KR101690279B1 - 단일염기다형 검출용 키트 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단일염기다형 검출 키트 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 방법을 이용한 단일염기다형 검출 키트 및 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 DNA 검출용 키트 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 단일염기다형 검출용 키트 및 방법에 관한 것이다.
인간의 게놈(genome) 지도가 완성되어 질병에 대한 위험도의 측정, 질병의 진단 또는 예진, 그리고 약물에 대한 반응의 예측을 보다 광범위하게 할 수 있다는 가능성이 제시되었고, 최근에는 다양한 유전자들에 대한 기능들이 밝혀지고 있다. 다양한 유전자들에 대한 기능 규명에 따라 예를 들어, 특정인의 특정 유전자에 대한 변이분석을 통하여 질병에 대한 위험도가 어느 정도인지 예측하여 질병을 사전에 예방하도록 유도할 수 있다. 또한, 생명체에 감염을 일으키는 다른 감염체, 예를 들어, 바이러스 등의 유전자 변이 분석을 통하여 해당 바이러스가 특정 치료 약물에 대해 내성을 갖는지 여부를 분석할 수 있고, 이러한 유전자형 분석을 통하여 감염체의 특정 치료 약물에 대한 반응, 예를 들어 내성반응을 예측함으로써 환자 개인별 맞춤형 치료방법을 개발할 수 있다. 이러한 개인맞춤형의료 및 치료동반진단의 핵심 기반 기술인 단일염기다형성(SNP; single Nucleotide Polymorphism) 분석에 새로운 PCR 기술을 이용하여 SNP를 분석하여 개인맞춤형 의료진단 및 환자의 유전형에 따른 약물의 효용성을 진단하는 동반진단에 있어서의 기존의 PCR 및 NGS(Next Generation Sequencing)의 한계와 고가 분석기기의 필요 그리고 분석까지의 많은 시간 소요 등의 문제를 해결할 수가 있다. 구체적으로 기존의 PCR(e.g AS-PCR기반)등은 이형접합체(heterotype)의 점돌연변이 분석의 어려움의 한계 등이 있으며, Taq-man Probe 등을 사용하는 Real-Time PCR은 광원 및 형광물질의 한계에 따른 분석 채널(channel)의 제한 및 현장진단(point-of-care-testing, POCT) 기기로의 개발의 어려움이 존재한다. NGS를 이용한 Sequencing은 그 분석 비용 및 기기의 고가 그리고 복잡한 프로세스 및 소요 시간이 오래 걸리며, 또한 POCT로서 적용이 불가능하다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 다중 SNP 분석 POCT 기기로 개발이 용이한 새로운 단일염기다형 검출용 키트 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면,
ⅰ) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머;
ⅱ) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리핵산서열로 구성되는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머;
ⅲ) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머;
ⅳ) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머; 및
ⅴ) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머를 포함하는, 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
ⅰ) 증폭 대상 주형 핵산을 PCR 조건에서 증폭 대상 게놈과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머; PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 핵산서열로 구성되는 돌연변이형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머; 및 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 증폭산물을 생성하는 증폭산물 형성단계; 및
ⅱ) 상기 증폭산물을 열변성한 후 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성된 제1연장용 프라이머; 및 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 겔 전기영동상 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머를 이용하여 연장반응을 수행함으로써 연장산물을 생성시키는 연장산물 형성단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 특정 유전자의 단일염기다형의 유무 및 종류를 정확하고 신속하게 검출하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 단열염기다형 검출용 키트 및 방법은 암을 비롯한 각종 질병의 진단, 특히 특정 약물에 대한 반응성 여부 및 대체 약물의 선택에 중요한 정보를 제공하는 동반진단(companion diagnostics)에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일염기다형 검출키트의 검출 대상 단일염기다형과 이를 증폭하기 위한 각종 프라이머들을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 단일염기다형 검출키드에 의해 수행되는 대립유전자 특이적 핵산 증폭반응을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 3은 상기 도 2에 도시된 대립유전자 특이적 핵산 증폭반응 이후 대립유전자 특이적 연장 프라이머를 이용하여 수행되는 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 4는 상기 대립유전자 특이적 비대칭 프라이머 연장반응 산물을 PCR 반응으로 증폭하는 핵산 증폭반응을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 5는 통상의 대립유전자 특이적 PCR(AS-PCR) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 증폭반응물 또는 이를 증폭한 증폭산물에 대한 아가로스 겔 전기영동 결과를 예시적으로 도시한 개요도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 대립유전자 특이적 PCR 반응의 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 반응의 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 단일염기다형 검출키드에 의해 수행되는 대립유전자 특이적 핵산 증폭반응을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 3은 상기 도 2에 도시된 대립유전자 특이적 핵산 증폭반응 이후 대립유전자 특이적 연장 프라이머를 이용하여 수행되는 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 4는 상기 대립유전자 특이적 비대칭 프라이머 연장반응 산물을 PCR 반응으로 증폭하는 핵산 증폭반응을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 5는 통상의 대립유전자 특이적 PCR(AS-PCR) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 증폭반응물 또는 이를 증폭한 증폭산물에 대한 아가로스 겔 전기영동 결과를 예시적으로 도시한 개요도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 대립유전자 특이적 PCR 반응의 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 반응의 결과를 나타내는 사진이다.
용어의 정의:
이하 본 문서에서 사용되는 용어를 정의한다:
본 문서에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 핵산을 구성하는 단위체 분자로 염기, 오탄당 및 인산으로 구성되어 있으며, 상기 염기는 DNA의 경우 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 및 티민(thymine)의 네 가지가 존재하고, RNA의 경우에는 상기 티민 대신 우라실(uracil)이 사용된다. 상기 오탄당은 DNA의 경우 2'-디옥시리보스(2'-deoxyribose), RNA의 경우 리보스(ribose)가 사용된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 상기 뉴클레오티드 단위체 분자의 중합체로서 일반적으로 13 내지 25개까지의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 단일쇄 핵산 사슬을 의미하는데, 경우에 따라서는 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer 및 12-mer 등 13개 미만의 뉴클레오티드로 구성되거나 25개 초과의 뉴클레오티드로 구성된 핵산 사슬을 지칭할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 통상적으로 상기 올리고뉴클레오티드 보다 더 긴 뉴클레오티드 단위체의 중합체 사슬을 의미하나, 상기 올리고뉴클레오티드와 혼용되어 사용되기도 한다. 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥 핵산사슬 모두를 포함한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "센스 가닥"은 이중가닥 DNA 분자 중 유전자의 코드의 진행방향과 동일한 방향의 단일가닥 핵산분자를 의미하고, "안티센스 가닥"은 상기 센스 가닥과 상보결합을 하는 다른 단일가닥 핵산분자를 의미하나, 유전자의 코드 진행방향과 무관하게, 최초로 핵산서열이 규명된 가닥을 "센스 가닥"으로 정의하고 그의 상보가닥을 "안티센스 가닥"으로 정의하는 것도 무방하다.
본 문서에서 사용되는 용어 "PCR(polymerase chain reaction)" 또는 "핵산증폭반응"은 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 표적 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. PCR에는 DNA 중합효소 외에 표적 핵산 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 프라이머(포워드 프라이머, 리버스 프라이머), 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture), Mg2+ 등의 2가이온을 포함하는 반응 완충액 등이 사용된다. 상기 PCR 반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "증폭산물"이라고 지칭하였다.
본 문서에서 사용되는 용어 "프라이머 연장반응(primer extension)"은 DNA 중합효소가 제한된 길이의 주형 핵산에 상보적으로 혼성화된 프라이머를 연장시켜 상기 주형 핵산의 5'-말단에서 종료가 되는 비연쇄반응을 의미한다. 상기 프라이머 연장반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "연장산물"이라고 지칭하였다.
본 문서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 PCR 반응 또는 프라이머 연장반응(primer extension) 반응의 개시를 위해 사용되는, 주형 DNA에 상보적으로 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. PCR 반응을 위한 프라이머는 증폭되는 핵산분자의 유전자 코드 진행방향과 동일한 센스 가닥으로부터 선택되는 포워드 프라이머(또는 센스 프라이머) 및 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥으로부터 선택되는 리버스 프라이머(또는 안티센스 프라이머)의 쌍이 사용되고, 프라이머 연장반응의 경우 통상적으로 단일한 연장용 프라이머가 사용된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "태그(tag)"는 특정 단일염기다형을 특이적으로 구분하기 위해 대립유전자 특이적 프라이머의 5'-말단에 부가되는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 상기 태그는 대응되는 단일염기다형 뉴클레오티드에 따른 고유의 핵산서열을 가지고 있으며, 상기 핵산서열은 증폭 대상 핵산과 연장용 프라이머를 제외한 다른 프라이머와 상동성이 존재하지 아니하여 비특이적 증폭반응을 최소화하도록 고안될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면,
ⅰ) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머;
ⅱ) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리핵산서열로 구성되는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머;
ⅲ) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머;
ⅳ) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머; 및
ⅴ) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머를 포함하는, 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 반응완충액, 디뉴클레오티드 혼합물 및 열안정성 DNA 폴리머라제가 추가로 포함될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 각각 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 프라이머 및 제2연장산물 증폭용 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드의 5'-말단이 공통의 서열로 구성되는 경우 이를 연장산물 증폭용 프라이머로 활용할 경우, 상기 제2연장산물 증폭용 프라이머는 생략이 가능하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
ⅰ) 증폭 대상 주형 핵산을 PCR 조건에서 증폭 대상 게놈과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머; PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 핵산서열로 구성되는 돌연변이형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머; 및 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 증폭산물을 생성하는 증폭산물 형성단계; 및
ⅱ) 상기 증폭산물을 열변성한 후 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성된 제1연장용 프라이머; 및 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 겔 전기영동상 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머를 이용하여 연장반응을 수행함으로써 연장산물을 생성시키는 연장산물 형성단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
상기 방법은 아울러, 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 각각 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 프라이머 및 제2연장산물 증폭용 프라이머를 이용하여 상기 연장산물을 증폭하는 연장산물 증폭단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드의 5'-말단이 공통의 서열로 구성되는 경우 이를 연장산물 증폭용 프라이머로 활용할 경우, 상기 제2연장산물 증폭용 프라이머는 생략이 가능하다.
상기 방법은 상기 연장산물을 겔 상에 로딩하여 전기영동을 수행한 후 밴드 패턴을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
선택적으로 상기 방법에 있어서, 상기 연장산물 증폭단계는 통상의 PCR 또는 실시간 PCR에 의해 수행될 수 있다. 상기 실시간 PCR은 프라이머쌍 외에 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드에 각각 특이적으로 결합하는 TaqMan 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 이 경우 형광 종류에 따라 상기 제1연장산물 및 상기 제2연장산물을 특이적으로 검출할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 증폭산물 형성단계, 상기 연장산물 형성단계 및 상기 연장산물 증폭단계는 연속적으로 수행되거나 비연속적으로 수행될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 증폭산물 형성 단계는 최적의 혼성화 조건을 탐색하기 위해, 어닐링 온도의 구배를 둔 복수의 반응으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 특별히 언급되지 않은 한, 복수의 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로 구성된 핵산분자는 5'-말단에서 3'-말단의 순서로 설명된다.
이하 본 발명의 일 실시예에 따른 키트 및 방법을 첨부된 도면을 통해 보다 상세히 설명한다.
도 1 내지 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일염기다형 검출키트의 검출 대상 단일염기다형과 이를 증폭하기 위한 각종 프라이머들(도 1) 및 본 발명의 일실시예에 따른 단일염기다형 검출키드에 의해 수행되는 대립유전자 특이적 핵산 증폭반응(도 2) 및 대립유전자 특이적 비대칭 프라이머 연장반응(도 3) 및 상기 대립유전자 특이적 비대칭 프라이머 연장산물의 증폭반응(도 4) 및 상기 증폭반응물에 대한 아가로스 겔 전기영동 결과(도 5)를 예시적으로 도시한 개요도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 게놈 내에 특정 유전자의 특정 단일염기다형 부위에 있어서 야생형과 돌연변이형이 모두 존재하는 이형접합체의 경우를 상정할 수 있다. 도 1에 예시된 바와 같이, 야생형 대립유전자에는 C:G 염기쌍이 돌연변이형 대립유전자에는 C > A(상보가닥 측면에서는 G > T) 변이가 존재할 경우, 통상의 대립유전자 특이적 PCR 방법을 사용할 경우, 대립유전자 특이적인 형광 탐침을 이용한 프라이머의 사용 및 실시간 PCR을 통해 SNP의 유무를 확인할 수 있다. 이 경우 고가의 형광 탐침과 실시간 PCR 기기를 사용한다는 측면에서 비용상 불리하다. 반면 본 발명의 일 실시예에 따르면 대립유전자 특이적 프라이머(110 및 120)를 사용한다는 점에서는 통상의 대립유전자 특이적 PCR과 유사하나, 본 발명의 일 실시예에서는 대립유전자 특이적 프라이머의 5'-말단에 증폭 대상 주형 핵산에 존재하지 않는 고유의 식별 태그(112 및 122)를 사용함으로써, 형광 탐침이나 실시간 PCR의 사용 없이도, SNP의 유무 및 종류까지 확인할 수 있다. 야생형 특이적 포워드 프라이머(110) 및 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(120)의 경우 각각 3'-말단이 상기 단일염기다형에 있어서 야생형 및 돌연변이형 뉴클레오티드이기 때문에, 실제 야생형 특이적 포워드 프라이머(110)는 야생형 대립유전자만 선택적으로 증폭할 수 있고 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(120)는 돌연변이형 대립유전자만 선택적으로 증폭할 수 있다. 한편, 야생형 특이적 포워드 프라이머(110) 및 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(120)의 5'-말단 서열은 상기 증폭 대상 주형 핵산에 존재하지 않는 고유의 핵산서열로서 야생형 특이적 증폭산물 및 돌연변이형 특이적 증폭산물 고유의 태그 역할을 수행한다. 편의상 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머에 포함된 태그는 제1태그 올리고뉴클레오티드(112)로 정의하고, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머에 포함된 태크는 제2태그 올리고뉴클레오티드(122)로 정의한다. 만약, 해당 단일염기다형 부위에 복수의 돌연변이가 존재하는 경우 제3태그 올리고뉴클레오티드(미도시) 및/또는 제4태그 올리고뉴클레오티드(미도시)가 각각 추가될 수 있으며, 상기 제3태그 올리고뉴클레오티드가 포함된 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머는 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머와 구분을 위해 편의상 제2돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(미도시), 상기 제4태그 올리고뉴클레오티드가 포함된 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머는 제3돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(미도시)로 정의한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 제1태그 올리고뉴클레오티드(112) 및 제2태그 올리고뉴클레오티드(122)를 각각 포함하는 야생형 특이적 포워드 프라이머(110) 및 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(120)와 공통의 리버스 프라이머(130)에 의한 PCR 반응에 의해 야생형 증폭산물(140) 및 돌연변이형 증폭산물(150)이 산출된다. (이 단계에서의 두 PCR-Product는 사이즈가 동일하여 겔 전기영동 상에서 밴드가 겹쳐 구분이 안됨) 제1태그 올리고뉴클레오티드(112) 및 제2태그 올리고뉴클레오티드(122)는 각각 프라이머 연장반응을 위해 사용되는 제1연장용 프라이머 및 제2연장용 프라이머의 3'-말단 서열로 사용된다. 따라서, 도 3에 도시된 바와 같이, 변성되어 단일가닥화된 야생형 증폭산물 안티센스 가닥(141)은 제1연장용 프라이머(161)의 3'-말단에 위치하는 제1태그 올리고뉴클레오티드(112)와 특이적으로 혼성화되고, 돌연변이형 증폭산물 안티센스 가닥(151)은 제2연장용 프라이머(170)의 3'-말단에 위치하는 제2태그 올리고뉴클레오티드(122)와 특이적으로 혼성화됨으로써 각각 제1연장산물(180) 및 제2연장산물(190)을 생성한다. 이 경우 제1연장용 프라이머(160)와 제2연장용 프라이머(170)는 그 길이가 상이하기 때문에, 제1연장산물(180)과 제2연장산물(190)은 겔 전기영동을 통해 밴드 패턴을 확인함으로써 구분이 가능하게 된다. 본 발명자는 이와 같은 대립유전자 특이적 프라이머 연장반응을 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응(allele specific bidirectional primer extension, ASBPE)로 명명하였다. 상기 ASBPE만으로도 단일염기다형을 검출할 수 있으나, 주형 핵산 분자의 농도가 낮을 경우 프라이머 연장반응만으로는 대립유전자 특이적 핵산분자의 검출이 어려울 수 있다. 이 경우 도 4에 도시된 바와 같이, 제1연장용 프라이머 및 상기 제2연장용 프라이머에서 각각 선택되는 고유의 핵산서열을 이용하여 제작된 연장산물 증폭용 프라이머(200)와 상술한 공통의 리버스 프라이머(130)를 이용하여 제1연장산물 및 제2연장산물을 증폭함으로써 보다 확실한 단일염기다형의 검출을 가능하게 할 수 있다. 이 경우 사용되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머(200)는 상기 제1연장용 프라이머 및 제2연장용 프라이머에 공통적으로 존재하는 서열을 이용하여 제작될 수 있고, 구분되는 고유의 핵산서열을 이용하여 제작될 수도 있다. 본 발명의 일 실시예를 예시적으로 도시하고 있는 도 1 및 도 4에는 제1연장용 프라이머(160) 및 제2연장용 프라이머(170)에 공통적으로 존재하는 서열을 이용하여 제작된 연장산물 증폭용 포워드 프라이머(200)만이 도시되어 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
실시예 1: 증폭 대상 핵산분자의 대립유전자 특이적 증폭
본 발명자는 상술한 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응에 의해 단일염기다형(SNP)의 유무 및 종류를 신속하게 판정할 수 있는지 조사하기 위해, 우선, SNP가 있는 것으로 잘 알려진 BCR-ABL 유전자를 주형으로 대립유전자 특이적 PCR이 제대로 수행하는지 조사하였다.
구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 주형 DNA(인간 c-abl oncogene)의 318번째 뉴클레오티드에 해당되는 SNP(C > T)를 검출하기 위해 대립유전자 특이적 프라이머로 서열번호 2로 표시되는 C 특이적 프라이머 및 서열번호 3으로 표시되는 T 특이적 프라이머와 서열번호 4로 표시되는 리버스 프라이머를 이용한 대립유전자 특이적 PCR 반응을 통해 115 bp 크기의 증폭 산물을 생성하였다. 이때, 상기 두 포워드 프라이머는 모두 3'-말단으로부터 3번째 염기에 의도적인 미스매치(C > A)를 도입하였다. 이는, 대립유전자 특이적 프라이머의 증폭을 더욱 안정적으로 수행하도록 해주는 것으로 알려져 있다(Liu et al. Plant Methods 2012, 8:34, 2012). 아울러, 프라이머의 어닐링 온도의 최적화를 위해 복수의 반응물의 어닐링 온도를 순차적으로 조절한 온도 구배 PCR 반응을 수행하였다. 상기 반응은 세 번 수행되었다. PCR 반응액의 조성 및 반응조건은 표 1 및 2에 각각 표시되어 있다.
| PCR 조성 | ||||
| Sample # | (μl) | End-Conc. | ||
| 5X PCR Buffer | 10 | 1X | ||
| Go Taq DNA polymerase | 0.25 | 1.25 U | ||
| dNTP Mix (10 mM) | 1 | 200 μM | ||
| 주형 | C, T | 1 | 105 copy | |
| 프라이머 | F | 1 | 100 nM | |
| R | 1 | 100 nM | ||
| 탈이온수 | ||||
| 총부피 | 50 | |||
| 온도 | 시간 | |
| 95℃ | 2 min | |
| 95℃ | 30 sec | 35 cycle |
| 53,55,57,59,61,63℃ | 30 sec | |
| 72℃ | 30 sec | |
| 72℃ | 5 min | |
| 4℃ | ∞ |
상기 온도 구배 AS-PCR 결과 도 6에 도시된 바와 같이, C 특이적 포워드 프라이머 및 T 특이적 포워드 프라이머는 각각 야생형 및 돌연변이형에서만 특이적인 증폭산물을 형성하였다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 프라이머는 제대로 작동을 하고 있음을 확인하였다. 한편, 최적의 어닐링 온도를 조사하기 위해 어닐링 온도에 대하여 온도 구배 PCR 반응을 수행한 결과 57℃ 정도의 온도가 야생형 및 돌연변이형 모두에서 최적인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 연장용 프라이머의 제작
본 발명자는 대립유전자 특이적 PCR에 이은 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응에 사용될 연장용 프라이머를 제조하였다. 구체적으로 주형 DNA로 인간 게놈 DNA와 서열 상동성이 낮은 서열번호 5로 표시되는 pBR322 플라스미드(Promega, USA)를 주형으로 하여 서열번호 6으로 표시되는 포워드 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 리버스 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 117 bp의 증폭산물을 생성하였다. 이 때, 상기 포워드 프라이머는 서열번호 8로 기재되는 상기 pBR322 플라스미드 DNA에 존재하는 상동서열과 이의 5'-말단에 부가되는 후술할 제2태그 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열인 제2태그 상보 올리고뉴클레오티드로 구성된다.
실시예 3: 태그 포함 프라이머의 제작 및 이를 이용한 ASBPE 반응
본 발명자는 이에 상기 AS-PCR에 사용된 포워드 프라이머의 5'-말단에 인간 게놈 내의 어떠한 서열과도 상동성이 떨어져서 위양성을 나타내지 않을 고유의 핵산서열을 갖는 태그 올리고뉴클레오티드를 고안하여 대립유전자 특이적 PCR을 수행하였다. 상기 태그 올리고뉴클레오티드는 본 기술분야에서 집코드(ZIP Code) 서열로도 알려져 있는데, 상기 집코드 서열은 게놈 DNA의 염기서열에 없는 서열을 갖는 뉴클레오티드 올리고머로서 게놈 DNA와 비특이적으로 혼성화되지 않도록 설계된 서열이다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 후술하는 실시예들에서 사용된 집코드 서열들 이외에도 당업계에 알려진 다양한 코드 서열들을 사용하여 프라이머를 변형시킬 수 있음을 용이하게 이해할 것이다(참고문헌: Slentz-Kesler et al., Genome Res., 10: 549-557, 2010).
구체적으로 본 발명자들은 돌연변이형 대립유전자 특이적 프라이머(서열번호 9)는 상기 실시예 1에서 사용된 돌연변이 특이적 포워드 프라이머의 5'-말단에 상기 서열번호 8로 표시되는 제2태그 상보 올리고뉴클레오티드의 상보서열인 서열번호 10으로 표시되는 상기 돌연변이형 대립유전자를 식별할 수 있는 고유의 태그 올리고뉴클레오티드(제2태그 올리고뉴클레오티드)를 부가함으로써 제조하였다. 실시예 1에서 제조된 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기에서 제조된 돌연변이 대립유전자 특이적 프라이머, 상기 실시예 2에서 연장용 프라이머 제작을 위해 사용된 서열번호 7로 표시되는 리버스 프라이머(본 PCR에서는 연장산물의 증폭을 위한 포워드 프라이머로 작용함) 및 상기 실시예 1에서 사용된 공통의 리버스 프라이머를 이용하여, 어닐링 온도가 57℃로 고정된 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 도 7에서 나타난 것과 같이, 야생형 특이적 포워드 프라이머와 공통의 리버스 프라이머에 의해 증폭된 115 bp 크기의 단편과 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 반응에 의해 생성된 232 bp 크기의 단편이 모두 증폭되었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응은 특정 증폭 대상 핵산분자 내의 특정 위치의 SNP의 존재 여부 및 종류를 정확하게 판정하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 더구나, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법은 단일한 튜브 내에서 단일한 반응으로 수행될 수 있을 뿐만 아니라고 고가의 기기를 사용하지 않고서도 간단한 겔 전기영동 후 밴드 패턴을 확인함으로써 손쉽고 저렴하게 사용될 수 있다는 점에서 매우 경제적인 방법이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구 범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
110: 야생형 특이적 포워드 프라이머
111: 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드
112: 제1태그 올리고뉴클레오티드
113: 제1태그 상보 올리고뉴클레오티드
114: 야생형 센스 표적 주형 핵산
115: 야생형 안티센스 표적 주형 핵산
120: 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머
121: 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드
122: 제2태그 올리고뉴클레오티드
123: 제2태그 상보 올리고뉴클레오티드
124: 돌연변이형 센스 표적 주형 핵산
125: 돌연변이형 안티센스 표적 주형 핵산
130: 공통 리버스 프라이머
140: 야생형 증폭산물
141: 야생형 증폭산물 안티센스 가닥
150: 돌연변이형 증폭산물
151: 야생형 증폭산물 안티센스 가닥
160: 제1연장용 프라이머
161: 제1연장 폴리뉴클레오티드
170: 제2연장용 프라이머
171: 제2연장 폴리뉴클레오티드
180: 제1연장산물
181: 제1연장산물 센스 가닥
182: 제1연장산물 안티센스 가닥
190: 제2연장산물
191: 제2연장산물 센스 가닥
192: 제2연장산물 안티센스 가닥
200: 연장산물 증폭용 포워드 프라이머
111: 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드
112: 제1태그 올리고뉴클레오티드
113: 제1태그 상보 올리고뉴클레오티드
114: 야생형 센스 표적 주형 핵산
115: 야생형 안티센스 표적 주형 핵산
120: 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머
121: 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드
122: 제2태그 올리고뉴클레오티드
123: 제2태그 상보 올리고뉴클레오티드
124: 돌연변이형 센스 표적 주형 핵산
125: 돌연변이형 안티센스 표적 주형 핵산
130: 공통 리버스 프라이머
140: 야생형 증폭산물
141: 야생형 증폭산물 안티센스 가닥
150: 돌연변이형 증폭산물
151: 야생형 증폭산물 안티센스 가닥
160: 제1연장용 프라이머
161: 제1연장 폴리뉴클레오티드
170: 제2연장용 프라이머
171: 제2연장 폴리뉴클레오티드
180: 제1연장산물
181: 제1연장산물 센스 가닥
182: 제1연장산물 안티센스 가닥
190: 제2연장산물
191: 제2연장산물 센스 가닥
192: 제2연장산물 안티센스 가닥
200: 연장산물 증폭용 포워드 프라이머
<110> HeimBiotek Inc.
<120> A kit and method for detecting single nucleotide polymorphic DNA
<130> PD14-5150
<160> 10
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 3913
<212> DNA
<213> Homo sapiense
<400> 1
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240
gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgc ccttggagcc 300
cccgttctat atcatcaytg agttcatgac ctacgggaac ctcctggact acctgaggga 360
gtgcaaccgg caggaggtga acgccgtggt gctgctgtac aagggcgaat tctgcagata 420
tccatcacac tggcggccgc tcgagcatgc atctagaggg cccaattcgc cctatagtga 480
atcgtattac aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 540
tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 600
ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagccta tacgtacggc agtttaaggt 660
ttacacctat aaaagagaga gccgttatcg tctgtttgtg gatgtacaga gtgatattat 720
tgacacgccg gggcgacgga tggtgatccc cctggccagt gcacgtctgc tgtcagataa 780
agtctcccgt gaactttacc cggtggtgca tatcggggat gaaagctggc gcatgatgac 840
caccgatatg gccagtgtgc cggtctccgt tatcggggaa gaagtggctg atctcagcca 900
ccgcgaaaat gacatcaaaa acgccattaa cctgatgttc tggggaatat aaatgtcagg 960
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttc acgtagaaag ccagtccgca 1020
gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc 1080
aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc 1140
ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg 1200
gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg 1260
atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 1320
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 1380
gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 1440
ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct 1500
atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc 1560
gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catcccacct 1620
tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 1680
tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 1740
gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 1800
agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 1860
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 1920
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 1980
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 2040
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaattga 2100
aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 2160
ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 2220
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 2280
agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 2340
gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 2400
cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 2460
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 2520
ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 2580
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 2640
gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 2700
cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 2760
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 2820
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 2880
gtagttatct acacgacggg gagccaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 2940
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 3000
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 3060
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 3120
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3180
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3240
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 3300
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3360
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggat 3420
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3480
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 3540
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3600
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3660
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 3720
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 3780
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 3840
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga atcagtgagc 3900
gaggaagcgg aag 3913
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-specific forward primer
<400> 2
gcccccgttc tatatcataa c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T-specific forward primer
<400> 3
gcccccgttc tatatcataa t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 4
gaattcgccc ttgtacagca 20
<210> 5
<211> 1200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pBR322 plasmid
<400> 5
gaatacaagc ttgggcgtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat 60
atcatcatga acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag 120
ccatattcaa cgggaaacgt cttgctcgag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga 180
tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg 240
attgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc 300
caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc 360
gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc 420
cgggaaaaca gcattccagg tattagaaga atatcctgag tcaggtgaaa atattgttga 480
tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa 540
cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga 600
tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat 660
gcataagctt ttgccattct caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga 720
taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat 780
cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc 840
attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca 900
gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta atcagaattg gttaattggt tgtaacactg 960
gcagagcatt acgctgactt gacgggacgg cggctttgtt gaataaatcg aacttttgct 1020
gagttgaagg atcagatcac gcatcttccc gacaacgcag accgttccgt ggcaaagcaa 1080
aagttcaaaa tcaccaactg gtccacctac aacaaagctc tcatcaaccg tggcgactct 1140
agaggatccc cgggcgagct cccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaccgaatt 1200
1200
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tag complementary-forward primer
<400> 6
cacggagtag ccgttatctg cagtttcatt tgatgctcga tgagt 45
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for extension polynucleotide
<400> 7
agccgccgtc ccgtcaagtc ag 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> homologous sequence to pBR322
<400> 8
cacggagtag ccgttatc 18
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant allele-specific extension primer
<400> 9
gataacggct actccgtggc ccccgttcta tatcataat 39
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a second tag oligonucleotide
<400> 10
gataacggct actccgtg 18
Claims (12)
- ⅰ) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머;
ⅱ) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리핵산서열로 구성되는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머;
ⅲ) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머;
ⅳ) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머; 및
ⅴ) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머를 포함하는, 단일염기다형 검출용 키트 - 제1항에 있어서,
반응완충액, 디뉴클레오티드 혼합물 및 열안정성 DNA 폴리머라제가 추가되는, 단일염기다형 검출용 키트. - 제1항에 있어서,
상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 각각 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 프라이머 및 제2연장산물 증폭용 프라이머를 추가로 포함되는, 단일염기다형 검출용 키트. - 제3항에 있어서,
상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드의 5'-말단이 공통의 서열로 구성되고, 상기 서열이 연장산물 증폭용 프라이머로 사용되면, 상기 제2연장산물 증폭용 프라이머는 생략이 가능한, 단일염기다형 검출용 키트. - ⅰ) 증폭 대상 주형 핵산을 PCR 조건에서 증폭 대상 게놈과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머; PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 핵산서열로 구성되는 돌연변이형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머; 및 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 증폭산물을 생성하는 증폭산물 형성단계; 및
ⅱ) 상기 증폭산물을 열변성한 후 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성된 제1연장용 프라이머; 및 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 겔 전기영동상 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티로 구성되는 제2연장용 프라이머를 이용하여 연장반응을 수행함으로써 연장산물을 생성시키는 연장산물 형성단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법. - 제5항에 있어서,
상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 각각 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 프라이머 및 제2연장산물 증폭용 프라이머를 이용하여 상기 연장산물을 증폭하는 연장산물 증폭단계를 추가로 포함되는, 단일염기다형 검출 방법. - 제6항에 있어서,
상기 연장산물 증폭단계는 통상의 PCR 또는 실시간 PCR에 의해 수행되는, 단일염기다형 검출 방법. - 제7항에 있어서,
상기 실시간 PCR은 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드에 각각 특이적인 TaqMan 프로브를 이용하여 수행되는, 단일염기다형 검출 방법. - 제6항에 있어서,
상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드의 5'-말단이 공통의 서열로 구성되고, 상기 서열을 연장산물 증폭용 프라이머로 사용하면, 상기 제2연장산물 증폭용 프라이머는 생략이 가능한, 단일염기다형 검출 방법. - 제5항에 있어서,
상기 연장산물을 겔 상에 로딩하여 전기영동을 수행한 후 밴드 패턴을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 단일염기다형 검출 방법. - 제6항에 있어서,
상기 증폭산물 형성단계, 상기 연장산물 형성단계 및 상기 연장산물 증폭단계는 연속적으로 수행되거나 비연속적으로 수행되는, 단일염기다형 검출 방법. - 제5항에 있어서,
상기 증폭산물 형성 단계는 최적의 혼성화 조건을 탐색하기 위해, 어닐링 온도의 구배를 둔 복수의 반응으로 수행되는, 단일염기다형 검출 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020150019785A KR101690279B1 (ko) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 단일염기다형 검출용 키트 및 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020150019785A KR101690279B1 (ko) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 단일염기다형 검출용 키트 및 방법 |
Publications (2)
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|---|---|
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Family
ID=56874724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020150019785A KR101690279B1 (ko) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 단일염기다형 검출용 키트 및 방법 |
Country Status (1)
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| KR (1) | KR101690279B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6728556B2 (ja) * | 2016-08-05 | 2020-07-22 | ハイムバイオテック インコーポレイテッド | 一塩基多型検出用キット及び方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101726238B1 (ko) * | 2010-10-15 | 2017-04-12 | (주) 하임바이오텍 | 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법, 이를 위한 프라이머 조성물 및 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트 |
-
2015
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