CN103243154A - 一种断端对接式发夹型dna探针构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种断端对接式发夹型DNA探针的构建方法，包括（1）构建断端对接式发夹型DNA探针的主链，其中主链包括依次相连的第一茎序列、环序列、第二茎序列、延长臂序列，其中环序列是与靶序列完全匹配的碱基序列，两茎序列互补结合；（2）构建辅链，辅链是与所述延长臂序列互补结合的单链核酸；在辅链上、与第一茎序列相近的末端修饰有与上述荧光分子或淬灭分子相对应的淬灭分子或荧光分子，（3）结合主、辅链形成荧光－淬灭分子对。本发明克服了中间修饰存在的高技术难度和修饰昂贵的技术缺陷，通过互补双链核酸断端对接，使荧光素和淬灭素紧邻，使荧光共振能量转移(FRET)现象得以变位实现。

Description

一种断端对接式发夹型DNA探针构建方法

本申请为申请日为2011年02月28日、申请号为CN201110047223.X 、名称为"一种断端对接式发夹型DNA探针"的发明专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及生物分子诊断和生物芯片技术领域，具体涉及一种断端对接式发夹型DNA探针的构建方法。 

背景技术

发夹型DNA探针（原始结构又叫分子信标molecular beacon）是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(fluores-cence resonance energy transfer,FRET)现象设计、常温下空间结构上呈茎环结构的一种DNA分子探针。环序列与靶核酸互补；茎由与靶序列无关的互补序列结合构成；两末端分别标记荧光/淬灭分子。荧光FRET现象：常温下发夹探针呈完整茎环结构时（折叠发夹状态），荧光/淬灭分子接触紧密，因淬灭作用荧光信号很弱（抑光态）；当温度升高或环序列与靶序列结合后，茎环打开（展开状态），荧光/淬灭分子对分离，淬灭作用减弱，荧光信号较强（发光态）；温度下降可复原，呈现随温度变化引起的可逆循环：“展开发光态-折叠抑光态”。发夹探针这种折展状态导致“荧光释放-抑制”与温度和靶序列等高度相关。与常规线型核酸探针相比，随结构变化而引起荧光信号显著改变的发夹探针具有明显优势：1.非常的高特异性和灵敏度:发夹探针对单个碱基错配、缺失或插入突变具有更强的检测能力，特别适用于SNP位点（单核苷酸多态性）一类的单碱基改变检测；2.性能稳定可重复使用等。目前常作为游离态探针应用于荧光定量PCR、活体内核酸检测等无固载技术领域。 

生物固载技术指生物分子（如探针等）固定在芯片、磁珠、微球等载体表面作识别探针的技术，核心是探针分子。发夹探针素有“光开关”之称，折-展状态与靶环单碱基匹配程度高度关联，设计严密的发夹靶环错一个碱基也不能打开茎环，因此特别适用于单硷基位点检测。但长久以来受结构限制（探针两末端分别修饰荧光-淬灭分子对而占用，缺少一个连接臂固定在载体表面），常为游离状态的发夹探针在芯片在固载表面的固定难题一直制约着其在生物固载领域的运用，并严重影响其优越性能发挥。为解决固定难题，按常规思路需要加一条连接臂与载体连接，环不能动，国内外学者只能在探针的茎臂上修饰，这也是目前的主研方向。茎臂修饰的发夹探针（国内外报道最多见）是茎臂修饰生物素方式：生物素（biotin）修饰到探针茎臂，亲和素（avidin）固定到芯片表面，通过biotin-avidin结合力固定，问题：1，发夹探针茎臂修饰有很高技术难度。2，茎臂修饰生物素的游离态发夹探针与芯片表面亲和素结合无特异性: 难以应用检测多分子，国外有少量研究报道目前主要限于单分子检测。另一种中间修饰方式：茎臂单侧延长末端修饰固定﹑与互补链荧光素对应中间位置修饰淬灭分子以达到荧光淬灭效应。但仍然存在两个问题：1，发夹探针的茎臂中间修饰淬灭素分子仍然存在较高技术难度和较高的修饰合成成本；2，中间标记对荧光分子（或淬灭分子）本身具有高选择性，许多性能优良的常用荧光分子由于技术原因无法中间修饰，从而影响到使用。以上“茎臂修饰”（即中间修饰）都存在较高技术难度和修饰昂贵等痼疾；第二种还存在只能标记高选择性荧光/淬灭分子问题。 

核心问题是解决发夹探针在固载表面的固定难题。我们对问题进行了深入剖析：荧光-淬灭分子对的距离远近引起的荧光共振能量转移(FRET)现象是发夹探针诸多优势的原始技术来源，因此设计原则上离不开荧光/淬灭这两个分子对，而要固定到固载支持物表面就必须还要接一个连接分子（如生物素/氨基/巯基等）。发夹探针展开后是一条完整的单链核酸（一般30-40bp），只有两个末端（3′、5′端）；而荧光分子、淬灭分子、连接分子，这三个必须分开的大分子按照常规思路设计是无论如何也不能同时放到两端的，如果两末端分别修饰荧光/淬灭分子而占用，必然有第三个分子被“挤”在被占用的探针两末端以外，这就是造成国内外在该领域研究中必须要涉及核酸单链中间修饰的根本原因。这也是长期以来引起发夹探针固定难题及其运用的根本原因。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：避开“单链核酸中间修饰”这个常规思路设计而提出一种DNA探针构建方法，依照该方法构建的DNA探针能保证无靶序列存在时荧光－淬灭分子对紧邻（无荧光）、有靶序列存在并杂交后分离（发出荧光），即保证荧光FRET现象前题下，把“荧光分子、淬灭分子、连接分子”三者放到发夹探针上，更充分发挥发夹型DNA探针的优势。 

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案： 

一种断端对接式发夹型DNA探针构建方法，包括以下步骤：

（１）构建断端对接式发夹型DNA探针的主链，包括依次相连的第一茎序列、环序列、第二茎序列、延长臂序列，其中环序列是与靶序列完全匹配的碱基序列，两茎序列碱基互补且互补结合；

第一茎序列的一端与环序列相连，另一端修饰荧光分子或淬灭分子，延长臂序列的一端与第二茎序列相连，另一端修饰用于与生物载体表面相固定的固定基团；

（2）构建断端对接式发夹型DNA探针的辅链，是与所述延长臂序列完全碱基互补的单链核酸；将辅链的预设相近末端修饰与步骤（1）中的荧光分子或淬灭分子相对应的淬灭分子或荧光分子；（所述预设相近末端，即根据碱基配对原则，主、辅链互补结合后辅链两末端中将与第一茎序列相近的一端。）

（3）将上述主、辅链互补结合，最后用软件验证生成物的发夹结构，并经genbank比对，验证合格后即完成断端对接式发夹型DNA探针。

应用本发明的构建方法，所形成产物结构如下：断端对接式发夹型DNA探针，包括主链与辅链；其中主链包括依次相连的第一茎序列、环序列、第二茎序列、延长臂序列，其中环序列是与靶序列完全匹配的碱基序列，第一、二茎序列碱基互补且互补结合；第一茎序列的一端与环序列相连，另一端修饰有荧光分子或淬灭分子，延长臂序列的一端与第二茎序列相连，另一端修饰有用于与生物载体表面相固定的固定基团； 

辅链是与所述延长臂序列碱基互补且互补结合的单链核酸，在辅链上、与第一茎序列相近的末端修饰有与上述荧光分子或淬灭分子相对应的淬灭分子或荧光分子，主、辅链结合形成荧光－淬灭分子对。

进一步，所述生物载体包括生物分子固定化基片、壳聚糖。 

进一步，所述固定基团包括氨基基团。 

上述断端对接式发夹型DNA探针，探针分为由主链和辅链两段，主链呈带延长臂的发夹结构，延长臂末端修饰氨基等常规固定基团以方便固定在芯片、磁珠、壳聚糖等生物载体表面，以常规成熟方式完成固定过程，第一茎序列末端按常规方式修饰荧光分子；辅链呈一短片段的单链核酸，根据碱基配对辅链上预设与第一茎序列相近的末端按常规方式修饰与主链修饰的荧光分子或淬灭分子相对应的淬灭分子或荧光分子。辅链序列与主链的延长臂序列碱基互补，主、辅链互补结合后，辅链末端的淬灭分子或荧光分子与主链末端的荧光分子或淬灭分子正好断端对接紧密靠近，形成具有荧光FRET现象的荧光－淬灭分子对。 

应用本发明构建方法所形成的断接式发夹探针，在其使用时，主链延长臂末端修饰氨基等常规固定基团固定在芯片、磁珠等生物载体表面，辅链与主链延长臂互补形成双链，辅链末端的淬灭分子或荧光分子与主链茎序列末端的荧光分子或淬灭分子正好断端对接紧密靠近，形成荧光－淬灭分子对的完整结构而具有显著的淬灭作用。当有靶序列存在时，与互补的主链环序列杂交结合拉开主链的茎结构，从而使断端对接的荧光－淬灭分子对分开，发生荧光FRET现象：淬灭作用消失，在激发光照射下发出荧光，从而检测到靶序列的存在；没有靶序列时，则探针结构完整检测不到荧光。 

应用本发明构建方法所形成的发夹型DNA探针相比于现有的发夹型DNA探针技术，具有以下有益效果及优点： 

（1）合成技术难度低，易于实现。无论是主链两末端修饰荧光分子和固定基团（即所述的连接分子），还是辅助链末端修饰淬灭分子，都是成熟的末端标记（修饰）常规技术，没有任何一点困难也没有合成成本提高的问题，通过巧妙设计的互补双链核酸断端对接，使荧光素和淬灭素紧密接触，使传统发夹型DNA探针的技术核心——荧光共振能量转移(FRET)现象得以变位实现。当靶分子与探针杂交结合后茎环结构打开，荧光分子远离淬灭分子而发出荧光。

（2）避开了传统设计最主要的技术难点：发夹探针茎臂中间修饰技术难。 

（3）该探针在设计使用上具有较好的适用性。如在针对高通量多分子检测时要设计相应的高通量探针群，设计者只需专注设计主链环序列的杂交特异性，其余如主链茎结构及单侧延长臂序列、辅助链序列均只使用一种设计，并可通用于所有的高通量探针群，减化了设计难度。 

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明： 

图1本发明方法构建的断端对接式发夹型DNA探针结构示意图。

图2本发明方法构建的断端对接式发夹型DNA探针使用性能示意图。 

图3本发明方法构建的断接式发夹型DNA探针实际检测结核基因片段结果 

具体实施方式   

实施例1  本发明方法所构建的探针

图1、图2是本发明方法构建的断端对接式发夹型DNA探针结构和使用性能示意图，是针对如该图2中所示的靶序列所构建，由图2可见，主链（A链）延长臂末端修饰氨基等常规固定基团固定在芯片、壳聚糖、磁珠等生物载体表面，辅链（B链）与主链（A链）延长臂下段互补形成双链，辅链（B链）末端的淬灭分子与主链（A链）茎序列末端的荧光分子正好断端对接紧密靠近，形成荧光-淬灭分子对的完整结构而具有显著的淬灭作用。当有靶序列存在时，与互补的主链（A链）环序列杂交结合拉开主链（A链）的茎结构，从而使断端对接的荧光-淬灭分子对分开，发生荧光FRET现象：淬灭作用消失，在激发光照射下发出荧光，从而检测到靶序列的存在；没有靶序列时，则探针结构完整检测不到荧光。

实施例2  灵敏性试验 

以不同浓度靶序列做灵敏性试验，先观察第一组：10mg/L、5mg/L、1mg/L；第二组：500ug/L、100ug/L、10ug/L、1ug/L；、第三组：500pg/L、100pg/L、10pg/L、1pg/L等不同浓度组别靶序列与预先设计好的断接式发夹探针杂交后，在芯片扫描仪上观测荧光强度，确定检测的最低浓度组别单位（mg\ug\pg）,再往下作某一浓度组别单位的精确浓度灵敏性试验，如pg级：500pg/L、400pg/L、300pg/L、100pg/L、50pg/L、40pg/L、30pg/L、20pg/L、10pg/L…

试验结果：

在芯片扫描仪上观测荧光强度：最低浓度与阴性对照荧光具有明显区别。（一般以阳性荧光/阴性荧光≥1.5为判断标准）说明本发明的方法构建的探针具有高灵敏性。

实施例3  特异性试验 

预先设计好靶序列及对应断接式发夹探针，另外设计合成10条与预先设计好的靶序列及断接式发夹探针无关的干扰序列（经比对证明不能杂交结合），在杂交条件固定情况下分别与特异性断接式发夹探针杂交，在芯片扫描仪上观测荧光，比较特异性靶序列和无关干扰序列与特异探针杂交的荧光信号强弱。试验结果：特异性靶序列与特异性断接式发夹探针杂交荧光信号强，而无关干扰序列与特异探针无杂交荧光背境信号弱。说明断接式发夹探针能特异性检测特异靶序列。

实施例4  本发明的探针能进行大规模检测的试验 

预先设计好针对某病原体（如结核分支杆菌TB）特异片段的靶序列及对应断接式发夹探针，收集临床相应某病原菌标本（如TB）若干（＞400份），标本处理后分别与对应探针杂交，观察杂交的荧光信号，设阴性对照，从而证明该探针能大规模进行临床检测。

芯片表面高密度点样，一份样本双份点样，统一设阴性对照，杂交冲洗后，荧光扫描仪下扫描，以阳性荧光/阴性荧光≥1.5为判断标准（以仪器软件分析）。 

实施例5  本发明的断接式发夹探针设计方法及其在对结核杆菌基因检测上的应用 

步骤一：针对结核杆菌保守序列IS986通过软件Primer 5.0设计靶序列

（1）下表中间为扩增目标产物为245bp（加粗），两端为扩增引物（字下加线表示）

Primer1: 5’-CGTGAGGGATCGAGGTGGC-3’

Primer2: 5’-GCGTAGGCTCGGTGACAAA-3’

ccgcgagggc cccgatggtt tgcggtgggg tgtcgagtcg atctgcacac agctgaccga

gctgggtgtg ccgatcgccc catcgaccta ctacgaccac atcaaccggg agcccagccg

ccgcgagctg cgcgatggcg aactcaagga gcacatcagc cgcgtccacg ccgccaacta

cggtgtttac ggtgcccgca aagtgtggct aaccctgaac cgtgagggca tcgaggtggc

cagatgcacc gtcgaacggc tgatgaccaa actcggcctg tccgggacca cccgcggcaa

agcccgcagg accacgatcg ctgatccggc cacagcccgt cccgccgatc tcg tccagcg

ccgcttcgga ccaccagc ac ctaaccggct gtgggtagca gacctcacct atgtgtcgac

ctgggcaggg ttcgcctacg tggcctttgt caccgacgcc tacgctcg ca ggatcctggg

ctggcgggtc gcttccacga tggccacctc catggtcctc gacgcgatcg agcaagccat

ctggacccgc caacaagaag gcgtactcga cctgaaagac gttatccacc atacggatag

（2）针对中间245bp扩增产物通过软件（Beacon Designer）设计靶序列：

上表774-797中斜体文字表示：

5’-tccagcg ccgcttcgga ccaccag-3’

步骤二：设计主链（A链）环碱基序列：即以上靶序列的对应互补序列：

5’-CTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGA-3’

步骤三：设计主链（A链）两个互补的短链碱基序列构成茎结构：

5’- GAGCTC-3’

步骤四：设计主链（A链）延长臂碱基序列

5’- GTTTTTTTTTTTTTTC-3’

步骤五：设计辅链（B链）碱基序列

5’- CAAAAAAAAAAAAAAG-3’

步骤六：按以下方案设计：

修饰FAM到主链（A链）一侧茎结构3’：

5’- GAGCTC-3’—FAM；

修饰氨基到主链（A链）长链延长臂下段碱基序列5’端：

氨基—5’- GTTTTTTTTTTTTTTC-3’

修饰DABCYL到辅链（B链）碱基序列5’端：

DABCYL—5’-GAAAAAAAAAAAAAAC-3’

步骤七：按上述设计在DNA合成仪上（如ABI394高通量DNA合成仪）合成针对结核杆菌保守序列IS986的主链（A链）和辅链（B链）构成的断接式发夹探针，并经genebank和DNA star软件证实并保证特异性。

        结核杆菌保守序列IS986断接式发夹探针： 

主链（A链）:

氨基-5’-GTTTTTTTTTTTTTTCGAGCTCCTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGAGAGCTC-3’ -FAM

辅链（B链）:DABCYL—5’-GAAAAAAAAAAAAAAC-3’

步骤八：然后按芯片实验的常规方法进行固定、扩增、纯化、杂交、芯片冲洗扫描和进行荧光信号数据分析。

分析结果见图3，由图3可见阳性荧光信号较之阴性信号区别非常明显，说明该发明的断接式发夹探针效果非常明显，完全能够投入芯片等固载领域实际应用。 

对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，如主链茎序列末端可修饰荧光分子，还可修饰淬灭分子（视选定的第一茎序列是位于5’还是3’而定），辅链末端则是修饰对应的淬灭分子或荧光分子；对于淬灭分子、荧光分子、固定基团（连接分子）类型的具体选择，本发明不作具体限定，凡本领域技术人员所知淬灭分子、荧光分子，在不影响本发明技术效果的前提下，均可应用；这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。 

Claims (1)

1.一种断端对接式发夹型DNA探针构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（１）构建断端对接式发夹型DNA探针的主链，包括依次相连的第一茎序列、环序列、第二茎序列、延长臂序列，其中环序列是与靶序列完全匹配的碱基序列，两茎序列碱基互补且互补结合；

第一茎序列的一端与环序列相连，另一端修饰荧光分子或淬灭分子，延长臂序列的一端与第二茎序列相连，另一端修饰用于与生物载体表面相固定的固定基团；

（2）构建断端对接式发夹型DNA探针的辅链，是与所述延长臂序列完全碱基互补的单链核酸；将辅链的预设相近末端修饰与步骤（1）中的荧光分子或淬灭分子相对应的淬灭分子或荧光分子； 

（3）将上述主、辅链互补结合，最后用软件验证生成物的发夹结构，并经genbank比对，验证合格后即完成断端对接式发夹型DNA探针。

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