具有多孔性。
皂化可通过本领域技术人员众所周知的方法来进行，例如可使用碱及醇来进行。碱例如优选使用氢氧化钠、氢氧化钾等的水溶液。另外，醇优选低级醇，例如更优选甲醇、乙醇等。具体来说，可将(d)中所得的二醋酸纤维素粒子在例如碱与醇的混合液中搅拌一定时间，由此进行皂化。
皂化前，理想的是对(d)中所得的二醋酸纤维素粒子进行清洗。用于清洗的溶液只要为可进行清洗而不破坏二醋酸纤维素粒子的结构的溶液，则并无特别限定，例如可使用甲醇、水等。
本发明的方法使用二醋酸纤维素作为原料，因此可选择有害性低的溶剂作为制备纤维素溶液时的溶剂。因此，可利用更为安全、且从环境保护的观点来看也优选的方法来制造多孔性纤维素粒子。另外，无须使用特殊的设备或特殊的条件，因此也可更简便地以低成本制造多孔性纤维素粒子。进而，根据本发明的实施形态的方法，可容易地控制所得的多孔性纤维素粒子的粒径及孔隙径，因此可获得具有最适于各用途的粒径及孔隙径的纤维素粒子。根据本发明的实施形态的方法，可获得具有尺寸范围广的粒径及孔隙径的多孔性纤维素粒子。即，无论是具有小尺寸、中间尺寸、大尺寸任一尺寸范围的粒径及孔隙径的多孔性纤维素粒子，均可获得。
多孔性纤维素粒子的粒径及孔隙径可通过使本发明的方法中的各种条件变化而容易地控制。例如可通过各工序的操作温度、所使用的二醋酸纤维素原料的量、所使用的溶剂及不良溶剂的种类、表面活性剂的种类及添加量等而控制。
具体来说，(a)中，纤维素溶液中的二醋酸纤维素浓度越高，有所得的多孔性纤维素粒子的粒径越变大、孔隙径越变小的倾向。
另外，在使用醋酸水溶液等水性溶剂作为溶解二醋酸纤维素的溶剂的情况下，有所得的多孔性纤维素粒子的粒径变大的倾向。另一方面，在使用有机溶剂作为溶解二醋酸纤维素的溶剂的情况下，有所得的多孔性纤维素粒子的粒径及孔隙径变小的倾向。
另外，(b)中所得的分散体系的粘度越高，有所得的多孔性纤维素粒子的粒径越变小的倾向。然而，分散体系的粘度几乎不影响多孔性纤维素粒子的孔隙径。
另外，若增加所使用的表面活性剂的添加量，则有所得的多孔性纤维素粒子的粒径变小的倾向，反之若减少表面活性剂的量，则有所得的多孔性纤维素粒子的粒径变大的倾向。另外，通过变更所使用的表面活性剂的种类，可改变所得的多孔性纤维素粒子的粒径分布。但是，即便改变表面活性剂的量或种类，也几乎不影响多孔性纤维素粒子的孔隙径。
进而，(c)中的冷却温度越低，有所得的多孔性纤维素粒子的粒径越变小的倾向，且有孔隙径越变大的倾向。反之，在冷却温度相对较高的情况下，有所得的多孔性纤维素粒子的粒径变大的倾向，且有孔隙径变小的倾向。
另外，(d)中添加的不良溶剂对二醋酸纤维素的溶解性越低，有所得的多孔性纤维素粒子的孔隙径越变大的倾向。然而，不良溶剂的种类几乎不影响多孔性纤维素粒子的粒径。根据这些情况，有以下倾向：通过使二醋酸纤维素急剧地结晶化而孔隙径变小，通过缓慢地结晶化而孔隙径变大。
[多孔性纤维素粒子或经修饰的多孔性纤维素粒子]
根据本发明的一个实施形态，提供一种可通过所述制造方法而制造的多孔性纤维素粒子。所述多孔性纤维素粒子可用于各种物质的分离纯化。例如可在尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography)等凝胶过滤法中，用于将分子尺寸不同的物质加以区分。此时，可将通过本发明所得的多孔性纤维素粒子直接应用，或者也能以进一步利用取代基进行修饰、或经交联反应的形态而应用。
另外，通过对本发明的多孔性纤维素粒子的反应性官能基的至少一部分加成配体(ligand)，可容易地获得可吸附各种物质的吸附剂。例如可用于对流行性感冒病毒或乙型肝炎等的病毒吸附体、抗体药品纯化用吸附体、低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)胆固醇吸附体等。根据本发明的实施形态的方法，像上文所述那样，可在广范围内容易地控制多孔性纤维素粒子的粒径及孔隙径，因此可根据用途而适当地制造吸附特性优异且非特异吸附少的吸附剂。
具体来说，通过对本发明的多孔性纤维素粒子所具有的至少一部分羟基进行硫酸化处理，在所述多孔性纤维素粒子中导入硫酸基(-OSO3H)，可提供一种适于溶菌酶、免疫球蛋白、凝血因子等蛋白质的分离或纯化的色谱法用填充剂。
在本发明的多孔性纤维素粒子中导入硫酸基的方法、即获得硫酸化多孔性纤维素粒子的方法并无特别限定，例如可像以下那样来进行。
首先，在反应容器中准备硫酸化剂。本发明中所用的硫酸化剂只要可与纤维素粒子中的羟基反应而在多孔性纤维素粒子中导入硫酸基，则并无特别限定，这种硫酸化剂例如可举出：氯磺酸-吡啶络合物、哌啶-N-硫酸、硫酸酐-二甲基甲酰胺络合物、三氧化硫-吡啶络合物、三氧化硫-三甲基胺络合物、硫酸-三甲基胺复合物等。硫酸化剂的使用量只要根据目标硫酸基的导入率及反应条件而任意选择即可，例如适当的是相对于多孔性纤维素粒子中的羟基而使用0.001当量～1当量。
然后，将经干燥的多孔性纤维素粒子添加到硫酸化剂中，进行硫酸化反应。反应温度及反应时间也根据溶剂或硫酸化剂的种类而不同，在惰性气体中在通常0℃～100℃、优选20℃～85℃下进行优选0.5小时～24小时、更优选0.5小时～10小时。
反应结束后，也可在反应混合物中添加碱性水溶液、例如氢氧化钠水溶液来进行中和。
其后，可对所得的反应混合物进行过滤或离心分离，由此回收产物，以水进行清洗直到变为中性，获得目标硫酸化多孔性纤维素粒子。硫酸化多孔性纤维素粒子中的硫酸基的导入量可通过变更硫酸化剂的使用量等而调整，只要根据色谱法填充剂的用途等而适当决定即可。
另外，通过对本发明的多孔性纤维素粒子中的至少一部分羟基进行磺化处理，在所述粒子中导入含磺酸基的基团，也可提供一种适于免疫球蛋白、溶菌酶等蛋白质的分离或纯化的强阳离子离子交换色谱法用填充剂。
可导入到本发明的多孔性纤维素粒子中的含磺酸基的基团只要为含有磺酸基(-SO3H)的烃基，则并无特别限制，含磺酸基的基团所含的氢原子也可经羟基、卤素原子、环氧基等取代基进一步取代。其中，所导入的含磺酸基的基团合适的是可具有取代基的碳数1～5的磺基烷基。
在本发明的多孔性纤维素粒子中导入含磺酸基的基团的方法只要为多糖类的磺化处理中通常所用的方法，则并无特别限制。例如可举出：使用3-氯-2-羟基丙磺酸钠、3-溴丙磺酸钠等卤代烷磺酸盐、或者1,4-丁烷磺内酯、1,3-丙烷磺内酯或1,2-环氧乙磺酸等具有环氧化物(epoxide)的磺酸等磺化剂，对本发明的多孔性纤维素粒子进行处理的方法。
磺酸化多孔性纤维素粒子中的含磺酸基的基团的导入量可通过变更磺化剂或碱的使用量等而调整，只要根据色谱法填充剂的用途等而适当决定即可。
多孔性纤维素粒子的磺化处理可参照日本专利特开2001-302702号公报或日本专利特开平9-235301号公报等来进行。通过适当设计变更实验条件，能仅以目标量而导入目标含磺酸基的基团。
像上文所述那样，根据本发明的一实施方式，提供一种含有通过本发明所得的多孔性纤维素粒子或经修饰的所述多孔性纤维素粒子的色谱法用填充剂或吸附剂。本发明的色谱法用填充剂或吸附剂尤其可用于将溶菌酶、免疫球蛋白、凝血因子等蛋白质及流行性感冒病毒、乙型肝炎等病毒粒子分离纯化。
从可用作各种物质的吸附体等观点来看，多孔性纤维素粒子的平均粒径优选1μm～2mm，更优选20μm～1mm，特别优选35μm～600μm。然而，并不限定于这些粒径。此外，平均粒径可通过使用粒度分布测定装置：崛场(HORIBA)制造的激光散射微粒尺寸分布分析仪(Laser Scattering Particle Size distribution Analyzer)帕缇卡(Partica)LA-950测定中值粒径而算出。
实施例
以下，通过实施例对本发明加以更详细说明，但本发明的内容不受所述实施例的限定。另外，以下的实施例中，只要无特别说明，则“％”是指“重量％”。
[实施例1]
在352.5g的85重量％醋酸水溶液中添加48.1g二醋酸纤维素(和光纯药试剂，乙酰化度：53％～56％)进行搅拌。进而，升温并在60℃下搅拌1小时，由此将二醋酸纤维素溶解，获得二醋酸纤维素浓度为12重量％的透明溶液。将所述溶液迅速注入到含有1.97g表面活性剂山梨醇酐单油酸酯的1.5L的100℃的邻二氯苯中，以400rpm的转速搅拌10分钟而获得分散体系。然后将所述分散体系冷却，达到30℃时，滴加620mL的作为不良溶剂的纯水。结果，二醋酸纤维素析出，获得球状的二醋酸纤维素粒子。其后，以大量的甲醇、然后水将所得的二醋酸纤维素粒子充分清洗。接着，使用网目600μm的筛将清洗后的二醋酸纤维素球状粒子分级。
将通过筛的二醋酸纤维素粒子在360mL的55％甲醇水溶液与177g的20重量％氢氧化钠水溶液的混合液中在35℃下搅拌20小时，由此进行皂化。结果获得作为最终产物的多孔性纤维素粒子。
(试验例1：粒度分布的测定)
对所述实施例1中所得的多孔性纤维素粒子测定粒度分布，求出平均粒径。用于测定的装置如下。
装置：激光散射微粒尺寸分布分析仪(Laser Scattering Particle Sizedistribution Analyzer)帕缇卡(Partica)LA-950(崛场(HORIBA)制造)
使用所述装置来测定中值粒径，由此算出平均粒径。
(试验例2：凝胶分配系数Kav的测定)
对所述实施例1中所得的多孔性纤维素粒子测定Kav值。测定方法如下。
(1)使用设备及试剂
管柱：空管柱1/4×4.0mm I.D×300mm，10F(东曹(Tosoh))
贮液器：帕卡(Pukka)·3/8(东曹(Tosoh))
泵：POMP P-500(法玛西亚(Pharmacia))
压力计：AP-53A(基恩士(KEYENCE))
(2)管柱填充法
将管柱与贮液器连接，对管柱下部连接端头配件(end fitting)。以经减压过滤的湿凝胶状态称取15g的要测定Kav的纤维素粒子，放入到50mL烧杯中。向其中添加20mL超纯水轻轻搅拌。在纤维素粒子分散于超纯水中的状态下，以沿着贮液器壁流动的方式将其缓缓添加到管柱中。以少量的超纯水洗涤烧杯中残留的纤维素粒子，缓缓添加到管柱中。其后，添加超纯水直到贮液器的上部极限，对贮液器加盖。在贮液器的上部连接承压座，以泵输送超纯水。在送液线的中途连接压力计，监控压力。提高流速直到压力达到0.3MPa，其后，一面流通超纯水30分钟一面填充。填充结束后止泵，卸下承压座及贮液器的盖子。然后，以吸管吸出贮液器中的超纯水。卸下贮液器，将自管柱中渗出的纤维素粒子去掉，连接端头配件。
(3)Kav测定装置(商品名)
系统：SCL-10APVP(岛津(SHIMAZU))
工作台：CLASS-VP(岛津(SHIMAZU))
RI检测器：RID-10A(岛津(SHIMAZU))
泵：LC-10AT(岛津(SHIMAZU))
自动注射器：SIL-10ADVP(岛津(SHIMAZU))
(4)Kav测定样品(商品名)
使用以下的表A中所示的Kav测定样品。
[表A]
将这些Kav测定样品溶解在纯水中，制成浓度50mg/mL的溶液而用于测定。
(5)Kav测定
将填充了纤维素粒子的管柱设置在Kav测定装置中。以流量0.4mL/min的流速使超纯水通液60分钟。将10μL的Kav测定样品应用(apply)于管柱中，使超纯水通液45分钟。Kav测定样品的检测是使用折射率(Refractive Index，RI)检测器来进行，记录测定图。对各Kav测定样品分别实施这些操作。所得的测定图(纵轴：RI检测强度，横轴：时间)显示正规分布。记录RI检测强度达到最大的时间。
(6)Kav导出式
根据Kav测定中所得的RI检测强度达到最大的时间及此时的通液量，算出Kav测定样品的保持容量(mL)。
Kav是由以下的式子算出。
Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)
[式中，Ve为样品的保持容量(mL)，Vt为空管柱体积(mL)，V0为葡聚糖T2000保持容量(mL)]
在以纵轴为Kav值、横轴为分子量进行绘图时，Kav值成为零的分子量为排阻极限分子量。
[实施例2及实施例3]
除了将二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素浓度设定为10重量％(实施例2)及4重量％(实施例3)以外，与实施例1同样地制造多孔性纤维素粒子。与实施例1同样地测定所得的多孔性纤维素粒子的粒度分布及Kav值。
将实施例1～实施例3的结果示于以下的表1中。表1中所示的Kav值为PEG4120(聚合物实验室(POLYMER LABORATORIES))的情况的值。
[表1]
根据表1，可谓二醋酸纤维素浓度越高，有所得的多孔性纤维素粒子的平均粒径越变大的倾向。在图1中示出实施例1～实施例3中所得的多孔性纤维素粒子的Kav值。根据图1，可谓二醋酸纤维素浓度越高，有所得的多孔性纤维素粒子的Kav值越变小的倾向、即孔隙径越变小的倾向。另外，实施例1～实施例3中所得的纤维素粒子的排阻极限分子量为10万Da以下。
[实施例4]
除了将二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素浓度设定为10重量％，以及使用620mL的50％甲醇水溶液作为不良溶剂以外，与实施例1同样地制造多孔性纤维素粒子。与实施例1同样地测定所得的多孔性纤维素粒子的粒度分布及Kav值。
[实施例5]
除了将二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素浓度设定为6重量％以外，与实施例4同样地制造多孔性纤维素粒子。与实施例1同样地测定所得的多孔性纤维素粒子的粒度分布及Kav值。
将实施例4及实施例5的结果示于以下的表2中。
[表2]
[实施例6]
在352.5g的85重量％醋酸水溶液中添加39.2g二醋酸纤维素(和光纯药试剂，乙酰化度：53％～56％)进行搅拌。进而，升温并在60℃下搅拌1小时，由此将二醋酸纤维素溶解，获得二醋酸纤维素浓度为10重量％的透明溶液。将所述溶液迅速注入到含有1.97g表面活性剂山梨醇酐单油酸酯的1.5L的100℃的邻二氯苯中，以400rpm的转速搅拌10分钟而获得分散体系。然后，将所述分散体系冷却到0℃，保持0℃而搅拌1小时后，滴加620mL的作为不良溶剂的5℃以下的纯水。结果，二醋酸纤维素析出，获得球状的二醋酸纤维素粒子。其后的清洗及皂化的工序是与实施例1同样地进行。
与实施例1同样地测定所得的多孔性纤维素粒子的粒度分布及Kav值。
[实施例7～实施例9]
除了将二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素浓度设定为8重量％(实施例7)、6重量％(实施例8)及4重量％(实施例9)以外，与实施例6同样地制造多孔性纤维素粒子。与实施例1同样地测定所得的多孔性纤维素粒子的粒度分布及Kav值。
将实施例6～实施例9的结果示于以下的表3中。
[表3]
根据表3，可谓二醋酸纤维素浓度越高，有所得的多孔性纤维素粒子的平均粒径越变大的倾向。另外，图2中示出实施例6～实施例9中所得的多孔性纤维素粒子的Kav值。根据图2，可谓二醋酸纤维素浓度越高，有所得的多孔性纤维素粒子的Kav值越变低的倾向、即孔隙径越变小的倾向。
图3为表示冷却温度与多孔性纤维素粒子的粒径的关系的图。对实施例2(冷却温度30℃)及实施例6(冷却温度0℃)的情况比较多孔性纤维素粒子的粒度分布。根据图3，可谓冷却温度低的情况下，有多孔性纤维素粒子的粒径变小的倾向。
图4为表示实施例2、实施例6、实施例8及实施例9中所得的多孔性纤维素粒子的Kav值的图。若将图4的实施例2(冷却温度30℃)与实施例6(冷却温度0℃)的结果比较，则可谓冷却温度低的情况下，有所得的多孔性纤维素粒子的Kav值变大的倾向、即孔隙径变大的倾向。
[实施例10]
在352.5g环己酮中添加39.2g二醋酸纤维素(和光纯药试剂，乙酰化度：53％～56％)进行搅拌。进而升温并在90℃下搅拌1小时，由此将二醋酸纤维素溶解，获得二醋酸纤维素浓度为10重量％的透明溶液。将所述溶液迅速注入到含有1.97g表面活性剂十二烷基苯磺酸钠的1.5L的90℃的水中，以400rpm的转速搅拌10分钟而获得分散体系。然后将所述分散体系冷却，达到30℃时，滴加620mL作为不良溶剂的甲醇。结果，二醋酸纤维素析出，获得球状的二醋酸纤维素粒子。其后的清洗及皂化的工序是与实施例1同样地进行。
与实施例1同样地测定所得的多孔性纤维素粒子的粒度分布及Kav值。
[实施例11]
与实施例10同样地制备二醋酸纤维素分散体系。其后，将所述分散体系冷却到0℃，保持0℃而搅拌1小时后，滴加620mL的作为不良溶剂的冷甲醇。结果，二醋酸纤维素析出，获得球状的二醋酸纤维素粒子。其后的清洗及皂化的工序是与实施例1同样地进行。
与实施例1同样地测定所得的多孔性纤维素粒子的粒度分布及Kav值。
将实施例10及实施例11的结果示于以下的表4中。
[表4]
若将表1～表3与表4相比较，则可谓有以下倾向：使用水性溶剂(醋酸水溶液)作为对二醋酸纤维素的溶剂的实施例1～实施例9的纤维素粒子的平均粒径大于使用有机溶剂(环己酮)的实施例10及实施例11。另外，使用有机溶剂的情况下(实施例10及实施例11)，可谓有Kav值变小的倾向、即孔隙径变小的倾向。
[比较例1]
将使用三醋酸纤维素作为原料而制造的市售赛璐凡硫酸酯(Cellufine Sulfate)(捷恩智(JNC)株式会社制造，S含量950μg/g)用于比较例。与实施例1同样地测定所述物品的粒度分布及Kav值。
[比较例2]
在60重量％硫氰酸钙水溶液中添加结晶性纤维素(旭化成：赛欧拉斯(Ceolus)PH-101)并在110℃下搅拌，制备纤维素浓度6重量％的溶液。将所述溶液一面搅拌一面注入到含有表面活性剂山梨醇酐单油酸酯的1.5L的130℃的邻二氯苯中，获得分散体系。然后将所述分散体系冷却，达到40℃时，滴加作为不良溶剂的甲醇。结果，纤维素析出，获得球状的纤维素粒子。其后，以大量的甲醇及水进行清洗。与实施例1同样地测定所得的多孔性纤维素粒子的粒度分布及Kav值。
将比较例1及比较例2的结果示于以下的表5中。
[表5]
图5为表示实施例2以及比较例1及比较例2中所得的多孔性纤维素粒子的Kav值的图。由图5得知，根据本发明的一实施方式，可获得具有中间的Kav值(即中间的孔隙径)的多孔性纤维素粒子。
[实施例12：作为色谱法用填充剂的使用]
以下，示出与作为本发明的多孔性纤维素粒子的一个优选使用形态的色谱法用填充剂有关的实施例。
使用实施例6中制造的多孔性纤维素粒子，测定以下的试样1～试样3各自的溶出时间(自注射起至溶出波峰的最大值的时间)。所述测定除了使用0.05M磷酸pH值8.0+0.5MNaCl作为移动相及试样的溶剂以外，与上文所述的凝胶分配系数Kav的测定同样地进行。
试样1.人γ球蛋白，来源于血清(和光纯药公司制造)；分子量16.0×104
试样2.牛血清白蛋白，来源于牛血清(和光纯药公司制造)；分子量6.6×104
试样3.溶菌酶，来源于鸡蛋白(和光纯药公司制造)；分子量1.43×104
关于各试样的溶出时间，试样1为16.9分钟，试样2为17.1分钟，试样3为20.6分钟。由所述结果表明，通过使用本发明的实施形态的多孔性纤维素粒子，可利用溶出时间的差将具有不同分子量的蛋白质分离。因此，可谓本发明的多孔性纤维素粒子例如可用作尺寸排阻色谱法用的管柱填充剂。
[实施例13：作为吸附剂的使用]
以下，示出与作为本发明的多孔性纤维素粒子的一个优选使用形态的吸附剂有关的实施例。
使由实施例2、实施例6及比较例2所得的多孔性纤维素粒子经过网目125μm、网目53μm的筛，分取粒径125μm～53μm的纤维素粒子。使所得的纤维素粒子与1mol当量的氯磺酸在65℃下反应，获得硫酸化纤维素粒子(以下设定为实施例2A、实施例6A、比较例2A)。通过离子色谱法来求出各硫酸化纤维素粒子的S含量(即，相对于1g硫酸化纤维素粒子的硫含量)(详细情况示于以下的试验例3中)，结果为实施例2A：14000μg/g，实施例6A：18000μg/g。关于比较例2A，欲利用所述方法将多孔性纤维素粒子硫酸化，结果粒子破碎，因此无法使用。
(试验例3：S含量的分析)
S含量可通过离子色谱法而求出。具体来说是通过以下记载的方法而求出。利用研钵将在60℃下经16小时～20小时真空干燥的样品磨碎，进而在105℃下干燥2小时。在0.05g的所述干燥试样中添加2.5mL的2M盐酸，在110℃下水解16小时。冰浴冷却后，提取1mL的上清液，以2M氢氧化钠水溶液进行中和，定容至25mL。管柱使用横河电机公司制造的ICS-A-23，烘箱温度为40℃，洗脱液是以1mL/min的流量的条件使用3mM Na2CO3溶液，除去液是以1mL/min的流量的条件使用15mM硫酸，使用横河电机公司制造的IC7000离子色谱分析仪进行分析，进而根据由后述标准溶液所制作的校准曲线来求出SO4浓度。对照(blank)值是设定为不添加干燥试样而同样地进行操作时的值。将SO4标准液(关东化学公司制造的阴离子混合标准液IV)的2μg/mL溶液作为所述测定法的标准溶液，对其进一步阶段稀释，在相同条件下利用离子色谱分析仪对阶段稀释品进行分析，制作校准曲线。硫含有比例是由下述式求出。此外，X试样、X对照为根据SO4标准溶液的校准曲线所求出的浓度(×10-4％)。
硫含有比例(×10-4％)＝(X试样-X对照)×25×2.5×0.3333/0.05
根据通过所述式所算出的硫含有比例，算出经修饰的纤维素粒子(例如硫酸化纤维素粒子或磺酸化纤维素粒子)的每1g干燥重量的硫含量(重量)。
使用所述制作的硫酸化纤维素粒子(实施例2A、实施例6A、比较例2A)及比较例1的纤维素粒子(市售品)，测定蛋白质的吸附量。
以50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液(pH值9.5)将各纤维素粒子充分清洗。准备650mg的作为测定对象的蛋白质，溶解在130mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH值9.5)中而制备蛋白质溶液。蛋白质是使用以下蛋白质。
(1)人γ球蛋白，来源于血清(和光纯药公司制造)
(2)溶菌酶，来源于鸡蛋白(和光纯药公司制造)
对于1mL纤维素粒子，使100mL的所述制备的蛋白质溶液通液2小时。为了求出吸附在纤维素粒子上的蛋白质量，对所回收的溶液进行波长280nm的吸光度测定，求出未吸附的蛋白质量。由所使用的蛋白质溶液中的蛋白质量减去存在于回收液中的未吸附的蛋白质量，由此算出吸附在纤维素粒子上的蛋白质量。将其结果示于以下的表6中。
[表6]
像表6的结果那样，得知通过在本发明的实施形态的多孔性纤维素粒子中导入适当的配体，可用作具有与市售品同等以上的吸附量的吸附剂。
[实施例14：病毒吸附试验(流行性感冒病毒)]
以文献：微生物免疫学(Microbiol Immunol)2012；56：490-495作为参考，按以下顺序进行流行性感冒病毒吸附试验。
(含钝化病毒的溶液的制备)
使用发育鸡蛋使流行性感冒病毒A/duck/Hokkaido/Vac-2/2004(H7N7)株增殖。将绒毛膜尿囊液(chorioallantoic fluid)回收并进行离心，回收上清液。以最终浓度成为0.1％的方式在其中添加β-丙内酯，使病毒钝化。以孔径0.45μm的乙酸纤维素制薄膜过滤器将所述钝化病毒液过滤，以含钝化病毒的溶液的形式供于试验。
(病毒吸附能力的评价)
使由实施例2、实施例6及实施例10所得的多孔性纤维素粒子经过网目125μm、网目53μm的筛，分取粒径125μm～53μm的纤维素粒子。使所得的纤维素粒子与1mol当量的氯磺酸在65℃下反应，获得硫酸化纤维素粒子(以下设定为实施例2A、实施例6A、实施例10A)。另外，使由实施例10所得的多孔性纤维素粒子与1mol当量的氯磺酸在75℃下反应而获得硫酸化纤维素粒子(以下设定为实施例10B)。通过离子色谱法来求出各硫酸化纤维素粒子的S含量(即，相对于1g硫酸化纤维素粒子的硫含量)，结果为实施例2A：14000μg/g、实施例6A：18000μg/g、实施例10A：1400μg/g、实施例10B：4000μg/g。
使所述获得的硫酸化纤维素粒子分别分散在水中，在减压下一面搅拌一面脱气。将经脱气的各分散液填充在玻璃管柱(Φ3×50mm)中。将所述管柱连接于色谱系统，以0.01M磷酸缓冲液(pH值7.4)平衡化。以下的通液是以流速0.47mL/min的速度进行，流出液是以1mL为单位而回收。首先，使15mL的所述制备的含病毒溶液通液，其后，以含有0.01M磷酸盐与0.15M氯化钠的缓冲液(pH值7.0)清洗非吸附成分。然后，以直线梯度将氯化钠水溶液的浓度提高到1.5M并进行通液，回收溶出组分。对所回收的各馏分的血凝素(hemagglutinin，HA)值进行测定，求出10％动态吸附量(DBC)。10％DBC是设定为将所使用的含病毒溶液的活性的强度的1/10以上吸附至正流出的馏分中的病毒的病毒活性。此外，病毒活性(HA值)的测定是像以下那样进行。
(病毒活性的测定)
在圆底96孔板的各孔中添加50μL生理盐水，在第一纵列中添加50μL评价样品(即，所述获得的溶出组分及作为参照的含钝化病毒的溶液)并充分混合。将其经2倍稀释的样品中的50μL添加到横向邻接的孔中并充分混合。反复进行相同的操作，制备2倍～4096倍的稀释样品直到第12个孔。在各样品中添加50μmL的0.5％鸡红血球浮游液并进行混合后，在室温下放置30分钟。30分钟后，将血球未凝聚沉底的情况视为有病毒活性，将不能确认活性的前一个稀释倍率视为每50μL样品的HA值(HAU/50μL)。另外，阴性对照(negative control)是使用生理盐水。
将结果示于表7中。
[表7]
根据所述结果确认到，通过将本发明的实施形态的多孔性纤维素粒子加以硫酸化，可吸附流行性感冒病毒。其中，S含量多的实施例2的硫酸化纤维素粒子(S含量为14000μg/g)及实施例6的硫酸化纤维素粒子(S含量为18000μg/g)显示出流行性感冒病毒的动态吸附量低的结果。由此可认为具有适于病毒吸附的硫酸基的导入量。
例如优选的是多孔性纤维素粒子经含有硫酸基或磺酸基的基团修饰，且相对于经修饰的多孔性纤维素粒子的S含量(即，相对于1g经修饰的多孔性纤维素粒子的硫含量)为800μg/g～5000μg/g，更优选800μg/g～4000μg/g，特别优选800μg/g～2000μg/g。实际证明，在相对于多孔性纤维素粒子的S含量为700μg/g以下的情况下，无法获得充分的病毒吸附量。因此，通过以S含量成为所述范围的方式对多孔性纤维素粒子进行修饰，可获得充分的病毒吸附量。
[实施例15：病毒吸附试验(乙型肝炎病毒)]
(含病毒溶液的制备)
使乙型肝炎病毒HBsAg-XT(拜力公司(Beacle Inc.))以成为150μg/mL的方式悬浮在以下所示的用于色谱管柱的平衡化的缓冲液中。
(病毒吸附能力的评价)
使用实施例14中制备的硫酸化纤维素粒子(实施例10A及实施例10B)。使实施例10A的硫酸化纤维素粒子(S含量：1400μg/g)及实施例10B的硫酸化纤维素粒子(S含量：4000μg/g)分别分散在水中，在减压下一面搅拌一面脱气。将经脱气的各分散液填充在玻璃管柱(Φ3×50mm)中。将所述管柱连接于色谱系统，分别以0.02M磷酸缓冲液(pH值7.0)及0.05M柠檬酸缓冲液(pH值5.0)平衡化。使2mL的所述制备的含病毒溶液在经平衡化的管柱中通液。通液是以0.25mL/min的流速进行，流出液是以1mL为单位而回收。含病毒溶液的通液后，使平衡化所用的缓冲液通液而清洗非吸附成分。然后，将氯化钠水溶液的浓度以直线梯度提高到1.5M并进行通液，将溶出组分回收(吸附成分)。各馏分是以1mL为单位而回收，利用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)分析法测定各馏分中的蛋白质浓度，由此求出病毒的回收量(即吸附量)。此外，所述BCA分析是按照赛默(Thermo)公司的操作指南以集团分离分析法(Bulked Segregation Analysis，BSA)为标准来进行。
将结果示于以下的表8中。表8中，“病毒负荷”是指管柱中通液的含病毒溶液中所含的病毒的量。“流出液中的病毒量”是指含病毒溶液的通液后及缓冲液的通液后的流出液中所含的病毒的量(非吸附成分)，其比例(％)是指非吸附病毒量相对于病毒负荷量的比例。“溶出组分中的病毒量”是指通过使氯化钠水溶液通液而回收的溶出组分中所含的病毒的量(吸附成分)，其比例(％)是指吸附病毒量相对于病毒负荷量的比例。
[表8]
由表8得知，硫酸化纤维素粒子在pH值5.0的条件下，显示出高达62.2％的对乙型肝炎病毒的吸附及回收能力。另外，在中性范围的pH值7.0的条件下，也显示出30％以上的对乙型肝炎病毒的吸附及回收能力。
本发明中，例如优选如下多孔性纤维素粒子：相对于二醋酸纤维素溶液，二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素的含量为6重量％～12重量％，冷却是通过冷却到0℃～30℃的温度而进行，使用分子量8000的PEG所测定的Kav值为0.52以下，且使用分子量12000的PEG所测定的Kav值为0.45以下。蛋白质、病毒等分别具有固有的分子量或大小，通常可认为这些与纤维素粒子的孔隙径(Kav值)的大小的关系影响吸附量。具有所述特性(制造方法及Kav值)的多孔性纤维素粒子(或所述纤维素粒子经配体修饰而成者)特别适合作为用来将溶菌酶、免疫球蛋白、凝血因子等蛋白质及流行性感冒病毒、乙型肝炎等病毒分离及纯化的色谱法用填充剂或吸附剂。
对本发明的若干实施形态进行了说明，但这些实施形态是作为示例而提示，并非意在限定发明的范围。这些新颖的实施形态能以其他各种形态而实施，可在不偏离发明主旨的范围内进行各种省略、替换、变更。这些实施形态或其变形包括在发明的范围或主旨中，并且包括在权利要求所记载的发明及其均等的范围内。

Claims (13)

1.一种多孔性纤维素粒子的制造方法，包括：
(a)将二醋酸纤维素溶解在溶剂中，制备二醋酸纤维素溶液，所述溶剂选自由醋酸水溶液、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、环己酮、醋酸乙酯、醋酸丁酯及这些的混合物所组成的群组；
(b)使所述二醋酸纤维素溶液分散在不与所述二醋酸纤维素溶液互溶的介质中，获得分散体系，所述介质选自由水、甲苯及邻二氯苯所组成的群组；
(c)将所述分散体系冷却；
(d)在经冷却的所述分散体系中添加含有醇的不良溶剂，由此使二醋酸纤维素粒子析出；以及
(e)将所述二醋酸纤维素粒子皂化。
2.根据权利要求1所述的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素溶液的溶剂为醋酸水溶液或环己酮。
3.根据权利要求2所述的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素溶液的溶剂为醋酸水溶液，相对于所述醋酸水溶液，所述醋酸水溶液中的醋酸的含量为80重量％～95重量％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素的乙酰化度为45％～57％。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，相对于所述二醋酸纤维素溶液，所述二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素的含量为3重量％～20重量％。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素在25℃～100℃的温度下溶解在所述溶剂中。
7.根据权利要求6所述的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(a)中，所述二醋酸纤维素在40℃～100℃的温度下溶解在所述溶剂中。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的多孔性纤维素粒子的制造方法，其中在(c)中，所述冷却是通过冷却到0℃～40℃的温度而进行。
9.一种多孔性纤维素粒子，其是由根据权利要求1至8中任一项所述的多孔性纤维素粒子的制造方法制造而成。
10.根据权利要求9所述的多孔性纤维素粒子，其中相对于所述二醋酸纤维素溶液，(a)中的所述二醋酸纤维素溶液中的二醋酸纤维素的含量为6重量％～12重量％，(c)中的所述冷却是通过冷却到0℃～30℃的温度而进行，使用分子量8000的聚乙二醇所测定的Kav值为0.01以上且0.52以下，并且使用分子量12000的聚乙二醇所测定的Kav值为0.001以上且0.45以下。
11.一种色谱法用填充剂，其含有根据权利要求9或10所述的多孔性纤维素粒子或经修饰的所述多孔性纤维素粒子。
12.根据权利要求11所述的色谱法用填充剂，其是用于将病毒粒子分离纯化。
13.根据权利要求12所述的色谱法用填充剂，其是用于流行性感冒病毒粒子或乙型肝炎病毒粒子的分离纯化，且所述色谱法用填充剂含有经含硫酸基或磺酸基的基团修饰、且相对于经修饰的多孔性纤维素粒子的S含量为800μg/g～5000μg/g的经修饰的多孔性纤维素粒子。
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