KR102336454B1 - 핵산 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 목표핵산(target nucleic acid)과 결합할 수 있는 상보서열(complementary sequence); 및 목표핵산의 포획(capture), 표지(labeling) 또는 증폭(amplification)을 매개할 수 있는 매개서열(mediator sequence)을 포함하는 헤어핀(hairpin) 구조의 매개핵산을 포함하고,
상기 매개핵산은 상기 매개핵산의 상보서열과 목표핵산이 상보적으로 결합한 상태에서만 상기 매개핵산의 상보서열의 일부 또는 전부와 상기 매개핵산의 매개서열의 일부 또는 전부의 상보적 결합이 풀림으로써 상기 매개서열이 단일가닥으로 노출되는 것인 목표핵산 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

핵산 검출 방법 {A method to detect nucleic acids}

본 발명은 목표핵산 검출용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목표 핵산과 특이적으로 결합하여 검출에 필요한 과정을 매개할 수 있는 매개핵산을 이용한 핵산검출 방법에 관한 것이다.

본 발명은 출원일자 2019년 6월 17일자, 출원번호 10-2019-0071266, 명칭 “입자를 이용한 분자진단 방법”에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 발명의 일부로 포함시킨다.

분자진단은 DNA나 RNA와 같은 핵산을 검출 또는 분석하는 진단 방법으로 염기서열의 특이성을 이용하기 때문에 다른 진단 방법에 비해 매우 정확하고 많은 정보를 얻을 수 있는 장점이 있다. 또한 분자진단은 암 진단, 사람 또는 가축의 감염성 질병진단, 병원균 항생제 내성 검사, 식품 검사, 혈액 검사, 유전학적 검사 등 응용범위가 매우 넓어 시장 규모가 크고 성장속도가 빠른 분야이다. 특히 현장 분자진단은 의료지원에 대한 접근성 강화, 결과에 대한 즉각적 분석과 처방, 방문 횟수 및 대기시간 감소 등을 통해 분자진단 영역을 확대시킬 수 있기 때문에 가장 활발하게 연구되고 있는 분야이다.

현재 미량의 핵산을 검출하기 위해서 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)이나 등온 증폭 방법 등에 의해 먼저 핵산의 양을 증폭하는 방법이 흔히 사용되고 있다. 그러나 이와 같은 증폭을 위해서는 효소를 포함하는 반응 혼합물이 필요하기 때문에 현장에서 적용하기 어려운 문제점이 있다. 미량의 핵산을 증폭하지 않고 직접 검출하기 위해 여러 가지 방법들이 시도되고 있지만 아직 감도가 낮을 뿐만 아니라 복잡하고 정교한 장치가 필요하여 실용화되기 어렵다.

중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 연구 기법, 차대룡, 대한신장학회지 2000; 19: S28-S40. 호흡기 바이러스 중합효소연쇄반응, 보건복지가족부, 신의료기술평가보고서, HTA-2008-006, 2008.

본 발명의 목적은 목표핵산(target nucleic acid)과 결합할 수 있는 상보서열(complementary sequence); 및 목표핵산의 포획(capture), 표지(labeling) 또는 증폭(amplification)을 매개할 수 있는 매개서열(mediator sequence)을 포함하는 헤어핀(hairpin) 구조의 매개핵산을 포함하고, 상기 매개핵산은 상기 매개핵산의 상보서열과 목표핵산이 상보적으로 결합한 상태에서만 상기 매개핵산의 상보서열의 일부 또는 전부와 상기 매개핵산의 매개서열의 일부 또는 전부의 상보적 결합이 풀림으로써 상기 매개서열이 단일가닥으로 노출되는 것인 목표핵산 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 목표핵산 검출용 조성물을 핵산을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 시료로부터 목표핵산의 존재여부를 검출하는 단계를 포함하는 목표핵산 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 목표핵산 검출용 조성물을 포함하는 목표핵산 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명에서 효소에 의한 증폭방법을 사용하지 않고, 매개핵산을 이용하여 핵산을 검출할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였다.

일 실시예에 따르면, 목표핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 서열과 목표핵산의 검출을 매개할 수 있는 서열인 매개서열을 포함하며 목표핵산에 결합한 상태에서만 상기 매개서열이 단일가닥으로 노출되도록 매개핵산(mediator nucleic acid)이 설계된다(도 1).

따라서, 본 발명은 목표핵산(target nucleic acid)과 결합할 수 있는 상보서열(complementary sequence); 및 목표핵산의 포획(capture), 표지(labeling) 또는 증폭(amplification)을 매개할 수 있는 매개서열(mediator sequence)을 포함하는 헤어핀(hairpin) 구조의 매개핵산을 포함하고, 상기 매개핵산은 상기 매개핵산의 상보서열과 목표핵산이 상보적으로 결합한 상태에서만 상기 매개핵산의 상보서열의 일부 또는 전부와 상기 매개핵산의 매개서열의 일부 또는 전부의 상보적 결합이 풀림으로써 상기 매개서열이 단일가닥으로 노출되는 것인 목표핵산 검출용 조성물을 제공한다.

핵산(nucleic acid)을 분석대상으로 하는 분자진단은 일반적으로 특정 염기서열의 존재 여부를 정성적 또는 정량적으로 분석하는 것을 목적으로 한다. 따라서, 본 발명에 있어서 “목표핵산(target nucleic acid)”은 “목표 염기서열(target sequence)”과 동일한 의미로 사용될 수 있고, 목표핵산은 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA, 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA 등을 포함할 수 있다.

한편, 일반적으로 이중가닥 DNA를 검출할 경우 온도를 높임으로써 목표핵산의 이중가닥을 분리하여 단일가닥으로 만든 상태에서 검출이 이루어지기 때문에 효소와 같은, 높은 온도에 취약한 물질을 분석과정에 사용할 수 없게 된다. 그러나, 목표핵산의 검출에 본 발명에 따른 매개핵산(mediator nucleic acid)을 이용하면 매개핵산을 목표핵산에 결합시킨 후에는 매개핵산의 매개서열이 단일가닥으로 노출되기 때문에 낮은 온도에서도 분석 과정을 진행할 수 있어서 높은 온도에 취약한 물질을 분석에 사용할 수 있다.

또한, 목표핵산에 본 발명에 따른 매개핵산이 결합한 후에는 매개핵산의 매개서열이 이중가닥 DNA 밖으로 노출되어 있어 검출을 위한 요소들이 결합하기 용이해진다. 뿐만 아니라 필요에 따라서 매개핵산의 매개서열을 변경할 수 있기 때문에 다양한 분석 방법을 적용할 수 있다.

본 발명에 따른 매개핵산은 헤어핀(hairpin) 구조를 갖는데, 만약 매개핵산이 헤어핀 구조를 갖지 않을 경우 목표핵산과 결합되지 않은 상태에서도 매개핵산의 매개서열에 의해 분석과정이 진행될 수 있기 때문에 위 양성(false positive) 반응을 막기 위해서는 매개핵산과 목표핵산이 결합한 이후 목표핵산과 결합하지 않은 매개핵산을 제거해야 한다. 그러나, 본 발명에 따라 목표핵산과 결합한 매개핵산만 매개서열이 노출되도록 하면 목표핵산과 결합하지 않은 매개핵산을 제거하지 않고 검출 과정을 진행할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 매개핵산은 단일 가닥 핵산으로 고리(loop)와 줄기(stem)로 구성된 헤어핀 구조를 형성하도록 제작하되, 상기 줄기의 한 쪽 끝이 다른 끝보다 더 길어 단일가닥으로 노출되도록 제작한다(도 1). 매개핵산의 상보서열은 단일가닥으로 노출된 더 긴 끝에서 시작하여 줄기(stem)의 한 지점까지 존재하며 매개서열은 상보서열을 제외한 나머지 부분에 포함되도록 제작할 수 있다(도 1). 매개핵산이 목표핵산과 만나면 먼저 단일가닥으로 노출된 매개핵산의 상보서열이 목표핵산의 전부 또는 일부와 결합하기 시작하면서 매개핵산의 줄기 속에 있던 나머지 서열까지 목표핵산과 결합하게 된다. 그 결과, 매개핵산의 줄기 부분의 서열이 풀리면서 헤어핀 구조가 열리고 매개핵산의 매개서열이 단일가닥으로 노출되면, 이 매개서열을 통해 목표핵산의 검출 과정이 진행된다.

만약, 목표핵산이 단일가닥 DNA 또는 RNA인 경우에는, 매개핵산을 더하여 반응시키면 목표핵산에 바로 결합할 수 있다. 그러나 목표핵산이 이중가닥 DNA인 경우에는 두 가닥이 분리되어야 매개핵산이 결합하는 반응이 일어날 수 있다. 이 때 DNA 호흡(DNA breathing)이라는 현상에 의해 이중가닥의 일부가 일시적으로 단일가닥으로 분리되기 때문에 낮은 온도에서도 매개핵산이 결합하는 것이 가능하지만 반응속도가 느려진다. 따라서 목표핵산과 매개핵산이 결합하는 반응을 촉진시키기 위해서는 DNA 가닥의 분리를 촉진하기 위해 온도를 37℃ 이상으로 올렸다가 낮추는 것이 더 바람직하다. 목표핵산에 매개핵산을 더한 상태에서 온도를 높여 변성(denaturation)시킨 후 온도를 낮추면 매개핵산의 상보서열이 목표핵산에 결합하면서 헤어핀 구조가 열리고 매개서열이 노출된다(도 1). 대개 95℃로 온도를 올리게 되면 DNA 가닥이 완전히 분리되기 때문에 빠른 속도로 반응을 일으킬 수 있다. 그러나 높은 온도를 얻기 위해서는 많은 에너지를 소비해야 하는 단점도 있기 때문에 매개핵산 결합반응의 온도는 검사에 요구되는 신속성 수준, 경제성 수준, 이동성 수준, 시료의 상태 등 여러 가지 요소를 고려하여 최적화 시키는 것이 바람직하다.

검출대상이 되는 목표핵산은 대부분 세포 내부에 들어있기 때문에 검출을 위해서는 세포를 용해시킨 후 핵산을 추출하는 것이 보통이다. 대부분의 세포는 높은 온도로 가열하면 용해되기 때문에 세포가 들어있는 시료에 매개핵산을 더하고 50℃ 이상으로 가열하면 세포가 용해되는 동시에 목표핵산에 매개핵산을 결합시킬 수 있다.

상기 기술한 것과 같이 온도를 높였다가 식힐 때는 열역학적인 조절보다는 속도론적인 조절이 이루어지게 하는 것이 좋다. 이중가닥 DNA 상태의 목표핵산에 매개핵산이 결합할 때 온도를 올렸다가 식히면 속도론적으로는 농도가 높은 매개핵산이 더 빠른 속도로 결합할 수 있다. 그러나 목표핵산의 한 가닥이 매개핵산과 결합한 상태보다 목표핵산의 두 가닥이 원래 상태대로 결합하는 것이 열역학적으로는 더 안정하다. 따라서 천천히 식히면서 열역학적 평형에 도달하도록 내버려두면 결합했던 매개핵산이 해리되고 목표핵산이 원래 상태로 되돌아갈 확률이 높아진다. 따라서 매개핵산이 목표핵산에 결합할 확률을 높이기 위해서는 반응용액을 물과 같이 열전도율(thermal conductivity)이 높은 매질에 담가 신속하게 식히는 것이 바람직하다.

목표핵산에 결합한 매개핵산이 검출과정에서 분리되지 않도록 하기 위해서는 목표핵산과 매개서열이 결합한 혼성화 이중가닥(hybridized double strand) 부분의 녹는 온도는 검출이 이루어지는 온도보다 10℃ 이상 높아지도록 제작하는 것이 좋다. 그리고 검출과정에서 매개핵산의 헤어핀 구조가 풀려 매개서열이 노출되지 않도록 하기 위해 매개핵산 줄기의 녹는 온도는 검출이 이루어지는 온도보다 10℃ 이상 높아지도록 제작하는 것이 좋다. 또한 매개핵산이 목표핵산에 결합하는 것을 촉진하기 위해 혼성화 이중가닥의 녹는 온도를 매개핵산 줄기의 녹는 온도보다 높게 제작하는 것이 좋다.

검출 특이성을 높이기 위해서는 상기 혼성화 반응이 일어나는 매질의 온도를 너무 낮지 않게 유지하는 것이 좋다. 상기 매질의 온도를 혼성화 이중가닥 부분의 녹는 온도보다 지나치게 낮게 하면 목표핵산과 염기서열이 유사한 유사핵산에 매개핵산이 비가역적으로 결합하여 비특이적인 검출이 일어날 수 있다. 그러나 매질의 온도를 혼성화 이중가닥 부분의 녹는 온도에 가깝게 유지하면 목표핵산 또는 유사핵산에 매개핵산이 가역적으로 결합하기 때문에, 유사핵산-매개핵산 혼성화보다 열역학적으로 더 안정한 목표핵산-매개핵산 혼성화가 더 우세하게 일어나게 된다. 그러나 이 경우 위에서 언급한 것처럼 목표핵산의 두 가닥이 다시 결합하는 반응도 일어나기 때문에 매질의 온도는 분석의 목적에 따라 최적화하는 것이 좋다. 도 1에 예시된 매개서열 가운데 3과 3′는 서로 상보적이어서 이차구조를 형성함으로써 검출과정을 방해할 수 있다. 따라서 매개핵산이 목표핵산에 결합한 후 노출된 매개핵산의 매개서열이 만드는 이차구조의 녹는점은 분석이 이루어지는 온도보다 10℃ 이상 낮아지도록 제작하는 것이 좋다. 예를 들어 분석과정이 수행되는 온도가 25℃라면 매개서열 내에 형성되는 이차구조의 녹는점은 15℃ 이하가 되도록 제작하는 것이 좋다.

한 개의 목표핵산에 복수의 매개핵산을 사용할 수도 있다. 이때 서로 다른 매개핵산들은 목표핵산의 서로 다른 부분에 결합해야하기 때문에 서로 다른 상보서열을 갖도록 제작해야 한다. 그러나 매개핵산의 매개서열은 필요에 따라 서로 다르게 할 수도 있고 상기 매개서열의 일부를 동일하게 제작할 수도 있다. 예를 들어 도 1에 예시된 매개핵산의 매개서열 가운데 2′는 상보서열에 의해 결정되기 때문에 매개핵산들마다 다를 수밖에 없지만 3, 4 및 3′서열은 임의로 정할 수 있기 때문에, 이 부분에 대해서는 서로 다른 매개핵산들이 동일한 염기서열을 갖도록 제작할 수 있다.

한 개의 목표핵산에 복수의 매개핵산을 사용할 때 한 매개서열은 목표핵산의 포획을 위해 사용하고 다른 하나는 목표핵산의 표지를 위해 사용할 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 매개핵산으로서 포획 매개핵산 및/또는 표지 매개핵산을 포함할 수 있다(도 2).

상기 포획 매개핵산은 포획 상보서열 1 및 2와 포획 매개서열 3, 4, 3’ 및 2’를 순차적으로 포함하되, 상기 포획 상보서열 1 및 2는 목표핵산과 결합 가능한 상보서열이고, 상기 포획 상보서열 2 및 포획 매개서열 3과 상기 포획 매개서열 2’ 및 3’은 서로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성하며, 상기 포획 매개서열 4는 헤어핀 구조의 고리(loop)를 형성할 수 있다. 또한 상기 표지 매개핵산은 표지 상보서열 a 및 b와 표지 매개서열 c, d, c’ 및 b’을 순차적으로 포함하되, 상기 표지 상보서열 a 및 b는 목표핵산과 결합 가능한 서열이고, 상기 표지 상보서열 b 및 표지 매개서열 c와 상기 표지 매개서열 b’ 및 c’은 서로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기를 형성하며, 상기 표지 매개서열 d는 헤어핀 구조의 고리(loop)를 형성할 수 있다.

또한, 상기 목표핵산과 상기 포획 상보서열 1 및 2, 상기 표지 상보서열 a 및 b가 결합하면, 상기 포획 상보서열 2와 포획 매개서열 2'; 포획 매개서열 3과 포획 매개서열 3'; 표지 상보서열 b와 표지 매개서열 b'; 및 표지 매개서열 c와 표지 매개서열 c'의 상보적 결합이 풀리는 것을 특징으로 한다(도 2).

또한, 상기 조성물은 추가로 포획 프로브가 자성입자에 고정되어 있는 포획입자 및/또는 표지 프로브가 표지물질에 고정되어 있는 검출표지를 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 포획 프로브는 포획 프로브 서열 2, 3 및 4’의 전체 또는 일부를 순차적으로 포함하되, 상기 포획 프로브 서열 2, 3 및 4'는 상기 포획 매개서열 2’, 3’ 및 4에 상보적으로 결합하고, 상기 표지 프로브는 표지 프로브 서열 b, c 및 d’의 전체 또는 일부를 순차적으로 포함하되, 상기 표지 프로브 서열 b, c 및 d'은 제3항에 따른 표지 매개서열 b’, c’ 및 d에 상보적으로 결합하는 것인 목표핵산 검출용 조성물을 제공한다(실시예 1 및 도 2).

상기 포획입자는 포획입자에 결합하지 않은 물질들로부터 쉽게 분리될 수 있어야 한다. 예컨대, 자성입자에 상기 포획 프로브를 고정시켜 포획입자를 제조할 경우에는 자석을 포집수단으로 이용하여 포획입자를 나머지 물질로부터 분리할 수 있다.

상기 표지물질은 신호를 발생할 수 있는 물질이라면 무엇이라도 관계없으며, 신호의 예로는 흡광, 형광, 발광, 방사성, 촉매활성 등이 있다. 구체적으로 퍼옥시다아제(peroxidase), 카탈라아제(catalase), 포스파타아제(phosphatase)와 같은 효소들, 그리고 유로퓸 킬레이트, 유기 형광분자 등과 같은 형광물질을 들 수 있다.

한편, 입자를 표지물질로 사용할 경우에는 단일 분자를 표지물질로 사용하는 것에 비해 훨씬 강한 신호를 발생시킬 수 있다. 예를 들어 한 개의 입자에 여러 개의 효소를 결합시킨 입자는 한 개의 효소분자보다 훨씬 더 강한 신호를 발생시키기 때문에 검출 감도를 향상시킬 수 있다. 형광 신호의 경우에도 단일 형광 분자를 표지물질로 사용하는 것보다 다수의 형광 분자가 고정된 형광 입자를 표지물질로 사용하면 형광의 강도를 크게 높일 수 있다. 예컨대, 유로퓸(europium) 형광입자를 표지물질로 사용할 경우 수십 개만 있어도 검출이 가능하기 때문에 극히 적은 수의 핵산을 검출할 수 있다(도 9).

일 실시예에 따르면, 본 발명은 증폭 매개핵산을 이용한 것에 비해 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체를 이용한 반응물의 형광 세기가 현저하게 증가됨을 확인하였다(도 14).

또한, 단일가닥으로 노출된 매개서열은 짧은 핵산조각들의 증폭 연쇄반응을 일으키는데 사용될 수 있으며 이러한 증폭 연쇄반응의 대표적인 예로는 hybridization chain reaction(HCR), catalytic hairpin assembly(CHA), entropy-driven catalytic(EDC) reaction 등이 있다. 여기에서 증폭 연쇄반응이 일어나는 짧은 핵산조각들을 기질핵산(substrate nucleic acid)으로 부르고 증폭 연쇄반응을 일으키는 매개핵산을 증폭 매개핵산으로 부르기로 한다. 이러한 증폭 연쇄반응에서는 한 개의 단일가닥 핵산이 반복해서 기질핵산들의 연쇄적인 구조변화를 일으킬 수 있기 때문에, 신호를 증폭하는 효과가 있다. 예를 들어 상기 구조변화가 두 개의 기질핵산으로 이루어진 이중가닥 핵산이 형성되는 구조변화일 경우, 한 개의 단일가닥 핵산에 의해 여러 개의 이중가닥 핵산이 형성되기 때문에 이 이중가닥 핵산을 검출함으로써 검출감도를 높일 수 있다. 따라서 이러한 지금까지 이러한 증폭 연쇄반응들을 이용한 수많은 검출방법들이 개발되었다(Li et al. 2011, Nucleic Acids Res. 39, e110; Jiang et al. 2013, J. Am. Chem. Soc. 135, 7430-7433; Huang et al. 2014, Sens. Actuators B Chem. 200, 117-122; Zhang et al. 2015, Biosens. Bioelectron. 68, 343-349; Wang et al. 2011, J. Am. Chem. Soc. 133, 17149-17151; Shimron et al. 2012, Anal. Chem. 84, 1042-1048; Yang et al. 2012, ACS Appl. Mater. Interfaces. 4, 6450-6453; Huang et al. 2013, Chem. Comm. 49, 9827-9829; Huang et al. 2015, J. Mater. Chem. B 3, 2395-2401; Yang et al. 2014, ACS Nano 8, 4902-4907; Shi et al. 2020, Anal. Methods, 12, 2779-2784).

단일가닥으로 노출된 매개서열을 이용하여 증폭 연쇄반응을 일으킬 경우 연쇄반응이 일어나는 정도는 노출된 매개서열의 수에 비례하고, 노출된 매개서열의 수는 목표핵산의 수에 비례하게 된다. 따라서 증폭 매개핵산을 이용하면 증폭 연쇄반응에 의한 모든 검출방법들을 이용하여 목표핵산을 검출할 수 있다.

증폭 연쇄반응에 의한 검출방법의 한 예로 새로운 이중가닥 DNA가 생성되는 CHA 방법을 설명하면 다음과 같다(도 3 및 도 4). 헤어핀 구조를 갖는 두 개의 짧은 핵산을 기질핵산(substrate nucleic acid) S1 또는 S2로 부르고 두 기질핵산이 결합하여 생성되는 이중가닥 DNA를 증폭핵산(amplified nucleic acid)으로 부르기로 한다. 대개 목표핵산은 큰 DNA 분자의 일부분인 반면 증폭핵산은 크기가 작기 때문에 증폭핵산의 검출이 더 용이하다. 또한 한 개의 목표핵산으로부터 여러 개의 증폭핵산이 생성되기 때문에 더욱 민감한 검출이 가능하게 된다.

따라서, 상기 조성물은 목표핵산의 증폭을 매개할 수 있는 증폭 매개핵산을 포함하고, 추가로 기질핵산 S1 및 S2를 포함하되, 상기 기질핵산 S1은 그 일부가 상기 증폭 매개핵산의 일부 서열과 상보적으로 결합하고, 상기 기질핵산 S2는 그 일부가 상기 기질핵산 S1 가운데 상기 증폭 매개핵산과 결합하지 않은 서열에 결합할 수 있다(도 3 및 도 4).

예를 들어 상기 증폭 매개핵산은 증폭 상보서열 1, 2, 3 및 4와 증폭 매개서열 5, 6, 5' 및 4'를 순차적으로 포함하되, 상기 증폭 상보서열 4와 증폭 매개서열 4' 및; 상기 증폭 상보서열 5와 증폭 매개서열 5'은 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성하고, 상기 기질핵산 S1은 기질 S1 상보서열 4, 5 및 6'; 및 기질 S1 매개서열 7, 6 및 5'를 순차적으로 포함하되, 상기 기질 S1 상보서열 5와 상기 기질 S1 매개서열 5'; 및 상기 기질 S1 상보서열 6'와 상기 기질 S1 매개서열 6은 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성하며, 상기 기질핵산 S2는 기질 S2 상보서열 6', 7' 및 6; 및 기질 S2 매개서열 5', 6' 및 7을 순차적으로 포함하되, 상기 기질 S2 상보서열 7'과 상기 기질 S2 매개서열 7; 및 상기 기질 S2 상보서열 6과 상기 기질 S2 매개서열 6'은 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성한다.

상기 증폭핵산은 상기 기술한 것과 같이 포획입자와 검출표지를 이용해서 검출할 수도 있다(도 5). 이를 위해서는 증폭핵산의 양 말단에 단일가닥 부분이 노출되도록 기질핵산을 제작해야 한다. 이렇게 형성된 증폭핵산의 한 쪽 단일가닥 부분에 결합할 수 있는 포획 프로브가 자성입자에 고정된 포획입자와 다른 쪽 단일가닥 부분에 결합할 수 있는 표지 프로브가 표지물질에 고정된 검출표지를 이용하면 증폭핵산의 검출이 가능하다.

따라서, 본 발명은 상기 조성물에 추가로 포획 프로브가 자성입자에 고정되어 있는 포획입자 및/또는 표지 프로브가 표지물질에 고정되어 있는 검출표지를 포함할 수 있다.

포획입자와 검출표지를 이용해서 도 4에 제시된 증폭핵산을 검출할 경우 상기 포획 프로브는 포획 프로브 서열 5를 포함하고, 상기 표지 포로브는 표지 프로브 서열 6 및 7'을 순차적으로 포함할 수 있다.

증폭핵산을 검출하는 다른 방법은 샌드위치 분석법을 이용하는 것이다(도 6). 두 가지 기질핵산 S1과 S2의 한쪽 끝에 각각 서로 다른 리간드 L1과 L2가 위치하도록 형성한 후 상기 기술한 방법으로 이중가닥을 형성하면 이중가닥 양쪽에 이 두 가지 리간드가 위치하게 된다. 그리고 이 두 가지 리간드에 대한 수용체 R1과 R2를 이용하여 다양한 방식의 샌드위치 방법으로 분석할 수 있다. 여기에 사용할 수 있는 리간드의 예로는 FAM(fluorescein), 비오틴(biotin), 디곡신(digoxin), 아미노산 등을 들 수 있고 수용체의 예로는 항체(antibody), 아비딘(avidin), 스트렙트아비딘(streptavidin) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 리간드 L1 및 L2, 그리고 수용체 S1및 S2는 리간드와 수용체의 결합 관계가 있다면 어떠한 결합 형태라도 관계 없으나, 예를 들어, 리간드가 항체일 경우, 수용체는 FAM, 디곡신, 아미노산 등일 수 있다.

한편, 샌드위치 방법의 한 예로 리간드 L1의 수용체 R1을 고정시킨 포획입자와 리간드 L2의 수용체 R2를 고정시킨 검출표지를 이용하여 증폭핵산을 검출할 수 있다(도 7).

또한, 샌드위치 방법의 다른 예로 측면 흐름 분석(lateral flow assay) 방법을 이용할 수도 있다. 한 가지 예를 들면 검사지(assay strip)의 검사 선(test line)에는 수용체 R1을 고정시키고 수용체 R2를 금나노입자에 고정시켜 놓는다. 대조선(control line)에는 수용체 R1과 결합할 수 있는 이차수용체를 고정시켜 놓는다. 양 끝에 리간드 L1과 L2가 있는 증폭핵산이 포함된 시료를 검사지에 더하면 리간드 L2에 금나노입자가 결합하여 흘러가다가 리간드 L1에 의해 검사선에 결합하게 된다. 따라서 검사선에 띠가 나타나는 것으로 증폭핵산을 검출할 수 있게 된다. 증폭핵산에 결합하지 않은 금나노입자가 대조선에 결합하여 나타나는 띠는 검사지의 정상 여부를 확인하는데 사용된다.

따라서, 본 발명은 상기 기질핵산 S1 및 상기 기질핵산 S2는 한 쪽 말단에 서로 다른 리간드(ligand) L1 및 L2가 형성되어 있는 것인, 목표핵산 검출용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상기 리간드 L1 및 L2에 결합 가능한 수용체 R1 및 R2가 결합된 포획입자 및/또는 검출표지를 추가로 포함할 수 있고, 상기 리간드 L1 또는 L2는 FAM(fluorescein), 비오틴(biotin), 디곡신(digoxin) 및 아미노산(amino acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 수용체 R1 또는 R2는 항체(antibody), 아비딘(avidin) 및 스트렙트아비딘(streptavidin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

한편, 본 발명은 본 발명에 따른 목표핵산 검출용 조성물을 목표핵산을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 시료로부터 목표핵산의 존재여부를 검출하는 단계를 포함하는 목표핵산 검출 방법을 제공한다.

상기 목표핵산 검출용 조성물은 증폭 매개핵산, 기질핵산 S1 및 S2를 포함하고, 상기 목표핵산 검출 방법은 증폭핵산을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 증폭핵산은 상기 기질 S1 매개서열 6과 상기 기질 S2 상보서열 6'; 상기 기질 S1 매개서열 7과 상기 기질 S2 상보서열 7'; 상기 기질핵산 S1 상보서열 6'과 상기 기질핵산 S2 상보서열 6; 및 상기 기질 S1 상보서열 5와 상기 기질 S2 매개서열 5'이 상보적으로 결합되어 형성될 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 목표핵산 검출용 조성물을 포함하는 목표핵산 검출용 키트를 제공한다.

상기 조성물은 포획 상보서열 1 및 2와 포획 매개서열 3, 4, 3’ 및 2’를 순차적으로 포함하되, 상기 포획 상보서열 1 및 2는 전체로서 목표핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보서열이고, 상기 포획 상보서열 2 및 포획 매개서열 3과 상기 포획 매개서열 2’ 및 3’은 서로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성하며, 상기 포획 매개서열 4는 헤어핀 구조의 고리(loop)를 형성하는 것인 포획 매개핵산; 포획 프로브 서열 2, 3 및 4’을 순차적으로 포함하되, 상기 포획 매개서열 2’, 3’ 및 4에 상보적으로 결합하는 것인 포획 프로브; 표지 상보서열 a 및 b와 표지 매개서열 c, d, c’ 및 b’을 순차적으로 포함하되, 상기 표지 상보서열 a 및 b는 전체로서 목표핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 서열이고, 상기 표지 상보서열 b 및 표지 매개서열 c와 상기 표지 매개서열 b’ 및 c’은 서로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기를 형성하며, 상기 표지 매개서열 d는 헤어핀 구조의 고리를 형성하는 것인 표지 매개핵산; 및 표지 프로브 서열 b, c 및 d’을 순차적으로 포함하되, 상기 표지 매개서열 b’, c’ 및 d에 상보적으로 결합하는 것인 표지 프로브를 포함하며, 상기 포획 프로브에는 포획입자가 고정되어 있고, 상기 표지 프로브에는 검출표지가 고정되어 있을 수 있다.

또한, 상기 조성물은 증폭 상보서열 1, 2, 3 및 4와 증폭 매개서열 5, 6, 5' 및 4'를 순차적으로 포함하되, 상기 증폭 상보서열 4와 증폭 매개서열 4' 및; 상기 증폭 상보서열 5와 증폭 매개서열 5'은 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성하는 것인 증폭 매개핵산; 기질 S1 상보서열 4, 5 및 6'; 및 기질 S1 매개서열 7, 6 및 5'를 순차적으로 포함하되, 상기 기질 S1 상보서열 5와 상기 기질 S1 매개서열 5'; 및 상기 기질 S1 상보서열 6'와 상기 기질 S1 매개서열 6은 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성하는 것인 기질핵산 S1; 및 기질 S2 상보서열 6', 7' 및 6; 및 기질 S2 매개서열 5', 6' 및 7을 순차적으로 포함하되, 상기 기질 S2 상보서열 7'과 상기 기질 S2 매개서열 7; 및 상기 기질 S2 상보서열 6과 상기 기질 S2 매개서열 6'은 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성하는 것인 기질핵산 S2를 포함하되, 상기 기질 S1 매개서열 6과 상기 기질 S2 상보서열 6'; 상기 기질 S1 매개서열 7과 상기 기질 S2 상보서열 7'; 상기 기질핵산 S1의 상보서열 6'과 상기 기질핵산 S2의 상보서열 6; 및 상기 기질 S1 상보서열 5와 상기 기질 S2 매개서열 5'이 상보적으로 결합되어 있는 증폭핵산을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 목표핵산 검출용 조성물을 포함하는 목표핵산 검출용 키트를 제공한다.

상기 키트는 시약이 별도의 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱 또는 종이의 스트립 내에 제공되는 것을 포함할 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.

한편, 매개서열을 이용하여 증폭핵산을 생성할 때는 상보서열은 서로 다르고 매개서열의 일부분이 동일한 복수의 매개핵산을 사용할 수 있다. 예를 들어 도 8과 같이 매개핵산 1의 상보서열은 1-2-3-4이고 매개핵산 2의 상보서열은 8-9-10-11로 서로 다르지만 매개서열에는 동일하게 5-6-7-5' 서열을 포함하고 있다. 이렇게 제조된 매개핵산들은 목표핵산의 서로 다른 부위에 결합하지만 동일한 매개서열을 노출시키기 때문에 동일한 기질핵산 쌍을 사용해서 동일한 증폭핵산을 생성할 수 있다. 따라서 한 개의 매개핵산을 사용하는 것에 비해 더 빠른 속도로 증폭핵산을 생성하게 된다.

더 높은 감도를 얻기 위해서는 두 단계에 걸쳐 증폭핵산을 생성하는 것도 가능하다. 상기 기술한 방법으로 생성된 일차 증폭핵산의 단일가닥 부분에 의해 증폭핵산을 생성할 수 있는 기질핵산 쌍을 사용함으로써 이차 증폭핵산을 생성하는 것이다. 한 개의 일차 증폭핵산에 의해 여러 개의 이차 증폭핵산이 생성되기 때문에 이차 증폭핵산은 기하급수적으로 숫자가 늘어난다. 따라서 상기 기술한 증폭핵산을 검출하는 방법을 이용하여 이차 증폭핵산을 검출하면 짧은 시간에 고감도 검출이 가능하게 된다.

매개핵산이나 기질핵산 등은 DNA나 RNA oligonucleotide로 제작할 수도 있고 peptide nucleic acid와 같이 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 물질이면 어느 것이라도 사용이 가능하다.

핵산을 검출 가능한 수준까지 증폭하기 위해 효소와 단백질을 사용하는 PCR이나 등온증폭법과 달리 이 방법은 효소와 단백질들을 사용하지 않기 때문에 단순하고 경제적이고 신속한 장점이 있다. 또한 에 검출표지가 고정된 검출 프로브에 효소를 사용하지 않을 경우 검출에 사용되는 물질들이 온도에 민감하지 않기 때문에 이 발명에 의해 만들어지는 검출 키트를 실온에 보관하는 것도 가능하게 된다.

본 발명에서 사용되는 용어 “노출(exposure)”은 상기 포획 상보서열 1 및 2, 상기 표지 상보서열 a 및 b가 목표핵산에 결합하면, 상기 포획 상보서열 2와 포획 매개서열 2'; 포획 매개서열 3과 포획 매개서열 3'; 표지 상보서열 b와 표지 매개서열 b'; 및 표지 매개서열 c와 표지 매개서열 c'의 결합이 풀려, 포획 매개서열 또는 표지 매개서열의 전부 또는 일부가 단일가닥으로 노출되는 것과 같이 매개핵산의 매개서열의 전부 또는 일부가 단일가닥으로 노출되는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 상기 포획입자 및 검출표지의 크기는 포획입자를 포획하는 방법 또는 검출표지를 검출하는 방법에 따라 상이할 수 있다.

본 발명에 따른 목표핵산 검출방법은 포획입자와 검출표지가 동시에 결합된 목표핵산만 검출되기 때문에 검출 특이성도 매우 높다.

본 발명에서 사용된 용어 “상보적으로 결합하는”은 뉴틀레오티드 서열 간에 상보적 염기쌍을 형성하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포획 매개핵산은 서열목록의 서열번호 1로 표현된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 표지 매개핵산은 서열목록의 서열번호 2로 표현된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포획 프로브는 서열목록의 서열번호 3으로 표현된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 표지 프로브는 서열목록의 서열번호 4로 표현된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭 매개핵산이 검출하는 목표핵산은 서열목록의 서열번호 5로 표현된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭 매개핵산은 서열목록의 서열번호 6으로 표현된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 기질핵산 3은 서열목록의 서열번호 7로 표현된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 기질핵산 4는 서열목록의 서열번호 8로 표현된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 기질핵산 5는 서열목록의 서열번호 9로 표현된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 기질핵산 6은 서열목록의 서열번호 10으로 표현된다.

일 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 기질핵산 중에서 기질핵산 3에 기질핵산 4와 5가 결합한 형태를 “삼중복합체(ternary complex)”라고 사용할 수 있다(실시예 2 및 도 11).

일 실시예에 따르면, 본 발명에서 목표핵산과 증폭 매개핵산이 상보적으로 결합한 형태를 “목표핵산-증폭 매개핵산 복합체”라고 사용될 수 있다(실시예 2).

상기 복합체가 형성되면, 증폭 매개핵산의 헤어핀 구조가 풀려 증폭 매개핵산의 매개서열이 단일가닥으로 노출된다. 그리고 노출된 매개서열이 상기 복합체에 결합하면서 기질핵산 4가 떨어져 나간다. 이때 기질핵산 5의 결합 부위와 증폭 매개핵산의 매개서열의 결합 부위 사이에는 염기서열 4개만큼의 틈(gap)이 형성된다. 기질핵산 6이 틈(gap)으로부터 시작하여 기질핵산 3에 결합하면 이중가닥 증폭핵산이 생성되고 기질핵산 5와 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체는 떨어져 나오게 된다. 그리고 떨어져 나온 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체는 다시 단계 2로 들어가 반복해서 단계 2와 3의 반응을 일으키기 때문에 한 개의 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체에 의해 여러 개의 증폭핵산이 생성된다(도 13).

상기 증폭핵산이 생성되는 과정에서 형광원자단은 소광원이 제거되었기 때문에 강한 형광을 발생하게 되므로, 이때 증폭핵산의 형광을 측정하여 목표핵산을 검출할 수 있다. 이때 스트렙트아비딘이 고정된 자성입자로 증폭핵산을 포획하여 검출하면 더 높은 감도를 얻을 수 있다. 또한 상기 증폭핵산은 양 끝에 비오틴과 FAM을 가지고 있기 때문에 앞에서 비오틴과 FAM에 대한 수용체가 고정된 포획입자와 표지입자를 이용하거나 측면 흐름 분석법을 이용한 검출이 가능하다. 또한 스트렙트아비딘이 고정된 자성입자를 넣어 증폭핵산을 결합시킨 후 fluorescence polarization을 측정할 수 있다(실시예 2).

본 발명에서 사용된 용어 “시료”란 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “검출(detection)”은 시료 내 목표핵산의 존재 여부 및 정량적 분석을 포함할 수 있으며, 분석(analysis)의 의미를 포함하는 용어로 사용될 수 있다.

본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 “분리”는 핵산의 상보적 결합이 풀리는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 “프로브(probe)”는 포획 매개서열 및/또는 표지 매개서열의 전부 또는 일부에 결합하고, 한쪽 끝에 포획입자 또는 표지물질이 고정되어 목표핵산을 검출하는 탐침자를 포괄적으로 포함하는 개념이며, 바람직하게는 서열번호 3 및 4로 표현되는 서열을 의미한다.

본 발명에 따른 키트는 “구획화된” 키트일 수 있다. 구획화된 키트는 시약이 별도의 용기, 예컨대 작은 유리 용기, 플라스틱 용기, 또는 플라스틱 또는 종이의 스트립 내에 제공되어 있는 임의의 키트를 포괄한다. 이러한 용기들은 시료 및 시약의 교차오염을 방지하면서 시약을 한 구획으로부터 또 다른 구획으로 효율적으로 전달하게 할 수 있고/있거나, 각각의 용기의 물질 또는 용액을 한 구획으로부터 또 다른 구획으로 정량적 방식으로 첨가하게 할 수 있다. 이러한 키트는 시험될 시료는 수용할 용기, 분석에서 사용될 시약을 함유하는 용기, 세척 시약을 함유하는 용기, 및 검출 시약을 함유하는 용기도 포함될 수 있다.

본 발명의 키트는 원하는 방법을 수행하기 위해 키트 성분의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 쓰이고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 쓰인다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명에 따른 분자진단 방법에 의하면 효소에 의한 증폭방법을 사용하지 않고 매개핵산을 이용하여 극미량의 핵산을 검출할 수 있는 효과가 있다.

또한 현장에서 사용할 수 있는 간단하고 경제적인 목표핵산 검출용 키트를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 매개핵산을 이용하여 목표핵산을 검출하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따라 목표핵산에 포획 매개핵산과 표지 매개핵산을 결합시킨 후 포획입자와 검출표지를 이용하여 목표핵산을 검출하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따라 매개서열의 매개에 의한 증폭핵산 생성에 이용되는 매개핵산과 두 가지 기질핵산 S1 및 S2의 구조를 보여주는 도면이다.
도 4는 본 발명에 따라 매개서열의 매개에 의해 증폭핵산이 생성되는 것을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따라 포획입자와 검출표지를 이용하여 증폭핵산을 검출하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에 따라 서로 다른 리간드 L1과 L2가 기질핵산 S1 및 S2의 한 말단에 합성되어 증폭핵산을 생성되는 방법을 보여준다.
도 7은 본 발명에 따라 리간드 L1의 수용체 R1을 고정시킨 포획입자와 리간드 L2의 수용체 R2를 고정시킨 검출표지를 이용하여 리간드 L1과 L2가 연결된 증폭핵산을 검출하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 따라 한 개 이상의 목표핵산을 검출할 때, 목표핵산과 동일한 개수의 매개핵산을 이용하여 목표핵산을 검출하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 9는 포획입자(CP)와 검출표지(LP)에 각각 포획 프로브와 표지 프로브가 고정된 것을 확인하는 실험결과를 나타낸 그래프이다. 대조구로 자성입자(MP)와 유로퓸 형광입자(EP)가 사용되었다.
도 10은 본 발명의 포획 매개핵산과 표지 매개핵산을 목표핵산(target DNA)인 pMAL-CRI 플라스미드 DNA에 결합시키고 포획입자와 검출표지를 이용하여 검출한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 증폭 매개핵산을 이용하여 암피실린 내성 유전자의 검출할 때 사용된 DNA의 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 증폭 매개핵산을 이용하여 암피실린 내성 유전자의 검출할 때 기질핵산 3, 4, 및 5가 결합하여 형성하는 삼중복합체 TC의 구조를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 증폭 매개핵산을 이용하여 암피실린 내성 유전자의 검출할 때 증폭 매개핵산에 의해 증폭 연쇄반응이 반복적으로 일어나는 것을 나타낸 그림이다.
도 14는 본 발명의 증폭 매개핵산을 이용하여 암피실린 내성 유전자의 검출할 때 증폭 매개핵산에 의해 entropy-driven catalytic(EDC) 증폭 연쇄반응이 일어나는 것을 이용하여 암피실린 내성 유전자 염기서열의 일부에 해당하는 단일가닥 DNA를 검출한 결과를 나타낸 그래프이다.

[실시예]

실시예 1: 포획 매개핵산 및 표지 매개핵산을 이용한 암피실린 내성 유전자의 검출

1) 염기서열 정리

이중가닥 플라스미드 DNA인 pMAL-CRI의 암피실린 내성 유전자를 검출하였다. 하기 표 1에 목표핵산 내에서 포획 매개핵산과 표지 매개핵산이 결합하는 부분의 염기서열, 포획 매개핵산과 표지 매개핵산의 염기서열, 그리고 포획 프로브와 표지 프로브의 염기서열을 정리하였다.

[표 1]

포획 매개핵산과 표지 매개핵산은 모두 51 뉴클레오티드 길이이다. 헤어핀의 줄기를 형성하는 부분을 굵은 글자로 표시하였다. 포획 프로브는 28 뉴클레오티드 길이이고 그 가운데 3’-말단에 있는 10개의 T는 연결자(linker) 역할을 한다. 포획 프로브 5’-말단에는 자성입자의 카르복시기와 연결을 위해 아미노기를 추가하여 합성하였고 3’-말단에는 자성입자에 결합했는지 확인할 수 있도록 비오틴을 추가하여 합성하였다. 표지 프로브는 28 뉴클레오티드 길이이고 그 가운데 5’-말단에 있는 10개의 T는 연결자(linker) 역할을 한다. 표지 프로브 3’-말단에는 자성입자의 카르복시기와 연결을 위해 아미노기를 추가하여 합성하였고 5’끝에는 유로퓸 입자에 결합했는지 확인할 수 있도록 비오틴을 추가하여 합성하였다.

2) 자성입자와 포획 프로브의 고정

실리카로 코팅되고 표면에 카르복시기를 가지고 있는 직경 300 nm 크기의 자성입자(아모라이프사이언스, 김포, 한국)와 포획 프로브를 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)를 사용하는 화학적 방법으로 결합시켰다. 포획입자와 포획 프로브가 고정되었는지 확인하기 위해 ‘겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase)와 연결된 스트렙트아비딘(HRP-SA)’을 넣어 포획입자에 결합시켰다. 결합하지 않은 HRP-SA를 제거한 후 포획입자(CP)에 결합한 HRP 활성을 측정한 결과 자성입자(MP)를 단일 분자로 사용한 것에 비해 뚜렷하게 높은 활성을 보여주었다(도 9).

3) 유로퓸 형광입자와 표지 프로브의 고정

표면에 카르복시기를 가지고 있는 직경 300 nm 크기의 유로퓸 형광입자(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 표지 프로브를 EDC를 사용하는 화학적 방법으로 고정시켰다. 검출표지와 표지 프로브가 고정되었는지 확인하기 위해 HRP-SA를 넣어 검출표지에 결합시켰다. 결합하지 않은 HRP-SA를 제거한 후 검출표지(LP)에 결합한 HRP 활성을 측정한 결과 유로퓸 형광입자(EP)를 단일 분자로 사용한 것에 비해 비해 뚜렷하게 높은 활성을 보여주었다(도 9).

4) 포집 및 세기 측정

반응 완충용액(150 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄, 1 mM EDTA, 0.02% Ficoll 400, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% BSA, 100 μg/mL sheared salmon sperm DNA, 0.1% Tween-20)을 이용하여 목표핵산(pMAL-CRI)을 서로 다른 농도로 묽혀주었다. 묽힌 시료(10 μL)에 포획 매개핵산(5 μM 용액 10 μL)과 표지 매개핵산(5 μM 용액 10 μL)을 넣고 95℃에서 5분간 가열한 후 얼음에 5분간 놓아두었다. 포획 프로브가 고정된 포획입자(2 mg/mL 용액 10 μL)와 검출 프로브가 고정된 검출표지(2 mg/mL 용액 10 μL)를 넣고 실온(25℃)에서 30분 반응시켰다. 자석으로 포집한 후 세척 완충용액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1% Tween-20, 0.25% BSA, pH 8.0)으로 2회 세척하고 세척 완충용액 90 μL에 분산시킨 후 유로퓸 형광(excitation: 360 nm, emission: 620 nm)의 세기를 측정하였다.

그 결과, 목표핵산의 농도에 따라 형광의 세기가 증가하였으며 목표핵산이 1,000개만 있어도 목표핵산이 없는 대조구와 뚜렷한 차이를 보여주었다(도 10).

목표핵산 1,000개는 몰(mole)수로 계산하면 1.7×10^-21 즉 1.7 젭토몰(zeptomole)에 해당된다. 그리고 pMAL-CRI의 분자량이 약 330,000이기 때문에 질량으로는 0.56 펨토그램(femtogram)이다. 이는 효소를 이용한 증폭 없이 얻을 수 있는 가장 높은 수준의 감도라고 할 수 있다.

실시예 2: 증폭 매개핵산을 이용한 암피실린 내성 유전자의 검출

1) 염기서열 정리

이 실시예에서는 entropy-driven catalytic(EDC) 증폭 연쇄반응을 이용하여 암피실린 내성 유전자 염기서열의 일부에 해당하는 단일가닥 DNA를 검출하였다. 그러나 동일한 방법으로 이중가닥 플라스미드 DNA인 pMAL-CRI의 암피실린 내성 유전자의 검출도 가능하다. 하기 표 1에 목표핵산, 증폭 매개핵산, 그리고 기질핵산들의 염기서열을 정리하였다.

[표 2]

목표핵산은 암피실린 유전자의 일부분에 해당하는, 30 뉴클레오티드 길이의 단일가닥 DNA이다. 증폭 매개핵산은 모두 58 뉴클레오티드 길이이다. 헤어핀의 줄기를 형성하는 부분을 굵은 글자로 표시하였고 목표핵산과 결합하는 부분을 염기 위에 점으로 표시하였다. 이 방법에서는 네 가지 기질핵산, 즉 기질핵산 3, 4, 5, 6이 사용된다. 기질핵산 3의 3'-끝에는 형광원자단인 FAM을 추가하였고, 기질핵산 5의 5'-끝에는 소광원자단인 Dabcyl기를 추가하였으며, 기질핵산 6의 3'-끝에는 비오틴 기를 추가하여 합성하였다. 기질핵산 3의 서열 가운데 굵은 글자로 표시한 부분에는 기질핵산 4에서 T 연속부위를 제외한 나머지 서열이 결합하고, 점으로 표시한 부분에는 기질핵산 5가 결합할 수 있다.

2) 검출방법의 원리

표 2에 있는 핵산들의 구조를 도 11에 간단하게 나타내었다. 기질핵산 3에는 기질핵산 4와 5가 결합하여 삼중복합체 TC(ternary complex)를 형성할 수 있다(도 12). TC에서는 형광원자단인 FAM(F)과 소광원자단인 Dabcyl(Q)기가 가까이 있기 때문에 형광이 약해진다. 검출에는 TC와 기질핵산 6이 혼합된 조성물을 사용하게 된다.

목표핵산이 증폭 매개핵산과 결합하여 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체가형성되면 도 13의 단계 1과 같이 헤어핀 구조가 풀려 매개서열이 단일가닥으로 노출된다(도 13). 그리고 도 13의 단계 2와 같이 노출된 매개서열이 삼중 복합체 TC에 결합하면서 기질핵산 4가 떨어져 나간다(도 13). 이 때 기질핵산 5의 결합부위와 매개서열의 결합부위 사이에는 염기서열 4개만큼의 '틈(gap)'이 형성된다. 기질핵산 6이 틈(gap)으로부터 시작하여 기질핵산 3에 결합하면 이중가닥 증폭핵산이 생성되고 기질핵산 5와 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체는 떨어져 나오게 된다(도 13 단계 3). 그리고 떨어져 나온 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체는 다시 단계 2로 들어가 반복해서 단계2와 3의 반응을 일으키기 때문에 한 개의 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체에 의해 여러 개의 증폭핵산이 생성된다.

증폭핵산에 있는 형광원자단은 소광원자단이 제거되었기 때문에 강한 형광을 발생하게 되고 따라서 증폭핵산의 형광을 측정함으로써 목표핵산을 검출할 수 있다. 여기에서 스트렙트아비딘이 고정된 자성입자로 증폭핵산을 포획하여 검출하면 더 높은 감도를 얻을 수 있다. 또한 이 증폭핵산은 양 끝에 비오틴과 FAM을 가지고 있기 때문에 앞에서 설명한 것처럼 각각 비오틴과 FAM에 대한 수용체가 고정된 포획입자와 표지입자를 이용하거나 측면 흐름 분석법을 이용한 검출이 가능하다. 또한 스트렙트아비딘이 고정된 자성입자를 넣어 증폭핵산을 결합시킨 후 fluorescence polarization을 측정할 수도 있다.

3) 검출 결과

목표핵산과 증폭 매개핵산을 각각 최종농도가 250 nM이 되도록 혼합한 후 95도에서 5분 가열하고 실온(25도)에서 1시간 식힘으로써 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체(MO-T)가 생성되게 하였다. 기질핵산 3, 4, 및 5를 각각 최종농도가 2.5 μM이 되도록 혼합하여 실온에서 1시간 반응시킴으로써 삼중 복합체 TC가 생성되게 하였다. TAE-M 완충용액(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, 12.5 mM magnesium acetate, pH8) 12 μL에 2.5 μM 삼중복합체 TC를 4 μL, 2.5 μM 기질핵산 6을 5 μL, 250 nM 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체를 4 μL 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 비교치로는 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체(MO-T) 대신 250 nM 증폭 매개핵산(MO)을 4 μL 넣고 동일하게 반응시켰다. 검은색 384-well plate에 반응물 10 μL와 TAE-M 완충용액 90 μL를 넣고 plate reader를 이용하여 형광을 측정하였다. 그 결과 증폭 매개핵산(MO)을 넣은 비교치에 비해 목표핵산-증폭 매개핵산 복합체(MO-T)를 넣은 반응물의 형광이 현저하게 증가하였다(도 14). 이는 목표핵산과 결합하여 노출된 매개서열에 의해 증폭핵산이 생성되는 연쇄반응이 일어났다는 것을 보여준다.

<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> A method to detect nucleic acids <130> P20U12C0008 <150> KR 10-2019-0071266 <151> 2019-06-17 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture mediator nucleic acid <220> <221> modified_base <222> (1)..(51) <223> capture mediator nucleic acid <400> 1 aagatccgtg acatttcacg gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat g 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> labeling mediator nucleic acid <220> <221> modified_base <222> (1)..(51) <223> labeling mediator nucleic acid <400> 2 taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca aggagtttga tctccttgaa g 51 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> capture probe <400> 3 tgaaatgtca cggatctttt tttttttt 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> labeling probe <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> labeling probe <400> 4 tgaaatgtca cggatctttt tttttttt 28 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target nucleic acid for producing of amplification mediator nucleic acid <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> target nucleic acid for producing of amplification mediator nucleic acid <400> 5 tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 30 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplification mediator nucleic acid <220> <221> modified_base <222> (1)..(58) <223> amplification mediator nucleic acid <400> 6 taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca ccatgaccgg tgaagatcag ttgggtgc 58 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate nucleic acid 3 <220> <221> modified_base <222> (1)..(45) <223> substrate nucleic acid 3 <400> 7 acccaactga tcttcactgc gccgtaagtt agttcgagag gtagg 45 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate nucleic acid 4 <220> <221> modified_base <222> (1)..(30) <223> substrate nucleic acid 4 <400> 8 tttttttttt tttttcgcag tgaagatcag 30 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate nucleic acid 5 <220> <221> modified_base <222> (1)..(24) <223> substrate nucleic acid 5 <400> 9 cctacctctc gaactaactt acgg 24 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate nucleic acid 6 <220> <221> modified_base <222> (1)..(39) <223> substrate nucleic acid 10 <400> 10 cctacctctc gaactaactt acggcgcagt gaagatcag 39

Claims (19)

1. 목표핵산(target nucleic acid)과 결합할 수 있는 상보서열(complementary sequence); 및 목표핵산의 포획(capture) 또는 표지(labeling)를 매개할 수 있는 매개서열(mediator sequence)을 포함하는 헤어핀(hairpin) 구조의 매개핵산을 포함하고,
   상기 매개핵산은 상기 매개핵산의 상보서열과 목표핵산이 상보적으로 결합한 상태에서만 상기 매개핵산의 상보서열의 일부 또는 전부와 상기 매개핵산의 매개서열의 일부 또는 전부의 상보적 결합이 풀림으로써 상기 매개서열이 단일가닥으로 노출되는 것인 목표핵산 검출용 조성물로서,
   상기 조성물은 매개핵산으로서 포획 매개핵산 및 표지 매개핵산을 포함하고,
   상기 조성물은 추가로 포획 프로브가 자성입자에 고정되어 있는 포획입자 및 표지 프로브가 표지물질에 고정되어 있는 검출표지를 포함하는 것인, 목표핵산 검출용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 포획 매개핵산은 포획 상보서열 1 및 2와 포획 매개서열 3, 4, 3' 및 2'를 순차적으로 포함하되,
   상기 포획 상보서열 1 및 2는 전체로서 목표핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보서열이고,
   상기 포획 상보서열 2 및 포획 매개서열 3과 상기 포획 매개서열 2' 및 3'은 서로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성하며,
   상기 포획 매개서열 4는 헤어핀 구조의 고리(loop)를 형성하고,
   상기 표지 매개핵산은 표지 상보서열 a 및 b와 표지 매개서열 c, d, c' 및 b'을 순차적으로 포함하되,
   상기 표지 상보서열 a 및 b는 전체로서 목표핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 서열이고,
   상기 표지 상보서열 b 및 표지 매개서열 c와 상기 표지 매개서열 b' 및 c'은 서로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기를 형성하며,
   상기 표지 매개서열 d는 헤어핀 구조의 고리(loop)를 형성하는 것인, 목표핵산 검출용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 목표핵산과 상기 포획 상보서열 1 및 2, 상기 표지 상보서열 a 및 b가 결합하면,
   상기 포획 상보서열 2와 포획 매개서열 2'; 포획 매개서열 3과 포획 매개서열 3'; 표지 상보서열 b와 표지 매개서열 b'; 및 표지 매개서열 c와 표지 매개 서열 c'의 상보적 결합이 풀리는 것을 특징으로 하는 목표핵산 검출용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 포획 프로브는 포획 프로브 서열 2, 3 및 4'을 순차적으로 포함하되,
   상기 포획 프로브 서열 2, 3 및 4'는 제3항에 따른 포획 매개서열 2', 3' 및 4에 상보적으로 결합하고,
   상기 표지 프로브는 표지 프로브 서열 b, c 및 d'을 순차적으로 포함하되,
   상기 표지 프로브 서열 b, c 및 d'은 제3항에 따른 표지 매개서열 b', c' 및 d에 상보적으로 결합하는 것인 목표핵산 검출용 조성물.
5. 제1항에 따른 목표핵산 검출용 조성물을 목표핵산을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 시료로부터 목표핵산의 존재여부를 검출하는 단계를 포함하는 목표핵산 검출 방법.
6. 제1항에 따른 목표핵산 검출용 조성물을 포함하는 목표핵산 검출용 키트.
7. 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 포획 상보서열 1 및 2와 포획 매개서열 3, 4, 3' 및 2'를 순차적으로 포함 하되,
   상기 포획 상보서열 1 및 2는 전체로서 목표핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보서열이고,
   상기 포획 상보서열 2 및 포획 매개서열 3과 상기 포획 매개서열 2' 및 3'은 서로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기(stem)를 형성하며,
   상기 포획 매개서열 4는 헤어핀 구조의 고리(loop)를 형성하는 것인 포획 매개핵산; 포획 프로브 서열 2, 3 및 4'을 순차적으로 포함하되,
   상기 포획 매개서열 2', 3' 및 4에 상보적으로 결합하는 것인 포획 프로브; 표지 상보서열 a 및 b와 표지 매개서열 c, d, c' 및 b'을 순차적으로 포함하되, 상기 표지 상보서열 a 및 b는 전체로서 목표핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 서열이고,
   상기 표지 상보서열 b 및 표지 매개서열 c와 상기 표지 매개서열 b' 및 c'은 서로 결합하여 헤어핀 구조의 줄기를 형성하며,
   상기 표지 매개서열 d는 헤어핀 구조의 고리를 형성하는 것인 표지 매개핵산; 및 표지 프로브 서열 b, c 및 d'을 순차적으로 포함하되,
   상기 표지 매개서열 b', c' 및 d에 상보적으로 결합하는 것인 표지 프로브를 포함하며,
   상기 포획 프로브에는 포획입자가 고정되어 있고, 상기 표지 프로브에는 검출표지가 고정되어 있는 것인, 목표핵산 검출용 키트.
8. 제6항에 있어서,
   상기 키트는 시약이 별도의 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱 또는 종이의 스트립 내에 제공되는 것을 포함하는 것인, 목표핵산 검출용 키트.
   
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