KR20210097176A - 이마티닙에 대한 압타머 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특히 이마티닙에 특이적으로 결합하는 압타머 및 그 사용 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 구체적으로 이마티닙에 특이적으로 결합하는 압타머 및 그 사용 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시 양태는 본원에 기재된 압타머를 사용하여 샘플에서 이마티닙의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 방법에 관한 것이다.
2-페닐 아미노 피리미딘 유도체인 이마티닙은 ABL, BCR-ABL, PDGFRA 및 c-KIT에 대해 활성을 갖는 티로신 키나제 억제제이다. 이마티닙은 이러한 표적의 ATP 결합 부위 근처에 결합하여 효소 활성 및 종양 발생을 촉진하는 다운 스트림 신호 전달 경로를 억제한다.
이마티닙은 암, 특히 백혈병이나 혈액 질환을 치료하는 데 사용되는 경구 표적 요법이다. 예를 들어, 이마티닙은 만성 골수성 백혈병(CML) 치료의 1차 요법으로 사용된다. 약동학 연구에 따르면, 신진 대사의 변화, 불량한 순응도 또는 약물-약물 상호작용으로 인해 이마티닙의 최저 농도에서 상당한 가변성이 있음을 알 수 있다. 이마티닙의 혈장 수준은 치료에 대한 반응과 관련있기 때문에 약물의 치료 수준을 모니터링(및 필요한 목표 수준으로 조정)하는 것은 효능을 높이고 독성을 최소화하는데 유용할 것이다.
이마티닙은 저-분자량 약물(C29H31N7O, 평균 분자량 493.6027 Da)로서, 이는 이 약물의 대사 산물과 교차-반응하지 않는 특정 항체를 사용하여 면역분석법을 개발하려는 노력에 방해 요소이다. 예를 들어, 소분자는 친화성 시약에 대해서는 표적으로서 매우 불량하다. 일반적으로, 소분자는 매우 적은 수의 작용기를 특징으로 하기에 친화성 시약은 이러한 기질에 특이적으로 결합하기가 어렵다. 더욱이, 소분자는 독성 문제 및/또는 면역원성 부족의 문제를 가질 수 있다. 이러한 문제에도 불구하고, 밀접하게 관련된 화합물 또는 약물 대사산물과의 교차 반응없이 이마티닙 및 이의 약리학적 활성 염에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 분석 플랫폼에 더 간단하고 쉽게 적응할 수 있고, 생산에 더 신뢰할 수 있으며, 한 쌍의 친화성 리간드에 의존하지 않고 신호-획득 판독('gain-of-signal' readout)을 제공하는 제제를 개발해야 할 필요성이 남아 있다.
CML 환자의 혈청에서 이마티닙 수준은 질량 분석법 또는 자외선 분광 광도 검출법과 결합된 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 기술을 사용하여 평가되어 왔다(Micova et al. Clin Chim Acta. 2010; 411; 1957-62). 그러나 이러한 기술은 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리며 전문적인 실험실, 값비싼 장비, 및 생물학적 물질, 용매 및 기타 물질의 과도한 사용을 필요로 한다.
이마티닙의 경우, 몇 가지 항체 기반 테스트가 개발되었지만, 이들 모두는 소분자 표적 면역분석과 관련된 동일한 한계가 있다. 이들은 한 쌍의 항체(분리하기 어렵고 생산 비용이 많이들 수 있음)에 의존하거나 '신호 손실' 출력('loss-of-signal' output)을 사용하는 경쟁 분석(competitive assay) 형식에 의존한다. 이러한 특성의 경쟁 분석은 높은 배경 신호와 감도 부족의 경향이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일부 구현예의 목적은 생산에 더 신뢰할 수 있고 한 쌍의 친화성 리간드에 의존하지 않으며 항체 기반 테스트와 비교하여 신호-획득 판독 값을 제공하는 검출 제제를 개발함으로써 선행 기술에서 확인된 일부 문제를 적어도 부분적으로 완화시키는 것이다.
본 발명의 특정
구현예의
요약
본 발명은 이마티닙 결합 압타머의 개발 및 그 사용 방법에 관한 것이다.
본원에 기술된 압타머는 효과적으로 작동하고 간단한 신호-획득 분석 형식을 사용하여 샘플에서 이마티닙의 존재, 부재 또는 양을 시험하는 간단한 수단을 제공하는 것으로 나타났다. 특히, 본원에 기재된 압타머는 높은 친화도로 이마티닙에 결합할 수 있다. 본원에 기술된 압타머에 의해서 임상 범위의 활성 이마티닙(즉, 1μM 미만)이 생물학적 유체에서 검출가능하다.
따라서, 본 발명의 특정 측면은 특히:
- 하기 구성을 포함하거나 이로 이루어진, 이마티닙에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머:
(a) 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나에서 선택된 핵산 서열;
(b) 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나와 적어도 85% 동일성을 갖는 핵산 서열;
(c) 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나의 약 30개 이상의 연속 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열; 또는
(d) 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열의 약 30개 이상의 연속 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열;
- 본원에 기술된 압타머와 이마티닙에 대한 결합에 대해 경쟁하는 압타머;
- 본원에 기재된 임의의 압타머 및 검출가능한 분자를 포함하는 복합체;
- 본원에 기재된 임의의 압타머를 포함하는 바이오센서 또는 검사 스트립;
- 샘플에서 이마티닙의 존재, 부재 또는 수준을 검출하기 위한 장치로서, 하기 구성:
(i) 지지체(support); 및
(ii) 본원에 기재된 임의의 압타머
를 포함하는 장치;
- 이마티닙을 검출, 농축, 분리 및/또는 단리하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 압타머, 복합체, 바이오센서, 검사 스트립 및/또는 장치의 사용;
- 샘플에서 이마티닙의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 방법으로서,
(i) 샘플을 본원에 기술된 임의의 압타머와 상호작용시키는 단계; 및
(ii) 이마티닙의 존재, 부재 또는 양 검출하는 단계
를 포함하는 방법;
- 개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
(i) 이마티닙의 초기 용량을 개체에게 투여하는 단계,
(ii) 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 개체로부터 수득된 샘플에서 이마티닙의 양을 검출하는 단계; 및
(iii)
(a) 이마티닙 수준이 하위 역치 수준 미만인 경우, 증가된 용량의 이마티닙을 개체에게 투여하는 단계, 또는
(b) 이마티닙의 수준이 상위 역치 수준을 초과하는 경우, 감소된 용량의 이마티닙을 개체에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법;
- 이마티닙을 검출 및/또는 정량하기 위한 키트로서, 상기 키트는 본원에 기재된 임의의 압타머를 포함하는 키트
를 제공하는 것이다.
본 발명의 특정 실시예는 첨부된 도면을 참조하여 아래에서 더 상세히 설명될 것이다:
도 1은 이마티닙(A-압타머 1(Ima-C5) B-압타머 2(Ima-E8))에 대한 압타머의 예측된 2차원 구조를 보여준다. 2차원 구조는 Mfold [핵산 폴딩 및 혼성화 예측을 위한 Zuker, M.(2003) Mfold 웹 서버. Nucleic Acid Res.31(13), 3406-15]를 사용하여 결정되었다. 고정화 올리고뉴클레오티드의 결합 부위는 녹색으로 강조 표시된다.
도 2는 압타머 라이브러리가 풍부해짐에 따라 연속적인 선택 라운드에서 회수된 압타머로부터의 형광의 점진적인 증가를 보여준다. 10 라운드 후, 표적 특정 다 클론 집단이 분리되었다.
도 3은 타겟에 대한 압타머 결합을 모니터링하고, 가장 성능이 좋은 압타머 클론을 식별하며, 동역학 분석에 사용되는 '딥 앤 리드' BLI(Biolayer Interferometry) 분석을 위한 모델 데이터를 보여준다. 이 모델 데이터는 센서 표면에 '압타머의 고정', '세척' 중 새로운 기준선 설정 및 압타머가 그 표적에 결합함과 센서 표면으로부터 '분리'됨에 따른 신호의 후속적인 감소를 보여준다.
도 4는 BLI 분석을 사용하여 모니터링한 다클론성 압타머 집단의 결합을 보여준다. 이 데이터는 도 3에서 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만 표시하며 소프트웨어 Steady State Analysis 알고리즘을 사용할 수 있도록 배경을 빼고 '뒤집었다(flipped). BLI 분석은 출발 라이브러리(파란색)와 비교하여, 선택된 압타머 집단의 선택 표적 이마티닙(빨간색) 및 그 주요 대사산물 N-데스메틸 이마티닙(녹색)에 대한 결합에서 개선이 있음을 보여준다.
도 5는 최고 성능의 단일클론 압타머의 '적중 선택(hit picking)'에 사용된 BLI 분석 데이터를 보여준다. 이 데이터는 도 3에 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만을 표시하고, 배경을 빼고 '뒤집었다'. 그 결과는 다른 스크리닝된 서열에 비해 이마티닙에 대한 결합이 개선된 압타머가 동정됨을 보여준다. 2개의 압타머는 10 라운드 선택으로부터의 다른 농축 압타머 집단에 비해 이마티닙에 대해 높은 친화성을 갖는다.
도 6은 압타머 특이성을 결정하기 위한 비교 결합 연구를 보여준다. 압타머 1(Ima-C5) 및 압타머 2(Ima-C8)는 선택 라운드 10에서 출발 라이브러리 및 농축 압타머 집단 모두에 비해 이마티닙(빨간색 트레이스) 및 이의 주요 대사 산물(녹색 트레이스)에 대한 향상된 결합을 나타냈다. 다른 시험된 분자들(구조적 및 기능적 관련)은 결합되지 않았다(파란색 및 보라색 트레이스). 특이성 연구는 도 3에 설명된 BLI 분석을 사용하여 수행되었다. 이 데이터는 도 3에 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만 표시하며 배경을 빼고 '뒤집었다'.
도 7은 농도 의존적 방식으로 표적 이마티닙에 결합하는 압타머 Ima C5를 보여준다. 이마티닙 상호작용은 압타머 Ima C5가 Biacore 기기의 센서 칩에 고정되는 직접 결합 분석을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 모니터링되었다. 이는 이마티닙의 농도 구배와 상호작용했다. 친화성 상수(KD value)는 로컬 R1 매개 변수가 있는 1:1 결합 Langmuir 결합 모델과 함께 Biacore Insight 평가 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 압타머 1의 이마티닙에 대한 친화도(PBS6에서)는 1.10 × 10-7 M(110 nM)으로 계산되었다.
도 8은 완충된 인간 혈장에서 표적에 결합하는 ELISA-유사 분석 형식에서 압타머 1의 사용을 보여준다. 최고 성능의 압타머(압타머 1)의 기능은 마이크로타이터 플레이트-기반 압타머 변위 분석(형광 분석)을 사용하여 입증되었다. 선택된 압타머는 혈장 단독에 대한 최소한의 배경 결합으로, 상이한 농도의 인간 혈장의 존재하에 표적 이마티닙에 대한 강한 농도 의존적 결합(신호-획득 반응을 유도함)을 나타낸다. 이마티닙의 치료 범위를 반영하는 목표 농도에서 분석을 수행했다.
도 9는 압타머 1의 최소 유효 단편을 확인하는데 사용된 BLI 변위 분석 결합 연구를 보여준다. 절단된 버전의 압타머 1 패널을 표적 이마티닙(PBS6에서 10μM)에 대한 결합에 대해 테스트했다. 압타머 1의 가장 작고 가장 성능이 좋은 단편은 본원에서 서열 번호 3(Ima-C5-F6b, 적색 결합 곡선)으로 확인된다. 최소 단편 동정 연구는 도 3에 설명된 BLI 분석을 사용하여 수행되었다. 이 데이터는 도 3에 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만 표시하며 배경을 빼고 '뒤집었다'.
도 10은 농도 의존적 방식으로 표적 이마티닙에 결합하는 압타머 단편 Ima C5-F6b를 보여준다. 이마티닙 상호 작용은 압타머 단편 Ima C5-F6b가 Biacore 기기의 센서 칩에 고정된 직접 결합 분석을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 모니터링되었다. 이는 이마티닙의 농도 구배와 상호작용했다. 친화성 상수(KD value)는 로컬 R1 매개 변수가 있는 1:1 결합 Langmuir 결합 모델과 함께 Biacore Insight 평가 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 압타머 단편 Ima C5-F6b의 이마티닙에 대한 친화도(PBS6에서)는 7.21 × 10-8 M(72.1 nM)으로 계산되었다.
도 11은 압타머 단편 Ima C5-F6b의 특이성을 결정하기 위해 사용된 BLI 기반 변위 분석 결합 연구를 보여준다. 이마티닙(적색, 10μM), 대사산물 N-데스메틸 이마티닙(녹색, 10μM) 및 음성 표적, 이리노테칸(자주색, 10μM)에 대한 압타머 결합을 보여주는 결합 곡선이다. 특이성 연구는 도 3에 설명된 BLI 분석을 사용하여 수행되었다. 이 데이터는 도 3에 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만 표시하며 배경을 빼고 '뒤집었다'.
도 12는 완충된 인간 혈장에서 표적에 결합하는, ELISA-유사 분석 형식에서 압타머 Ima C5-F6b의 사용을 보여준다. Ima C5-F6b의 기능은 마이크로타이터 플레이트-기반 압타머 변위 분석(형광 분석)을 사용하여 시험되었다. 선택된 압타머는 혈장 단독에 대한 최소한의 백그라운드 결합으로, 상이한 농도의 인간 혈장의 존재하에 표적 이마티닙에 대한 강한 농도 의존적 결합(신호-획득 반응을 유도함)을 나타낸다. 이마티닙의 치료 범위를 반영하는 목표 농도에서 테스트를 수행했다.
도 1은 이마티닙(A-압타머 1(Ima-C5) B-압타머 2(Ima-E8))에 대한 압타머의 예측된 2차원 구조를 보여준다. 2차원 구조는 Mfold [핵산 폴딩 및 혼성화 예측을 위한 Zuker, M.(2003) Mfold 웹 서버. Nucleic Acid Res.31(13), 3406-15]를 사용하여 결정되었다. 고정화 올리고뉴클레오티드의 결합 부위는 녹색으로 강조 표시된다.
도 2는 압타머 라이브러리가 풍부해짐에 따라 연속적인 선택 라운드에서 회수된 압타머로부터의 형광의 점진적인 증가를 보여준다. 10 라운드 후, 표적 특정 다 클론 집단이 분리되었다.
도 3은 타겟에 대한 압타머 결합을 모니터링하고, 가장 성능이 좋은 압타머 클론을 식별하며, 동역학 분석에 사용되는 '딥 앤 리드' BLI(Biolayer Interferometry) 분석을 위한 모델 데이터를 보여준다. 이 모델 데이터는 센서 표면에 '압타머의 고정', '세척' 중 새로운 기준선 설정 및 압타머가 그 표적에 결합함과 센서 표면으로부터 '분리'됨에 따른 신호의 후속적인 감소를 보여준다.
도 4는 BLI 분석을 사용하여 모니터링한 다클론성 압타머 집단의 결합을 보여준다. 이 데이터는 도 3에서 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만 표시하며 소프트웨어 Steady State Analysis 알고리즘을 사용할 수 있도록 배경을 빼고 '뒤집었다(flipped). BLI 분석은 출발 라이브러리(파란색)와 비교하여, 선택된 압타머 집단의 선택 표적 이마티닙(빨간색) 및 그 주요 대사산물 N-데스메틸 이마티닙(녹색)에 대한 결합에서 개선이 있음을 보여준다.
도 5는 최고 성능의 단일클론 압타머의 '적중 선택(hit picking)'에 사용된 BLI 분석 데이터를 보여준다. 이 데이터는 도 3에 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만을 표시하고, 배경을 빼고 '뒤집었다'. 그 결과는 다른 스크리닝된 서열에 비해 이마티닙에 대한 결합이 개선된 압타머가 동정됨을 보여준다. 2개의 압타머는 10 라운드 선택으로부터의 다른 농축 압타머 집단에 비해 이마티닙에 대해 높은 친화성을 갖는다.
도 6은 압타머 특이성을 결정하기 위한 비교 결합 연구를 보여준다. 압타머 1(Ima-C5) 및 압타머 2(Ima-C8)는 선택 라운드 10에서 출발 라이브러리 및 농축 압타머 집단 모두에 비해 이마티닙(빨간색 트레이스) 및 이의 주요 대사 산물(녹색 트레이스)에 대한 향상된 결합을 나타냈다. 다른 시험된 분자들(구조적 및 기능적 관련)은 결합되지 않았다(파란색 및 보라색 트레이스). 특이성 연구는 도 3에 설명된 BLI 분석을 사용하여 수행되었다. 이 데이터는 도 3에 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만 표시하며 배경을 빼고 '뒤집었다'.
도 7은 농도 의존적 방식으로 표적 이마티닙에 결합하는 압타머 Ima C5를 보여준다. 이마티닙 상호작용은 압타머 Ima C5가 Biacore 기기의 센서 칩에 고정되는 직접 결합 분석을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 모니터링되었다. 이는 이마티닙의 농도 구배와 상호작용했다. 친화성 상수(KD value)는 로컬 R1 매개 변수가 있는 1:1 결합 Langmuir 결합 모델과 함께 Biacore Insight 평가 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 압타머 1의 이마티닙에 대한 친화도(PBS6에서)는 1.10 × 10-7 M(110 nM)으로 계산되었다.
도 8은 완충된 인간 혈장에서 표적에 결합하는 ELISA-유사 분석 형식에서 압타머 1의 사용을 보여준다. 최고 성능의 압타머(압타머 1)의 기능은 마이크로타이터 플레이트-기반 압타머 변위 분석(형광 분석)을 사용하여 입증되었다. 선택된 압타머는 혈장 단독에 대한 최소한의 배경 결합으로, 상이한 농도의 인간 혈장의 존재하에 표적 이마티닙에 대한 강한 농도 의존적 결합(신호-획득 반응을 유도함)을 나타낸다. 이마티닙의 치료 범위를 반영하는 목표 농도에서 분석을 수행했다.
도 9는 압타머 1의 최소 유효 단편을 확인하는데 사용된 BLI 변위 분석 결합 연구를 보여준다. 절단된 버전의 압타머 1 패널을 표적 이마티닙(PBS6에서 10μM)에 대한 결합에 대해 테스트했다. 압타머 1의 가장 작고 가장 성능이 좋은 단편은 본원에서 서열 번호 3(Ima-C5-F6b, 적색 결합 곡선)으로 확인된다. 최소 단편 동정 연구는 도 3에 설명된 BLI 분석을 사용하여 수행되었다. 이 데이터는 도 3에 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만 표시하며 배경을 빼고 '뒤집었다'.
도 10은 농도 의존적 방식으로 표적 이마티닙에 결합하는 압타머 단편 Ima C5-F6b를 보여준다. 이마티닙 상호 작용은 압타머 단편 Ima C5-F6b가 Biacore 기기의 센서 칩에 고정된 직접 결합 분석을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 모니터링되었다. 이는 이마티닙의 농도 구배와 상호작용했다. 친화성 상수(KD value)는 로컬 R1 매개 변수가 있는 1:1 결합 Langmuir 결합 모델과 함께 Biacore Insight 평가 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 압타머 단편 Ima C5-F6b의 이마티닙에 대한 친화도(PBS6에서)는 7.21 × 10-8 M(72.1 nM)으로 계산되었다.
도 11은 압타머 단편 Ima C5-F6b의 특이성을 결정하기 위해 사용된 BLI 기반 변위 분석 결합 연구를 보여준다. 이마티닙(적색, 10μM), 대사산물 N-데스메틸 이마티닙(녹색, 10μM) 및 음성 표적, 이리노테칸(자주색, 10μM)에 대한 압타머 결합을 보여주는 결합 곡선이다. 특이성 연구는 도 3에 설명된 BLI 분석을 사용하여 수행되었다. 이 데이터는 도 3에 설명된 '표적 결합에 의한 분리'만 표시하며 배경을 빼고 '뒤집었다'.
도 12는 완충된 인간 혈장에서 표적에 결합하는, ELISA-유사 분석 형식에서 압타머 Ima C5-F6b의 사용을 보여준다. Ima C5-F6b의 기능은 마이크로타이터 플레이트-기반 압타머 변위 분석(형광 분석)을 사용하여 시험되었다. 선택된 압타머는 혈장 단독에 대한 최소한의 백그라운드 결합으로, 상이한 농도의 인간 혈장의 존재하에 표적 이마티닙에 대한 강한 농도 의존적 결합(신호-획득 반응을 유도함)을 나타낸다. 이마티닙의 치료 범위를 반영하는 목표 농도에서 테스트를 수행했다.
서열 목록
서열 번호 1: 압타머 1(Ima-C5)의 제1 랜덤화 영역(R1)을 보여준다.
CCCCGCTATG
서열 번호 2: 압타머 1(Ima-C5)의 제2 랜덤화 영역(R2)을 보여준다.
GTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGCGGGGG
서열 번호 3: 압타머 1(Ima-C5)의 최고 성능의 최소 유효 핵산 단편(F6b)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCC
서열 번호 4: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F6a)을 보여준다.
CTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCC
서열 번호 5: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F6c)을 보여준다.
CTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCC
서열 번호 6: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F6d)을 보여준다.
TTTTTCTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCC
서열 번호 7: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F6e)을 보여준다.
CGCTCTTTTTCTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCC
서열 번호 8: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F7a)을 보여준다.
CTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGC
서열 번호 9: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F7b)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGC
서열 번호 10: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F7c)을 보여준다.
CTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGC
서열 번호 11: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F7d)을 보여준다.
TTTTTCTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGC
서열 번호 12: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F7e)을 보여준다.
CGCTCTTTTTCTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGC
서열 번호 13: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F14f)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCC
서열 번호 14: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F14g)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGC
서열 번호 15: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F14h)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGCGGGGG
서열 번호 16: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F14i)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGCGGGGG
서열 번호 17: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F14j)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGCGGGGGGCATT
서열 번호 18: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F14k)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGCGGGGGGCATTGAGGG
서열 번호 19: 전장 Ima-C5와 비교하여 이마티닙에 대한 결합이 개선된 Ima-C5의 핵산 단편(F14l)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGCGGGGGGCATTGAGGGTGACA
서열 번호 20: 압타머 1(Ima-C5)의 핵산 단편(F6)을 보여준다.
ATCCACGCTCTTTTTCTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCC
서열 번호 21: 압타머 1(Ima-C5)의 핵산 단편(F7)을 보여준다.
ATCCACGCTCTTTTTCTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGC
서열 번호 22: 압타머 1(Ima-C5)의 핵산 단편(F8)을 보여준다.
ATCCACGCTCTTTTTCTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGCGGGGG
서열 번호 23: 압타머 1(Ima-C5)의 핵산 단편(F14)을 보여준다.
CCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGCGGGGGGCATTGAGGGTGACATAGG
서열 번호 24: 압타머 1(Ima-C5)의 전체 핵산 서열을 보여준다.
ATCCACGCTCTTTTTCTCCCCCCGCTATGTGAGGCTCGATCGTTCGGTGTGTTTTTAAAGGGTACAGATCCTGGGCGGGGGGCATTGAGGGTGACATAGG
서열 번호 25: 압타머 2(Ima-E8)의 제1 랜덤화 영역(R1)을 보여준다.
GTGGACTAGA
서열 번호 26: 압타머 2(Ima-E8)의 제2 랜덤화 영역(R2)을 보여준다.
TACTTAATCATGTTAAGAGTCCACGTCTTGAGTTGTGGAT
서열 번호 27: 압타머 2(Ima-E8)의 핵산 단편(F10)을 보여준다.
ATCCACGCTCTTTTTCTCCGTGGACTAGATGAGGCTCGATCTACTTAATCATGTTAAGAGTCCACGTCTTGAGTTGTGGATGCATT
서열 번호 28: 압타머 2(Ima-E8)의 핵산 단편(F11)을 보여준다.
ATCCACGCTCTTTTTCTCCGTGGACTAGATGAGGCTCGATCTACTTAATCATGTTAAGAGTCCACGTCTTGAGTTGTGGATGCATTGAGGG
서열 번호 29: 압타머 2(Ima-E8)의 핵산 단편(F12)을 보여준다.
ATCCACGCTCTTTTTCTCCGTGGACTAGATGAGGCTCGATCTACTTAATCATGTTAAGAGTCCACGTCTTGAGTTGTGGATGCATTGAGGGTGACA
서열 번호 30: 압타머 2(Ima-E8)의 전체 핵산 서열을 보여준다.
ATCCACGCTCTTTTTCTCCGTGGACTAGATGAGGCTCGATCTACTTAATCATGTTAAGAGTCCACGTCTTGAGTTGTGGATGCATTGAGGGTGACATAGG
서열 번호 31: 예시적 고정화 영역(I)을 보여준다.
TGAGGCTCGATC
서열 번호 32: 예시적 제1 프라이머 영역(P1)을 보여준다.
ATCCACGCTCTTTTTCTCC
서열 번호 33: 예시적 제2 프라이머 영역(P2)을 보여준다.
GCATTGAGGGTGACATAGG
서열 번호 34: 예시적 고정화 서열을 보여준다.
GATCGAGCCTCA
서열 번호 35: 예시적 역 제2 프라이머 영역(P2)을 보여준다.
CCTATGTCACCCTCAATGC
아래에서 추가로 설명하는 바와 같이, 밑줄이 그어진 서열은 제1 (P1) 및 제2 (P2) 프라이머 부위를 의미하고, 이탤릭체 서열은 압타머의 고정 영역(I)을 의미한다(즉, 고정화 서열의 적어도 일부에 결합할 수 있는 압타머의 핵산 서열)). R1 및 R2는 각각 제1 및 제2 랜덤화 영역을 나타낸다.
상세한 설명
본 발명의 특정 실시예의 추가적 특징이 하기에서 설명된다. 본 발명의 실시예는 달리 지시되지 않는 한, 당업계에서 일하는 기술자의 지식 수준 내에서 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다.
대부분의 일반적인 분자 생물학, 미생물 재조합 DNA 기술 및 면역 기술은 Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2001) Cold Harbor-Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 또는 Ausubel et al., Current protocols in molecule biology (1990) John Wiley and Sons, NY에서 찾을 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., Academic Press; 및 Oxford University Press는 당업자에게 본 명세서에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 SI(Systeme International de Unitese) 허용 양식으로 표시된다. 숫자 범위에는 범위를 정의하는 수치가 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 작성되고, 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 작성된다.
다음에서, 본 발명은 특정 구현예의 비제한적인 예를 통해 보다 상세히 설명될 것이다. 실시예의 실험에서는 오염이 없는 표준 시약 및 버퍼가 사용되었다.
이마티닙
본 발명은 이마티닙에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 제공한다.
이마티닙은 다음과 같은 구조를 가지고 있다:
이마티닙 및 그 염(예: 이마티닙 메실레이트)는 암 치료에 사용된다. 예를 들어, 이마티닙은 필라델피아 염색체 양성(Ph+)인 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 림프구성 백혈병(ALL), 및 특정 유형의 위장관 기질 종양(GIST; gastrointestinal stromal tumors), 전신 비만세포증 및 골수이형성 증후군을 치료하는 데 사용할 수 있다.
일반적으로 이마티닙은 경구로 복용한다. 일반적인 부작용으로는 구토, 설사, 근육통, 두통 및 발진이 있다. 심각한 부작용으로는 체액 저류, 위장 출혈, 골수 억제, 간 문제 및 심부전이 있다.
이마티닙의 바람직한 약리학적 활성 염은 이마티닙 메실레이트이며, 그 구조는 다음과 같다:
본 발명의 압타머는 이마티닙 및/또는 이의 약리학적 활성 염에 특이적으로 결합한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 압타머는 이마티닙 메실레이트에 특이적으로 결합한다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 압타머는 이마티닙의 약리학적 활성 대사산물에 특이적으로 결합한다. 이마티닙의 주요 활성 대사산물인 N-데스메틸 이마티닙는 다음과 같은 구조를 가지고 있다:
N-데스메틸 이마티닙은 이마티닙과 Bcr-ABL 키나제에 대해 동일한 시험관내 효능을 가지며 일반적으로 이마티닙 수준의 10-15%로 혈장에 존재한다. 특정 실시 양태에서, 압타머는 N-데스메틸 이마티닙에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 용어 "이마티닙"은 이마티닙 및/또는 이마티닙 메실레이트 및/또는 N-데스메틸 이마티닙을 포함하는 이의 임의의 약리학적 활성 염 또는 대사산물을 포함하는 것으로 이해된다.
압타머는 이마티닙에 "특이적으로" 결합하고, 이마티닙에 대해 우선적이거나 높은 친화도로 결합하지만 다른 구조적으로 관련된 소분자(예를 들어, Irinotecan)에는 낮은 친화도로만 결합하거나 결합하지 않는 압타머이다.
특정 실시 양태에서, 압타머는 약 1μM 미만, 약 500nM 미만, 약 400nM 미만, 약 300nM 미만, 약 200nM 미만, 약 100nM 미만, 약 90nM 미만, 약 80nM 미만, 약 70nM 이하의 결합 해리 평형 상수(KD)로 이마티닙(및/또는 그의 염)에 결합한다. 압타머의 결합 친화도는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생물층 간섭 측정(Biolayer Interferometry; BLI), 변위 분석 및/또는 정상 상태 분석을 포함하여 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 이마티닙에 특이적으로 결합하지 않는 압타머는 이마티닙에 대해 비-우선적이거나 낮은 친화도로 결합하는 압타머이다. 예를 들어, 이마티닙에 대해 낮은 친화도로만 결합하는(또는 다른 구조적으로 관련된 소분자에 대해 낮은 친화도로 결합하는) 압타머는 약 1μM 초과, 약 2μM 초과, 약 3μM 초과, 약 4μM 초과, 약 5μM 초과 또는 그 이상의 KD를 갖는 압타머일 수 있다.
압타머
본원에 기재된 압타머는 높은 친화성 및 특이성으로 이마티닙에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA, RNA 또는 그의 변형을 포함하는 작은 인공 리간드이다.
본원에 사용된 "압타머", "핵산 분자" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 표적 분자(즉, 이마티닙)에 대해 바람직한 작용을 갖는 비-천연 발생 핵산 분자를 지칭하는데 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 압타머는 DNA 압타머일 수 있다. 예를 들어, 압타머는 단일 가닥 DNA(ssDNA)로부터 형성될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 압타머는 RNA 압타머일 수 있다. 예를 들어, 압타머는 단일 가닥 RNA(ssRNA)로부터 형성될 수 있다. 본 발명의 압타머는 본원에 기재된 변형된 핵산을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 압타머는 표적 결합, 분할(partitioning) 및 표적 결합 서열의 우선적 증폭(preferential amplification of target binding sequences)의 반복 주기를 포함하는, 당업계에 공지된 시험관내 선택의 원리를 사용하여 제조된다.
특정 실시 양태에서, 압타머는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 핵산 분자 라이브러리와 같은 핵산 분자 라이브러리로부터 선택된다. 전형적으로, 압타머는 임의의 선택된 압타머가 나열된 임의의 분석 형식으로 변환하기 위해 거의 또는 전혀 적응을 필요로 하지 않도록 설계된 "범용 압타머 선택 라이브러리"로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, "범용 압타머 선택 라이브러리"는 하기의 기능부를 포함한다: 제1 프라이머 영역, 하나 이상의 고정화 영역, 하나 이상의 랜덤화 영역 및 제2 프라이머 영역.
특정 실시 양태에서, 압타머 라이브러리의 뉴클레오티드 서열은 다음 구조를 갖는다(5'에서 3' 방향으로):
P1-R1-I-R2-P2
여기서 P1은 제1 프라이머 영역이고, R1은 제1 랜덤화 영역이며, I는 고정화 영역이고, R2는 추가 랜덤화 영역이며, P2는 추가 프라이머 영역이고, 여기서 적어도 R1 및/또는 R2 또는 이의 일부는 표적 분자 결합에 관여한다.
일단 선택되면, 압타머는 사용 전에 추가로 변형될 수 있는데, 예를 들어 프라이머 서열 및/또는 표적 결합에 필요하지 않은 랜덤화 또는 고정화 영역의 일부 중 하나 또는 둘 모두를 제거하는 것이다.
전형적으로, 본 발명의 압타머는 고정화 영역(즉, 도킹 서열)을 포함한다. 압타머의 고정화 영역은 "고정화 올리고뉴클레오티드"의 적어도 일부에 걸쳐 혼성화할 수 있다. 전형적으로, 고정화 영역은 고정화 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이다. 전형적으로, 고정화 영역은 약 10개 내지 약 20개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 길이이다.
본원에 사용된 용어 "혼성화하다" 및 "혼성화(hybridisation)"는 통상적인 하이브리드화 조건하에서, 바람직하게는 엄격한 조건하에서 압타머 내의 고정 영역(fixed region)과 '고정화 올리고뉴클레오티드(immobilisation oligonucleotide)' 내의 상보적 서열 사이에 Watson-crick 염기 쌍을 기반으로 하는 상호작용을 형성하는 것을 의미하며, 이는 예를 들어 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3.Ed.(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.에서 기술되어 있다.
당업자는 예를 들어 출발 라이브러리 및/또는 압타머 선택 프로토콜에 따라 압타머의 고정화 영역이 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 다양한 조합의 랜덤 라이브러리는 상업적으로 구입할 수 있다. 특정 구현예에서, 고정화 영역은 서열 번호 31 및/또는 고정화 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 34를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 압타머는 제1 프라이머 영역(예: 5 '말단에서), 제2 프라이머 영역(예: 3' 말단에서) 또는 둘 모두를 포함한다. 프라이머 영역은 라이브러리 및 선택된 압타머의 PCR 증폭을 위한 프라이머 결합 부위 역할을 할 수 있다.
당업자는 예를 들어 출발 라이브러리 및/또는 압타머 선택 프로토콜에 따라 상이한 프라이머 서열이 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 압타머는 서열 번호 32 및/또는 33의 서열을 포함할 수 있다.
제1 프라이머 영역 및/또는 제2 프라이머 영역은 본원에 기술된 바와 같이 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 및/또는 제2 프라이머 영역은 형광성(예: FAM) 표지가 부착될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 제1 및/또는 제2 프라이머 영역의 프라이머는 포스페이트(P04) 표지되어 있다.
본 발명의 압타머는 제1 랜덤화 영역(R1) 및/또는 제2 랜덤화 영역(R2)을 갖는 핵산 분자 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 압타머는 R1 및/또는 R2의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 25의 적어도 일부(예를 들어, 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드 또는 그 이상) 및/또는 서열 번호 2 또는 서열 번호 26의 적어도 일부(예를 들어, 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드 또는 그 이상)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 25의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 2 또는 서열 번호 26 중 적어도 30개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 서열(예를 들어, "Ima-C5" 및/또는 "Ima-E8" 압타머 관련)을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 24 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 서열(예를 들어, "Ima-C5" 압타머 관련)을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 19 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 이들 서열은 전장 Ima-C5에 비해 이마티닙에 대한 결합이 개선된 것으로 나타난 Ima-C5 단편에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3을 포함하거나 이로 구성된다. 이 최소 유효 단편은 본 명세서에서 이마티닙에 대해 가장 우수한 성능의 압타머로 나타났다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 24 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 19 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에 사용된 "서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 상기 서열의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 뉴클레오티드의 백분율을 지칭한다. 핵산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, CLUSTALW 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, % 핵산 서열 동일성 값은 European Bioinformatics Institute 웹 사이트(http://www.ebi.ac.uk)에 있는 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 생성될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 24(전장 Ima-C5) 또는 서열 번호 30(전장 Ima-C8)의 최소 유효 단편을 포함하거나 이로 구성된다. 여기서, "최소 유효 단편"은 전장 압타머의 단편(예를 들어, 그 일부)을 의미하는 것으로 이해된다(예를 들어, 전장 압타머와 비교하여 동일하거나 개선된 친화도로 이마티닙에 결합할 수 있는 서열 번호 24 또는 30의 서열). 최소 유효 단편은 전장 압타머와 이마티닙 결합에 경쟁할 수도 있다(예: 서열 번호 24 또는 서열 번호 30).
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 임의의 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 동일성을 갖는 서열의 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 이러한 맥락에서, 용어 "약"은 일반적으로 언급된 뉴클레오티드 서열 길이에 그 언급된 길이의 10%를 더하거나 뺀 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 24의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열의 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 19의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 동일성 갖는 서열의 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 동일성 갖는 서열의 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나를 포함하는 서열의 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 24 중 어느 하나를 포함하는 서열의 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 19 중 어느 하나를 포함하는 서열의 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3을 포함하는 서열의 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
본 발명의 압타머는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 및/또는 염기 유도체(또는 이들의 조합)를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 압타머는 데옥시리보스, 리보스, 포스페이트, 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 또는 우라실(U) 이외의 화학 구조를 포함하도록 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 압타머는 핵 염기, 당 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다.
특정 구현예에서, 압타머는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 변형예는, 예를 들어 알킬화, 아릴화 또는 아세틸화, 알콕실화, 할로겐화, 아미노기 또는 다른 작용기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 예는 RNA 압타머에 사용되는 2'-플루오로 리보뉴클레오티드, 2'-NH2-, 2'-OCH3- 및 2'-0-메톡시에틸 리보뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 압타머는 전체적으로 또는 부분적으로 포스포로티오에이트 또는 DNA, 포스포로디티오에이트 또는 DNA, 포스포로세 레노에이트 또는 DNA, 포스포로디셀레노에이트 또는 DNA, 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), N3'-P5' 포스포라미데이트 RNA/DNA, 사이클로헥센 핵산(CeNA), 트리사이클로 DNA(tcDNA) 또는 스피겔머(spiegelmer), 또는 포스포라미데이트 모르폴린(PMO) 성분 또는 당업자에게 알려진 다른 변형(Chan et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology(2006) 33, 533-540)일 수 있다.
일부 변형은 압타머가 핵산 절단 효소에 대해 안정화되도록 한다. 압타머의 안정화에 있어서, 일반적으로 압타머의 후속 변형과 이미 변형된 RNA/DNA를 갖는 것의 선택 간에는 구별이 있을 수 있다. 안정화는 변형된 RNA/DNA 압타머의 친화성에 영향을 미치지 않지만 RNases/DNase에 의한 유기체 또는 생물학적 용액에서 압타머의 빠른 분해를 방지한다. 샘플(예를 들어, 생물학적 매질)의 반감기가 1분 이상, 바람직하게는 1시간 이상, 더 바람직하게는 1일 이상인 경우, 압타머는 본 발명의 맥락에서 안정화된 것으로 언급된다. 압타머는 또한 리포터 분자로 변형될 수 있는데, 이는 표지된 압타머의 검출에 뿐만 아니라 그 안정성 증가에 기여할 수도 있다.
압타머는 핵산 서열에 의존하는 특정 3차원 구조의 형성을 특징으로 한다. 압타머의 3차원 구조는 Watson과 Crick 분자 내 염기 쌍, Hoogsteen 염기 쌍(quadruplex), wobble-쌍 형성 또는 기타 비정규 염기 상호 작용으로 인해 형성된다. 이 구조는 항원-항체 결합과 유사하게, 압타머가 표적 구조를 정확하게 결합할 수 있도록 한다. 압타머의 핵산 서열은 정의된 조건하에서 정의된 표적 구조에 특이적인 3차원 구조를 가질 수 있다.
특정 실시 양태에서, 압타머는 도 1에 나타낸 바와 같은 2차 구조를 포함한다. 압타머의 2차 구조 분석은 자유-에너지 최소화 알고리즘 Mfold(M Zuker. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-3415, 2003)에 의해 수행되었다. 특정 구현예에서, 본 발명의 압타머는 서열 번호 3 내지 24 및 27 내지 30 중 어느 하나와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 변이를 함유할 수 있다. 이러한 변화가 도입될 수 있는 위치는 예를 들어 도 1에 표시된 2차 구조를 기반으로 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같이 압타머와 이마티닙과의 결합에 대해 경쟁하는 압타머를 제공한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명은 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나에 기재된 압타머와 이마티닙에 대한 결합에 대해 경쟁하는 압타머를 제공한다. 특정 실시 양태에서, 경쟁 분석은 이마티닙에 대한 결합에 대해 경쟁하는 압타머를 동정하는데 사용될 수 있다. 예시적인 경쟁 분석에서, 고정화된 이마티닙은 이마티닙에 결합하는 제1 표지된 압타머 및 이마티닙에 대한 결합에 대해 제1 압타머와 경쟁하는 능력에 관해 테스트되는 제2 표지되지 않은 압타머를 포함하는 용액에서 배양된다. 대조군으로서, 고정화된 이마티닙은 제1 표지된 압타머를 포함하지만 제2 표지되지 않은 압타머를 포함하지 않는 용액에서 배양될 수 있다. 이마티닙에 대한 제1 압타머의 결합을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션 한 후, 과량의 결합되지 않은 압타머를 제거할 수 있고, 고정화된 이마티닙과 관련된 표지의 양을 측정할 수 있다. 고정화된 이마티닙과 관련된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 테스트 샘플에서 실질적으로 감소하면, 이는 제2 압타머가 이마티닙에 대한 결합에 대해 제1 압타머와 경쟁하고 있음을 나타낸다.
고정화 올리고뉴클레오티드
특정 구현예에서, 압타머는 임의의 고정화 올리고뉴클레오티드의 부재하에 검출된다. 예를 들어, 본 발명의 압타머는 본원에 기재된 링커 서열을 통해 지지체에 고정될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 압타머는 고정화 영역을 포함한다. 압타머의 고정화 영역은 적절하게 설계된 고정화 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 걸쳐 혼성화할 수 있다.
특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드는 그 길이의 적어도 일부에 걸쳐 압타머의 고정화 영역에 혼성화하도록 구성된 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 고정화 올리고뉴클레오티드(또는 이의 일부)는 압타머의 고정화 영역(또는 이의 일부)과 함께 이중 가닥 듀플렉스 구조를 형성하도록 구성될 수 있다.
특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 약 20개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 전형적으로, 고정화 올리고뉴클레오티드는 압타머의 고정화 영역에 상보적이다. 특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드는 복수의 압타머에 포함된 고정화 영역에 혼성화할 수 있는 "보편적" 올리고뉴클레오티드이다.
특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 압타머는 고정화 올리고뉴클레오티드 및/또는 압타머의 표면 부착을 허용하는 적절한 관능성 모이어티를 갖는 링커 부분을 포함한다. 관능성 모이어티는 비오틴, 티올 및 아민 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 그룹으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 압타머는 스페이서 분자, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자, C6 스페이서 분자, C12 스페이서 분자, 다른 길이의 C 스페이서 분자, 헥사에틸렌 글리콜 분자, 헥산디올 및/또는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 스페이서 분자를 포함한다. 링커는 예를 들어 비오틴 링커 일 수 있다. 특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 압타머는 스트렙타비딘, 아비딘 및/또는 뉴트라비딘에 접합될 수 있다.
특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 압타머는 지지체 표면에 대한 부착을 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 압타머는 실란 연결을 통해 부착될 수 있다. 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 압타머는 숙시닐화될 수 있다(예를 들어, 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 압타머를 아미노페닐 또는 아미노프로필-유도체화된 유리에 부착하기 위해). 적절하게, 지지체는 아미노페닐 또는 아미노프로필-유도체화된다. 특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 압타머는 NH2 변형(예를 들어 에폭시 실란 또는 이소티오시아네이트 코팅된 유리에 부착하기 위해)을 포함한다. 일반적으로, 지지 표면은 에폭시 실란 또는 이소티오시아네이트로 코팅된다. 특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 압타머는 알데하이드 또는 에폭사이드 분자에 부착하기 위해 히드라지드-변형된다.
지지체
특정 구현예에서, 압타머 또는 고정화 올리고뉴클레오티드는 지지체에 부착된다. 일반적으로, 지지체는 멤브레인 또는 비드와 같은 고체 지지체이다. 지지체는 2차원 지지체, 예를 들어, 마이크로 플레이트, 또는 3차원 지지체, 예를 들어, 비드일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 지지체는 적어도 하나의 자기 비드를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 지지체는 적어도 하나의 나노 입자, 예를 들어, 금 나노 입자 등을 포함할 수 있다. 추가 실시 양태에서, 지지체는 비드, 마이크로타이터 또는 기타 분석 플레이트, 스트립, 막, 필름, 겔, 칩, 마이크로입자, 나노입자, 나노 섬유, 나노 튜브, 미셀, 마이크로포어, 나노포어 또는 바이오센서 표면을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 바이오센서 표면은 프로브 팁 표면, 바이오센서 유동-채널 또는 이와 유사한 것일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 압타머 또는 고정화 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 자기 비드에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는데, 상기 자기 비드는 예를 들어, 카르복시-말단, 아비딘-개질 또는 에폭시-활성화 또는 기타 호환 가능한 반응성 기로 개질된 것일 수 있다.
지지체, 예를 들어 고체 상 지지체에 올리고뉴클레오티드의 고정화는 DNA 또는 RNA를 고체 상에 고정시키기 위해 당업자에게 공지된 다양한 방식 및 임의의 방식으로 달성될 수 있다. 나노 입자에 대한 압타머의 고정화는 예를 들어 W02005/13817에 기술된 바와 같다. 예를 들어, 종이 또는 다공성 물질의 고체상은 액상 압타머로 적셔질 수 있고, 액상은 후속적으로 휘발되어 종이 또는 다공성 물질에 압타머를 남긴다.
특정 실시 양태에서, 지지체는 막, 예를 들어 니트로 셀룰로오스, 폴리에틸렌(PE), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌(PP), 셀룰로오스 아세테이트(CA), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리이미드(PI), 폴리설폰(PS), 폴리에테르설폰(PES) 알루미늄 산화물(Al2O3), 실리콘 산화물(SiO2) 및/또는 지르코늄 산화물(Zr02)을 포함하는 막 또는 무기 막을 포함할 수 있다. 특히, 지지체가 만들어질 수 있는 적합한 재료는 예를 들어 무기 중합체, 유기 중합체, 유리, 유기 및 무기 결정, 광물, 산화물, 세라믹, 금속, 특히 귀금속, 탄소 및 반도체를 포함한다. 특히 적합한 유기 중합체는 폴리스티렌에 기초한 중합체이다. 특히, 적절한 유기 중합체는 폴리스티렌에 기초한 중합체, 바이오중합체, 예를 들어, 셀룰로스, 덱스트란, 한천, 아가로스 및 세파덱스이며, 이는 관능화될 수 있고, 특히, 니트로셀룰로스 또는 시아노겐 브로마이드 세파덱스는 고체 지지체를 제공하는 중합체로 사용될 수 있다.
검출가능한
표지
특정 실시 양태에서, 본 발명의 압타머는 샘플에서 이마티닙의 양을 검출 및/또는 정량화하는데 사용된다. 일반적으로 압타머는 검출가능한 라벨을 포함한다. 압타머의 검출 및/또는 정량화를 용이하게 할 수 있는 임의의 라벨이 본원에서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 검출가능한 표지는 형광 모이어티, 예를 들어, 형광/소광제 화합물이다. 형광/소광제 화합물은 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, Mary Katherine Johansson, Methods in Molecular Biol. 335: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Designs and Protocols, 2006, Didenko, ed., Humana Press, Totowa, NJ, and Marras et al., 2002, Nucl. Acids Res. 30, el22(본원에 참조로 포함됨)를 참조하라.
특정 구현예에서, 검출가능한 표지는 FAM이다. 특정 구현예에서, FAM-표지는 압타머의 제1 또는 제2 프라이머 영역에 위치한다. 당업자는 라벨이 압타머 내의 임의의 적절한 위치에 위치할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer; "FRET")의 결과로서, 서로 근접할 때 검출가능한 신호를 증가시키는 모이어 티가 본 명세서에서 사용될 수도 있다. 적합한 쌍은 플루오로세인 및 테트라메틸로다민을 포함하지만 이에 제한되지 않고; 로다민 6G와 말라카이트 그린, 및 FITC 및 티오세미카르바졸 등이 있다.
특정 구현예에서, 검출가능한 표지는 형광단, 나노입자, 양자 점(quantum dot), 효소, 방사성 동위원소, 기-정의된 서열 부분, 비오틴, 데스티오비오틴, 티올 기, 아민 기, 아지드, 아미노알릴 기, 디곡시제닌(digoxigenin), 항체, 촉매, 콜로이드 금속 입자, 콜로이드 비금속 입자, 유기 고분자, 라텍스 입자, 나노 섬유, 나노 튜브, 덴드리머, 단백질 및 리포좀로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 검출가능한 표지는 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 단백질 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 형광 단백질이다.
특정 구현예에서, 검출가능한 표지는 효소이다. 예를 들어, 효소는 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 우레아제, β-갈락토시다제 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 효소로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 검출의 특성은 사용된 검출가능한 라벨에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 라벨은 그 색상, 예를 들어, 금 나노 입자로 인해 검출될 수 있다. 광학 판독기 또는 카메라, 예를 들어 이미징 소프트웨어가 있는 카메라 등으로 색상을 정량적으로 감지할 수 있다.
특정 구현예에서, 검출가능한 표지는 형광 표지, 예를 들어 양자 점이다. 이러한 실시 양태에서, 검출 수단은 형광 강도를 기록하도록 구성된 형광판 판독기, 스트립 판독기 또는 이와 유사한 것을 포함할 수 있다.
검출가능한 표지가 효소 표지인 실시 양태에서, 검출 수단은 예를 들어 비색계, 화학발광 및/또는 전기화학적(예를 들어, 전기화학적 검출기를 사용함) 일 수 있다. 일반적으로, 전기화학적 감지는 산화환원 리포터(예: 메틸렌 블루 또는 페로센)를 압타머의 한쪽 끝으로, 센서 표면을 다른 쪽 끝으로 접합(컨쥬게이션)하는 것을 통한다. 일반적으로, 표적 결합시 압타머 형태의 변화는 리포터와 센서 사이의 거리를 변경하여 판독값을 제공한다.
특정 실시 양태에서, 검출가능한 표지는 증폭된 신호를 제공하기 위해 기질을 촉매적으로 전환시키기 위해 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제(APP) 또는 이와 유사한 효소와 같은 효소를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명의 압타머 및 검출가능한 분자를 포함하는 복합체(예를 들어, 접합체)를 제공한다. 전형적으로, 본 발명의 압타머는 검출가능한 분자에 공유적으로 또는 물리적으로 접합된다.
특정 실시 양태에서, 검출가능한 분자는 시각, 광학, 광자, 전자, 음향, 광-음향, 질량, 전기화학적, 전기-광학, 분광계, 효소적 또는 다른 물리적으로, 화학적으로 또는 생화학적으로 검출가능한 표지이다.
특정 실시 양태에서, 검출가능한 분자는 발광, UV/VIS 분광법, 효소적, 전기 화학적 또는 방사성에 의해 검출된다. 발광은 빛의 방출을 의미한다. 예를 들어, 광발광(photoluminescence), 화학발광(chemiluminescence) 및 생물발광(bioluminescence)은 라벨 검출에 사용된다. 광발광 또는 형광에서는, 광자의 흡수에 의해 여기가 발생한다. 예시적인 형광단은 비제한적으로 비스벤지미다졸, 플루오레세인, 아크리딘 오렌지, Cy5, Cy3 또는 프로피듐 요오드화물을 포함하며, 이는 압타머와 공유적으로 커플링될 수 있고, 테트라메틸-6-카르복시호다민(TAMRA), 텍사스 레드(TR), 로다민, 알렉사 플루오르 염료(et al. 다른 회사의 다른 파장의 형광 염료)도 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 검출가능한 분자는 예를 들어 콜로이드성 금속 입자, 예를 들어 금 나노입자, 콜로이드 비금속 입자, 양자 점, 유기 폴리머, 라텍스 입자, 나노섬유(예: 탄소 나노섬유), 나노튜브(예: 탄소 나노튜브), 덴드리머, 단백질 또는 신호-생성 물질을 갖는 리포좀이다. 콜로이드 입자는 비색계로 감지할 수 있다.
특정 구현예에서, 검출가능한 분자는 효소이다. 특정 구현예에서, 효소는 기질을 착색된 제품으로 전환시킬 수 있는데, 예를 들어 퍼옥시다제, 루시퍼라제, β-갈락토시다제 또는 알칼리성 포스파타제이다. 예를 들어, 무색 기질 X-gal은 β-갈락토시다아제의 활성에 의해 색상이 시각적으로 감지되는 청색 제품으로 변환된다.
특정 구현예에서, 검출 분자는 방사성 동위원소이다. 이러한 검출은 또한 3H, 14C, 32P, 33P, 35S 또는 125I, 더욱 바람직하게는 32P, 33P 또는 125I를 포함 하나 이에 제한되지 않는 압타머가 표지된 방사성 동위 원소에 의해 수행될 수 있다. 섬광 계수(scintillation counting)에서는, 방사능으로 표지된 압타머 표적 복합체에서 방출되는 방사능 방사선을 간접적으로 측정한다. 섬광 물질은 동위 원소의 방사성 방출에 의해 여기된다(excited). 섬광 물질이 다시 바닥 상태로 전환되는 동안, 여기 에너지는 빛의 섬광(flash)으로 다시 방출되며, 이는 광증배기(photomultiplier)에 의해 증폭되고 계수된다.
특정 실시 양태에서, 검출가능한 분자는 디곡시제닌 및 비오틴으로부터 선택된다. 따라서, 압타머는 또한 예를 들어 항체 또는 스트렙타비 딘에 의해 결합된 디곡시제닌 또는 비오틴으로 표지될 수 있으며, 이는 차례로 표지, 예컨대 효소 접합체로 실행될 수 있다. 압타머와 효소의 이전 공유 결합(접합)은 여러 알려진 방법으로 달성될 수 있다. 압타머 결합의 검출은 또한 RIA(방사성 면역분석)에서 방사성 동위원소를 사용하여, 바람직하게는 1251로, 또는 형광단, 바람직하게는 플루오레세인 또는 FITC를 사용하는 FIA(플루오로 면역분석)에서 형광에 의해, 압타머를 표지함으로써 이루어질 수 있다.
장치
본 발명에 따른 장치는 다수의 상이한 포맷으로 제공될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명은 샘플에서 이마티닙의 존재, 부재 또는 수준을 검출하기 위한 장치를 제공하며, 이 장치는 본원에 기재된 압타머를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 장치는 본원에 기재된 바와 같은 지지체를 포함한다. 예를 들어, 이마티닙이 없는 경우, 압타머는 고정화를 위해 지지체에 직접 또는 간접적으로 고정될 수 있다.
특정 구현예에서, 장치는 본원에 기술된 고정화 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 압타머는 지지체에 직접 또는 간접적으로 부착되는 고정화 올리고뉴클레오티드에 혼성화함으로써 부착될 수 있다. 대안적으로, 압타머 자체는지지체 표면에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커를 통해) 부착될 수 있다. 이 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드는 압타머의 적어도 일부에 혼성화하도록 구성된다. 이 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드와 압타머 사이의 상호 작용의 파괴는 이마티닙의 존재에 대한 간접적인 측정으로서 측정될 수 있다.
본 발명의 특정 실시 양태는 이마티닙에 결합할 때, 형태를 변화시키는 압타머의 능력을 이용한다. 이러한 형태적 변화는 압타머가 고정화 올리고뉴클레오티드로부터 분리되도록 하여 지지체에 부착된 것에 따라 고정화 올리고뉴클레오티드 또는 이마티닙과 복합체 상태의 압타머를 방출할 수 있다. 이마티닙이 존재하지 않는 경우, 압타머는 형태 변화를 겪지 않으므로 고정화 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 채로 남는다.
특정 실시 양태에서, 장치는 지지체에 부착된 링커 분자를 포함하고, 여기서 링커 분자는 압타머에 혼성화하도록 구성되고, 나아가 고정화 올리고뉴클레오티드는 압타머가 링커 분자에 혼성화될 때 압타머에 혼성화하도록 구성된다.
적절하게, 링커 분자는 지지체에 부착되고 링커 분자는 고정화 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록 구성되며, 나아가 압타머는 고정화 올리고뉴클레오티드가 링커 분자에 혼성화될 때 고정화 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록 구성된다. 특정 구현예에서, 링커 분자는 DNA 또는 RNA 분자 또는 혼합된 DNA/RNA 분자이고, 선택적으로 링커 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 장치는 바이오센서일 수 있다. 바이오센서는 다양한 형식으로 제공된다. 특정 실시 양태에서, 바이오센서는 압타머, 및 압타머와 이마티닙 사이의 결합 이벤트를 전기적으로 정량화가능한 신호로 변환하는 변환기를 포함한다. 바이오센서는 용기 또는 프로브 등에 포함될 수 있다.
또한, 장치는 신호 처리 장치, 출력 전자장치, 디스플레이 장치, 데이터 처리 장치, 데이터 메모리 장치 및 다른 장치에 대한 인터페이스와 같은 다른 요소를 더 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 이마티닙을 함유하는 샘플은 바이오센서와 접촉하게 된다. 이마티닙은 이마티닙이 압타머에 특이적으로 결합할 때 압타머 특성의 변화를 통해 확인될 수 있다.
센서의 감도는 사용되는 변환기의 영향을 받을 수 있다. 변환기는 샘플 내 표적 분자 농도에 비례하는 결합 이벤트로부터의 신호를 전기적으로 정량가능한 측정 신호로 변환한다. 신호는 압타머와 이마티닙 사이의 분자 상호작용으로 인해 발생한다. 본 발명에 따른 바이오센서를 사용하면 정성적, 정량적 및/또는 반-정량적 분석 정보를 얻을 수 있다.
광 변환기로 측정은 광도측정(photometry) 원리를 기반으로 할 수 있으며, 이에 따라, 예를 들어 색상 또는 발광 강도 변화가 감지된다. 광학적 방법에는 형광, 인광, 생물발광 및 화학발광, 적외선 전이 및 광 산란 측정이 포함된다. 광학적 방법은 또한 이마티닙이 압타머에 결합될 때 층 두께 변화의 측정을 포함한다. 층 두께는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR), 반사 간섭 분광법(RIfS), 생물층 간섭측정(BLI) 또는 이와 유사한 방법으로 측정할 수 있다.
더 나아가, 얇은 층 상의 간섭(SPR 또는 RIfS)과 소멸 장(evanescent field)의 변화를 측정할 수 있다. 음향 변환기는 압전 수정 결정(piezoelectric quartz crystal)의 주파수 변화를 사용하는데, 이는 표적이 압타머에 결합할 때 발생하는 매우 민감한 질량 변화를 감지한다. 사용되는 수정 결정은 진동하는 전기장에 배치되고 결정의 공진 주파수가 측정된다. 수정 결정 표면의 질량 변화를 정량화할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 장치는 BLI(Biolayer Interferometry) 장치 또는 이의 유사 장치이다. BLI는 생체분자 상호작용을 측정하기 위한 무-표지 기술이다. 이는 바이오센서 팁 상에 고정된 리간드 층과 내부 기준 층의 두 표면에서 반사된 백색광의 간섭 패턴 변화를 분석하는 광학 분석 기술이다. 바이오센서 팁에 결합된 분자 수의 변화는 실시간으로 측정할 수 있는 간섭 패턴의 변화를 유발한다. 바이오센서에 결합하거나 분리하는 분자만 간섭 패턴을 이동시키고 BLI 센서에서 반응 프로필을 생성할 수 있다. 결합되지 않은 분자, 주변 매질의 굴절률 변화 또는 유속 변화는 간섭 패턴에 영향을 주지 않는다. 변위 선택 원리(Displacement Selection Principle)는 압타머의 고정화 서열과 고정화 올리고뉴클레오티드 사이의 이중 형성에 기반한 검출 분석의 개발을 허용한다. 표적-의존적 형태 변화는 듀플렉스 구조로부터 압타머의 방출을 유발할 수 있다. 혼성화 듀플렉스에서 압타머의 변위 단계(displaced stage)로의 이러한 변경은 기록 가능한 신호, 표적 농도 의존 신호를 생성하는 데 사용할 수 있다.
설계에 따라, 측정 대상에 대한 정성적, 정량적 및/또는 반-정량적 분석 정보를 측정 장치로 얻을 수 있다. 검출 수단은 예를 들어 휴대용 계량기일 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 압타머 또는 복합체를 포함하는 검사 스트립 및/또는 측면 유동 장치를 제공한다. 측면 유동 장치는 측면 유동 테스트, 측면 유동 분석 및 측면 유동 면역분석이라고도 언급될 수 있다.
특정 구현예에서, 측면 유동 장치는 고정화 올리고뉴클레오티드가 부착된 지지체를 포함한다. 고정화 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 압타머의 고정화 영역의 적어도 일부에 혼성화하도록 구성된다. 여기에 설명된 모든 샘플(예: 혈액 또는 혈장 샘플)이 도입될 수 있다. 샘플이 이마티닙을 포함하는 경우, 압타머는 이마티닙에 결합하여 입체적 형태 변화를 겪을 수 있고, 그 결과 압타머가 고정화 올리고뉴클레오티드로부터 분리된다.
특정 실시 양태에서, 장치는 ELISA(효소-결합 면역흡착 분석)와 같은 분석에 사용하기에 적합할 수 있다. 항체 대신 압타머를 사용하는 경우, 결과 분석은 종종 "ELONA"(효소-결합 올리고뉴클레오티드 분석), "ELASA"(효소-결합 압타머 흡착 분석), "ELAA"(효소-결합 압타머 분석), 또는 이의 유사 용어로도 언급된다. 이러한 ELISA와 유사한 분석 플랫폼에 압타머를 통합하면 감도가 증가하고 더 많은 수의 분석물이 검출될 수 있는데, 압타머는 형광단, 소광제 분자 및/또는 본원에 설명된 임의의 다른 검출 모이어티를 포함하는 다중 리포터 분자에 접합될 수 있기 때문에 이용가능한 항체가 없거나 및 광범위한 출력값을 갖는 분석물도 검출될 수 있다.
특정 실시예에서, 장치는 용기를 포함할 수 있다. 이마티닙에 특이적인 압타머는 용기(예를 들어, 용기의 표면)에서 고정화 올리고뉴클레오티드에 혼성화를 통해 고정될 수 있다. 이마티닙을 포함할 수 있는 샘플이 상기 용기에 추가될 수 있다. 샘플이 이마티닙을 포함하는 경우, 이 표적은 압타머에 결합하여 형태적 변화를 일으키고, 이는 고정화 올리고뉴클레오티드로부터 압타머의 변위(displacement)를 초래할 수 있다. 그 후, 변위된 압타머는 본원에 기재된 임의의 적절한 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
이마티닙
검출 방법
특정 실시 양태에서, 본 발명은 샘플에서 이마티닙의 존재, 부재 또는 함량을 검출하는 방법을 제공한다.
특정 실시 양태에서, 샘플은 합성(예: 비-생물학적) 샘플이다. 예를 들어, 샘플은 이마티닙을 포함하는(또는 포함하는 것으로 의심되는) 약제학적 조성물일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물의 제조동안 이마티닙의 양을 정량화하는 방법을 제공한다.
특정 실시 양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 예를 들어, 샘플은 전혈, 백혈구, 말초 혈액 단핵 세포, 혈장, 혈청, 객담, 숨(breath), 소변, 정액, 타액, 수막 액, 양수, 선액, 림프액, 유두 흡인물, 기관지 흡인물, 활액(synovial fluid), 관절 흡인물, 세포, 세포 추출물, 대변, 조직, 조직 생검 또는 뇌척수액을 포함할 수 있다. 일반적으로, 샘플은 혈액(예: 혈장) 샘플이다. 특정 실시 양태에서, 샘플은 예를 들어, 효소, 완충제, 염 용액 또는 마커의 혼합, 첨가와 같은 전-처리되거나 정제될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 샘플은 이마티닙 치료를 받고 있는 개체로부터 수득된다. 개체는 모든 동물(예: 고양이, 개 또는 말) 일 수 있다. 일반적으로 개체는 인간이다. 일반적으로, 개체는 백혈병(예: CML 또는 ALL), 위장 간질 종양(GIST), 전신 비만세포증 또는 골수이형성증후군과 같은 암을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 개체이다. 일반적으로, 백혈병은 필라델피아 염색체-양성(PH+)이다.
샘플에서 이마티닙의 존재, 부재 또는 함량을 검출하는 방법에서, 샘플은 본원에 기술된 압타머와 상호 작용(즉, 접촉)한다. 예를 들어, 본원에 기술된 샘플 및 압타머는 압타머의 적어도 일부가 샘플 내 이마티닙에 결합하기에 충분한 조건 하에서 배양될 수 있다.
통상의 기술자는 본 명세서에 기재된 압타머와 이마티닙 사이에 결합이 발생하기 위해 조건이 필요함을 이해할 것이다. 특정 실시 양태에서 샘플 및 압타머는 약 20℃ 내지 약 37℃, 바람직하게는 약 22℃의 온도에서 배양될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 샘플 및 압타머는 적절한 버퍼(예: PBS 등)로 상이한 농도로 희석될 수 있다(예: 적어도 약 1%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% v/v 또는 그 이상). 특정 실시 양태에서, 샘플 및 압타머는 진탕 및/또는 혼합하는 동안 배양될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 샘플 및 압타머는 1분 이상, 5분 이상, 15분 이상, 1시간 이상 동안 배양된다.
특정 실시 양태에서, 압타머와 이마티닙의 결합은 압타머-이마티닙 복합체의 형성을 유도한다. 결합 또는 결합 이벤트는 예를 들어, 시각적으로, 광학적으로, 광자적으로, 전자적으로, 음향적으로, 광-음향적으로, 질량에 의해, 전기화학적으로, 전기-광학적으로, 분광학적으로, 효소학적으로 또는 그 외의 화학적, 생화학적 또는 물리적으로 본원에 기재된 바와 같이 검출될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 방법은 샘플을 본 발명의 압타머 및 본원에 기재된 고정화 올리고뉴클레오티드와 상호작용시키는 것을 포함한다. 위에서 논의된 바와 같이, 이마티닙의 결합은 압타머 내 입체형태적 변화를 유발하여 고정화 올리고뉴클레오티드로부터의 변위를 초래할 수 있다. 예를 들어, 고정화 올리고뉴클레오티드가 지지체에 부착된 경우, 이마티닙이 압타머에 결합하면 지지체로부터 압타머가 변위될 수 있다.
특정 구현예에서, 고정화 올리고뉴클레오티드에 대한 압타머의 결합은 지지체에 대한 고정화 올리고뉴클레오티드의 고정화 전에 수행된다. 대안적으로, 고정화 올리고뉴클레오티드는 핵산 분자를 고정화 올리고뉴클레오티드에 혼성화하기 전에 지지체에 부착될 수 있다. 고정화 올리고뉴클레오티드 및/또는 핵산 분자 중 어느 것이라도 지지체에 부착될 수 있다. 부착은 직접 또는 간접적으로, 예를 들어 링커 또는 기타 부착 부분을 통해 이루어질 수 있다.
압타머와 이마티닙의 결합은 임의의 적절한 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 위에서 논의한 바와 같이, 예를 들어 압타머와 이마티닙의 결합은 바이오센서를 사용하여 검출될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 압타머 및 이마티닙의 결합은 본원에 기재된 바와 같이 SPR, RIfS, BLI, LFD 또는 ELONA를 사용하여 검출된다.
유리하게는, 본 발명의 압타머는 임상적으로 관련된 함량의 이마티닙의 검출을 허용한다. 전형적으로, 본 발명의 압타머는 약 1μM 미만의 이마티닙, 예를 들어 약 900nM 미만, 약 800nM 미만, 약 700nM 미만, 약 600nM 미만 또는 약 500nM 미만의 이마티닙 검출 한계를 갖는다. 전형적으로, 본 발명의 압타머는 약 0.5μM 내지 약 10μM의 이마티닙, 예를 들어 약 0.5 내지 약 5μM의 이마티닙 검출 범위를 갖는다. 따라서, 압타머는 높은 특이성과 친화도로 이마티닙에 결합할 수 있으며, 활성 이마티닙의 임상 범위가 샘플에서 검출될 수 있다.
암 치료 중
이마티닙
모니터링
특정 실시 양태에서, 본 발명은 이마티닙 치료를 받고 있는 개체로부터 수득된 샘플에서 이마티닙 수준을 모니터링하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 개체의 개인적 요구에 기초하여 치료 체계를 조정할 수 있는 기회를 제공하고, 이는 보다 효과적이고 개인화된 치료를 가능하게 한다.
특정 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 개체로부터 수득된 샘플에서 이마티닙 양의 검출을 제공하고, 검출된 이마티닙 수준에 따라 개체에서 암을 치료 또는 예방한다.
특정 실시 양태에서, 본 방법은 개체로부터 수득된 샘플에서 이마티닙의 양을 검출한 후, 개체에게 이마티닙의 용량(예를 들어, 초기 용량)을 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 암은 CML(전형적으로 PH+), ALL(전형적으로 PH+), GIST, 전신 비만세포증 또는 골수이형성증후군이다. 일반적으로 개체는 인간이다.
이마티닙의 초기 용량은 이마티닙의 치료적 또는 예방적 유효량으로 예측될 수 있다. 일반적으로, 이마티닙의 초기 용량은 경구로 투여된다. 초기 용량은 다양한 매개 변수, 특히 치료할 환자의 연령, 체중 및 상태 및 필요한 요법에 따라 결정될 수 있다. 의사는 모든 환자에게 필요한 투여 경로와 용량을 결정할 수 있다.
특정 실시 양태에서, Ph+ CML 또는 ALL을 갖는 것으로 새롭게 진단된 성인 또는 소아 개체는 1일 약 300 내지 600mg의 이마티닙의 초기 용량으로 치료된다.
특정 실시 양태에서, 재발성 또는 불응성 Ph+ CML 또는 ALL을 갖는 성인 개체는 1일 약 400mg의 이마티닙 초기 용량으로 치료된다.
암을 치료 또는 예방하는 본 방법에서, 개체의 샘플에서 이마티닙의 수준은 본원에 기재된 방법에 따라 검출된다. 일반적으로, 샘플은 혈액 샘플이다. 일반적으로, 혈액 샘플에서 이마티닙의 혈장 최저치(Cmin)가 검출된다(예: 다음 용량의 이마티닙 투여 전에 이마티닙이 도달한 최저 농도).
이마티닙 수준이 하위 역치 수준(lower threshold level) 미만인 것으로 결정되면, 이마티닙의 증가된 용량이 개체에게 투여될 수 있다. 여기에서, "하위 역치 수준"은 개체에서 종양 반응을 유발할 가능성이 없는 것으로 간주되는 이마티닙의 임의의 혈장 수준을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 이마티닙의 하위 역치 수준은 약 500ng/ml 이하, 약 600ng/ml 이하, 약 700ng/ml 이하, 약 800ng/ml 이하, 약 900ng/ml 이하 또는 약 1000 ng/ml 이하일 수 있다.
"증가된 용량"은 후속 샘플에서 이마티닙의 수준을 하위 역치 수준(예를 들어, 약 1000 ng/ml 내지 약 3000 ng/ml) 초과로 증가시키도록 작용하는 초기 용량보다 더 높은 용량을 의미하는 것으로 이해된다. 통상의 기술자는 예를 들어 이마티닙의 초기 용량 및 샘플 내 이마티닙 수준을 기준으로 적절한 증가된 용량을 계산할 수 있을 것이다.
이마티닙 수준이 상위 역치 수준(upper threshold level)을 초과하는 것으로 결정되면, 이마티닙의 감소된 용량이 개체에게 투여될 수 있다. 여기서, "상위 역치 수준"은 개체에서 독성을 유발할 가능성이 있는 것으로 간주되는 이마티닙의 임의의 혈장 수준을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 이마티닙의 상위 역치 수준은 약 3000 ng/ml, 약 3,500 ng/ml, 약 4,000 ng/ml, 또는 그 이상일 수 있다.
"감소된 용량"은 후속 샘플에서 이마티닙의 수준을 약 1000 ng/ml 내지 약 3000 ng/ml 사이로 감소시키는 초기 용량보다 낮은 용량을 의미하는 것으로 이해된다. 통상의 기술자는 이마티닙의 초기 용량과 샘플 내 이마티닙 수준을 기준으로 적절한 감소 용량을 계산할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 이마티닙의 수준은 이마티닙의 초기 용량을 개체에게 투여한 후, 1주, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 12개월 이내에 검출된다. 이마티닙 수준은 예를 들어 이마티닙 치료를 시작한 후 규칙적인 간격으로 한 번 이상 검출될 수 있다. 일반적으로, 이마티닙 수준은 약 3, 6 및/또는 12개월에 검출되며, 이마티닙 치료 첫 해 동안 이마티닙의 치료 수준을 모니터링(필요한 경우 목표 수준으로 조정)할 수 있다.
키트
본 발명은 또한 이마티닙을 검출 및/또는 정량화하기 위한 키트를 제공하며, 본 키트는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 압타머를 포함한다. 일반적으로, 키트는 또한 본원에 기술된 검출가능한 분자를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 사용설명서를 추가로 포함한다.
특정 실시 양태에서, 키트는 본원에 기재된 고정화 서열, 지지체 및/또는 링커를 추가로 포함한다.
전형적으로, 키트는 키트 또는 수행될 방법이 의도하는 반응을 위한 추가 성분, 예를 들어 농축, 분리 및/또는 분리 절차에서 의도된 검출을 위한 성분을 포함한다. 예로는 완충액, 색 반응을 위한 기질, 염료 또는 효소 기질이 있다. 키트에서, 압타머는 다양한 형태로 제공될 수 있으며, 예를 들어 지지체(예: 고체 지지체)에 미리 고정된 상태, 동결 건조된 상태 또는 액체 매질 내로 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 키트의 부품은 바이알에 개별적으로 또는 용기 또는 다중 용기 단위로 조합하여 포장될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 일반적으로, 키트의 제조는 당업자에게 알려진 표준 절차를 따른다.
실시예
하기에서, 본 발명은 특정 구현예의 비-제한적인 실시예를 통해보다 상세히 설명될 것이다. 실시예의 실험에서는 오염이 없는 표준 시약 및 버퍼가 사용된다.
실시예
1 -
압타머
선택
단일 가닥 DNA 압타머를 변위 선택 프로세스를 사용하여 선택하였다. 삽입된 형광 마커를 통해, 형광 측정에 의해 공정의 다른 단계 후, DNA 정량화가 가능하였다.
선택 과정에서 압타머 라이브러리의 ssDNA 올리고머를 상보적 고정화 올리고뉴클레오티드를 통해 자기 비드 상에 고정하였다. 별개의 상이한 세척 단계를 시행하여 결합되지 않은 ssDNA 분자 및 약하게 결합된 ssDNA 분자만을 제거한 후, 백그라운드 용출 및 후속 표적 결합 단계를 동일한 조건에서 수행하였다. 표적 결합은 압타머의 형태적 변화를 유발하였다. 이 형태적 변화는 압타머가 고정화 올리고뉴클레오티드로부터 분리되도록 하여 표적 분자와 복합된 형태로 압타머를 방출/치환시킨다. 표적 분자가 존재하지 않는 경우, 압타머 분자는 형태적 변화를 겪지 않으므로 고정화 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 채 남게 된다.
백그라운드 단계에서 비특이적 용출된 물질의 양과 표적-결합으로 인해 변위된 압타머의 양을 직접 비교하면 선택 과정을 추적할 수 있다. 표적-결합 물질이 비특이적 백그라운드에 비해 지수적으로 농축되어 있다면(enriched), 압타머 선택 프로세스는 성공적이다. 농축된 압타머 풀은 '다클론 압타머'로 사용될 수 있고, 또는 개별 압타머 분자를 풀에서 분리하여 사용할 수도 있다.
카운터 선택 단계를 도입하여 선택 과정의 엄격성을 강화했다. 이러한 단계에서, 고정화된 라이브러리는 비특이적/'원치 않는' 표적 분자로 고정되어 이러한 비특이적/'원치 않는' 표적에 대한 친화성을 갖는 ssDNA 분자를 제거한다.
압타머
라이브러리 및 올리고뉴클레오티드
선택 과정 동안, 압타머 라이브러리(IDT에 의해 제조됨, 벨기에)의 ssDNA 올리고뉴클레오티드 서열을 상보적 고정화 올리고뉴클레오티드(서열 번호 31)를 통해 자기 비드에 고정하였다.
압타머 라이브러리의 뉴클레오티드 서열은 다음 구조를 갖는다(5'에서 3' 방향으로):
P1-R1-I-R2-P2,
여기서, P1은 제1 프라이머 영역이고, R1은 제1 랜덤화 영역이며, I는 고정화 영역이고, R2는 추가 랜덤화 영역이며, P2는 적어도 R1 및/또는 R2 또는 이의 일부가 표적 분자 결합에 관여하는 추가 프라이머 영역이다.
PCR을 통한 올리고머의 증폭에는 다음과 같은 변형된 프라이머가 사용되었다: 서열: 5'-/56FAM/ATCCACGCTCTTTTTCTCC-3'을 갖는 플루오레신(FAM)-라벨링된 정방향 프라이머(P1) 및 서열: 5'/5Phos/CCTATGTCACCCTCAATGC-3'을 갖는 PO4-변형된 역방향 프라이머(P2).
예시적인 비오틴화된 고정화 올리고뉴클레오티드(I)는 다음 구조를 갖는다: 5'Bio-GTC-HEGL-GATCGAGCCTCA-3'. 모든 올리고뉴클레오티드는 벨기에 IDT에 의해 화학적으로 합성되었다.
라이브러리의 제1 랜덤화 영역(R1)은 약 10개의 핵산 서열이다. 라이브러리의 제2 랜덤화 영역(R2)은 약 40개의 핵산 서열이다.
마그네틱
비드
상에
압타머
라이브러리 고정
고정화 올리고뉴클레오티드는 서열 간의 혼성화를 가능하게 하는, 출발 라이브러리의 ssDNA 뉴클레오티드 서열의 고정화 영역에 상보적인 12개의 뉴클레오티드의 정의된 영역을 포함한다. 또한, 고정화 올리고뉴클레오티드는 헥사에틸렌 글리콜(HEGL) 잔기를 통해 결합된 5' 비오틴을 운반하며, 이는 고정화 올리고뉴클레오티드와 스트렙타비딘-변형된 자기 비드의 커플링을 담당한다.
고정화를 위해, 혼합물을 95℃에서 5분 동안 가열함으로써, 3 nmol의 나이브 라이브러리 및 2 nmol의 고정화 올리고뉴클레오티드를 250㎕ 결합 버퍼 'BB' (20mM Tris-HCl pH 7.4, 100mM NaCl, 2mM MgCl2, 1mM CaCl2, 0.01% Tween 20)에서 사전-혼성화했다. 4℃로 냉각한 후, 사전-혼성화 라이브러리-고정화 올리고뉴클레오티드 혼합물을 B&W(5mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5mM EDTA, 1M NaCl, 0.01% Tween 20)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 109 Dynabeads® M-270 Streptavidin Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific, UK)와 함께 인큐베이션하여 그 위에 고정화했다.
라운드 2부터, 300 pmol의 FAM-표지 압타머 라이브러리 및 200 pmol 고정화 올리고뉴클레오티드 서열을 상기와 동일한 프로토콜을 사용하여 100㎕ 결합 완충액(BB)에서 혼성화시켰다. 사전-혼성화된 압타머 라이브러리-고정화 올리고뉴클레오티드 혼합물을 제조업체의 지침에 따라 108 Dynabeads®M-270 스트렙타비딘 마그네틱 비드 상에 고정했다.
변위 접근법을 사용한
시험관내
선택
압타머 라이브러리에 통합된 형광 마커를 사용하여 형광 플레이트 판독기 분석을 통해 공정의 각 단계 후 압타머 DNA 정량화가 가능하다. 플루오레세인(FAM)-표지된 DNA의 형광 측정을 여기 485nm / 방출 520nm 측정 조건 하에서 BMG 형광 플레이트 리더(FLUOstar OPTIMA, BMG, UK)를 사용하여 수행하였다.
표적 치환 및 회수된 압타머 DNA의 정량화는 관련 압타머 선택 버퍼에서 각 압타머 라이브러리에 대해 준비된 0-50 pmol/mL 범위의 FAM-표지 ssDNA(올리고뉴클레오티드 라이브러리)의 검량선을 사용한 계산을 기반으로 한다.
표적 이마티닙(Sigma-Aldrich, UK)를 DMSO에서 1mg/ml(1.7mM) 스톡 용액으로 희석하고 -20℃에서 보관했다. 작업 스톡을 사용 직전에 선택 버퍼 PBS6(10mM Na2HP04/ 2mM KH2P04, pH 6.0, 137mM NaCl, 2.7mM KCI, 2mM MgCl2, 1mM CaCl2, 0.01% Tween 20)에서 20μM에서 제조하였다. 이마티닙 표적화 압타머의 선택에 사용되는 버퍼는 선택의 효율성을 향상시키기 위해 최적화된다.
다음 단계를 포함하는 변위 선택 프로세스를 연속 라운드로 수행하였는데, 이는 또한 원치 않는 표적과의 상호 작용을 줄이고, 약한 결합 서열 또는 기계적 공정을 통해 방출되는 서열을 제거하도록 최적화되며, 이마티닙 선택의 효율성을 개선한다:
- 상기 프로토콜에 따른 나이브 압타머 라이브러리(또는 이전 라운드에서 제조된 농축된 압타머 라이브러리)를 자기 비드에 결합하는 단계;
- 고정화된 압타머 라이브러리 양의 정량화(형광 측정) 단계로서, 제1 선택 라운드에 500 pmol 고정화 나이브 라이브러리 입력, 및 다음 선택 라운드마다 80 pmol 고정화된 압타머 라이브러리 입력하는 단계;
- 1000rpm으로 쉐이킹하면서(Thermomixer comfort, Eppendorf, Germany), 선택 버퍼 PBS6에서 28℃에서 15분 동안 세척하여, 상승된 온도에서 약하게 결합된 올리고머 제거하는 단계;
- 1000rpm에서 쉐이킹하여 선택 버퍼 PBS6에서 22℃에서 45분 동안 백그라운드 용출하는 단계;
- 선택 라운드 8, 9 및 10의 단계로서, 이는 또한 1000rpm으로 쉐이킹하면서, 선택 버퍼 PBS6에서 22℃에서 45분 동안 40% 인간 혈장(HUMANPL32NCU2N, BiolVT, UK)을 사용하여 역-선택 단계를 포함하는, 단계;
- 표적 분자(20mM 이마티닙)가 보충된 선택 완충액 PBS6에서 1000rpm에서 쉐이킹하며 22℃에서 45분 동안 표적 결합하는 단계;
- 각 라운드의 선별 후, 표적-변위된 압타머를 변위되지 않은 압타머로부터 분리하고, 동일하지 않은 프라이머 믹스(2μM FAM-표지된 정방향 프라이머 및 0.1μM P04-변형된 역방향 프라이머)를 사용하여, 반-비대칭 PCR에 의해 회수 및 직접 증폭하는 단계;
- 이중 가닥 DNA를 30분까지 제거하는 단계로서, 제조업체 프로토콜에 따라 37℃에서 Lambda 엑소뉴클레아제(EURx, 폴란드)로 처리하고 초기(nascent) ssDNA를 AxyPrep Mag PCR Clean-up Kit(Axygen Biosciences, USA)를 사용하여 정제하여 농축된 압타머 라이브러리를 얻는 단계. 선택 및 정제된 압타머 라이브러리는 후속 변위 선택 라운드에서 사용되었다;
- 각 라운드에서, 백그라운드 용출, 카운터-선택 또는 복합 매트릭스(예: 혈장)(해당되는 경우) 및 표적 결합 분획에서 회수된 압타머 라이브러리의 양을 형광 측정으로 정량화하는 단계. 각 샘플에서 회수된 물질의 양은 표적 결합 압타머의 농축을 추적하는데 사용된다(백그라운드 또는 카운터 표적 결합제 대비);
- 이마티닙 특이적 압타머를 농축하기 위해 총 10회의 라운드를 수행했다.
도 2는 고친화성 압타머 집단을 동정한 것을 보여준다. 7 라운드 후 표적 변위의 현저한 증가가 관찰되었으며, 그 후 인간 혈장으로의 카운터-선택이 포함되었다. 10 라운드 후, 표적 특이적 다클론 집단을 분리하였다.
바이오센서의 구축 및
압타머
-표적 결합의 평가
10차 선택 라운드 후, 농축된 압타머 집단을 생물층 간섭계(BLI)에 의해 표적 분자 이마티닙에 대한 결합 특이성이 있는지 테스트하였다. 이 실험은 BLItz 또는 Octet QK 기기(ForteBio, Pall Life Sciences, USA)를 사용하여 수행되었다.
바이오센서 프로브(Streptavidin-SA Dip & Read Biosensors, ForteBio, Pall Life Sciences, USA) 상에 압타머 고정화를 위해, 1.5μM 압타머(또는 나이브 라이브러리) 및 1μM 고정화 올리고뉴클레오티드를 10분 동안 95℃까지 가열하여 버퍼 BB에서 사전-혼성화한 후, 즉시 5분 동안 4℃로 냉각한 후, 동일한 부피의 2x B&W 버퍼(10mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM EDTA, 2M NaCl, 0.02% Tween 20)와 혼합했다. 그 다음, 고정화 올리고뉴클레오티드 상의 비오틴 그룹을 사용하여, 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 스트렙타비딘-코팅된 표면에 고정시켰다. 스트렙타비딘으로 코팅된 프로브를 5분 동안 이 사전-혼성화된 혼합물과 함께 인큐베이션했다. 느슨하게 고정된 라이브러리 물질을 제거하기 위해 완충액 PBS6을 사용한 3번의 세척 단계(30초, 120초, 30초)를 수행했다. 이어서, 프로브를 5분 동안 표적 용액(PBS6에서 20μM 이마티닙 또는 20μM 대사산물 N-데스메틸 이마티닙)과 함께 배양하였다.
표적 결합은 고정화된 압타머의 형태적 변화를 일으키고, 이는 신호 감소로 나타나는 압타머 변위를 생성하였다(도 3). 이 "딥 앤 리드(dip and read)" BLI 분석은 압타머-표적 상호작용을 모니터링하고, 최고 성능의 압타머 클론을 식별하며, 비교 동역학 분석을 하는데 사용되었다.
ForteBio 시스템(ForteBio Data Analysis 8.0)의 소프트웨어를 사용하면 신호를 "플립핑"하여 비교 동역학 분석이 가능하다. 이러한 접근법을 사용하여 BLI 결합 분석을 통해, 출발 라이브러리와 비교시, 선택된 압타머 집단의 선택 표적 이마티닙 및 이의 주요 대사 산물 N-데스메틸 이마티닙에 대한 결합 개선을 볼 수 있다(도 4 참조).
클로닝
마지막 선택 라운드 후, 회수된 압타머 라이브러리를, 변형되지 않은 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 이 정제된 dsDNA를 제조업체 프로토콜(CloneJET PCR 클로닝 키트, Thermo Fisher Scientic, UK)에 따라 pJET1 .2/blunt 클로닝 벡터 상으로 클로닝하였고 이.콜라이(NEB 5-alpha E. coli C2987H)의 시퀀싱 균주를 형질 전환하는데 사용했다. 96개의 양성 형질전환체/클론을 플라스미드-특이적 프라이머(pJET 정방향 프라이머 및 pJET 역방향 프라이머, CloneJET PCR 클로닝 키트, Thermo Fisher Scientic, 영국)를 사용하여 'colony PCR'로 분석했다. 동시에, 압타머 특이적 FAM-표지된 정방향 프라이머 및 PO4-변형 역방향 프라이머를 사용하여 '압타머 PCR'에 의해 동일한 형질전환체/클론으로부터 압타머 DNA를 생성했다.
개별
압타머
동정
단일 가닥 DNA를 상기 클로닝 프로토콜에 따라 개별 DNA 클론에 대해 제조하였다. 그 다음, 각 클론을 위에 설명된 BLI 분석을 사용하여 표적 결합에 대해 분석했다. 2개의 클론은 표적 이마티닙에 대한 높은 친화성을 보였다(도 5).
압타머 1 및 압타머 2 클론의 DNA를 시퀀싱했다. 수득한 시퀀스 데이터는 EBI 웹 서버(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)에서 제공하는 웹 기반 도구 ClustalW를 사용하여 분석 및 정렬되었다. 압타머의 2차 구조 분석을 자유-에너지 최소화 알고리즘 Mfold [[Zuker, M. (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acid Res. 31(13), 3406-15]( http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold )를 사용하여 수행하였다(도 1).
압타머
특이성 결정
압타머 특이성을 위에서 설명한 프로토콜에 따라 BLI 분석을 사용하여 결정하였다. 표적 이마티닙, 대사 산물 N-데스메틸 이마티닙, 음성 표적 1 이리노테칸, 음성 표적 2 SN-38을 PBS6에서 10μM로 적용했다(도 6).
도 6에서 압타머 1 및 2가 선택 라운드 10에서 출발 라이브러리 및 농축된 압타머 집단에 비해 선택 표적 및 이의 주요 대사 산물에 대해 개선된 결합 반응을 보였음을 명확히 알 수 있다. 다른 테스트된 소분자 표적(구조적 및 기능적 관련)은 어느 압타머에 의해서도 결합되지 않았다. 특이성 연구는 BLI 변위 분석을 사용하여 수행되었다(플립된 데이터, 버퍼 차감).
압타머
-
이마티닙
겉보기 결합
친화도의
결정
겉보기 압타머 친화도를 직접 결합 분석을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라, 시리즈 S CAP 칩(GE Healthcare 28920234)을 Biacore T200(GE Healthcare, Uppsala)에 도킹, 수화 및 사전조정했다. 이 기기를 PBS6 완충액으로 프라이밍하고 5' 비오틴화된 압타머를 1μM의 농도, 5㎕/분의 유속 및 10분의 접촉 시간을 사용하여 제조업체의 권장 사항에 따라 칩 표면에 캡처했다. 전장 압타머 1(Ima C5), 최소 단편(Ima C5-F6b) 및 랜덤 대조군을 각각 Fc2, Fc3 및 Fc4로 캡쳐하였다. 이마티닙에 대한 동역학은 두 개의 블랭크 대조군을 사용하여 30㎕/min에서 이어서, 0.039, 0.075, 0.157, 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6μM의 주입으로, 이어서 블랭크에 의해, 및 접촉 시간 60초, 해리 시간 60초로 0.75 μM로 복제함으로써 다중 사이클 동역학을 통해 결정되었다. 데이터를 로컬 RI 매개 변수를 갖는 1:1 결합 Langmuir 결합 모델과 함께 Biacore Insight 평가 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 이마티닙(PBS6에서)에 대한 압타머 1(Ima C5)의 친화도는 1.10 x 10-7M로 계산되었다(도 7).
'ELISA-유사'
압타머
변위 분석(
마이크로타이터
플레이트-기반 형광 분석) 및 인간 혈장에서
압타머
선택성 평가
스트렙타비딘-코팅된 MTP(Pierce Streptavidin Coated, HBC, Black 96-Well Plates with SuperBlock Blocking Buffer, Thermo Scientific, USA)상으로 압타머 고정화를 위해, 0.75μM 압타머 1 및 0.5μM 고정화 올리고뉴클레오티드를 버퍼 BB에서 95℃로 10분동안 가열하여 사전-혼성화한 후, 즉시 4℃로 5분 동안 냉각한 다음 동일한 부피의 2x B&W 버퍼와 혼합하였다. 마이크로타이터 플레이트 MTP 1을 MTP 쉐이커(IKA Schuttler MTS 4, IKA Werke GmbH & Co. KG, Germany)에서 1000rpm으로 쉐이킹하면서 실온에서 1시간 동안 이 사전-혼성화된 혼합물과 함께 배양하였다. 고정화 효율을 인큐베이션 전 및 후 각각 입력 및 출력 형광을 비교하여 결정하였다. 이를 통해 형광 측정에 의해 로드된 압타머의 대략적인 양을 계산할 수 있었다. 압타머 로딩된 플레이트(MTP 1)는 느슨하게 고정된 DNA를 제거하기 위해 선택 버퍼 PBS6로 광범위하게 세척된 후, 완충된 인간 혈청(HUMANPL32NCU2N, BiolVT, UK)에서 4가지 농도(버퍼 PBS6 중 0%, 10%, 20% 및 25% v/v 매트릭스)에서 제조된 표적 이마티닙(10μM, 5μM, 2.5μM, 1.25μM, 0.625μM, 0μM)의 구배로 실온(MTP 쉐이커에서 1000rpm)에서 1시간 동안 배양되었다. 표적-용출된 물질(MTP 1로부터)을 회수하고 표적-결합 압타머의 양을 형광 측정에 의해 결정하였다. 원시 데이터는 '표적 농도'에 대한 '형광'으로서, 상이한 혈장 농도들에서 표시되었다.
표적 이마티닙에 대한 명확한 농도 의존적 결합을, 각 농도의 완충 혈장 단독에 최소한의 백그라운드 결합과 함께 4가지 혈장 농도 모두에서 압타머 'Ima C5'에 대해 관찰할 수 있었다(도 8). 이 테스트를 치료 분자의 치료 범위를 반영하는 이마티닙 농도에서 수행하였다. 이마티닙의 검출 한계는, 이 약물의 임상 범위에 대한 명확한 농도 의존 반응으로, 1μM 미만이다.
실시예
2 -
압타머
1의 최소 유효 결합 단편의 확인
압타머 1의 최소 기능성 단편을 식별하기 위해, 단편들의 패널(모 압타머의 잘린 버전)을 생성했다(벨기에 IDT에서 제조).
모 압타머 1의 잘린 버전의 패널을 표적 이마티닙(PBS6에서 10μM)에 대한 결합 능력에 대해 테스트했다. 특히, BLI 변위 결합 연구는 압타머 1의 최소 유효 단편을 확인하는데 사용되었다. 압타머 1의 절단된 버전의 패널을 표적 이마티닙(PBS6에서 10μM)에 대한 결합 능력에 대해 테스트했다(도 9). 최소 단편 식별 연구는 BLI 변위 분석(플립된 데이터, 버퍼 차감)을 사용하여 수행되었다. 많은 압타머 단편들이 결합 능력을 상실하였는데, 이는 결합 부위가 제거되었거나 손상되었음을 나타낸다. 다른 단편들은 모 압타머(Ima C5)에 비해 개선된 결합을 보여주었다. 이 패널에서 가장 작고 가장 성능이 좋은 압타머 단편은 단편 F6b(서열 번호 3)인 것으로 밝혀졌다.
최소 유효 단편 Ima C5-F6b의 겉보기 결합 친화성을 위에서 언급한 Biacore 기기에서 직접 결합 접근법의 프로토콜을 사용하여 SPR에 의해 시험하였다. 이마티닙(PBS6에서)에 대한 압타머 단편 Ima C5-F6b의 겉보기 친화도는 7.21 x 10-8M으로 계산되었다(도 10).
압타머 특이성은 위에서 설명한 대로 BLI 변위 분석을 사용하여 결정되었다(도 11). 표적 유도된 변위를 여러 관련 표적을 사용하여 결정하였고, 최소 기능성 단편이 이마티닙 및 대사 산물 N-데스메틸 이마티닙에 결합하지만 음성 표적 이리노테칸에는 결합하지 않음을 입증했다.
인간 혈장에서 압타머 선택성의 평가는 위에서 설명한 대로 ELISA-유사 압타머 변위 분석(마이크로타이터 플레이트-기반 형광 분석)에 의해 검증되었다(도 12). 이 결과는 최소 기능성 단편 Ima C5-F6b가 혈장 단독에 대한 최소한의 백그라운드 결합으로 인간 혈장의 존재하에 이마티닙에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여준다. 이 테스트는 이 약물의 치료 범위를 반영하는 목표 농도에서 수행되었다.
본 출원과 관련하여 본 명세서와 동시에 또는 이전에 제출되고 본 명세서와 함께 공개 검사에 개방된 모든 문서 및 문서에 대해 통상의 기술자의 관여가 가능하며, 이러한 모든 문서 및 문서의 내용은 여기에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Aptamer Diagnostics Limited
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<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> first randomized region (R1) of Aptamer 1 (Ima-C5)
<400> 1
ccccgctatg 10
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second randomized region (R2) of Aptamer 1 (Ima-C5)
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gttcggtgtg tttttaaagg gtacagatcc tgggcggggg 40
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> best performing minimal effective nucleic acid fragment (F6b) of Aptamer 1 (Ima-C5)
<400> 3
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cc 52
<210> 4
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> nucleic acid fragment (F6a) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 4
ctatgtgagg ctcgatcgtt cggtgtgttt ttaaagggta cagatcc 47
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
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<223> nucleic acid fragment (F6c) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 5
ctccccccgc tatgtgaggc tcgatcgttc ggtgtgtttt taaagggtac agatcc 56
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F6d) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 6
tttttctccc cccgctatgt gaggctcgat cgttcggtgt gtttttaaag ggtacagatc 60
c 61
<210> 7
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F6e) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 7
cgctcttttt ctccccccgc tatgtgaggc tcgatcgttc ggtgtgtttt taaagggtac 60
agatcc 66
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F7a) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 8
ctatgtgagg ctcgatcgtt cggtgtgttt ttaaagggta cagatcctgg gc 52
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F7b) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 9
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cctgggc 57
<210> 10
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (f7c) of ima-c5 with improved binding toImatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 10
ctccccccgc tatgtgaggc tcgatcgttc ggtgtgtttt taaagggtac agatcctggg 60
c 61
<210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F7d) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 11
tttttctccc cccgctatgt gaggctcgat cgttcggtgt gtttttaaag ggtacagatc 60
ctgggc 66
<210> 12
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F7e) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 12
cgctcttttt ctccccccgc tatgtgaggc tcgatcgttc ggtgtgtttt taaagggtac 60
agatcctggg c 71
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F14f) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 13
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cc 52
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F14g) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 14
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cctgggc 57
<210> 15
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F14h) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 15
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cctgggcggg 60
gg 62
<210> 16
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F14i) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 16
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cctgggcggg 60
gg 62
<210> 17
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F14j) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 17
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cctgggcggg 60
gggcatt 67
<210> 18
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F14k) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 18
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cctgggcggg 60
gggcattgag gg 72
<210> 19
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F14l) of Ima-C5 with improved binding to Imatinib as compared to full length Ima-C5
<400> 19
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cctgggcggg 60
gggcattgag ggtgaca 77
<210> 20
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F6) of Aptamer 1 (Ima-C5)
<400> 20
atccacgctc tttttctccc cccgctatgt gaggctcgat cgttcggtgt gtttttaaag 60
ggtacagatc c 71
<210> 21
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F7) of Aptamer 1 (Ima-C5)
<400> 21
atccacgctc tttttctccc cccgctatgt gaggctcgat cgttcggtgt gtttttaaag 60
ggtacagatc ctgggc 76
<210> 22
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F8) of Aptamer 1 (Ima-C5)
<400> 22
atccacgctc tttttctccc cccgctatgt gaggctcgat cgttcggtgt gtttttaaag 60
ggtacagatc ctgggcgggg g 81
<210> 23
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F14) of Aptamer 1 (Ima-C5)
<400> 23
ccccgctatg tgaggctcga tcgttcggtg tgtttttaaa gggtacagat cctgggcggg 60
gggcattgag ggtgacatag g 81
<210> 24
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> full nucleic acid sequence of Aptamer 1 (Ima-C5)
<400> 24
atccacgctc tttttctccc cccgctatgt gaggctcgat cgttcggtgt gtttttaaag 60
ggtacagatc ctgggcgggg ggcattgagg gtgacatagg 100
<210> 25
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> first randomized region (R1) of Aptamer 2 (Ima-E8)
<400> 25
gtggactaga 10
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second randomized region (R2) of Aptamer 2 (Ima-E8)
<400> 26
tacttaatca tgttaagagt ccacgtcttg agttgtggat 40
<210> 27
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F10) of Aptamer 2 (Ima-E8)
<400> 27
atccacgctc tttttctccg tggactagat gaggctcgat ctacttaatc atgttaagag 60
tccacgtctt gagttgtgga tgcatt 86
<210> 28
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F11) of Aptamer 2 (Ima-E8)
<400> 28
atccacgctc tttttctccg tggactagat gaggctcgat ctacttaatc atgttaagag 60
tccacgtctt gagttgtgga tgcattgagg g 91
<210> 29
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid fragment (F12) of Aptamer 2 (Ima-E8)
<400> 29
atccacgctc tttttctccg tggactagat gaggctcgat ctacttaatc atgttaagag 60
tccacgtctt gagttgtgga tgcattgagg gtgaca 96
<210> 30
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> full nucleic acid sequence of Aptamer 2 (Ima-E8)
<400> 30
atccacgctc tttttctccg tggactagat gaggctcgat ctacttaatc atgttaagag 60
tccacgtctt gagttgtgga tgcattgagg gtgacatagg 100
<210> 31
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> exemplary immobilisation region (I)
<400> 31
tgaggctcga tc 12
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> exemplary first primer region (P1)
<400> 32
atccacgctc tttttctcc 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> exemplary second primer region (P2)
<400> 33
gcattgaggg tgacatagg 19
<210> 34
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> exemplary immobilisation sequence
<400> 34
gatcgagcct ca 12
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> exemplary reverse second primer region (P2)
<400> 35
cctatgtcac cctcaatgc 19
Claims (27)
- 이마티닙에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머로서,
(a) 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나에서 선택되는 핵산 서열;
(b) 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나와 적어도 85% 동일성을 갖는 핵산 서열;
(c) 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나의 약 30개 이상의 연속 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열; 또는
(d) 서열 번호 3 내지 24 또는 27 내지 30 중 어느 하나와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열의 약 30개 이상의 연속 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열
을 포함하거나, 이로 이루어지는, 압타머. - 제1항에 있어서, 상기 압타머는
(a) 서열 번호 3 내지 24 중 어느 하나에서 선택되는 핵산 서열;
(b) 서열 번호 3 내지 19 중 어느 하나에서 선택되는 핵산 서열;
(c) 서열 번호 3에서 선택되는 핵산 서열;
(d) (a) 내지(c)의 서열 중 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산 서열; 및/또는
(e) (a) 내지(d)의 서열 중 어느 하나의 적어도 약 50개의 연속 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열
을 포함하거나, 이로 이루어지는, 압타머. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 압타머가 단일 가닥 DNA 압타머인, 압타머.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 압타머와 이마티닙에 대한 결합에 대해 경쟁하는 압타머.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머가 검출가능한 표지를 포함하는 압타머.
- 제5항에 있어서, 검출가능한 표지가 형광단, 나노입자, 양자 점(quantum dot), 효소, 방사성 동위원소, 기-정의된 서열 부분, 비오틴, 데스티오비오틴, 티올 기, 아민 기, 아지드, 아미노알릴 기, 디곡시제닌(digoxigenin), 항체, 촉매, 콜로이드 금속 입자, 콜로이드 비금속 입자, 유기 고분자, 라텍스 입자, 나노 섬유, 나노 튜브, 덴드리머, 단백질 및 리포좀로부터 선택되는, 압타머.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 압타머 및 검출가능한 분자를 포함하는 복합체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 압타머를 포함하는 바이오센서 또는 검사 스트립.
- 샘플에서 이마티닙의 존재, 부재 또는 수준을 검출하기 위한 장치로서,
상기 장치는
(i) 지지체; 및
(ii) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 압타머
를 포함하는, 장치. - 제9항에 있어서, 상기 지지체는 비드, 마이크로타이터 또는 기타 분석 플레이트, 스트립, 막, 필름, 겔, 칩, 마이크로입자, 나노입자, 나노섬유, 나노튜브, 미셀, 마이크로포어, 나노포어 또는 바이오센서 표면인, 장치.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 장치가 고정화 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 고정화 올리고뉴클레오티드는 압타머의 핵산 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열을 포함하고, 상기 압타머는 상기 고정화 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는, 장치.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 또는 고정화 올리고뉴클레오티드가 지지체에 직접 또는 간접적으로 부착되는 장치.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생물층 간섭측정(BLI), 측면 유동 분석 및/또는 ELONA에 적합한 장치.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 압타머, 제7항에 기재된 복합체, 제8항에 기재된 바이오센서 또는 검사 스트립, 또는 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 장치의 이마티닙 검출, 농축, 분리 및/또는 분리를 위한 용도.
- 샘플에서 이마티닙의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 방법으로서,
(i) 샘플을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 압타머와 상호작용시키는 단계; 및
(ii) 이마티닙의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서, 압타머가 고정화 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고, 상기 고정화 올리고뉴클레오티드는 압타머의 핵산 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열을 포함하고, 상기 압타머의 샘플 내 임의의 이마티닙과의 결합이 압타머 및 압타머의 검출을 허용하는 고정화 올리고뉴클레오티드의 변위를 유도하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 압타머 또는 고정화 올리고뉴클레오티드가 지지체에 부착되는, 방법.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 이마티닙의 존재, 부재 또는 양이 광자 검출, 전자 검출, 음향 검출, 전기화학적 검출, 전기광학 검출, 효소적 검출, 화학적 검출, 생화학적 검출 또는 물리적 검출에 의해 검출되는 방법.
- 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 합성 샘플이고, 선택적으로 샘플이 이마티닙을 함유하는 제약 조성물인 방법.
- 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 이마티닙 치료요법을 받고 있는 개체로부터 수득되는, 방법.
- 제20항에 있어서, 샘플이 혈액 샘플이고, 선택적으로 이마티닙의 혈장 최저 수준(Cmin)이 검출되는, 방법.
- 개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
(i) 이마티닙의 초기 용량을 개체에게 투여하는 단계;
(ii) 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 개체로부터 수득된 샘플에서 이마티닙의 양을 검출하는 단계; 및
(iii) (a) 이마티닙 수준이 하위 역치 수준 미만인 경우, 증가된 용량의 이마티닙을 개체에게 투여하는 단계;
(b) 이마티닙의 수준이 상위 역치 수준을 초과하는 경우, 감소된 용량의 이마티닙을 개체에게 투여하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제22항에 있어서, 샘플이 선택적으로 혈액 샘플이고, 혈액 샘플에서 이마티닙의 혈장 최저 수준(Cmin)이 검출되는, 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 하위 역치 수준이 약 1000ng/ml 이하이고/이거나 상위 역치 수준이 약 3000ng/ml 이상인, 방법.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 이마티닙의 수준이 개체에게 이마티닙의 초기 용량을 투여한 후 약 3개월, 약 6개월 및/또는 약 12개월 후에 검출되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 압타머를 포함하는 이마티닙 검출 및/또는 정량용 키트.
- 제26항에 있어서, 고정화 올리고뉴클레오티드, 링커, 지지체 및/또는 검출가능한 분자를 포함하는, 키트.
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