JP7313485B2 - 核酸検出用多価核酸ナノ構造体及びこれを用いた高感度核酸探針 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸バイオマーカーの探知効率を上げるための核酸プローブシステムに関し、具体的に、一本鎖ベースのプローブ配列を核酸ナノ構造体に集約させる方法によりバイオマーカーに対する探知効率及び検出感度を改善した発明である。
特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質を検出する方法は、科学研究分野において基本的に重要な技術である。特定の核酸又はタンパク質を検出し同定可能になることにより、研究者らは、どのような遺伝的、生物学的標識が人の健康状態を示す指標となるかを判定することが可能になった。このような核酸とタンパク質を検出する方法を用いると、試料に存在する病原体遺伝子の変形、又は特定遺伝子の発現などを発見することができる。このような分子診断は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの疾病の根本を診断することであり、感染疾患、癌診断、遺伝疾患及びカスタマイズ診断など、様々な分野で用いられている。代表的な分子診断技術には、短時間でＤＮＡを増幅させるＰＣＲ技術がある（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７－９１．，１９９８）。しかしながら、一般のＰＣＲ技術は、増幅されたＤＮＡを確認するために電気泳動方法を用いなければならない。このような電気泳動を行うためには、アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を作り、ＤＮＡをＥｔＢｒなどで染色して確認しなければならず、面倒だった。また、最近用いられている実時間ＰＣＲ方法は、蛍光を用いるものであって、電気泳動が不要であるが、高価の使用機器と高価の蛍光試薬を使用しなければならないという不具合があった（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６－１０３０，１９９３）。近年、現場診断概念のＰＣＲ製品であるＣｅｐｈｅｉｄ社のＧｅｎｅＸｐｒｔシステムと試薬が開発され販売されているが、装備と試薬が非常に高価であるため、一般の検査に使用することは困難である（Ｈｅｌｂ，Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：２２９－２３７，２０１０）。他の方法として、ＰＣＲ後にゲル電気泳動に代えてメンブレインを使用して確認する核酸側面流れアッセイ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ａｓｓａｙ）がある（Ａｖｅｙａｒｄ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４１：４２５１－４２５３，２００７）。しかし、ゲル電気泳動技術に比べて複雑なため、実験室で製造して使用することは不可能であり、メンブレインに付着したプローブのシーケンスは、ＰＣＲ増幅産物に応じて特異的に結合し得るように使用しなければならないという技術の限界があり、汎用するには限界点がある。特に、このようなＰＣＲベースの塩基配列分析法は、特定の誤りに極めて脆弱であり、データ解析過程で問題が生じるため、核酸及びタンパク質検出の正確度及び感度に限界を示す。
臨床的診断目的のために細胞や組織或いは血液から分離及び精製された核酸バイオマーカーは、その濃度が低いため、検出過程において信号増幅過程が不回避である。核酸バイオセンサーに適用される信号増幅手法には、ＨＣＲ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）；ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような代表的な方法が提示されており、このような既存の増幅手法は、プローブのターゲット（ｔａｒｇｅｔ）認識後に発生する信号を増幅させることにフォーカスしている。しかし、このような技術を適用したバイオセンサーも同様、初期段階でプローブがターゲットを認識し、続く反応を開始する過程を必然的に含んでおり、この過程は、プローブとターゲット分子の拡散及び衝突の支配を受ける。特に、ターゲット分子の濃度が低い場合、このような衝突頻度が非常に急激に減少し、信号増幅段階の非反応或いはノイズを引き起こすが、この場合、続く増幅過程にもかかわらずターゲット検出の効率が低下する問題点がある。
例えば、ＨＰＡ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）；ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；ＤＫＡ（Ｄｕａｌ ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｓｓａｙ）のように優れた検出効率を示すプローブシステムが既存文献から提示されたことがあり、それらは主として、ターゲット（ｔａｒｇｅｔ）認識によって発生する信号増幅効率を上げることに重点をおいて開発された。しかし、優れた信号増幅効率を示すシステムといっても、バイオマーカーの濃度が非常に低くなるとターゲット検出及び信号増幅のための分子間衝突／反応の頻度も減り、このため、プローブシステムの反応性及び検出感度の限界が決定付けられる問題があるが、それに対する対応戦略は提示されたところがない。
そこで、本発明らは、プローブシステム自体の反応性とバイオマーカーの検出感度の限界を根本的に改善するために鋭意努力した結果、一本鎖ベースのプローブ配列を多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）で集約させた新規核酸ナノ構造体を開発し、該ナノ構造体の形成によるプローブの集積及びナノ構造体の柔軟性に基づいてプローブ間の衝突頻度が増加してバイオマーカーに対する探知効率が改善することを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ターゲット核酸に相補的なプローブ対を含む核酸ナノ構造体を提供することである。
本発明の他の目的は、本発明の核酸ナノ構造体を含む核酸検出用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、本発明の核酸ナノ構造体の製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、本発明の核酸ナノ構造体を用いた核酸検出方法を提供することである。
上記の目的を解決するために、本発明は、ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を含むプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されてプローブ－構造体鎖をそれぞれ形成し、前記それぞれのプローブ－構造体鎖は、前記構造体核酸間の相補的結合によって互いに連結されていることを特徴とする核酸ナノ構造体を提供する。
本発明は、前記核酸ナノ構造体を含むターゲット核酸検出用組成物を提供する。
本発明は、また、前記核酸検出用組成物を含む診断キットを提供する。
本発明は、また、次の段階を含む核酸ナノ構造体の製造方法を提供する：
（ａ）ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を含むプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されているプローブ－構造体鎖を作製する段階；及び
（ｂ）前記プローブ－構造体鎖を互いにアニールさせ、核酸ナノ構造体を得る段階。
（ａ）ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を含むプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されているプローブ－構造体鎖を作製する段階；及び
（ｂ）前記プローブ－構造体鎖を互いにアニールさせ、核酸ナノ構造体を得る段階。
本発明は、また、前記核酸ナノ構造体を用いてターゲット核酸を検出する方法を提供する。
特に断らない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使われるものである。
特に断りのない限り、本明細書において、核酸は、左側から右側に５’→３’配向で記録される。明細書中に列挙された数値範囲は、範囲を定義する数字を含み、定義された範囲内のそれぞれの整数又は任意の非整数分画を含む。
本願に記述されたものと類似又は等価である任意の方法及び材料が、本発明をテストするための実行において用いられ得るが、好ましい材料及び方法が本願で記述される。
本発明では、標的核酸検出のための高感度プローブシステムを開発しようとし、一本鎖ベースのプローブ配列を多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）で含む新規核酸ナノ構造体を作製し、該核酸ナノ構造体を用いて標的核酸を検出する場合に、ナノ構造体の柔軟性に基づいてプローブ間の衝突頻度が増加し、バイオマーカーに対する探知効率が改善することを確認した。
本発明は、一観点において、ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を含むプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されてプローブ－構造体鎖をそれぞれ形成し、前記それぞれのプローブ－構造体鎖は、前記構造体核酸間の相補的結合によって互いにハイブリダイズされていることを特徴とする核酸ナノ構造体に関する。
本発明で使われる用語“核酸ナノ構造体”は、ターゲット核酸に相補的な配列を含むプローブ対、構造体核酸、蛍光団及び消光剤を含む構造体を含む。本発明において、前記核酸ナノ構造体は、ダイマー型（Ｄ型）、Ｙ型、テトラマー型（Ｔ型）、又はヘキサマー型（Ｈ型）であり得るが、これに限定されるものではない。
本発明において用語“プローブ”とは、特定配列を含む核酸（例、バイオマーカー）と特異的結合をなし得る、短くは数塩基から長くは数百塩基までに該当するＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸断片を意味し、ラベリングされているので、特定核酸の存在の有無が確認できる。プローブは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で作製されてよい。
本発明において、プローブ対は、ヘアピン構造を有する一対の一本鎖プローブを意味し、本明細書において、前記それぞれのプローブは、区分のために、“第１プローブ”及び“第２プローブ”との名称で使われる。本明細書の一部において、説明の便宜のために、ターゲット核酸と特異的に結合したプローブを“第１プローブ”と、即時的分子内反応により前記第１プローブと結合したプローブを“第２プローブ”と称するが、命名順序によって序数を変えて使用してもよい。前記“第１”及び“第２”などの序数は、プローブ対を構成する各プローブを区分するために明示したもので、権利範囲を制限するためのものではなく、“構造体核酸”を区分するために同じ方法で用いられた。
本発明において、前記プローブ対のいずれか一つ以上が、相補的なターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記プローブ対のプローブはそれぞれ、互いに相補的な配列を含むことを特徴とし得る。好ましくは、即時的プローブ間の反応のために、一つのプローブのヘアピン構造以外の配列一部が、他のプローブの配列一部と相補的であることを特徴とし、より好ましくは、一つのプローブのヘアピン構造が解けた時の一本鎖として表される配列の一部が、他のプローブの配列一部と相補的であることを特徴とし得る（図１、図３）。
本発明の用語“構造体核酸”とは、前記プローブを集約させ、多価の核酸ナノ構造体の形成を誘導するオリゴ核酸を意味する。
本発明において、前記構造体核酸は、一部に互いに相補的な配列を含むので、ハイブリダイズにより核酸ナノ構造体を形成することができる。
本発明において、前記構造体核酸が３個以上である場合に、各構造体核酸は、他の１個以上の構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、ハイブリダイズにより核酸ナノ構造体を形成することができる。
本発明において、前記構造体核酸は、その単独で用いられてもよく、プローブに連結されてプローブ－構造体鎖の形態で用いられてもよい。前記構造体の核酸は、２個以上の他の構造体核酸の全部又は一部と相補的な配列を含むことができ、その組合せによって核酸ナノ構造体の形態が変わってよい。本発明の一実施例において、配列番号１～配列番号９の配列を有する構造体核酸が用いられたが、これに限定されるものではない。
‘プローブ’と‘構造体核酸’との連結、又は‘プローブ又は構造体核酸’と‘消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）又は蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）’との連結の文脈において使われた本発明の用語“連結”とは、プローブ、構造体、消光剤及び蛍光団の間が通常の技術者にとって認識可能な方法で結合していることを意味する。前記‘連結’は、例えば、水素結合、共有結合、電気的結合、ファンデルワールス結合などによって直接に結合したものでよく、リンカーなどによって間接に結合してもよい。本発明の一実施例において、プローブと構造体核酸との連結は、プローブの５’末端と構造体核酸の３’末端とがリン酸ジエステル結合で連結され、プローブ又は構造体と消光剤又は蛍光団との結合は共有結合で連結されているが、これに限定されるものではない。
本発明の用語“相補的”とは、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使われる。例えば、ワトソンクリック塩基対結合のように、ＤＮＡにおいてアデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。したがって、本発明は、また、本願に開示されたり或いは使用された完全に相補的な配列の他、実質的に類似な核酸配列によって“相補的”である配列も含む。
本発明において、“プローブ”及び“構造体核酸”で用いられた“互いに相補的な配列”は、それぞれ独立した意味で使われる。
本発明において、前記プローブ対を構成する２つの一本鎖プローブのいずれか一プローブがターゲット核酸と結合する場合に、ヘアピン構造が解けることを特徴とし得る。
本発明において、前記ターゲット核酸と結合したプローブのヘアピン構造が解けた後、即時的分子内反応により、前記プローブ対を構成する他のプローブと相補的に結合することを特徴とし得る。
本発明において、ターゲット核酸と結合したプローブが、即時的分子内反応により、前記プローブ対を構成する他のプローブと相補的に結合する場合に、前記他のプローブのヘアピン構造が解けることを特徴とし得る。
本発明の用語“即時的分子内反応”とは、前記第１プローブ及び第２プローブが相補的な配列による結合を形成し、これによって起こり得る反応を意味し、本発明の核酸ナノ構造体の形成により、個別のプローブ分子の反応に比べて著しく高い反応性を示すことができる。前記反応は、各具現例によって図１（ｂ）、図３（ｂ）及び図４（ａ）に詳細に示されている。
本発明において、前記プローブ対を構成する２つのプローブが相補的に結合する場合に、ターゲット核酸が分離され、他の核酸ナノ構造体と反応できることを特徴とし得る。
本発明において、前記第１プローブ及び第２プローブの結合によってターゲット核酸が分離されても、ヘアピン構造の形成が抑制され、持続して線形プローブの形態を維持し、検出信号（例えば、蛍光）を発生させることを特徴とし得る。
本発明による核酸ナノ構造体は、一つの構造体に複数個（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）のプローブ配列を含んでおり、標的核酸と結合可能なプローブが空間的に集約している一方、腕の個数と柔軟性は高いので、プローブ間の接近性、衝突頻度が上がり、標的核酸に対する感度が高くなり、検出限界が下がることを特徴とする。
本発明において、“ターゲット核酸”は、検出しようとする標的となる核酸を意味する。前記ターゲット核酸は、好ましくは一本鎖であることを特徴とし、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡなどの短いＲＮＡ断片であり得るが、これに限定されるものではない。本発明において、前記“ターゲット核酸”は、好ましくは、１０～４０ｂｐの塩基配列であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
一具現例において、核酸ナノ構造体は、３’末端にそれぞれのプローブ対が連結された構造体核酸を含むことができる。
一具現例において、核酸ナノ構造体は、１対、２対又は３対のプローブを一構造体内に含むことができ、１対のプローブを含む構造体は、直線形の両端にプローブ対の各一本鎖プローブを含むダイマー構造体、３個の二本鎖腕のうち、２個の腕の端にプローブ対の各一本鎖プローブを含むＹ型構造体、及び十字型の４個の二本鎖腕のうち２個の腕の端にプローブ対の各一本鎖プローブを含む２腕テトラマー(２－Ａｒｍ Ｔｅｔｒａｍｅｒ)構造体を含むことができ；２対のプローブを一構造体内に含む核酸ナノ構造体は、４個の二本鎖腕の端に含むテトラマー構造体であり；及び、３対のプローブを一構造体内に含む核酸ナノ構造体は、プローブ対の各一本鎖プローブを交互に６個の二本鎖腕の端に含むヘキサマー構造体であり得る（図３（ｂ）及び図４（ａ）参照）。
本発明の各プローブ対は、同一のプローブ対が１対、２対又は３対で使用されることが好ましいが、これに限定されるものではなく、同一の又は異なるターゲット核酸に特異的に結合する異なるプローブ対が組み合わせられて使用されてもよい。
本発明において、１対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、直線形の両端にプローブ対の各核酸構造体模型のプローブを含むダイマー型（Ｄ型）構造体であることを特徴とし得る。
本発明において、前記ダイマー型（Ｄ型）構造体は、第１プローブ－第１構造体鎖と第２プローブ－第２構造体鎖で構成されており、互いに相補的な配列を含む第１構造体鎖と第２構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
本発明において、１対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、３個の二本鎖腕のうち２個の腕の端にプローブ対の各一本鎖プローブを含むＹ型構造体であることを特徴とし得る。
本発明において、前記Ｙ型構造体は、第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖及び第２プローブ－３構造体鎖で構成されており、
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖及び第２プローブ－第３構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖及び第２プローブ－第３構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
本発明において、１対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、十字型の４個の二本鎖腕のうち２個の腕の端にプローブ対の各一本鎖プローブを含む２腕テトラマー構造体であることを特徴とし得る。
本発明において、前記２腕テトラマー構造体は、第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖、第３構造体鎖及び第２プローブ－第４構造体鎖で構成され、
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第４構造体核酸は、第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖、第３構造体鎖及び第２プローブ－第４構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第４構造体核酸は、第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖、第３構造体鎖及び第２プローブ－第４構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
本発明において、２対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、４個の二本鎖腕の端に２対のプローブの各一本鎖プローブを含むテトラマー型（Ｔ型）構造体であることを特徴とし得る。
本発明において、前記テトラマー型（Ｔ型）構造体は、第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖及び第２プローブ－第４構造体鎖で構成されており、
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸と相補的な配列を含み、第４構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖及び第２プローブ－第４構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸と相補的な配列を含み、第４構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖及び第２プローブ－第４構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
本発明において、前記３対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、プローブ対の各一本鎖プローブを交互に６個の二本鎖腕の端に含むヘキサマー型（Ｈ型）構造体であることを特徴とし得る。
本発明において、前記ヘキサマー型（Ｈ型）構造体は、第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖、第２プローブ－第４構造体鎖、第１プローブ－第５構造体鎖及び第２プローブ－第６構造体鎖で構成されており、
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第６構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第４構造体核酸は、第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第５構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第５構造体核酸は、第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第６構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第６構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第５構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖、第２プローブ－第４構造体鎖、第１プローブ－第５構造体鎖、及び第２プローブ－第６構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第６構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第４構造体核酸は、第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第５構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第５構造体核酸は、第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第６構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第６構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第５構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖、第２プローブ－第４構造体鎖、第１プローブ－第５構造体鎖、及び第２プローブ－第６構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
一具現例において、それぞれのプローブに連結された相補的な構造の構造体核酸を含むことができ、それぞれのヘアピン構造のプローブに連結された構造体核酸は、互いに相補的な配列を含むことができ、それぞれのプローブ及び構造体が連結された一本鎖核酸のそれぞれの末端には、蛍光団又は消光剤が連結されてよい。
本発明の一実施例において、Ｄ構造体の場合、第１プローブの末端には消光剤が付着しており、第２構造体一本鎖核酸の末端には蛍光団が付着しているので、第１プローブ及び第１構造体一本鎖核酸と第２プローブ及び第２構造体一本鎖核酸とが相補的に結合しており、第１プローブがヘアピン構造を備えている場合には、有意の蛍光信号が検出されない（図３（ｂ）のαＤ－ＤＮＡ参照）。ここで、前記の第１構造体一本鎖核酸と第２構造体一本鎖核酸とが相補的に結合した状態の第１プローブがターゲット核酸配列と分子内反応をして構造が変更されることにより、消光剤と蛍光団が遠ざかって蛍光信号を放出する（図３（ｂ）のβＤ－ＤＮＡ参照）。
一具現例において、１対のプローブを一構造体内に含む核酸ナノ構造体（ダイマー構造体）は、プローブ対の第１プローブに連結された第１構造体核酸を含む一本鎖核酸；及びプローブ対の第２プローブに連結された第２構造体核酸を含む一本鎖核酸を含み、第１構造体核酸と第２構造体核酸は互いに相補的であり得る。
一具現例において、１対のプローブを一構造体内に含む核酸ナノ構造体（Ｙ型構造体）は、プローブ対の第１プローブに連結された第１構造体核酸を含む一本鎖核酸；第２構造体核酸を含む一本鎖核酸；及びプローブ対の第２プローブに連結された第３構造体核酸を含み、第１構造体核酸は、第２構造体核酸及び第３構造体核酸の一部配列と相補的であり、第２構造体核酸は、第１構造体核酸及び第３構造体核酸の一部配列と相補的であり、第３構造体核酸は、第１構造体核酸及び第２構造体核酸の一部配列と相補的であり得る。
一具現例において、１対のプローブを一構造体内に含む核酸ナノ構造体（２腕Ｔ構造体）は、プローブ対の第１プローブに連結された第１構造体核酸を含む一本鎖核酸；第２構造体核酸を含む一本鎖核酸；第３構造体核酸；及びプローブ対の第２プローブに連結された第４構造体核酸を含み、第１構造体核酸は、第２構造体核酸及び第４構造体核酸の一部配列と相補的であり、第２構造体核酸は、第１構造体核酸及び第３構造体核酸の一部配列と相補的であり、第３構造体核酸は、第２構造体核酸及び第４構造体核酸の一部配列と相補的であり、第４構造体核酸は、第１構造体及び第３構造体核酸の一部配列と相補的であり得る。
一具現例において、２対のプローブを一構造体内に含む核酸ナノ構造体（Ｔ構造体）は、プローブ対の第１プローブに連結された第１構造体核酸を含む一本鎖核酸；プローブ対の第２プローブに連結された第２構造体核酸を含む一本鎖核酸；プローブ対の第１プローブに連結された第３構造体核酸；及びプローブ対の第２プローブに連結された第４構造体核酸を含み、第１構造体核酸は、第２構造体核酸及び第４構造体核酸の一部配列と相補的であり、第２構造体核酸は、第１構造体核酸及び第３構造体核酸の一部配列と相補的であり、第３構造体核酸は、第２構造体核酸及び第４構造体核酸の一部配列と相補的であり、第４構造体核酸は、第１構造体及び第３構造体核酸の一部配列と相補的であり得る。
一具現例において、３対のプローブを一構造体内に含む核酸ナノ構造体（Ｈ－構造体）は、プローブ対の第１プローブに連結された第１構造体核酸を含む一本鎖核酸；プローブ対の第２プローブに連結された第２構造体核酸を含む一本鎖核酸；プローブ対の第１プローブに連結された第３構造体核酸；プローブ対の第２プローブに連結された第４構造体核酸；プローブ対の第１プローブに連結された第５構造体核酸；及びプローブ対の第２プローブに連結された第６構造体核酸を含み、第１構造体核酸は、第２構造体核酸及び第６構造体核酸の一部配列と相補的であり、第２構造体核酸は、第１構造体核酸及び第３構造体核酸の一部配列と相補的であり、第３構造体核酸は、第２構造体核酸及び第４構造体核酸の一部配列と相補的であり、第４構造体核酸は、第３構造体及び第５構造体核酸の一部配列と相補的であり、第５構造体核酸は、第４構造体核酸及び第６構造体核酸の一部配列と相補的であり、第６構造体核酸は、第１構造体核酸及び第５構造体核酸の一部配列と相補的であり得る。
一具現例において、構造体核酸は、配列番号１の塩基配列を含むＳ１、配列番号２の塩基配列を含むＳ２、配列番号３の塩基配列を含むＳ３、配列番号４の塩基配列を含むＳ４、配列番号５の塩基配列を含むＳ５、配列番号６の塩基配列を含むＳ６、配列番号７の塩基配列を含むＳ７、配列番号８の塩基配列を含むＳ８、又は配列番号９の塩基配列を含むＳ９、又はその組合せを含むことができ、一実施例において、本発明のＤ構造体は、Ｓ１及びＳ８を含み、Ｔ構造体はＳ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４を含み、Ｈ構造体はＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７を含み、Ｙ構造体はＳ１、Ｓ２及びＳ９を含み、２腕Ｔ構造体はＳ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４を含む。
本発明において、前記核酸ナノ構造体は、消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）及び蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を含むことを特徴とし得る。
一具現例において、５’末端又は３’末端に消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を含み、３’末端又は５’末端に蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を含むことができる。
一具現例において、蛍光団は、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、ＴＭＲ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、Ｑｕａｓａｒ ５７０、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、ＬＣ ｒｅｄ ６４０、ＬＣ ｒｅｄ ６７０、ＬＣ ｒｅｄ ７０５及び量子点（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）からなる群から選ばれてよい。
一具現例において、消光剤は、ＤＤＱ－Ｉ、ＤＤＱ－ ＩＩ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｉｏｗａ ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ ｂｌａｃｋ ＲＱ、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－７、金ナノ粒子、炭素ナノチューブ、グラフェン、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、ＴＭＲ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、Ｑｕａｓａｒ ５７０、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、ＬＣ ｒｅｄ ６４０、ＬＣ ｒｅｄ ６７０、ＬＣ ｒｅｄ ７０５及び量子点（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）からなる群から選ばれてよい。
一具現例において、本発明のターゲット核酸に相補的なプローブ対を一構造体内に含む核酸ナノ構造体は、ヘアピン構造によって互いに反応しないプローブ対がターゲット核酸の触媒役割によって順次に反応してヘアピン構造が解けることにより、相補的結合によって二本鎖を形成し、それぞれの消光剤によって消光された蛍光団が発光し得る。
一具現例において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ及びＲＮＡであってよい。
一具現例において、本発明のプローブは、ホスホラミダイト固体支持体方法、又はその他周知の方法を用いて化学的に合成できる。このような核酸配列は、また、当該分野に公知された多くの手段を用いて変形させることができる。このような変形の非制限的な例には、メチル化、カプセル化、天然ヌクレオチドの一つ以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の変形、例えば、荷電されていない連結体（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）又は荷電された連結体（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への変形がある。
本発明の核酸ナノ構造体は、検出過程の反応物である核酸プローブを核酸ナノ構造体に集約させることにより、反応過程が分子間反応ではなく分子内反応で起き得るようにする。したがって、溶液上に分散されていた反応物を一分子に集約させ、制限された量の触媒によって速くて効率的な反応を誘導し、反応を阻害していた反応物の拡散過程が一部省略され、核酸構造体内部プローブ間の高い衝突頻度をもたらすことにより、反応性、診断感度及び検出速度が改善する。
一具現例において、本発明の核酸ナノ構造体は、ターゲット核酸であるｍｉＲ－２１（配列番号１９）に対して、プローブ対としてＨ１（配列番号２０）及びＨ２（配列番号２１）；及び、構造体核酸としてＳ１（配列番号１）、Ｓ２（配列番号２）、Ｓ３（配列番号３）、Ｓ４（配列番号４）、Ｓ５（配列番号５）、Ｓ６（配列番号６）、Ｓ７（配列番号７）、Ｓ８（配列番号８）、Ｓ９（配列番号９）、Ｓ１Ｈ１（配列番号１０）、Ｓ２Ｈ２（配列番号１１）、Ｓ３Ｈ１（配列番号１２）、Ｓ４Ｈ２（配列番号１３）、Ｓ５Ｈ２（配列番号１４）、Ｓ６Ｈ１（配列番号１５）、Ｓ７Ｈ２（配列番号１６）、Ｓ８Ｈ２（配列番号１７）、Ｓ９Ｈ２（配列番号１８）、又はそれらの組合せを含む核酸ナノ構造体であり得る。
一観点において、本発明は、核酸ナノ構造体を含む核酸検出用組成物に関する。
本発明において用語“試料（サンプル）”は、対象又は患者から得た組織、細胞、血液、血清、小便、唾液、血漿又は体液を含み、組織又は細胞サンプルの供給源は、新鮮な、凍結した及び／又は保存された臓器又は組織サンプル又は生検又は吸引物からの固形組織；血液又は任意の血液構成分；対象の妊娠又は発生の任意の時点における細胞であってよい。組織サンプルは、また、１次又は培養細胞、又は細胞株であってよい。
本発明において、用語“検出”又は“測定”は、検出又は測定された対象の濃度を定量することを意味する。
本発明において、“ターゲット核酸”は、検出しようとする標的となる核酸を意味する。前記ターゲット核酸は、好ましくは一本鎖であることを特徴とし、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡなどの短いＲＮＡ断片であり得るが、これに限定されるものではない。本発明において、前記“ターゲット核酸”は、好ましくは１０～４０ｂｐの塩基配列であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
他の観点において、本発明は、本発明のターゲット核酸検出用組成物を含む診断キットに関する。
さらに他の観点において、本発明は、次の段階を含む核酸ナノ構造体の製造方法に関する：
（ａ）ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を有するプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されているプローブ－構造体鎖を作製する段階；及び
（ｂ）前記プローブ－構造体鎖を互いにアニールさせ、核酸ナノ構造体を得る段階。
（ａ）ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を有するプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されているプローブ－構造体鎖を作製する段階；及び
（ｂ）前記プローブ－構造体鎖を互いにアニールさせ、核酸ナノ構造体を得る段階。
一具現例において、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールしてプローブと構造体核酸を連結し、プローブ－構造体鎖を作製できる。
一具現例において、プローブ－構造体鎖の濃度をそれぞれ５００～７００ｎＭとし、４０～４５℃で３～１０分間維持した後、４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールすることによってＤ構造体を作製できる。
一具現例において、プローブ－構造体鎖の濃度をそれぞれ８００～１０００ｎＭとし、４０～４５℃で３～１０分間維持した後、４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールすることによってＹ構造体を作製できる。
一具現例において、プローブ－構造体鎖の濃度をそれぞれ１１００～１３００ｎＭとし、４０～４５℃で３～１０分間維持した後、４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールすることによって２腕Ｔ構造体又はＴ構造体を作製できる。
一具現例において、プローブと連結された構造体核酸の濃度をそれぞれ１７００～１９００ｎＭとし、５０～６０℃で３～１０分間維持した後、４℃まで－０．１℃／１４４秒の速度でアニールすることによってＨ構造体を作製できる。
一具現例において、核酸ナノ構造体の一部であるプローブ対のプローブ一本鎖のそれぞれのヘアピン構造が解けたり或いは他の配列と更なる結合を成さない状態を維持しながら、構造体中心の二本鎖腕を形成するためにアニーリングを２回にわたって行ってよく、構造体を構成する各一本鎖（Ｄ構造体は２本、Ｔ構造体は４本、Ｈ構造体は６本、Ｙ構造体は３本、２腕Ｔ構造体は４本）を個別にアニールしてプローブ一本鎖モチーフのヘアピン構造を完成した後、このヘアピン構造が解けないように初期温度を低温に設定して前記一本鎖をアニールすることができる。
さらに他の観点において、本発明は、前記核酸ナノ構造体又は前記核酸検出用組成物を用いた核酸の検出方法に関する。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１．検出プローブ対を含むＤＮＡナノ構造体の合成
１－１．分離状態Ｈ１及びＨ２の合成
目的核酸であるｍｉＲ－２１の探知のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を有するプローブ対であるＨ１及びＨ２を等温鎖置換（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）反応によって蛍光信号増幅を誘導した。具体的に、ヘアピン構造の解け（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）を蛍光信号増加から確認できるように、Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２（ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２）、５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｈ１配列の濃度が３００ｎＭ、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液を１００μＬ作り、熱循環器（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）で９５℃を５分間維持後に、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。Ｈ２配列も同じ方法で準備した。
１－１．分離状態Ｈ１及びＨ２の合成
目的核酸であるｍｉＲ－２１の探知のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を有するプローブ対であるＨ１及びＨ２を等温鎖置換（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）反応によって蛍光信号増幅を誘導した。具体的に、ヘアピン構造の解け（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）を蛍光信号増加から確認できるように、Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２（ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２）、５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｈ１配列の濃度が３００ｎＭ、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液を１００μＬ作り、熱循環器（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）で９５℃を５分間維持後に、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。Ｈ２配列も同じ方法で準備した。
１－２．ダイマーＤＮＡ（Ｄ－ＤＮＡ）構造体の合成
目的核酸であるｍｉＲ－２１の探知のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を有するプローブ対であるＨ１及びＨ２をダイマ－構造（２個の二本鎖腕を有する（１対のＨ１及びＨ２含む）。）で有するナノ構造体を合成した。具体的に、ヘアピン構造の解けを蛍光信号増加から確認できるように、Ｓ１Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２（ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２）、Ｓ８Ｈ２配列の５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｓ１Ｈ１又はＳ８Ｈ２配列の濃度が６００ｎＭ、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液をそれぞれ５０μＬ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持した後、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。その後、ＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、配列の濃度がそれぞれ６００ｎＭであるＳ１Ｈ１及びＳ８Ｈ２溶液を５０μＬずつ混ぜた後、４３．５℃で５分間維持した熱循環器で４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。これにより、最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬのＤ－ＤＮＡ溶液を完成した。
目的核酸であるｍｉＲ－２１の探知のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を有するプローブ対であるＨ１及びＨ２をダイマ－構造（２個の二本鎖腕を有する（１対のＨ１及びＨ２含む）。）で有するナノ構造体を合成した。具体的に、ヘアピン構造の解けを蛍光信号増加から確認できるように、Ｓ１Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２（ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２）、Ｓ８Ｈ２配列の５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｓ１Ｈ１又はＳ８Ｈ２配列の濃度が６００ｎＭ、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液をそれぞれ５０μＬ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持した後、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。その後、ＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、配列の濃度がそれぞれ６００ｎＭであるＳ１Ｈ１及びＳ８Ｈ２溶液を５０μＬずつ混ぜた後、４３．５℃で５分間維持した熱循環器で４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。これにより、最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬのＤ－ＤＮＡ溶液を完成した。
１－３．テトラマーＤＮＡ（Ｔ－ＤＮＡ）構造体の合成
目的核酸であるｍｉＲ－２１の探知のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を有するプローブ対であるＨ１及びＨ２を、テトラマー構造（４個の二本鎖腕を有する（２対のＨ１及びＨ２含む）。）で有するナノ構造体を合成した。具体的に、Ｓ１Ｈ１配列及びＳ３Ｈ１配列の各３’末端にＢＨＱ２が、Ｓ２Ｈ２配列及びＳ４Ｈ２配列の各５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｓ２Ｈ２、Ｓ３Ｈ１、Ｓ４Ｈ２又はＳ１Ｈ１配列の濃度が１２００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液をそれぞれ２５μＬ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持後に９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。その後、ＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、配列の濃度が各１２００ｎＭであるＳ１Ｈ１、Ｓ２Ｈ２、Ｓ３Ｈ１及びＳ４Ｈ２溶液を２５μＬずつ混ぜた後、４３．５℃で５分間維持した熱循環器で４３．５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールし、最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬのＴ－ＤＮＡ溶液を完成した。
目的核酸であるｍｉＲ－２１の探知のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を有するプローブ対であるＨ１及びＨ２を、テトラマー構造（４個の二本鎖腕を有する（２対のＨ１及びＨ２含む）。）で有するナノ構造体を合成した。具体的に、Ｓ１Ｈ１配列及びＳ３Ｈ１配列の各３’末端にＢＨＱ２が、Ｓ２Ｈ２配列及びＳ４Ｈ２配列の各５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｓ２Ｈ２、Ｓ３Ｈ１、Ｓ４Ｈ２又はＳ１Ｈ１配列の濃度が１２００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液をそれぞれ２５μＬ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持後に９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。その後、ＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、配列の濃度が各１２００ｎＭであるＳ１Ｈ１、Ｓ２Ｈ２、Ｓ３Ｈ１及びＳ４Ｈ２溶液を２５μＬずつ混ぜた後、４３．５℃で５分間維持した熱循環器で４３．５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールし、最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬのＴ－ＤＮＡ溶液を完成した。
１－４．ヘキサマーＤＮＡ（Ｈ－ＤＮＡ）構造体の合成
目的核酸であるｍｉＲ－２１の探知のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を有するプローブ対であるＨ１及びＨ２をヘキサマー構造（６個の二本鎖腕を有する（３対のＨ１及びＨ２含む）。）で有するナノ構造体を合成した。具体的に、Ｓ１Ｈ１配列、Ｓ３Ｈ１配列及びＳ６Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２が、Ｓ２Ｈ２配列、Ｓ５Ｈ２配列及びＳ７Ｈ２配列の５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用したし、Ｓ２Ｈ２、Ｓ３Ｈ１、Ｓ５Ｈ２、Ｓ６Ｈ１、Ｓ７Ｈ２又はＳ１Ｈ１配列の濃度が１８００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液を１６．７μＬずつ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持した後、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。上記で準備した、ＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、各配列の濃度が各１８００ｎＭであるＳ１Ｈ１、Ｓ２Ｈ２、Ｓ３Ｈ１、Ｓ５Ｈ２、Ｓ６Ｈ１及びＳ７Ｈ２溶液を１６．７μＬずつ混ぜ、熱循環器で５５℃を５分間維持した後、５５℃から４℃まで－０．１℃／１４４秒の速度でアニールした。最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬのＨ－ＤＮＡ溶液を完成した。
目的核酸であるｍｉＲ－２１の探知のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を有するプローブ対であるＨ１及びＨ２をヘキサマー構造（６個の二本鎖腕を有する（３対のＨ１及びＨ２含む）。）で有するナノ構造体を合成した。具体的に、Ｓ１Ｈ１配列、Ｓ３Ｈ１配列及びＳ６Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２が、Ｓ２Ｈ２配列、Ｓ５Ｈ２配列及びＳ７Ｈ２配列の５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用したし、Ｓ２Ｈ２、Ｓ３Ｈ１、Ｓ５Ｈ２、Ｓ６Ｈ１、Ｓ７Ｈ２又はＳ１Ｈ１配列の濃度が１８００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液を１６．７μＬずつ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持した後、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。上記で準備した、ＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、各配列の濃度が各１８００ｎＭであるＳ１Ｈ１、Ｓ２Ｈ２、Ｓ３Ｈ１、Ｓ５Ｈ２、Ｓ６Ｈ１及びＳ７Ｈ２溶液を１６．７μＬずつ混ぜ、熱循環器で５５℃を５分間維持した後、５５℃から４℃まで－０．１℃／１４４秒の速度でアニールした。最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬのＨ－ＤＮＡ溶液を完成した。
１－５．Ｙ型ＤＮＡ（Ｙ－ＤＮＡ）構造体の合成
ＤＮＡナノ構造体の柔軟性比較のために、一対のＨ１及びＨ２モチーフを含むＤＮＡナノ構造体として、Ｙ－ＤＮＡ構造体（総３個の二本鎖腕のうち２個の腕にのみＨ１及びＨ２モチーフを含む。）を合成した。具体的に、Ｓ１Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２が、Ｓ９Ｈ２配列の５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｓ２、Ｓ９Ｈ２又はＳ１Ｈ１配列の濃度が９００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液を３３．３μＬずつ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持した後、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。上記のように準備した、ＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、配列の濃度が各９００ｎＭであるＳ１Ｈ１及びＳ９Ｈ２溶液を３３．３μＬずつ混ぜ、熱循環器で４３．５℃を５分間維持した後、４３．５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールすることにより、最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬのＹ－ＤＮＡ溶液を完成した。
ＤＮＡナノ構造体の柔軟性比較のために、一対のＨ１及びＨ２モチーフを含むＤＮＡナノ構造体として、Ｙ－ＤＮＡ構造体（総３個の二本鎖腕のうち２個の腕にのみＨ１及びＨ２モチーフを含む。）を合成した。具体的に、Ｓ１Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２が、Ｓ９Ｈ２配列の５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｓ２、Ｓ９Ｈ２又はＳ１Ｈ１配列の濃度が９００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液を３３．３μＬずつ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持した後、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。上記のように準備した、ＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、配列の濃度が各９００ｎＭであるＳ１Ｈ１及びＳ９Ｈ２溶液を３３．３μＬずつ混ぜ、熱循環器で４３．５℃を５分間維持した後、４３．５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールすることにより、最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬのＹ－ＤＮＡ溶液を完成した。
１－６．２腕Ｔ－ＤＮＡ構造体の合成
ＤＮＡナノ構造体の柔軟性比較のために、一対のＨ１及びＨ２モチーフを含むＤＮＡナノ構造体として、Ｔ－ＤＮＡ構造体（総４個の二本鎖腕のうち２個の腕にのみＨ１及びＨ２モチーフを含む。）を合成した。具体的に、Ｓ１Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２が、Ｓ２配列の５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４Ｈ２又はＳ１Ｈ１配列の濃度が１２００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液をそれぞれ２５μＬ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持した後、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。このように製造したＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、各配列の濃度が各１２００ｎＭであるＨ１Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４Ｈ２溶液を２５μＬずつ混ぜ、熱循環器で４３．５℃を５分間維持した後、４３．５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬの２腕Ｔ－ＤＮＡ溶液を完成した。
ＤＮＡナノ構造体の柔軟性比較のために、一対のＨ１及びＨ２モチーフを含むＤＮＡナノ構造体として、Ｔ－ＤＮＡ構造体（総４個の二本鎖腕のうち２個の腕にのみＨ１及びＨ２モチーフを含む。）を合成した。具体的に、Ｓ１Ｈ１配列の３’末端にＢＨＱ２が、Ｓ２配列の５’末端にＣｙ５蛍光団が置換された配列を使用し、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４Ｈ２又はＳ１Ｈ１配列の濃度が１２００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである溶液をそれぞれ２５μＬ作り、熱循環器で９５℃を５分間維持した後、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。このように製造したＮａＣｌ（ａｑ）濃度が２００ｍＭで、各配列の濃度が各１２００ｎＭであるＨ１Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４Ｈ２溶液を２５μＬずつ混ぜ、熱循環器で４３．５℃を５分間維持した後、４３．５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールした。最終的に、構造体の濃度が３００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が２００ｍＭである１００μＬの２腕Ｔ－ＤＮＡ溶液を完成した。
前記実施例１で製造及び使用されたプローブ対、構造体核酸及びターゲット核酸の塩基配列は、次表の通りである。
実施例２．ナノ構造体合成の有無の確認
前記実施例１で作製したＤ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ、Ｈ－ＤＮＡ及びＹ－ＤＮＡ構造体の合成されたか否かを確認するために、１ｘ ＴＢＥ ５％又は１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１ｘトリス／ボレート／ＥＤＴＡポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行った。
前記実施例１で作製したＤ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ、Ｈ－ＤＮＡ及びＹ－ＤＮＡ構造体の合成されたか否かを確認するために、１ｘ ＴＢＥ ５％又は１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１ｘトリス／ボレート／ＥＤＴＡポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行った。
その結果、図２に示すように、Ｄ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ、Ｈ－ＤＮＡ及びＹ－ＤＮＡ構造体がいずれも成功的に合成されたことが分かった（図２）。
実施例３．分離状態プローブシステムとＤＮＡナノ構造体プローブが集約されたシステムの目的物質に対する反応性比較
３－１．分離状態Ｈ１及びＨ２
ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が５０ｍＭで、ｍｉＲ－２１配列の濃度が各０ｎＭ、３０ｎＭ、６０ｎＭ、９０ｎＭ、１２０ｎＭ、１５０ｎＭ、１８０ｎＭ、２１０ｎＭ、２４０ｎＭ、３００ｎＭ、４５０ｎＭ又は６００ｎＭである溶液１６．７μＬと、前記実施例１で合成した３００ｎＭの分離状態のＨ１及びＨ２溶液をそれぞれ１６．７μＬずつ混合し、最終的にＨ１及びＨ２の濃度が各１００ｎＭで、ｍｉＲ－２１の濃度が０ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ又は２００ｎＭであり、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。Ｃｙ５蛍光団及び消光剤からｍｉＲ－２１による反応を示すＨ１のヘアピン構造の解けを測定可能であるので、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）して６７０ｎｍの放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図３（ｅ））、ｍｉＲ－２１濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析（図３（ａ））、反応２４時間後のｍｉＲ－２１濃度別の反応程度（図３（ｃ））、及び反応時間別検出限界（図３（ｄ））を確認した（図３）。
３－１．分離状態Ｈ１及びＨ２
ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が５０ｍＭで、ｍｉＲ－２１配列の濃度が各０ｎＭ、３０ｎＭ、６０ｎＭ、９０ｎＭ、１２０ｎＭ、１５０ｎＭ、１８０ｎＭ、２１０ｎＭ、２４０ｎＭ、３００ｎＭ、４５０ｎＭ又は６００ｎＭである溶液１６．７μＬと、前記実施例１で合成した３００ｎＭの分離状態のＨ１及びＨ２溶液をそれぞれ１６．７μＬずつ混合し、最終的にＨ１及びＨ２の濃度が各１００ｎＭで、ｍｉＲ－２１の濃度が０ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ又は２００ｎＭであり、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。Ｃｙ５蛍光団及び消光剤からｍｉＲ－２１による反応を示すＨ１のヘアピン構造の解けを測定可能であるので、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）して６７０ｎｍの放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図３（ｅ））、ｍｉＲ－２１濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析（図３（ａ））、反応２４時間後のｍｉＲ－２１濃度別の反応程度（図３（ｃ））、及び反応時間別検出限界（図３（ｄ））を確認した（図３）。
３－２．Ｄ－ＤＮＡ
２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液１６．７μＬ、ｍｉＲ－２１配列の濃度がそれぞれ０ｎＭ、３０ｎＭ、６０ｎＭ、９０ｎＭ、１２０ｎＭ、１５０ｎＭ、１８０ｎＭ、２１０ｎＭ、２４０ｎＭ、３００ｎＭ、４５０ｎＭ又は６００ｎＭである溶液１６．７μＬ、及び前記実施例１で合成した３００ｎＭのＤ－ＤＮＡ構造体溶液１６．７μＬを混合し、最終的に、構造体の濃度が１００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激して６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図３（ｆ））、ｍｉＲ－２１濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析（図３（ａ））、反応２４時間後のｍｉＲ－２１濃度別の反応程度（図３（ｃ））、及び反応時間別検出限界（図３ｄ）を確認した（図３）。
２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液１６．７μＬ、ｍｉＲ－２１配列の濃度がそれぞれ０ｎＭ、３０ｎＭ、６０ｎＭ、９０ｎＭ、１２０ｎＭ、１５０ｎＭ、１８０ｎＭ、２１０ｎＭ、２４０ｎＭ、３００ｎＭ、４５０ｎＭ又は６００ｎＭである溶液１６．７μＬ、及び前記実施例１で合成した３００ｎＭのＤ－ＤＮＡ構造体溶液１６．７μＬを混合し、最終的に、構造体の濃度が１００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激して６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図３（ｆ））、ｍｉＲ－２１濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析（図３（ａ））、反応２４時間後のｍｉＲ－２１濃度別の反応程度（図３（ｃ））、及び反応時間別検出限界（図３ｄ）を確認した（図３）。
３－３．Ｔ－ＤＮＡ
前記実施例１で合成した３００ｎＭのＴ－ＤＮＡ構造体溶液８．３μＬを、前記２－１におけるように様々な濃度のｍｉＲ－２１溶液１６．７μＬ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液２５μＬを混合し、最終的に、構造体の濃度が５０ｎＭであり、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激して６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図３（ｇ））、ｍｉＲ－２１濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析（図３（ａ））し、反応２４時間後のｍｉＲ－２１濃度別の反応程度（図３（ｃ））、及び臨床及び実験標準機関（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＣＬＳＩ）のガイドラインに基づいて計算した反応時間別検出限界（図３（ｄ））を確認した（図３）。その結果、電気泳動でγ構造が確認された。
前記実施例１で合成した３００ｎＭのＴ－ＤＮＡ構造体溶液８．３μＬを、前記２－１におけるように様々な濃度のｍｉＲ－２１溶液１６．７μＬ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液２５μＬを混合し、最終的に、構造体の濃度が５０ｎＭであり、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激して６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図３（ｇ））、ｍｉＲ－２１濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析（図３（ａ））し、反応２４時間後のｍｉＲ－２１濃度別の反応程度（図３（ｃ））、及び臨床及び実験標準機関（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＣＬＳＩ）のガイドラインに基づいて計算した反応時間別検出限界（図３（ｄ））を確認した（図３）。その結果、電気泳動でγ構造が確認された。
３－４．Ｈ－ＤＮＡ
前記実施例１で合成した３００ｎＭのＨ－ＤＮＡ構造体溶液５．５μＬを、前記２－１におけるように様々な濃度のｍｉＲ－２１溶液１６．７μＬ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液２７．８μＬを混合し、最終的に、構造体の濃度が３３．３ｎＭであり、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激して６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図３ｈ）、ｍｉＲ－２１濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析（図３ａ）、反応２４時間後のｍｉＲ－２１濃度別の反応程度（図３ｃ）、及び反応時間別検出限界（図３ｄ）を確認した（図３）。
前記実施例１で合成した３００ｎＭのＨ－ＤＮＡ構造体溶液５．５μＬを、前記２－１におけるように様々な濃度のｍｉＲ－２１溶液１６．７μＬ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液２７．８μＬを混合し、最終的に、構造体の濃度が３３．３ｎＭであり、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激して６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図３ｈ）、ｍｉＲ－２１濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析（図３ａ）、反応２４時間後のｍｉＲ－２１濃度別の反応程度（図３ｃ）、及び反応時間別検出限界（図３ｄ）を確認した（図３）。
３－５．分離状態Ｈ１及びＨ２、Ｄ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ、及びＨ－ＤＮＡの最終反応程度較及び検出限界計算
各配列に付着した蛍光強度の変化を用いてＨ１のヘアピン構造の解けた程度、すなわち各プローブシステムの反応程度を２４時間測定した図３の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）の結果に基づき、各構造体の様々なｍｉＲ－２１濃度に対する反応程度測定２４時間目の反応程度を、各サンプルの反応程度は各構造体が２００ｎＭのｍｉＲ－２１を使用した場合に到達した平衡状態の蛍光値を１００％と仮定し、平衡に到達した程度を用いて比較した結果、Ｈ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ、Ｄ－ＤＮＡ、及び分離状態Ｈ１及びＨ２の順に低い濃度のｍｉＲ－２１に対する高い反応程度を示した（図（３ｃ））。また、２４時間の間に蛍光強度の変化により測定された各プローブシステムの反応程度に基づき、臨床及び実験標準機関（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＣＬＳＩ）のガイドラインに基づき、反応時間別検出限界を下記式１で計算した結果、分離状態のＨ１及びＨ２と比較したとき、分子間反応に代えて分子内反応が起きるＤ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ及びＨ－ＤＮＡの検出限界が大幅に減ったことが確認でき、反応１２時間後からＨ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ、Ｄ－ＤＮＡの順に検出限界が低く現れた（図３（ｄ））。なお、同一濃度のＨ１又はＨ２モチーフ条件（１００ｎＭ）において、Ｈ－ＤＮＡの構造体では、Ｈ－ＤＮＡの構造体自体の濃度が低い（３３．３ｎＭ）ため、図１（ｂ）に示した分子間衝突頻度が比較的低く、初期速度及び反応性が他のプローブシステムに比べて低下したことが見られた。
各配列に付着した蛍光強度の変化を用いてＨ１のヘアピン構造の解けた程度、すなわち各プローブシステムの反応程度を２４時間測定した図３の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）の結果に基づき、各構造体の様々なｍｉＲ－２１濃度に対する反応程度測定２４時間目の反応程度を、各サンプルの反応程度は各構造体が２００ｎＭのｍｉＲ－２１を使用した場合に到達した平衡状態の蛍光値を１００％と仮定し、平衡に到達した程度を用いて比較した結果、Ｈ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ、Ｄ－ＤＮＡ、及び分離状態Ｈ１及びＨ２の順に低い濃度のｍｉＲ－２１に対する高い反応程度を示した（図（３ｃ））。また、２４時間の間に蛍光強度の変化により測定された各プローブシステムの反応程度に基づき、臨床及び実験標準機関（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＣＬＳＩ）のガイドラインに基づき、反応時間別検出限界を下記式１で計算した結果、分離状態のＨ１及びＨ２と比較したとき、分子間反応に代えて分子内反応が起きるＤ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ及びＨ－ＤＮＡの検出限界が大幅に減ったことが確認でき、反応１２時間後からＨ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ、Ｄ－ＤＮＡの順に検出限界が低く現れた（図３（ｄ））。なお、同一濃度のＨ１又はＨ２モチーフ条件（１００ｎＭ）において、Ｈ－ＤＮＡの構造体では、Ｈ－ＤＮＡの構造体自体の濃度が低い（３３．３ｎＭ）ため、図１（ｂ）に示した分子間衝突頻度が比較的低く、初期速度及び反応性が他のプローブシステムに比べて低下したことが見られた。
[数１]
検出限界の蛍光値＝陰性対照群の蛍光値＋１．６４５＊（陰性対照群の蛍光値の標準偏差）＋１．６４５＊（低濃度サンプル蛍光値の標準偏差）
（陰性対照群：ｍｉＲ－２１の濃度が０ｎＭである場合；及び低濃度サンプル：ｍｉＲ－２１の濃度が１０ｎＭである場合）
検出限界の蛍光値＝陰性対照群の蛍光値＋１．６４５＊（陰性対照群の蛍光値の標準偏差）＋１．６４５＊（低濃度サンプル蛍光値の標準偏差）
（陰性対照群：ｍｉＲ－２１の濃度が０ｎＭである場合；及び低濃度サンプル：ｍｉＲ－２１の濃度が１０ｎＭである場合）
３－６．Ｙ－ＤＮＡ
前記実施例１で合成した３００ｎＭのＹ－ＤＮＡ構造体溶液１６．７μＬを、前記２－１におけるように様々な濃度のｍｉＲ－２１溶液１６．７μＬ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液１６．７μＬを混合し、最終的に、構造体の濃度が１００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激し、６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図４（ｅ））、初期反応速度（図４（ｂ））及び反応時間別検出限界（図４（ｃ））を確認した。
前記実施例１で合成した３００ｎＭのＹ－ＤＮＡ構造体溶液１６．７μＬを、前記２－１におけるように様々な濃度のｍｉＲ－２１溶液１６．７μＬ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液１６．７μＬを混合し、最終的に、構造体の濃度が１００ｎＭで、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激し、６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図４（ｅ））、初期反応速度（図４（ｂ））及び反応時間別検出限界（図４（ｃ））を確認した。
３－７．２腕Ｔ－ＤＮＡ
前記実施例１で合成した３００ｎＭの２腕Ｔ－ＤＮＡ構造体溶液１６．７μＬを、前記２－１におけるように様々な濃度のｍｉＲ－２１溶液１６．７μＬ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液１６．７μＬと混合し、最終的に、構造体の濃度が１００ｎＭであり、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激し、６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図４（ｆ））、初期反応速度（図４（ｂ））及び反応時間別検出限界（図４（ｃ））を確認した。
前記実施例１で合成した３００ｎＭの２腕Ｔ－ＤＮＡ構造体溶液１６．７μＬを、前記２－１におけるように様々な濃度のｍｉＲ－２１溶液１６．７μＬ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）溶液１６．７μＬと混合し、最終的に、構造体の濃度が１００ｎＭであり、ＮａＣｌ（ａｑ）の濃度が１５０ｍＭとなるようにした。その後、３７℃で分光器を用いて６４０ｎｍの波長でＣｙ５蛍光団を刺激し、６７０ｎｍの放出波長の強度を２４時間の間に３分間隔で測定することにより、様々な濃度のｍｉＲ－２１に対する時間による反応度を確認し（図４（ｆ））、初期反応速度（図４（ｂ））及び反応時間別検出限界（図４（ｃ））を確認した。
３－８．検出限界計算及び初期反応速度比較
各配列に付着した蛍光強度の変化を用いてＨ１のヘアピン構造の解けた程度、すなわち各プローブシステムの反応程度を２４時間の間に測定した図４の（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）の結果に基づき、各構造体の各ｍｉＲ－２１濃度におけるグラフを最も近いＳ字形ウェイブル（ｗｅｉｂｕｌｌ）モデルに合わせて回帰して時間による反応程度に対する式を導出し、これにより、グラフの反応開始１時間目の勾配、すなわち反応速度を計算した結果、反応開始から１時間目の各プローブシステム別反応速度をｍｉＲ－２１濃度によって比較した初期反応速度において、０ｎＭから４０ｎＭまでのｍｉＲ－２１濃度条件では２腕Ｔ－ＤＮＡ、Ｙ－ＤＮＡ及びＤ－ＤＮＡの順に反応速度が速く現れ、５０ｎＭ以上のｍｉＲ－２１濃度条件では２腕Ｔ－ＤＮＡ、Ｙ－ＤＮＡ、Ｄ－ＤＮＡの順に反応が飽和状態に到達し、反応速度が減少し始めた（図（４ｂ））。また、臨床及び実験標準機関（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＣＬＳＩ）のガイドラインに基づいて各プローブシステムの反応時間別検出限界を導出した結果、Ｈ１及びＨ２モチーフ間の連結部品の柔軟性が大きい２腕Ｔ－ＤＮＡ、Ｙ－ＤＮＡ及びＤ－ＤＮＡの順に検出限界が低く現れた（図４（ｃ））。
各配列に付着した蛍光強度の変化を用いてＨ１のヘアピン構造の解けた程度、すなわち各プローブシステムの反応程度を２４時間の間に測定した図４の（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）の結果に基づき、各構造体の各ｍｉＲ－２１濃度におけるグラフを最も近いＳ字形ウェイブル（ｗｅｉｂｕｌｌ）モデルに合わせて回帰して時間による反応程度に対する式を導出し、これにより、グラフの反応開始１時間目の勾配、すなわち反応速度を計算した結果、反応開始から１時間目の各プローブシステム別反応速度をｍｉＲ－２１濃度によって比較した初期反応速度において、０ｎＭから４０ｎＭまでのｍｉＲ－２１濃度条件では２腕Ｔ－ＤＮＡ、Ｙ－ＤＮＡ及びＤ－ＤＮＡの順に反応速度が速く現れ、５０ｎＭ以上のｍｉＲ－２１濃度条件では２腕Ｔ－ＤＮＡ、Ｙ－ＤＮＡ、Ｄ－ＤＮＡの順に反応が飽和状態に到達し、反応速度が減少し始めた（図（４ｂ））。また、臨床及び実験標準機関（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＣＬＳＩ）のガイドラインに基づいて各プローブシステムの反応時間別検出限界を導出した結果、Ｈ１及びＨ２モチーフ間の連結部品の柔軟性が大きい２腕Ｔ－ＤＮＡ、Ｙ－ＤＮＡ及びＤ－ＤＮＡの順に検出限界が低く現れた（図４（ｃ））。
実施例４．ｏｘＤＮＡシミュレーションプログラムを用いたＤＮＡナノ構造体内におけるプローブ間の距離測定及び衝突頻度計算
４－１．構造体形成段階の塩基対間の距離及び衝突頻度の計算
ＤＮＡナノ構造体の形成と構造体内塩基対間の距離の分析のために、図５に記載されたパラメータを用いたＤＮＡ核酸シミュレーションプログラムを用いて、各構造体のＨ１モチーフがｍｉＲ－２１と結合した状態のＤ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ及びＨ－ＤＮＡの構造を分析した。具体的に、プログラム上で各構造体を形成するために、各構造体において相補的に結合する配列の末端から２番目の塩基対を“ｔｒａｐ”機能によって結んだ。また、構造が比較的複雑なＨ－ＤＮＡの場合にのみ、さらに、末端から三番目の塩基対にもｍｕｔｕａｌ ｔｒａｐ機能を適用した（Ｍｕｔｕａｌ ｔｒａｐ：異なる２塩基の座標上の距離を任意に近づかせる機能で、一般に配列間の円滑な二重結合形成のために用いる機能）。
４－１．構造体形成段階の塩基対間の距離及び衝突頻度の計算
ＤＮＡナノ構造体の形成と構造体内塩基対間の距離の分析のために、図５に記載されたパラメータを用いたＤＮＡ核酸シミュレーションプログラムを用いて、各構造体のＨ１モチーフがｍｉＲ－２１と結合した状態のＤ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ及びＨ－ＤＮＡの構造を分析した。具体的に、プログラム上で各構造体を形成するために、各構造体において相補的に結合する配列の末端から２番目の塩基対を“ｔｒａｐ”機能によって結んだ。また、構造が比較的複雑なＨ－ＤＮＡの場合にのみ、さらに、末端から三番目の塩基対にもｍｕｔｕａｌ ｔｒａｐ機能を適用した（Ｍｕｔｕａｌ ｔｒａｐ：異なる２塩基の座標上の距離を任意に近づかせる機能で、一般に配列間の円滑な二重結合形成のために用いる機能）。
４－２．構造体内塩基対間の距離の分析
ＤＮＡナノ構造体に集約されたＨ１、Ｈ２モチーフ間の分子内反応時の距離を測定するために、配列ベースのＭＤ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃ）シミュレーションを用いて、前記４－１の実際に反応が始まるｍｉＲ－２１が結合した状態のＨ１モチーフの３’末端から８番目の塩基とＨ２モチーフの５’末端から１番目の塩基（Ｈ１とＨ２間の相補結合が始まる塩基対）との間の距離を測定し、Ｄ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ及びＨ－ＤＮＡはそれぞれ１つ、４つ、９つのＨ１、Ｈ２モチーフ組合せの間の距離を測定した（図６）。
ＤＮＡナノ構造体に集約されたＨ１、Ｈ２モチーフ間の分子内反応時の距離を測定するために、配列ベースのＭＤ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃ）シミュレーションを用いて、前記４－１の実際に反応が始まるｍｉＲ－２１が結合した状態のＨ１モチーフの３’末端から８番目の塩基とＨ２モチーフの５’末端から１番目の塩基（Ｈ１とＨ２間の相補結合が始まる塩基対）との間の距離を測定し、Ｄ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ及びＨ－ＤＮＡはそれぞれ１つ、４つ、９つのＨ１、Ｈ２モチーフ組合せの間の距離を測定した（図６）。
４－３．Ｈ１及びＨ２の有効衝突頻度の計算
前記４－２で測定したＤＮＡナノ構造体内Ｈ１及びＨ２モチーフ間の相補結合が始まる塩基対間の距離分布のうち、一般に、ｏｘＤＮＡプログラム距離単位１（一般に通用される塩基対間に有効な反応が起こるための十分の距離）に到達する回数と時間を測定し、衝突頻度を計算した（図７）。そのために、図６で測定したモチーフ間の距離に基づき、Ｈ１及びＨ２モチーフ間の距離が１である時の回数を基準に分子内の衝突頻度を計算した。
前記４－２で測定したＤＮＡナノ構造体内Ｈ１及びＨ２モチーフ間の相補結合が始まる塩基対間の距離分布のうち、一般に、ｏｘＤＮＡプログラム距離単位１（一般に通用される塩基対間に有効な反応が起こるための十分の距離）に到達する回数と時間を測定し、衝突頻度を計算した（図７）。そのために、図６で測定したモチーフ間の距離に基づき、Ｈ１及びＨ２モチーフ間の距離が１である時の回数を基準に分子内の衝突頻度を計算した。
実施例５．分離状態のＨ１及びＨ２の衝突頻度の理論的計算
既存の一本鎖ベースの診断システムに該当する分離状態のＨ１及びＨ２のプローブ間衝突頻度は、水溶液内拡散反応に基づくスモルコフスキ方程式によって理論的に計算した。具体的に、スモルコフスキの液相における溶質の凝固モデル（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）の一部を用いて分離状態のＨ１及びＨ２の衝突頻度を計算し、中心となる一つの粒子に向かってブラウン運動（Ｂｒｏｗｎｉａｎ ｍｏｔｉｏｎ）によって分散される粒子の個数を考慮し、フィックの法則（Ｆｉｃｋ’ｌａｗ）により、半径がｒである全ての中心粒子を囲んでいる粒子を通過して結局に中心粒子に到達する一つの粒子のフラックス（ｆｌｕｘ）、すなわち、中心粒子との衝突頻度を、下記式２で示すことができる。
既存の一本鎖ベースの診断システムに該当する分離状態のＨ１及びＨ２のプローブ間衝突頻度は、水溶液内拡散反応に基づくスモルコフスキ方程式によって理論的に計算した。具体的に、スモルコフスキの液相における溶質の凝固モデル（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）の一部を用いて分離状態のＨ１及びＨ２の衝突頻度を計算し、中心となる一つの粒子に向かってブラウン運動（Ｂｒｏｗｎｉａｎ ｍｏｔｉｏｎ）によって分散される粒子の個数を考慮し、フィックの法則（Ｆｉｃｋ’ｌａｗ）により、半径がｒである全ての中心粒子を囲んでいる粒子を通過して結局に中心粒子に到達する一つの粒子のフラックス（ｆｌｕｘ）、すなわち、中心粒子との衝突頻度を、下記式２で示すことができる。
[数２]
Ｆ＝４πＲＤυ０
（Ｆ：フラックス（ｆｌｕｘ）；Ｄ：拡散係数（ｄｉｆｆｕｓｉｖｉｔｙ）；Ｒ：２粒子の中心間の距離；及びυ０：バルク（ｂｕｌｋ）濃度）
Ｆ＝４πＲＤυ０
（Ｆ：フラックス（ｆｌｕｘ）；Ｄ：拡散係数（ｄｉｆｆｕｓｉｖｉｔｙ）；Ｒ：２粒子の中心間の距離；及びυ０：バルク（ｂｕｌｋ）濃度）
ここで、衝突する粒子の半径が同一であるとすれば、ストークス－アインシュタイン方程式（Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ）により、拡散係数を下記式３で示すことができる。
［数３］
Ｄ＝２ＫＢＴ／３πηＲ
（ｋＢ：ボルツマン定数；及びη：溶液の粘度）
Ｄ＝２ＫＢＴ／３πηＲ
（ｋＢ：ボルツマン定数；及びη：溶液の粘度）
前記式３を式２に代入し、溶液の粘度を実験条件によって７５９．８７３μＰａ・ｓと仮定すれば、分離状態のＨ１及びＨ２の衝突頻度は、２７１０ｓ－１と計算される。これを、前記実施例４のｏｘＤＮＡシミュレーション分析から類推された各ＤＮＡナノ構造体Ｈ１、Ｈ２モチーフの分子内反応の衝突頻度と比較した結果、分離状態のＨ１及びＨ２は、分子間衝突頻度が図１（ａ）におけるように１つのｍｉＲ－２１に対して２回起きたが、Ｄ－ＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡ及びＨ－ＤＮＡの反応過程で起きる１回の分子内反応では、衝突頻度が分離状態のＨ１及びＨ２の分子間反応の衝突頻度に比べて少なくは５倍、多くは５００倍以上大きいことが見られた。このことから、分離状態のＨ１及びＨ２に比べて、Ｈ１及びＨ２モチーフがＤＮＡナノ構造体に集約されている本発明の構造体プローブシステムの高い反応性が確認できた（図８）。すなわち、増大した診断感度が、構造体内に集約されたプローブ配列によるものであることが分かる。
２つのヘアピン構造を有するモチーフであるＨ１及びＨ２は、等温鎖置換反応によりｍｉＲ－２１が検出でき、２種のモチーフが関与することにより、ｍｉＲ－２１は検出プローブと分離、再利用が可能であり、これは、検出シグナルの増幅を可能にし、その過程でプローブとｍｉＲ－２１との間には２回の分子間反応が起きた（図１（ａ））。２モチーフであるＨ１及びＨ２が二本鎖構造に集約されることにより、分離されたＨ１及びＨ２の分子間反応２がより即時的に且つ速く分子内反応に変わり（図１（ｂ））、分離状態だったＨ１及びＨ２はＤＮＡナノ構造体への集約によって各モーティブ間の衝突頻度が増加し、これによって、プローブシステムの反応性が増加した（図１（ｃ））。
本発明の核酸ナノ構造体は、プローブ配列を局地的に集約させた構造により、単純拡散による分子間衝突／反応段階の一部を核酸構造体内部の速い反応に切り替えることができ、構造的柔軟性を用いた核酸構造体内信号増幅機序を速く活性化させることによって標的核酸に対する検出能力を増進させ、検出能力を向上させ、よって、標的核酸に対する最終検出限界を効果的に下げることができる。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述してきたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施の態様であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
Claims (19)
- ヘアピン構造を有するプローブ対を含む、ターゲット核酸を検出するための核酸ナノ構造体であって、
前記プローブ対のそれぞれのプローブは構造体核酸と連結されてプローブ－構造体鎖をそれぞれ形成し、
前記構造体核酸は互いに相補的な配列を含み、そして互いにハイブリダイズすることによって核酸ナノ構造体を形成し、
前記プローブ対の１つは、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を含むヌクレオチドを含み、
前記プローブ対の１つのプローブがターゲット核酸と結合する場合、前記プローブは分子内反応によって前記プローブ対の他のプローブのヘアピン構造と相補的に結合する、
核酸ナノ構造体。 - 前記構造体核酸の３’末端にプローブが連結されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸ナノ構造体。
- 以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の核酸ナノ構造体：
（ｉ）１対のプローブを含む核酸ナノ構造体；
（ｉｉ）２対のプローブを含む核酸ナノ構造体；及び
（ｉｉｉ）３対のプローブを含む核酸ナノ構造体。 - 前記１対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、直線形の両端にプローブ対の各一本鎖プローブを含むダイマー型（Ｄ型）構造体であって、第１プローブ－第１構造体鎖及び第２プローブ－第２構造体鎖で構成されており、互いに相補的な配列を有する第１構造体鎖と第２構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項３に記載の核酸ナノ構造体。
- 前記１対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、３個の二本鎖腕のうち２個の腕の端にプローブ対の各一本鎖プローブを含むＹ型構造体であって、
第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖、及び第２プローブ－第３構造体鎖で構成されており、
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖、及び第２プローブ－第３構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項３に記載の核酸ナノ構造体。 - 前記１対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、十字型の４個の二本鎖腕のうち２個の腕の端にプローブ対の各一本鎖プローブを含む２腕テトラマー（２－Ａｒｍ Ｔｅｔｒａｍｅｒ）構造体であって、
第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖、第３構造体鎖、及び第２プローブ－第４構造体鎖で構成されており、
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第４構造体核酸は、第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２構造体鎖、第３構造体鎖、及び第２プローブ－第４構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項３に記載の核酸ナノ構造体。 - 前記２対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、４個の二本鎖腕の端に２対のプローブの各一本鎖プローブを含むテトラマー型（Ｔ型）構造体であって、
第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖、及び第２プローブ－第４構造体鎖で構成されており、
第１構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第４構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖、及び第２プローブ－第４構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項３に記載の核酸ナノ構造体。 - 前記３対のプローブを含む核酸ナノ構造体はプローブ対の各一本鎖プローブを交互に６個の二本鎖腕の端に含むヘキサマー型（Ｈ型）構造体であって、
第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖、第２プローブ－第４構造体鎖、第１プローブ－第５構造体鎖、及び第２プローブ－第６構造体鎖で構成されており、
第１構造体核酸は、第２構造体核酸と相補的な配列及び第６構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第２構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第３構造体核酸は、第２構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第４構造体核酸は、第３構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第５構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第５構造体核酸は、第４構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第６構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第６構造体核酸は、第１構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第５構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、前記第１プローブ－第１構造体鎖、第２プローブ－第２構造体鎖、第１プローブ－第３構造体鎖、第２プローブ－第４構造体鎖、第１プローブ－第５構造体鎖、及び第２プローブ－第６構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項３に記載の核酸ナノ構造体。 - 核酸ナノ構造体の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ及びＲＮＡである、請求項１に記載の核酸ナノ構造体。
- ５’末端又は３’末端に消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を含み、３’末端又は５’末端に
蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を含む、請求項１に記載の核酸ナノ構造体。 - 請求項１に記載の核酸ナノ構造体を含むターゲット核酸検出用組成物。
- 請求項１１に記載の核酸検出用組成物を含む診断キット。
- 次の段階を含む核酸ナノ構造体の製造方法：
（ａ）ヘアピン構造を有するプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結され、前記プローブ対のプローブはターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列及び互いに相補的な配列を含む、プローブ－構造体鎖を作製する段階；及び
（ｂ）前記プローブ－構造体鎖を互いにアニールさせ、核酸ナノ構造体を得る段階。 - （ａ）段階において、プローブ－構造体鎖は、９５℃から４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールしてプローブと構造体核酸とを連結することを特徴とする、請求項１３に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- （ｂ）段階において、プローブ－構造体鎖の濃度をそれぞれ５００～７００ｎＭとし、４０～４５℃で３～１０分間維持した後、４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールすることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- （ｂ）段階において、プローブ－構造体鎖の濃度をそれぞれ８００～１０００ｎＭとし、４０～４５℃で３～１０分間維持した後、４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールすることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- （ｂ）段階において、プローブ－構造体鎖の濃度をそれぞれ１１００～１３００ｎＭとし、４０～４５℃で３～１０分間維持した後、４℃まで－０．５℃／３０秒の速度でアニールすることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- （ｂ）段階において、プローブ－構造体鎖の濃度をそれぞれ１７００～１９００ｎＭとし、５０～６０℃で３～１０分間維持した後、４℃まで－０．１℃／１４４秒の速度でアニールすることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- 請求項１に記載のナノ構造体又は請求項１１に記載の核酸検出用組成物を用いたターゲット核酸の検出方法。
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