WO2023080710A1 - 나노입자를 이용한 표적물질의 증폭 또는 검출 방법 - Google Patents

나노입자를 이용한 표적물질의 증폭 또는 검출 방법 Download PDF

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WO2023080710A1
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WO
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target
strand
oligonucleotide
cloning
ncr
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PCT/KR2022/017238
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박은혜
남좌민
김선기
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서울대학교산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present application is a nanoparticle comprising a plurality of partially double-stranded probes, and a composition for amplifying, detecting, quantifying, identifying, and/or visualizing a target material using the nanoparticles. , arrays, kits, devices, and/or methods.
  • Onsite sensing and diagnostic methods provide a fast, inexpensive, and direct means to identify the sources of acute illness, infection, or biological and chemical warfare agents with little or no equipment required. has advantages, and is particularly useful on a portable platform.
  • colorimetric methods are powerful and widely applicable because they can detect targets with the naked eye without specialized knowledge or equipment.
  • nanoparticle-based colorimetric assays rely only on the optical properties of nanomaterials, which limits their sensitivity, reliability and quantification capabilities. Therefore, colorimetric analysis generally has a narrow range of practical use, low reliability, and is not suitable for application to analysis requiring high sensitivity.
  • ultrasensitive detection methods are based on polymerase chain reaction (PCR) or highly sophisticated amplification, sensing and imaging techniques.
  • the present application provides nanoparticles having a plurality of partially double-stranded probes and amplification, detection, quantification, identification, and/or visualization of a target substance using the nanoparticles.
  • oligonucleotide comprising:
  • a first strand (template strand) comprising;
  • target-cloning strand or target-amplification strand (2) a second strand comprising the same sequence as the target oligonucleotide (target-cloning strand or target-amplification strand).
  • Another example provides a nanoparticle comprising two or more of the above partially double-stranded oligonucleotides on its surface.
  • a substrate particle comprising a target-capture strand that partially hybridizes with a target oligonucleotide on its surface
  • amplification, detection, quantification, identification of a target material comprising the nanoparticle, and / or compositions, arrays, kits, and / or devices for visualization are provided.
  • a substrate particle comprising a target-capture strand that partially hybridizes with a target oligonucleotide on its surface
  • amplification, detection, quantification, identification of a target material using the nanoparticle and/or provide a visualization method.
  • Another example is (a) a substrate particle comprising on its surface a target-capture strand that partially hybridizes with a target oligonucleotide, and/or (b) amplification, detection, quantification, identification of the target material of the nanoparticle, and/or Or provide a use for visualization.
  • nanoparticles having a specific structure and “Nanoparticle Chain Reaction (NCR)” technology using the nanoparticles are provided.
  • the NCR technology is one of the nucleic acid molecule amplification methods, and is differentiated from the existing PCR (polymerase chain reaction) in that it is an enzyme-free technology that uses nanoparticles having a specific structure in place of polymerase, and is simpler and amplified than existing technologies. Since the efficiency is remarkably high, it can be used very usefully for detecting nucleic acid molecules and various target substances that can be amplified through nucleic acid molecules.
  • target material refers to a composition, array, kit, device, and/or method for amplification, detection, quantification, identification, and/or visualization provided herein that ultimately amplifies, It refers to a substance to be detected, quantified, confirmed, and/or visualized, and may be selected from all substances having biological activity.
  • the target material is an organism (various eukaryotic or prokaryotic cells; eg, viruses, bacteria, fungi, etc.) or biologically active substances, such as nucleic acid molecules (e.g., full-length genomes (DNA or RNA), genome fragments, genes, gene fragments, siRNA, miRNA, biomarkers, other DNA or RNA fragments, etc.), proteins, peptides, macromolecules, small molecule chemicals (e.g., various It may be at least one selected from the group consisting of metal ions, chemical drugs including at least one selected from the group consisting of organic compounds, etc.), etc., but is not limited thereto.
  • nucleic acid molecules e.g., full-length genomes (DNA or RNA), genome fragments, genes, gene fragments, siRNA, miRNA, biomarkers, other DNA or RNA fragments, etc.
  • proteins e.g., various It may be at least one selected from the group consisting of metal ions, chemical drugs including at least one selected from
  • the bioactive material such as the nucleic acid molecule, protein, peptide, etc. may be derived from the above-described organism (eg, virus, bacteria, fungus, etc.), but is not limited thereto, recombinantly or chemically synthesized it may have been
  • sample may mean any biological and/or environmental sample for which the presence and/or level of a target substance is to be measured.
  • the biological sample may be selected from the group consisting of cells, tissues, blood, lymph, saliva, sputum, nasal mucus, urine, feces, and other body fluids isolated from a subject (patient), but is not limited thereto.
  • the target may include humans, livestock (eg, cows, pigs, horses, sheep, goats, dogs, cats, etc.), birds (chicken, ducks, geese, turkeys, ostriches, quails, etc.), but is not limited thereto. no.
  • target oligonucleotide refers to an oligonucleotide that is directly amplified by the chain reaction provided herein, and is also referred to as “target strand”, and the two terms compatible in an equivalent sense.
  • target oligonucleotide is
  • the target material is a nucleic acid molecule, all of it (if the nucleic acid molecule is a DNA fragment and / or RNA fragment) or a part thereof (a sequence to be amplified; e.g., a part unique to the nucleic acid molecule),
  • target substance is a protein, peptide, polymer, or small molecule chemical substance, it can be understood as the same as the target-cloning strand described below.
  • template strand refers to a single-stranded oligonucleotide used as a template for target oligonucleotide amplification in the NCR technology provided herein, and is complementary to the full-length target oligonucleotide sequence. It may include a target-cloning site having an ideal nucleic acid sequence and a target-binding site having a nucleic acid sequence complementary to a part of the target oligonucleotide.
  • the template strand is 10-1000 nt, 10-500 nt, 10-200 nt, 10-100 nt, 10-90 nt, 10-80 nt, 10-70 nt, 10-60 nt, 10-55 nt, 10 It may be an oligonucleotide of -50 nt, or 10-45 nt in length, but is not limited thereto.
  • target-cloning strand refers to a single-stranded oligonucleotide having the same nucleic acid sequence as the target oligonucleotide or a partial amplification target sequence of the target, and the target-cloning site and the target-cloning strand of the template strand. Hybridization (complementary binding) is possible.
  • target-capturing strand refers to a function of capturing a target oligonucleotide in a substrate particle, and is different from the target-binding site of the template strand of the target oligonucleotide and the complementary portion. It refers to a single-stranded oligonucleotide having a nucleic acid sequence complementary to a part.
  • nucleic acid molecule or protein “has a specific nucleic acid sequence or amino acid sequence” may mean that it includes the sequence or consists essentially of the sequence.
  • One example provides a partially double-stranded oligonucleotide comprising:
  • a first strand (long (extended) strand; hereinafter also referred to as template strand) comprising:
  • a target-binding site that is hybridizable or complementary to a portion of the target oligonucleotide, wherein the target-cloning site and the target-binding site are linked to each other (e.g., the 3'-end of the target-cloning site and The 5'-end of the target-binding site may be linked, or the 5'-end of the target-cloning site and the 3'-end of the target-binding site may be linked);
  • a second strand (shorter strand (shorter than the first strand)) comprising the same sequence as the target oligonucleotide (ie, a sequence complementary (hybridizable) with the target-cloning site of the first strand; , Also referred to as target-cloning strand or target-amplification strand, the two terms are interchangeable with equivalent meaning),
  • the target-cloning strand hybridizes (complementary binding) with the target-cloning site of the template strand to form a double-stranded structure (ie, a double-stranded portion (site) of a partially double-stranded oligonucleotide), and the template The target-binding site of the strand is exposed in single-stranded form.
  • the template strand is 10-1000 nt, 10-500 nt, 10-200 nt, 10-100 nt, 10-90 nt, 10-80 nt, 10-70 nt, 10-60 nt, 10-55 nt, 10 It may be an oligonucleotide of -50 nt, or 10-45 nt in length, but is not limited thereto.
  • the target-cloning strand may be an oligonucleotide of a length that hybridizes with the target-cloning site of the first strand and exposes the target-binding site, eg, the same as the target oligonucleotide.
  • NCR probes NCR probes
  • a nanoparticle comprising one or more (eg, two or more or a plurality) partially double-stranded oligonucleotides on its surface.
  • the partially double-stranded oligonucleotide is as described above.
  • the partially double-stranded oligonucleotide is at one end of the template strand (e.g., the other end of both ends of the target-cloning site in the template strand from the end connected to the target-binding site), directly or through a linker (first linker ), it may be fixed (attached) to the surface of the nanoparticle.
  • the nanoparticles, on the surface are the nanoparticles, on the surface.
  • a template strand comprising: (i) a target-cloning site immobilized to the surface directly or via a linker (first linker), and (ii) one end of the target-cloning site (e.g., a nanoparticle a target-binding site linked to a surface-anchored end and a different end); and
  • the target-cloning site of the template strand (first strand) and the target-cloning strand (second strand) hybridize to form a partially double-stranded oligonucleotide having a partially double-stranded structure, and the target of the template strand -The binding site may be in an exposed form.
  • the number of partially double-stranded oligonucleotides fixed (attached) to the surface per nanoparticle is 1 or more, 2 or more, 10 or more, 20 or more, 50 or more, 70 or more, 100 or more, 120 or more.
  • , 150 or more, or 170 or more (the upper limit is not particularly limited, and may be the maximum number of oligonucleotides attachable to the nanoparticle surface (which may be appropriately determined based on the nanoparticle surface area), for example, 10,000, 5,000, 2,500, 1,000, 750, 500, 250, or 200, but is not limited thereto), but is not limited thereto.
  • the nanoparticle may be made of a material capable of being visualized (eg, naked-eye-detectable) and/or conjugable to a biomolecule (eg, nucleic acid molecule, antibody, etc.), such as , metals such as gold (e.g., gold nanoparticles), silver (e.g., silver nanoparticles), platinum, copper, alloys (e.g. including two or more selected from the group consisting of gold, silver, platinum, copper, etc.), silica, It may be made of a material such as hydrogel, carbon nanotube, quantum dot, etc., but is not limited thereto.
  • the nanoparticles may be visualized by a fluorescent label included in oligonucleotides bound to the surface.
  • the size (average diameter) of the nanoparticles may be 1 to 1000 nm, 1 to 500 nm, 1 to 200 nm, 1 to 100 nm, 10 to 1000 nm, 10 to 500 nm, 10 to 200 nm, or 10 to 100 nm, but is not limited thereto. no.
  • the nanoparticle is not particularly limited in its structure and/or shape, and for example, has a solid structure, core-shell structure, hollow structure, etc., and/or has a circular, elliptical, tubular, polygonal structure, etc. It may have, but is not limited thereto. In some cases, the level of biomolecule binding, amplification, and/or visibility may be adjusted depending on the type of nanoparticle.
  • the nanoparticle may be used as a probe (NCR probe) for detecting or amplifying a target oligonucleotide.
  • the partially double-stranded oligonucleotide or the nanoparticle attached to the surface has a site (having a complementary sequence) capable of hybridizing with the target oligonucleotide (target-binding site) and a nucleic acid sequence identical to the target-oligonucleotide. Since the branch contains a target-cloning strand, it can be advantageously used for detection and/or amplification of the target oligonucleotide or target substance.
  • the nanoparticle may further include a binding material of the target material in addition to the partially double-stranded oligonucleotide described above.
  • the binding material of the target material may be at least one selected from the group consisting of an antibody, an aptamer, and a small molecule chemical material capable of binding (eg, specific binding) to a part of the target material.
  • substrate particle refers to any type of particle having a surface capable of immobilizing a capture material (eg, oligonucleotide, antibody, peptide, polymer compound, etc.) of a target material.
  • a capture material eg, oligonucleotide, antibody, peptide, polymer compound, etc.
  • one or more (e.g., two or more or a plurality) target-capturing strands (or target-capturing oligonucleotides) having a sequence hybridizable to or complementary to a portion of the target oligonucleotide ) is provided with substrate particles fixed (attached, adhered) to the surface.
  • the target-capture strand may be fixed (attached) to the substrate particle surface directly or through a linker (second linker).
  • the target-capture fixed (attached) to the surface per substrate particle As will be described later, since the number of nanoparticles obtained by multiplying the number of target-cloning strands included in the nanoparticle by the number of NCR cycles is bound to the substrate particle, the target-capture fixed (attached) to the surface per substrate particle.
  • the number of strands should be sufficiently large to cover the number of nanoparticles.
  • the number of target-capture strands included per substrate particle is 10 or more, 50 or more, 10 2 or more, 10 3 or more, 10 5 or more, 10 6 or more, 10 7 or more, or 10 8 or more (the upper limit is not particularly limited, and may be the maximum number of oligonucleotides attachable to the substrate particle surface (which may be appropriately determined based on the substrate particle surface area), for example, 10 12 , 10 11 , It may be 10 10 or 10 9 , but is not limited thereto), but is not limited thereto.
  • the substrate particle may be made of a solid material, and in order to facilitate the collection / purification of the complex formed with the nanoparticle, it may be one or more selected from the group consisting of magnetic particles and beads (eg, magnetic beads, etc.,
  • the substrate particle is a group consisting of gold (e.g., gold nanoparticles), silver (e.g., silver nanoparticles), platinum, copper, alloy (e.g. gold, silver, platinum, copper, etc.) It may be made of a material such as metal, silica, hydrogel, carbon nanotube, quantum dot, etc., but is not limited thereto.
  • the size (average diameter) of the substrate particle is It should be sufficiently larger than the nanoparticles, and may be 2 times or more, 5 times or more, 10 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more, or 50 times or more of the nanoparticle size (average diameter), for example, 0.1 to 100 ⁇ m, 0.1 to 50 ⁇ m, 0.1 to 20 ⁇ m, 0.1 to 10 ⁇ m, 0.1 to 8 ⁇ m, 0.1 to 5 ⁇ m, 0.1 to 3 ⁇ m, 0.5 to 100 ⁇ m, 0.5 to 50 ⁇ m, 0.5 to 20 ⁇ m, 0.5 to 10 ⁇ m, 0.5 to 8 ⁇ m, 0.5 to 5 ⁇ m, 0.5 to 3 ⁇ m, 1 to 100 ⁇ m, 1 to 50 ⁇ m, 1 to 20 ⁇ m, 1 to 10 ⁇ m, 1 to 8 ⁇ m, 1 to 5 ⁇ m, or
  • the substrate particle may have a size of 1 ⁇ m to 3 ⁇ m, but is not limited
  • the matrix particle may further include a target material capture material in addition to the target-capture strand described above.
  • the capture material of the target material may be one or more selected from the group consisting of an antibody, an aptamer, and a small molecule chemical substance capable of binding (eg, specific binding) to a part of the target material.
  • the capture material of the target material included in the substrate particle and the binding material of the target material included in the nanoparticles may bind to different sites of the target material. That is, in the target material, binding sites of the capture material and the binding material may not overlap each other.
  • a linker usable for immobilizing (attaching) the template strand (target-cloning site) to the nanoparticle surface and a linker usable for immobilizing (attaching) the target-capture strand to the substrate particle (
  • the second linker may be appropriately selected from all materials capable of attaching oligonucleotides to the surface of solid particles, and may include, for example, chemical functional groups (eg, thiol group (SH), amine group (NH2), etc.), binding proteins (eg, biotin), etc., but is not limited thereto, and may be appropriately selected depending on the surface material of the adhered particles.
  • the linker is attached to the ends at which the template strand and the target-capture strand bind to the surface of the nanoparticle and the substrate particle, respectively (e.g., the 3' end for the template strand and the 5' end for the target-capture strand), and / or may be bound to the surface of nanoparticles and / or substrate particles.
  • the template strand and/or the target-capture strand have ends (e.g., 3' ends in the case of template strands) that bind to the surface of the nanoparticle and/or substrate particle, respectively, in order to maintain a predetermined distance from the surface of the nanoparticle and/or substrate particle.
  • the target-capture strand may further include a spacer at the 5' end) (if the strands include a linker, the spacer is between the template strand and the first linker (first spacer), and / or between the target-capture strand and the second linker (second spacer)).
  • the spacer may be appropriately selected from all materials having a length/volume capable of providing a predetermined distance, and for example, oligonucleotides (eg, Poly A (eg, A 2-20 ), etc.), polymers (eg, polyethylene) It may be one or more selected from the group consisting of glycol (PEG), etc.), alkyl having 1-6 carbon atoms, etc., but is not limited thereto.
  • the spacer is poly A, PEG, or a combination thereof (first spacer) , or poly A, alkyl having 1 to 6 carbon atoms, or a combination thereof (second spacer), but is not limited thereto.
  • compositions or uses
  • arrays, kits, and/or devices for the amplification, detection, quantification, identification, and/or visualization of a target substance comprising one or more substrate particles and one or more nanoparticles as described above.
  • the composition, array, kit, and/or device may include the substrate particles and/or nanoparticles in a form in which they are dispersed and/or suspended in an appropriate medium (eg, liquid medium).
  • composition, array, kit, and/or device may include:
  • nanoparticles (b) one or more (eg, two or more) nanoparticles, wherein each nanoparticle has one or more (eg, two or more or multiple) partially double-stranded oligonucleotides on its surface.
  • the nanoparticles and partially double-stranded oligonucleotides are as described above.
  • compositions, array, kit, and/or device for amplification, detection, quantification, identification, and/or visualization of the target material may include:
  • a substrate particle having one or more (e.g., two or more or multiple) target-capture strands having a sequence capable of hybridizing with or complementary to a part (first part) of the target oligonucleotide fixed (attached, adhered) to the surface;
  • each nanoparticle comprises one or more (e.g., two or more or a plurality) partially double-stranded oligonucleotides on its surface, each The partially double-stranded oligonucleotides of include:
  • a first strand comprising:
  • a target-binding site that is hybridizable or complementary to a portion (second portion) of the target oligonucleotide, wherein the target-cloning site and the target-binding site are linked to each other (e.g., a target-cloning site
  • a target-cloning site The 3'-end and the 5'-end of the target-binding site may be joined, or the 5'-end of the target-cloning site and the 3'-end of the target-binding site may be linked;
  • a second strand comprising the same sequence as the target oligonucleotide (i.e., a sequence complementary to (hybridizable with) the target-cloning site of the template strand);
  • the target-cloning strand hybridizes with the target-cloning site of the template strand to form a double-stranded structure (ie, the double-stranded portion (site) of the partially double-stranded oligonucleotide), and the target-binding of the template strand The site is exposed in single-stranded form.
  • a double-stranded structure ie, the double-stranded portion (site) of the partially double-stranded oligonucleotide
  • the target-capture strand essentially includes a portion capable of hybridizing with a portion (first portion) of the target oligonucleotide, and one end thereof (eg, 5' end or 3' end) is directly or through a linker (second linker). It may be fixed (attached) to the substrate particle surface.
  • the part where the target-capture strand on the substrate particle is hybridized (first part) and the part where the target-binding site on the first strand on the nanoparticle is hybridized (second part) overlap each other. It may have been designed to not. For example, if the target-capture strand hybridizes with the 5' terminal portion (first portion) of the target oligonucleotide, the target-binding portion hybridizes with the 3' terminal portion (second portion) of the target oligonucleotide.
  • the target-binding site is the 5' terminal portion of the target oligonucleotide ( The second part) may be hybridized with.
  • a portion (first portion) of the target oligonucleotide is a substrate. It hybridizes with one or more target-capture strands on the particle to produce one or more unhybridized, single-stranded, exposed second portions of the target oligonucleotide.
  • the at least one second portion exposed in this way binds to the target-binding site in the template strand on the nanoparticle, thereby binding the at least one nanoparticle to the substrate particle to form a substrate particle-nanoparticle sandwich composite.
  • the target-cloning strand of each nanoparticle is dehybridized with the target-cloning site of the template strand and released. Since the target-cloning strand released in this way has the same nucleic acid sequence as the target oligonucleotide, it hybridizes with the target-capture strand on the substrate particle in the first portion and repeats the next cycle. By this process, as the cycle is repeated, the number of nanoparticles bound to the substrate particle surface increases exponentially and accumulates (concentrates).
  • the number of nanoparticles multiplied by the number of cycles by the number of target-cloning strands included in the nanoparticle binds to the substrate particle and accumulates (concentrates) [(target-cloning strand per nanoparticle number) n , where n is the number of cycles].
  • concentration of the target oligonucleotide and/or concentration of the nanoparticles to a detectable level, such as a visually detectable level (i.e., through a color change of the solution due to the accumulated (concentrated) nanoparticles, etc. Easy to detect presence and/or concentration of).
  • Another example provides a method for amplifying, detecting, quantifying, confirming, and/or visualizing a target material using the substrate particles and nanoparticles described above.
  • the method may include:
  • A adding (or applying or contacting) a target oligonucleotide or a sample to a substrate particle having a plurality of target-capture strands on the surface, thereby hybridizing a part (first part) of the target oligonucleotide and the target-capture strand step;
  • oligonucleotides each partially double-stranded oligonucleotide comprising:
  • a first strand comprising:
  • target-cloning strand (2) a second strand comprising the same sequence as the target oligonucleotide (target-cloning strand);
  • a complex between the substrate particle and the nanoparticle is formed by hybridization of the target-binding site with another part (second part) of the target oligonucleotide partially hybridized with the target-capture strand on the surface of the substrate particle;
  • step (A) when the target oligonucleotide or the sample is added to the substrate particle having a plurality of target-capture strands on the surface, the target-capture strands can hybridize to a part (first part) of the target oligonucleotide.
  • the target oligonucleotide present in the target oligonucleotide sample (if present in the sample) can be captured.
  • the plurality of nanoparticles used in step (B) each include a plurality of partially double-stranded oligonucleotides on their surface, and each partially double-stranded oligonucleotide may include:
  • a first strand comprising:
  • a target-binding site that is hybridizable or complementary to a portion (second portion) of the target oligonucleotide, wherein the target-cloning site and the target-binding site are linked to each other (e.g., a target-cloning site
  • a target-cloning site The 3'-end and the 5'-end of the target-binding site may be joined, or the 5'-end of the target-cloning site and the 3'-end of the target-binding site may be linked;
  • a second strand comprising the same sequence as the target oligonucleotide (ie, comprising a sequence complementary (hybridizable) with the target-cloning site of the first strand).
  • the target-cloning strand hybridizes with the target-cloning site of the template strand to form a double-stranded structure (ie, the double-stranded portion (site) of the partially double-stranded oligonucleotide), and the target-binding of the template strand
  • the site is exposed in a single-stranded form, allowing hybridization between the target-capturing strand on the substrate particle and the other part (second part) of the target oligonucleotide partially hybridized (in the first part) and the target-binding site,
  • a sandwich complex assembly between substrate particles and nanoparticles may be formed.
  • the first part in the targeting oligonucleotide binds (hybridizes) to the target-binding site of the template strand on the nanoparticle, and the second part (not overlapping with the first part) binds (hybrids) to the target-capture strand on the substrate particle.
  • step (C) the dehybridizing of the partially double-stranded oligonucleotide and/or the disassembly of the sandwich complex assembly (eg, may be due to the dehybridizing) It can be carried out by conventional dehybridization means.
  • the dehybridization is performed by an increase in pH (eg, basic conditions), an increase in temperature (eg, 50 to 100 ° C, 52 to 100 ° C, 55 to 100 ° C, 50 to 90 ° C, 52 to 90 ° C).
  • °C increase in the range of 55 to 90 °C
  • salt (salt) concentration can be carried out by one or more selected from the group consisting of, etc.
  • the salt solution is distilled water It was replaced and performed by lowering the temperature, but is not limited thereto.
  • the target-capture strand and the target oligonucleotide hybridized with the target-binding site and/or the target-cloning strand hybridized with the target-cloning site are each dehybridized and released in single-stranded form do.
  • the binding (hybridization) between the target oligonucleotide by dehybridization, the target-binding site of the template strand on the nanoparticle and the target-capture strand on the substrate particle is also decomposed, thereby forming a complex through the target oligonucleotide.
  • the formed nanoparticles and substrate particles are separated (released). The thus released target-cloning strands and nanoparticles can be used for subsequent cycles.
  • step (B) the step of separating, collecting, and/or concentrating the complex may further be included (B-1), wherein the separated, collected, and/or concentrated complex Step (C) may be performed for Separation, collection, and/or concentration of the complex may be performed by applying a magnetic field (e.g., using a magnet; when the matrix particles are magnetic particles), and/or centrifugation, but is not limited thereto, It can be carried out by a conventional method appropriately selected in consideration of the material, characteristics, etc. of the particles used.
  • a magnetic field e.g., using a magnet; when the matrix particles are magnetic particles
  • steps (A) to (C) may be repeated two or more times (steps (A) to (C) are 1 cycle).
  • the target-cloning strand having the same sequence as the target oligonucleotide, released in the form of a single strand in step (C) is again used as the target oligonucleotide in step (A), and the nanoparticles released in step (C) can be used as an NCR probe to perform the next cycle.
  • one target oligonucleotide is amplified by the number of target-cloning strands included in one nanoparticle, and in the next cycle, nanoparticles as many as the number of target-cloning strands are bound to one substrate particle, and the step proceeds. do.
  • one target oligonucleotide is amplified by the number multiplied by the number of cycles by the number of target-cloning strands included per nanoparticle. That is, the number of target oligonucleotides according to the cycle performance may be m n times the initial number (m is the number of target-cloning strands per nanoparticle (174 are exemplified in the example), n is the number of cycles).
  • the amplification level of the NCR technology provided in this specification is remarkably high.
  • the number of target-cloning strands per nanoparticle (m) is 2 or more, 10 or more, 20 or more, 50 or more, 70 or more, 100 or more, 120 or more, 150 or more, or 170 or more (the upper limit is not particularly limited, and may be the maximum number of oligonucleotides attachable to the nanoparticle surface (which may be appropriately determined based on the nanoparticle surface area), for example, 10,000, 5,000, 2,500, 1,000, 750, 500, 250, or 200, but is not limited thereto), but is not limited thereto.
  • the target-cloning strand number (m) per nanoparticle may be 2 to 1,000, 2 to 500, 50 to 1,000, 50 to 500, 100 to 1,000, or 100 to 500, but is limited thereto It is not.
  • the number of cycles (n) is 1 to 20 times, 1 to 15 times, 1 to 10 times, 1 to 5 times, 2 to 20 times, 2 to 15 times, 2 to 10 times, 2 to 5 times , 3 to 20 times, 3 to 15 times, 3 to 10 times, or to 3 to 5 times, but is not limited thereto.
  • the target material is a bioactive material other than a nucleic acid molecule
  • in the composition, array, kit, device and / or method for amplifying, detecting, quantifying, confirming, and / or visualizing the target material in the composition, array, kit, device and / or method for amplifying, detecting, quantifying, confirming, and / or visualizing the target material
  • the substrate particle of (a), in addition to the target-capture strand described above, further includes a capture material for the target material,
  • the nanoparticle of (b) may further include a binding material of the target material in addition to the partially double-stranded oligonucleotide described above.
  • the binding material of the target material may be at least one selected from the group consisting of an antibody, an aptamer, and a small molecule chemical material capable of binding (eg, specific binding) to a part of the target material.
  • the capture material of the target material included in the substrate particle and the binding material of the target material included in the nanoparticles may bind to different sites of the target material. That is, in the target material, binding sites of the capture material and the binding material may not overlap each other.
  • the target material is a bioactive material other than a nucleic acid molecule
  • the target material or sample is brought into contact with a substrate particle on which a capture material of the target material is immobilized, a part of the target material binds to the capture material, and the target material
  • the binding material binds to the target material at a site different from the binding site to the capture material, thereby forming a complex between the substrate particle and the nanoparticle. Formation of the complex dehybridizes the partially double-stranded oligonucleotide on the nanoparticle, releasing the target-cloning strand.
  • the released target-cloning strand has the same nucleic acid sequence as the target oligonucleotide, a part thereof hybridizes with the target-capture strand on the surface of the substrate particle, and the subsequent process is the same as in (A) to (C) described above.
  • bioactive substances other than nucleic acid molecules can be amplified and/or detected by the target-cloning strand. That is, the presence and/or level of the bioactive material in the sample can be measured through the amplified target-cloning strand and/or the accumulated (concentrated) nanoparticles.
  • the nanoparticles are concentrated on the surface of the substrate particle
  • nanoparticles can be used in a sufficiently larger amount (number) than substrate particles, and theoretically, the minimum number of nanoparticles per substrate particle can be appropriately selected from 2 to the number of target-capture strands per substrate particle. , but is not limited thereto.
  • the amount of nanoparticles and substrate particles used may be appropriately adjusted according to detection conditions, characteristics of the target sequence, etc.
  • the amount of nanoparticles can be relatively small, and if the degree of hybridization is weak (e.g., “AT-rich” sequence), the amount of nanoparticles can be relatively large, but is not limited thereto) .
  • compositions, arrays, kits, devices, and/or methods for amplification, detection, quantification, identification, and/or visualization of a target nucleic acid molecule or target material provided herein may not involve the use of a polymerase. (enzyme-free or polymerase-free).
  • the method for amplifying, detecting, quantifying, confirming, and/or visualizing a target nucleic acid molecule or target material provided in the present application may be performed in a liquid phase.
  • detection/quantification/visualization can be achieved by labeling the target-cloning (target-amplification) strand, in addition to or in place of detection/quantification/visualization by the nanoparticles themselves due to the use of visualizable nanoparticles.
  • the target-cloning (target-amplification) strand may be labeled with a conventional marker.
  • the usable labeling material is not particularly limited, and may be selected from all labeling materials usable for labeling oligonucleotides, and may be, for example, a fluorescent material (eg, fluorescent dye and/or fluorescent protein), but is not limited thereto. no.
  • the NCR technology provided herein can be applied to multiple detection (bionsensing) and/or amplification of two or more different target substances by using two or more kinds of nanoparticles for different target substances (multiplexibility).
  • compositions, arrays, kits, devices, and/or methods for amplifying, detecting, quantifying, confirming, and/or visualizing target substances provided herein are for different target substances (target nucleic acid molecules).
  • target substances target nucleic acid molecules.
  • two or more kinds of nanoparticles including a template strand and a target-cloning strand and/or different target substances two or more kinds of substrate particles including target-capture strands for target nucleic acid molecules
  • a target nucleic acid molecule can simultaneously amplify, detect, quantify, identify, and/or visualize a composition, array, kit, device, and/or method.
  • the nanoparticle may further include a binding material to a target material other than the nucleic acid molecule.
  • two or more types of target materials can be amplified, detected, quantified, identified, and/or visualized at once by labeling the target-cloning strand differently for each target material.
  • the target substance detection sensitivity of the composition, array, kit, device, and/or method provided herein based on the amount of target substance (eg, DNA (eg, gDNA) or RNA) in the sample, is 10 -7 ng or more, 10 -6 ng or more, 10 -5 ng or more, 10 -4 ng or more, or 10 -3 ng or more (ie, the lower limit of the amount of the target substance in the detectable sample (detection limit) is 10 -7 ng , 10 -6 ng, 10 -5 ng, 10 -4 ng or 10 -3 ng).
  • target substance eg, DNA (eg, gDNA) or RNA
  • the limit of detection (LoD) identified as the UV-Vis spectrum integration region is about 2 times or more, about 10 times or more, about 50 times or more, about 100 times or more compared to PCR in the case of NCR. , about 500 times or more, about 1,000 times or more, about 5,000 times or more, or about 10,000 times or more (see FIG. 12c).
  • compositions, array, kit, device, and/or method are applicable to a quantitative diagnostic platform.
  • the compositions, arrays, kits, devices, and/or methods provided herein can be applied to amplification/detection/quantification of various target substances by replacing/extending conventional PCR techniques, and can be applied to diseases related to the target substances and/or Or it can be applied to the diagnosis of symptoms.
  • the compositions, arrays, kits, devices, and/or methods provided herein can be applied to rapid diagnostic techniques such as LFA (Lateral Flow Assay) and, for example, to rapid diagnostic kits such as strip sensors.
  • LFA Local Flow Assay
  • nanoparticle chain reaction technique eg, colorimetric detection
  • NCR nanoparticle chain reaction chain reaction
  • a plurality of hybridized target-cloning DNAs released from nanoparticles in which DNA in which a sequence identical to the target DNA (target-cloning DNA) and a complementary sequence partially form a double-strand are bound thereto. through amplification of the target DNA.
  • the amplification may be performed by forming and isolating a target DNA sandwich complex using DNA modulating (binding) magnetic particles, and releasing the target cloning DNA strand together with the target DNA strand from the nanoparticle through a desalting process.
  • the NCR techniques provided herein can exponentially increase the target DNA by n (the number of target-cloning DNAs per nanoparticle), where n is the number of cycles.
  • the NCR technique dramatically increases the number of nanoparticles in the solution, so that the clear solution color change induced by the plasmonic nanoparticles can be detected with the naked eye.
  • the NCR can repeat the cycle until the number of accumulated DNA-nanoparticles is high enough to perform colorimetric detection based on the naked eye or quantification based on UV-Vis spectrophotometry.
  • target-cloning DNA-loaded AuNPs are released from the complex by dehybridization.
  • the target-cloning DNA sequence is exactly the same as the target site sequence of the target DNA, and is preloaded on the NCR probe surface before assay.
  • multiple target-cloning DNA strands are released along with the target strand.
  • the released target-cloning strand is used to form a NCR probe-magnetic particle (magnetic probe) sandwich complex in a subsequent cycle, leading to a high level of opportunity for NCR probe-magnetic particle complex formation (FIG. 1A).
  • FIG. 3 schematically shows the release of the target-cloning strand from the loaded NCR probe.
  • the loaded NCR probe contains the pre-hybridized target-cloning strand (green) and the target binding site of the template strand (red).
  • the pre-hybridized target-cloning strand is released, indicating that the loaded NCR probe becomes an unloaded NCR probe and is used in the next cycle for target amplification.
  • the NCR probe is prepared by attaching (conjugating) a thiolated template strand to gold nanoparticles (AuNPs) and then adding an excess target-cloning strand, so that the target-cloning strand is the template strand. It can be produced by partially hybridizing to.
  • the target-binding site included in the template strand is complementary to a portion of the target-cloning strand, so there may be unwanted hybridization between the target-cloning strand and the target-binding site, resulting in an inactive NCR probe malfunction and can severely degrade the selectivity and sensitivity of the NCR assay. Therefore, by inducing toehold-mediated displacement by adding target complements (toehold sequence), the target-cloning strand undesiredly hybridized to the target-binding site of the template strand is removed, and the target-binding site of the template strand is removed. Fully exposed to open the target-binding site for binding to the target strand, thereby forming an active NCR probe (FIG. 1D).
  • the gel electrophoresis results of the inactive NCR probe and the NCR probe (toehold sequence added) are shown in FIG. 2A. As shown in FIG. 2a, it can be confirmed that intentional toehold-mediated displacement that exposes the target-binding site has occurred by adding the toehold sequence.
  • the dynamic light scattering measurement results of the inactive NCR probe and the active NCR probe are shown in FIG. 8 . As confirmed in FIG. 8 , the inactive NCR probe had a larger diameter than the active NCR probe, and the unloaded NCR probe had the largest diameter.
  • the zeta potential measurement results are shown in FIG. 9 . The zeta potential results in FIG.
  • FIG. 9 show the surface negative charge state by DNA conjugated to the NCR probe surface
  • FIG. 10 shows AuNPs, template strand-modified (conjugated) AuNPs, inactive NCR probes, and active NCR probes in various UV-Vis shows that it produces a spectrum.
  • an absorption peak by DNA at 260 nm and an absorption peak by gold nanoparticles at 532 nm were confirmed.
  • comparison between inactive and active NCR probes demonstrated improved selectivity of the active NCR probe (Figs. 2b, 8).
  • Active NCR probes showed red color only on the target strand, whereas little detectable color was observed for off-target and single-base mismatch sequences.
  • the inactive NCR probe showed strong red color for all of the target, non-target, and single-base mismatch sequences, indicating very low selectivity for the target sequence.
  • the increased number of captured NCR probes corresponds to the amplified number of target nucleic acids following repetition of the NCR cycle.
  • the AuNP-induced red intensity of NCR assay products increases as the number of NCR cycles increases (Fig. 2c). It was confirmed that the detection limit of the NCR assay with the naked eye was as low as 1pM, 1fM, and 100zM after 1, 2, and 3 NCR cycles, respectively. Overall, the red intensity of NCR assay products gradually increased with increasing target DNA concentration. For comparison, 10 pM off-target and single nucleotide mismatch sequences were detected through the NCR assay, and as a result, there was no detectable solution color change in both cases.
  • UV-Vis measurements were also performed.
  • the amount of AuNPs was measured in the UV-Vis spectrum at a wavelength of 400 to 650 nm. It was obtained by integrating the area (Fig. 2d).
  • a more pronounced increase in detection signal intensity with increasing target concentration was observed as the number of NCR cycles increased, and after 3 NCR cycles, a very wide dynamic range from 100 zM to 100 pM target concentration was observed.
  • the nanoparticles provide a high surface-to-volume ratio so that a large number of nucleic acid molecules can be conjugated to the surface of AuNPs.
  • the average number of template strands is 430 strands per AuNP
  • the number of pre-hybridized target-cloning strands is 174 strands per AuNP (FIGS. 9 and 10).
  • a single NCR probe can release up to 174 target-cloning strands per NCR cycle.
  • PCR amplifies the target strand by a factor of 2 n
  • the NCR provided in this application can theoretically amplify the target strand by nth power of 174 (174 n ), the number of target-cloning strands bound to one nanoparticle. Yes (n represents the number of cycles).
  • n represents the number of cycles.
  • accumulated unloaded NCR probes may interfere with target-mediated hybridization between the loaded NCR probes and DNA-conjugated magnetic particles.
  • Analysis results in this example showed that unloaded NCR probes were more preferred than loaded NCR probes in target binding (FIG. 11). Therefore, the amplification efficiency of the NCR cycle was not maximized in the current assay and requires further optimization. Nonetheless, the NCR assay allowed visual detection of the zeptomolar target concentration after only performing 3 NCR cycles.
  • NCR nanoparticle chain reaction
  • 1c is an SEM image of a sandwich complex of NCR probes and magnetic substrate particles initiated by a concentration of 10 pM of the target analyte (Scale bar, 200 nm; insets show color detectable with the naked eye as the number of unloaded NCR probes increases). appearance).
  • 1e is a schematic diagram of an NCR probe comprising a target-binding site (red) on the target-cloning strand (green) and template strand (red).
  • Figure 2 shows the results of a colorimetric NCR assay
  • 2a is the result of performing gel electrophoresis to show the desired NCR probe preparation process, showing that different DNA lengths are obtained at each step of NCR probe preparation,
  • 2b is a graph showing NCR results (UV-Vis spectrum) for various concentrations of the analyte (target material), non-target sequence (N) and single-base mismatch sequence (S). ) is not detected, while the target material is detected with high sensitivity (100 zM or more), and the detection ability is proportional to the number of cycles,
  • Figure 3 schematically shows the release of the target-cloning strand from the loaded NCR probe.
  • Figure 4 shows SEM images of the sandwich composite during the NCR assay.
  • the NCR assay was performed at a target strand concentration of 10 pM, and the production of the sandwich composite increased as the number of NCR cycles increased (Scale bar: 1 ⁇ m).
  • 5 is a graph showing the results of measuring the UV-Vis absorbance area after performing two NCR assay cycles.
  • 6 is a graph showing the results of quantifying the target-cloning strand on the NCR probe.
  • FIG. 11 is a graph showing the degree of capture of the target strand of a loading (including target-cloning strand hybridized partially double-stranded oligonucleotide) and unloading (including only the template strand) NCR probe.
  • 12a is a schematic diagram of a comparison of the gDNA detection process between NCR and PCR
  • 12c is a graph showing comparison of NCR and PCR analysis results (UV-Vis spectrum).
  • 50-nm citrate-stabilized gold nanoparticles were purchased from BBI Solutions (Cardiff, UK). Dynabeads® M-270 carboxylic acid was purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). All chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) and used as received without further purification. Oligonucleotides used in the examples below were obtained from Integrated DNA Technologies, Inc. Distilled water was obtained from a Millipore system (>18.0 M ⁇ , Milli-Q) and was used in all experiments. A mixed solution obtained by mixing Perfect Hyb TM Plus Hybridization buffer (Sigma-Aldrich) and 1x PBS buffer at a ratio of 1:3 was used as a hybridization buffer for NCR assay.
  • the target oligonucleotide to be detected (hereinafter also referred to as a target strand or a target sequence) is an anthrax lethal factor DNA sequence (GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT; SEQ ID NO: 1) was selected, and then the test was performed.
  • an anthrax-related gene a representative example of infectious pathogens, was selected as a detection target.
  • Carboxylic acid-functionalized magnetic particles (2.8 ⁇ m in diameter) were thoroughly vortexed for 10 minutes before use. 200 ⁇ l of magnetic particles were transferred to a new tube and stored. The magnetic particles were washed twice with 25 mM 2-[N-morpholino] ethane sulphonic acid (MES) buffer (pH 4.8) and resuspended in 20 ⁇ l of the same buffer. .
  • MES 2-[N-morpholino] ethane sulphonic acid
  • the disulfide-modified template strand (5′-TAA CAA TAA TCC CTC ATC CTT ATC AAT ATT TAA CAA TAA TCC CTC (A) 10 -3′; [SEQ ID NO: 2]-(A) 10 ) was prepared for 2 hours at room temperature. After incubation, reduction using 100 mM dithiothreitol (DTT) dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 8) resulted in a 3'-thiolated template strand (5'-[SEQ ID NO: 2]-PEG 6 -A 10 -SH-3') was prepared. After reduction, excess DTT was removed using a NAP-5 column (Fisher Scientific).
  • DTT dithiothreitol
  • the newly reduced thiolated template strand was added to a distilled water solution containing 0.1% (v/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) and 5.17 moles of gold nanoparticles (AuNPs) with an average diameter of 50 nm in an amount of 10 3 pmoles.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • AuNPs gold nanoparticles
  • the final mixture was slowly cooled to room temperature and incubated overnight to obtain a suspension of gold nanoparticles having a plurality of template strands bonded (conjugated) to the surface.
  • the suspension was washed through centrifugation (8000 rpm, 10 minutes), and the resulting particle solution was redispersed in distilled water.
  • Template strand-conjugated gold nanoparticles were incubated with excess target-cloning strand (5'-GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT-3'; SEQ ID NO: 1) in 300 mM NaCl buffer at 55 °C for 10 minutes. After incubation, it was cooled to room temperature for 1 hour.
  • Excess target-cloning strands were removed by centrifugation (11000 rpm, 2 min).
  • Excess toehold DNA SEQ ID NO: 4
  • 40-mM MgCl2 buffer with 0.1% (v/v) SDS was added to the same tube, incubated at 43 °C for 30 minutes, then cooled to room temperature for 3 hours.
  • an NCR probe having a template strand bound to the surface and a target-cloning strand partially hybridized to the template strand was obtained. After continuous hybridization, the obtained NCR probe was washed 4 times by centrifugation (11000 rpm, 2 minutes) and redispersed in hybridization buffer.
  • hybridization buffer was added to increase the salt concentration, followed by incubation for 10 minutes.
  • NCR assay products were immediately separated via a magnetic separator and incubated at 80 °C for nucleic acid release prior to UV-Vis measurement.
  • the absorbance spectrum of each emitted NCR assay product was measured using an ultraviolet-visible spectrometer (S-3100, SCINCO).
  • S-3100, SCINCO ultraviolet-visible spectrometer
  • the red UV-Vis intensity measured from the gold nanoparticle probe (NCR probe) was measured at 532 nm.
  • Polyacrylamide gel electrophoresis was performed to verify the active NCR probe preparation process including the toehold-mediated displacement reaction.
  • a 15% (w/v) polyacrylamide gel was prepared using 30% (w/v) acrylamide/Bis solution, deionized water, 5X TBE (Tris-Borate-EDTA) buffer, ammonium persulfate, and TEMED (tetramethylethylenediamine). manufactured.
  • DNA-bound gold nanoparticles (Example 1.3) were dissolved by treatment with a 0.1M KCN solution.
  • a gold-dissolved DNA sample with loading dye was added to each well of a 1.5 mm thick gel. To confirm DNA molecular weight on the gel, a 20bp DNA ladder was loaded into the other wells.
  • Electrophoresis was performed by applying an electric field (130V) to the gel for 70 minutes using a power supply. After electrophoresis, the gel was stained with SYBR Green I (Lonza) for 10 minutes, and the gel was imaged using UV photoexcitation at 306 nm by a gel imager.
  • Sandwich complexes of magnetic substrate particles and NCR probes in the presence of the target strand (SEQ ID NO: 1) in each cycle were examined with a Field Emission Scanning Electron Microscope (FE-SEM; SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany). Observed. Sandwich composite structured particles were loaded onto copper grids, coated with Pt (EM ACE200, Leica, Austria), and imaged. FE-SEM imaging was performed at NICEM (National Instrumentation Center for Environmental Management; Seoul National University, Seoul, South Korea).
  • an AuNP-based PCR probe was prepared using a fluorescent dye-modified oligonucleotide. Fluorescent signals were measured using a fluorometer (F200 Pro, TECAN). The template strand and the target-cloning strand were labeled at the 5' end using Cy3 dye (template strand) and Cy5 dye (target-cloning strand), respectively. After salting and NCR assay, gold nanoparticles were dissolved in 10 mM KCN. Fluorescence intensity was measured using the remaining fluorescence-labeled oligonucleotide. A calibration curve of known concentrations of dye samples was used for quantification.
  • the NCR probe and/or magnetic substrate particles were dispersed in a distilled water solution, and then a dynamic light scattering photometer (Malvern Instrument, Malvern) was used to measure the particle size and The charge was measured, and the average value after three measurements was used.
  • a dynamic light scattering photometer Mervern Instrument, Malvern
  • NCR assay results according to the target oligonucleotide concentration or whether toehold sequences were used were confirmed by UV-Vis spectrum (see Examples 1.4 and 1.5).
  • Figure 2b is a graph showing NCR results (UV-Vis spectrum) for target strands at various concentrations, and non-target strands (N; non-target sequence) and single-base mismatch sequence (S: single-base mismatch sequence) are detected
  • the target strand is detected with high sensitivity (detection limit: 100 zM or more), showing that the detection power is proportional to the number of cycles.
  • Figures 2c (1 cycle performed) and 2d (1 to 3 cycles performed) show the results of visually confirming the NCR assay results, while the NCR assay also did not detect off-target strands and single base mismatch strands. , showing that the target strand can be detected with high sensitivity.
  • FIG. 2c shows that the activated NCR probe, in which the target-binding site of the template strand is exposed, clearly distinguishes N and S strands from the target strand with the naked eye.
  • the UV-Vis absorbance area after performing two NCR assay cycles was measured and shown in FIG. 5 .
  • the initial target strand concentration was 10 pM
  • N and S represent a non-target sequence and a single-base mismatch sequence, respectively
  • optical extinction values were measured at 532 nm (Error bars show the s.d. of the extinction values). from three independent experiments).
  • the activated NCR probe with the target-binding site of the template strand exposed clearly distinguishes the N and S strands from the target strand with the naked eye.
  • Figure 6 shows the results of quantifying the target-cloning strand on the NCR probe.
  • the number of target cloning strands on the AuNPs was calculated by measuring the fluorescence intensity.
  • NCR probes constructed using target-cloning strands labeled with Cy5 dye were used for testing.
  • a standard curve was prepared from serially diluted samples with known concentrations of Cy5 dye.
  • the NCR probe (AuNP) was used after being dissolved in 10 mM KCN, and the blue triangle mark on the standard curve shows the fluorescence intensity measured in the NCR probe solution.
  • FIG. 8 shows the dynamic light scattering (DLS) measurement results of the NCR probe.
  • Particle size changes during the NCR probe manufacturing process were measured by DLS.
  • the gold nanoparticles modified (bonded) to the template strand exhibited a Z-average size of 78.82 nm.
  • the Z-average size of the inactive NCR probe prepared through target-cloning strand hybridization was measured at 91.28 nm, indicating that the DNA length was longer than that of the gold nanoparticle bound to the template strand.
  • the active NCR probe after removing the excessive target-cloning strand through the Toehold sequence was measured to have a Z-average size of 69.51 nm, confirming that it had a reduced DNA length.
  • the Z-average size of the active NCR probe is smaller because it contains double-stranded helical DNA.
  • UV-Vis absorbance spectra were measured at various stages during NCR probe fabrication.
  • the NCR probe shows a blue shift in the UV-Vis data as the DNA strands are conjugated to the surface of the gold nanoparticles.
  • FIG. 11 is a graph showing the degree of capture of the target strand of a loading (including target-cloning strand hybridized partially double-stranded oligonucleotide) and unloading (including only the template strand) NCR probe.
  • Unloading NCR probes are generated during the NCR assay and prevent the desired sandwich complex formation in the next cycle.
  • the kinetics of the unloaded and loaded NCR probes were measured in a single cycle NCR assay. For comparison, the same test was performed on mixtures in which both probes were added at the same concentration as the target strand, i.e., 10 pM, respectively.
  • a mixture of the loaded NCR probe and the unloaded NCR probe was prepared at a 1:1 ratio. It was confirmed that the unloaded NCR probe showed a better response than the loaded NCR probe.
  • Genomic DNA (gDNA) of bacteria Bacillus cereus was detected by the colorimetric NCR assay of the present application and conventional PCR, and the results were compared.
  • the NCR assay was performed by the method of Example 1.4 using the magnetic probe and the NCR probe prepared in Examples 1.1 to 1.3.
  • F-primer 5'-CTGGCTCAGGATGAACGC-3' (SEQ ID NO: 7)
  • R-primer 5'-CGACTTCGGGTGTTACAA-3' (SEQ ID NO: 8)
  • PCR conditions 35 cycles of three steps: 95 C for 1 minute, 53 C for 30 seconds, and 72 C for 1 minute 30 seconds.
  • FIGS. 12a to 12c Comparative results of the colorimetric NCR assay and PCR obtained above are shown in FIGS. 12a to 12c.
  • 12a is a schematic diagram of a comparison of gDNA detection processes between NCR and PCR. In the case of NCR assay, equipment for detection is not required and can be performed in a shorter time than PCR.
  • 12b shows the results of detecting gDNA extracted from bacteria by NCR or PCR, and the NCR assay is visually detectable (detection limit: 10 -7 ng), but the PCR can be confirmed through gel electrophoresis ( Detection limit: 10 -3 ng).
  • 12c is a graph showing a comparison of NCR and PCR analysis results (UV-Vis spectrum), and it can be confirmed that the NCR assay shows a sensitivity approximately 10 4 times higher than that of the PCR assay.

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Abstract

본 출원은 복수의 부분적으로 이중가닥인(partially double-stranded) 프로브를 포함하는 나노입자, 및 이를 이용한, 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인 (identifying) 및/또는 시각화(visualizing)를 위한 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법을 제공한다. 상기 나노입자는, (1) (i) 표적 올리고뉴클레오타이드에 대한 상보적 서열을 포함하는 표적 클로닝 부위(target cloning site) 및 (ii) 표적 핵산 단편의 일부에 대한 상보적 서열을 포함하는 표적 결합 부위(target binding site)을 포함하는 주형 가닥, 및 (2) 상기 표적 올리고뉴클레오타이드과 동일한 서열을 포함하고 주형 가닥의 표적 클로닝 부위에 혼성화하는 표적-클로닝 가닥 을 포함할 수 있다.

Description

나노입자를 이용한 표적물질의 증폭 또는 검출 방법
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2021년 11월 5일자 대한민국 특허출원 제10-2021-0151779호 및 2021년 11월 18일자 대한민국 특허출원 제10-2021-0159555호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 출원은 복수의 부분적으로 이중가닥인(partially double-stranded) 프로브를 포함하는 나노입자, 및 이를 이용한, 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인 (identifying) 및/또는 시각화(visualizing)를 위한 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법을 제공한다.
현장 감지(Onsite sensing) 및 진단 방법은 별다른 장비가 필요 없이 또는 최소한의 장비로 급성 질병, 감염, 또는 생물학적 및 화학적 warfare agent의 원인(sources)을 식별할 수 있는 빠르고 저렴하며 직접적인 수단을 제공한다는 점에서 이점을 가지며, 특히 portable platform 상에서 유용하다. 이러한 방법 중, 비색법(colorimetric methods)은 전문 지식이나 장비 없이도 표적을 육안으로 탐지할 수 있기 때문에 강력하고 광범위하게 적용할 수 있는 방법이다. 그러나, 대부분의 경우, 나노입자 기반 비색분석법(nanoparticle-based colorimetric assays)은 나노 물질의 광학 특성에만 의존하며, 이는 감도, 신뢰성 및 정량화 능력을 제한하는 요인이 된다. 따라서, 비색 분석은 일반적으로 실제 사용 범위가 좁고 신뢰도가 낮으며, 높은 민감도를 요구하는 분석에 적용하기에 적절하지 않다는 문제점이 있다. 일반적으로, 초고감도 검출 방법은 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 고도로 정교한 증폭, 감지 및 이미징 기술을 기반으로 한다.
따라서, 보다 간편하면서도 감도가 우수한 생물학적 검출 기술의 개발이 요구된다.
감도가 우수하고 신속하며 저렴하고 간편한 표적물질의 검출 수단을 제공하기 위하여, 본 출원은 다수의 부분적 이중가닥 프로브를 가지는 나노입자 및 이를 이용한 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 일 예는 다음을 포함하는 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 (partially double-stranded oligonucleotide)를 제공한다:
(1) (i) 표적 올리고뉴클레오타이드와 혼성화 가능한 표적-클로닝 부위(target-cloning site), 및
(ii) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부와 혼성화 가능하거나 상보적인 표적-결합 부위
를 포함하는 제1 가닥 (주형 가닥); 및
(2) 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함하는 제2 가닥 (표적-클로닝 가닥 또는 표적-증폭 가닥).
다른 예는 표면에 상기 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 2개 이상 포함하는 나노입자를 제공한다.
다른 예는 (a) 표면에 표적 올리고뉴클레오타이드와 부분적으로 혼성화하는 표적-포획 가닥을 포함하는 기질입자, 및/또는 (b) 상기 나노입자를 포함하는 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 조성물, 어레이, 키트, 및/또는 장치를 제공한다.
다른 예는 (a) 표면에 표적 올리고뉴클레오타이드와 부분적으로 혼성화하는 표적-포획 가닥을 포함하는 기질입자, 및/또는 (b) 상기 나노입자를 이용한, 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화 방법을 제공한다.
다른 예는 (a) 표면에 표적 올리고뉴클레오타이드와 부분적으로 혼성화하는 표적-포획 가닥을 포함하는 기질입자, 및/또는 (b) 상기 나노입자의, 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 용도를 제공한다.
본 명세서에서는 특정 구조의 나노입자 및 이를 사용하는 “나노입자 연쇄반응 (Nanoparticle Chain Reaction; NCR)”기술이 제공된다. 상기 NCR 기술은 핵산분자 증폭 방법의 하나로, 폴리머라제를 대체하여 특정 구조를 가지는 나노입자를 사용하는 enzyme-free 기술이라는 점에서 기존의 PCR (polymerase chain reaction)과 차별화되고, 기존 기술보다 간단하면서도 증폭 효율이 현저히 높아서, 핵산분자 및 핵산분자를 통하여 증폭가능한 다양한 표적물질의 검출에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다:
용어의 정의
본 명세서에서, 용어 “표적물질(target material)”은 본 명세서에서 제공되는 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법에서 최종적으로 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화하고자 하는 물질을 의미하는 것으로, 생물학적 활성을 가지는 모든 물질 중에서 선택된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 표적물질은 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화하고자 하는 유기체 (각종 진핵세포 또는 원핵 세포; 예컨대, 바이러스, 박테리아, 진균류 등) 또는 생물학적 활성 물질, 예컨대, 핵산분자 (예, 전장 유전체 (DNA 또는 RNA), 유전체 단편, 유전자, 유전자 단편, siRNA, miRNA, 바이오마커(biomarker), 그 외 DNA 또는 RNA 단편 등), 단백질, 펩타이드, 고분자, 소분자 화학물질 (예, 각종 금속이온, 유기 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 화학 약물 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 핵산분자, 단백질, 펩타이드 등의 생체활성물질은 상기 기재한 유기체(예컨대, 바이러스, 박테리아, 진균 등)에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 재조합적 또는 화학적으로 합성된 것일 수도 있다.
본 명세서에서, 용어 “시료”는 표적물질의 존재 여부 및/또는 수준을 측정하고자 하는 모든 생물학적 및/또는 환경 시료를 의미하는 것일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시료는 대상(환자)로부터 분리된 세포, 조직, 혈액, 림프, 타액, 가래, 콧물, 소변, 대변, 기타 체액 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 대상은 인간, 가축(예: 소, 돼지, 말, 양, 염소, 개, 고양이 등), 조류(닭, 오리, 거위, 칠면조, 타조, 메추라기 등) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 “표적 올리고뉴클레오타이드(target oligonucleotide)”는 본 명세서에서 제공되는 연쇄반응에 의하여 직접적으로 증폭되는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, “표적 가닥(target strand)”라고도 칭해지며, 두 용어는 동등한 의미로 호환 가능하다. 일 예에서, 용어 표적 올리고뉴클레오타이드는,
- 상기 표적물질이 핵산분자인 경우, 그 전부 (상기 핵산분자가 DNA 단편 및/또는 RNA 단편인 경우) 또는 그 일부 (증폭대상서열; 예컨대, 상기 핵산분자에 고유한 부분)이고,
- 상기 표적물질이 단백질, 펩타이드, 고분자, 또는 소분자 화학물질인 경우, 하기 설명되는 표적-클로닝 가닥과 동일한 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “주형 가닥 (template strand)”은 본 명세서에서 제공되는 NCR 기술에서 표적 올리고뉴클레오타이드 증폭을 위하여 템플리트(template)로 사용되는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 표적 올리고뉴클레오타이드 전장 서열과 상보적인 핵산서열을 가지는 표적-클로닝 부위와 상기 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부와 상보적인 핵산서열을 가지는 표적-결합 부위를 포함하는 것일 수 있다. 상기 주형 가닥은 10-1000 nt, 10-500 nt, 10-200 nt, 10-100 nt, 10-90 nt, 10-80 nt, 10-70 nt, 10-60 nt, 10-55 nt, 10-50 nt, 또는 10-45 nt 길이의 올리고뉴클레오타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 “표적-클로닝 가닥 (target-cloning strand)”은 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 핵산서열 또는 표적의 일부 증폭 대상서열을 가지는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 혼성화(상보적 결합) 가능하다.
본 명세서에서, 용어 “표적-포획 가닥 (target-capturing strand)”은 표적 올리고뉴클레오타이드를 기질입자에 포획하는 기능을 하는 것으로, 표적 올리고뉴클레오타이드의 상기 주형 가닥의 표적-결합 부위와 상보적인 부분과 다른 부분과 상보적인 핵산 서열을 가지는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 명세서에서, 핵산분자 또는 단백질이 “특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 가진다”함은 상기 서열을 포함하거나, 상기 서열로 필수적으로 이루어진 것을 의미할 수 있다.
부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 (partially double-stranded oligonucleotide)
일 예는 다음을 포함하는 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 (partially double-stranded oligonucleotide)를 제공한다:
(1) 다음을 포함하는 제1 가닥 (긴 (확장된) 가닥; 이하, 주형 가닥(template strand)으로도 칭함):
(i) 표적 올리고뉴클레오타이드와 혼성화 가능한 (상보적인) 표적-클로닝 부위(target-cloning site), 및
(ii) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부와 혼성화 가능하거나 상보적인 표적-결합 부위, 이 때, 상기 표적-클로닝 부위 및 표적-결합 부위는 서로 연결됨 (예를 들어, 표적-클로닝 부위의 3'-말단과 표적-결합 부위의 5'-말단이 결합되거나, 표적-클로닝 부위의 5'-말단과 표적-결합 부위의 3'-말단이 연결될 수 있음); 및
(2) 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함(즉, 상기 제1 가닥의 표적-클로닝 부위와 상보적 (혼성화 가능한) 서열을 포함)하는 제2 가닥 (짧은 가닥(제1 가닥보다 짧음); 이하, 표적-클로닝 가닥(target-cloning strand) 또는 표적-증폭 가닥(target amplifier strand)이라고도 칭하며, 두 용어는 동등한 의미로 호환 가능함),
이 때, 상기 표적-클로닝 가닥은 상기 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 혼성화(상보적 결합) 하여 이중가닥 구조(즉, 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 이중가닥 부분(부위))를 형성하고, 상기 주형 가닥의 표적-결합 부위는 단일가닥 형태로 노출됨.
상기 주형 가닥은 10-1000 nt, 10-500 nt, 10-200 nt, 10-100 nt, 10-90 nt, 10-80 nt, 10-70 nt, 10-60 nt, 10-55 nt, 10-50 nt, 또는 10-45 nt 길이의 올리고뉴클레오타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 표적-클로닝 가닥은 상기 제1 가닥의 표적-클로닝 부위와 혼성화하고, 표적-결합 부위를 노출시키는 길이의 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 예컨대, 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일할 수 있다.
나노입자 (nanoparticles; NCR 프로브)
다른 예는 하나 이상(예컨대, 2개 이상 또는 복수)의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 표면에 포함하는 나노입자를 제공한다. 상기 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 앞서 설명한 바와 같다. 예를 들어, 상기 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 주형 가닥의 일 말단 (예컨대, 주형 가닥 내의 표적-클로닝 부위의 양 말단 중 표적-결합 부위와 연결된 말단과 다른 말단)에서, 직접 또는 링커(제1 링커)를 통하여, 나노입자 표면에 고정(부착)된 것일 수 있다.
다르게 표현하면, 상기 나노입자는, 그 표면에,
(1) 다음을 포함하는 주형 가닥: (i) 상기 표면에 직접 또는 링커(제1 링커)를 통하여 고정된 표적-클로닝 부위, 및 (ii) 상기 표적-클로닝 부위의 일 말단 (예컨대, 나노입자 표면에 고정된 말단과 다른 말단)과 연결된 표적-결합 부위; 및
(2) 상기 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 혼성화 가능한 (상보적인) 표적-클로닝 가닥
을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 주형 가닥(제1 가닥)의 표적-클로닝 부위와 표적-클로닝 가닥(제2 가닥)이 혼성화하여 부분적으로 이중가닥인 구조를 가지는 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 형성하고, 주형 가닥의 표적-결합 부위는 노출된 형태일 수 있다.
상기 나노입자 1개당 표면에 고정(부착)된 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 개수는 1개 이상, 2개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 70개 이상, 100개 이상, 120개 이상, 150개 이상, 또는 170개 이상 (상한값은 특별한 제한은 없고, 나노입자 표면에 부착 가능한 올리고뉴클레오타이드의 최대 개수일 수 있으며(나노입자 표면적을 기준으로 적절히 정해질 수 있음), 예컨대, 10,000개, 5,000개, 2,500개, 1,000개, 750개, 500개, 250개, 또는 200개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 나노입자는 가시화 가능(예컨대, 육안 검출 가능(naked-eye-detectable)) 및/또는 생분자 (biomolecule; 예컨대, 핵산분자, 항체 등) 접합 가능한 재질로 된 것일 수 있으며, 예컨대, 금 (e.g., 금 나노입자), 은 (e.g., 은 나노입자), 백금, 구리, 합금 (e.g. 금, 은, 백금, 구리 등으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상 포함) 등과 같은 금속, 실리카, 하이드로겔, 카본나노튜브, 양자점(Quantum dot) 등 재질의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예에서, 상기 나노입자는 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드에 포함된 형광표지에 의하여 가시화될 수 있다. 상기 나노입자의 크기 (평균 지름)은 1 내지 1000nm, 1 내지 500nm, 1 내지 200nm, 1 내지 100nm, 10 내지 1000nm, 10 내지 500nm, 10 내지 200nm, 또는 10 내지 100nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 나노입자는 그 구조 및/또는 형태에 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 솔리드 구조, 코어-쉘 구조, 할로우 구조 (hollow structure) 등을 가지거나, 및/또는 원형, 타원형, 튜브형, 다각형 구조 등을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라 나노입자의 종류에 따라 생분자 결합, 증폭 및/또는 가시성 수준을 조절할 수 있다.
일 예에서, 상기 나노입자는 표적 올리고뉴클레오타이드를 검출 또는 증폭하기 위한 프로브 (NCR 프로브)로 사용될 수 있다.
상기 설명한 바와 같은, 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이를 표면에 부착한 나노입자는 표적 올리고뉴클레오타이드와 혼성화 가능한 (상보적 서열을 가지는) 부위 (표적-결합 부위) 및 상기 표적-올리고뉴클레오타이드와 동일한 핵산 서열을 가지는 표적-클로닝 가닥을 포함하므로, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드 또는 표적물질의 검출 및/또는 증폭에 유리하게 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 표적물질이 핵산 분자 이외의 물질인 경우, 상기 나노입자는, 앞서 설명한 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드에 더하여, 상기 표적물질의 결합 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 표적물질의 결합 물질은 표적물질이 일부와 결합(예컨대 특이적 결합) 가능한 항체, 압타머, 소분자 화학물질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
기질입자 (substrate particles)
본 명세서에서, 용어 “기질입자(substrate particle)”는 표적 물질의 포획 물질 (예컨대, 올리고뉴클레오타이드, 항체, 펩타이드, 고분자 화합물 등)을 고정시킬 수 있는 표면을 가지는 모든 형태의 입자를 의미한다.
일 예에서, 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부와 혼성화 가능하거나 상보적 서열을 가지는 하나 이상(예컨대, 2개 이상 또는 복수)의 표적-포획 가닥(target capturing strand; 또는 표적-포획 올리고뉴클레오타이드(target capturing oligonucleotides))가 표면에 고정(부착, 접착)된 기질입자가 제공된다. 상기 표적-포획 가닥은 기질입자 표면에 직접 또는 링커(제2 링커)를 통하여 고정(부착)된 것일 수 있다.
후술하는 바와 같이, 상기 기질입자에 상기 나노입자에 포함된 표적-클로닝 가닥 개수를 NCR 사이클 회수만큼 곱한 개수만큼의 나노입자가 결합되므로, 상기 기질입자 1개당 표면에 고정(부착)된 표적-포획 가닥 개수는 상기 나노입자 개수를 커버할 수 있을 정도로 충분히 많아야 한다. 예컨대, 상기 기질입자 1개당 포함된 표적-포획 가닥의 개수는 10개 이상, 50개 이상, 102개 이상, 103개 이상, 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상, 또는 108개 이상 (상한값은 특별한 제한은 없고, 기질입자 표면에 부착 가능한 올리고뉴클레오타이드의 최대 개수일 수 있으며(기질입자 표면적을 기준으로 적절히 정해질 수 있음), 예컨대, 1012개, 1011개, 1010개 또는 109개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기질입자 고형 재질로 된 것일 있으며, 상기한 나노입자와 형성하는 복합체의 수집/정제 등을 용이하게 하기 위하여, 자성입자, 비드(예, 자성비드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 기질입자는 금 (e.g., 금 나노입자), 은 (e.g., 은 나노입자), 백금, 구리, 합금 (e.g. 금, 은, 백금, 구리 등으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상 포함) 등과 같은 금속, 실리카, 하이드로겔, 카본나노튜브, 양자점(Quantum dot) 등 재질의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 기질입자의 크기(평균지름)는 상기 나노입자보다 충분히 커야 하며, 나노입자 크기(평균지름)의 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 또는 50배 이상일 수 있고, 예컨대, 0.1 내지 100 μm, 0.1 내지 50 μm, 0.1 내지 20 μm, 0.1 내지 10 μm, 0.1 내지 8 μm, 0.1 내지 5 μm, 0.1 내지 3 μm, 0.5 내지 100 μm, 0.5 내지 50 μm, 0.5 내지 20 μm, 0.5 내지 10 μm, 0.5 내지 8 μm, 0.5 내지 5 μm, 0.5 내지 3 μm, 1 내지 100 μm, 1 내지 50 μm, 1 내지 20 μm, 1 내지 10 μm, 1 내지 8 μm, 1 내지 5 μm, 또는 1 내지 3 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 기질입자는 그 구조 및/또는 형태에 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 솔리드 구조, 코어-쉘 구조, 할로우 구조 (hollow structure) 등을 가지거나, 및/또는 원형, 타원형, 튜브형, 다각형 구조 등을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 표적물질이 핵산 분자 이외의 물질인 경우, 상기 기질입자는, 앞서 설명한 표적-포획 가닥에 더하여, 상기 표적물질의 포획 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 표적물질의 포획 물질은 표적물질이 일부와 결합(예컨대 특이적 결합) 가능한 항체, 압타머, 소분자 화학물질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 이 때, 기질입자에 포함되는 표적물질의 포획 물질과 나노입자에 포함되는 표적물질의 결합 물질은 표적물질의 서로 다른 부위에 결합하는 것일 수 있다. 즉, 표적물질에서, 상기 포획 물질과 결합 물질의 결합하는 부위는 서로 중복되지 않는 것일 수 있다.
본 출원에서, 상기 주형 가닥 (표적-클로닝 부위)을 나노입자 표면에 고정(부착)시키는데 사용 가능한 링커 (제1 링커) 및 상기 표적-포획 가닥을 기질입자에 고정(부착)시키는데 사용 가능한 링커 (제2 링커)는 올리고뉴클레오타이드를 고형의 입자 표면에 부착시킬 수 있는 모든 물질 중에서 적절히 선택될 수 있고, 예컨대, 화학적 관능기(예컨대, 티올기(SH), 아민기(NH2) 등), 결합 단백질류 (예, 바이오틴 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 부착 입자의 표면 재질 등에 따라서 적절히 선택될 수 있다. 상기 링커는 상기 주형 가닥과 표적-포획 가닥이 각각 나노입자 및 기질입자 표면에 결합하는 말단 (예컨대, 주형 가닥의 경우 3’ 말단, 표적-포획 가닥의 경우 5’ 말단)에 결합되어 있거나, 및/또는 나노입자 및/또는 기질입자 표면에 결합되어 있을 수 있다. 또한, 상기 주형가닥 및/또는 표적-포획 가닥은 나노입자 및/또는 기질입자 표면으로부터의 소정의 간격 유지를 위하여 각각 나노입자 및 기질입자 표면에 결합하는 말단(예컨대, 주형 가닥의 경우 3’ 말단, 표적-포획 가닥의 경우 5’ 말단)에 스페이서(spacer)를 추가로 포함할 수 있다 (상기 가닥들이 링커를 포함하는 경우, 상기 스페이서는 주형가닥과 제1 링커 사이 (제1 스페이서), 및/또는 표적-포획 가닥과 제2 링커 사이(제2 스페이서)에 포함될 수 있음). 상기 스페이서는 소정의 간격을 부여할 수 있는 길이/부피를 가지는 모든 물질 중에서 적절히 선택될 수 있으며, 예컨대, 올리고뉴클레오타이드(예컨대, Poly A (e.g., A2~20) 등), 고분자(예, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등), 탄소수 1-6의 알킬 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 일 예에서, 상기 스페이서는 poly A, PEG, 또는 이들의 조합(제1 스페이서), 또는 poly A, 탄소수 1-6의 알킬, 또는 이들의 조합(제2 스페이서)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
표적물질(핵산분자)의 검출 및/또는 증폭
다른 예는 앞서 설명한 바와 같은 하나 이상의 기질입자 및 하나 이상의 나노입자를 포함하는 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 조성물(또는 용도), 어레이, 키트, 및/또는 장치를 제공한다. 상기 조성물, 어레이, 키트, 및/또는 장치는 상기 기질입자 및/또는 나노입자를 적절한 매질 (예컨대, 액체 매질) 내에 분산 및/또는 현탁시킨 형태로 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물, 어레이, 키트, 및/또는 장치는 다음을 포함할 수 있다:
(a) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부와 혼성화 가능하거나 상보적 서열을 가지는 하나 이상(예컨대, 2개 이상 또는 복수)의 표적-포획 가닥(target capturing strand; 또는 표적-포획 올리고뉴클레오타이드(target capturing oligonucleotides))가 표면에 고정(부착, 접착)된 하나 이상(예컨대, 2개 이상 또는 복수)의 기질입자, 및
(b) 하나 이상(예컨대, 2개 이상 또는 복수)의 나노입자, 이 때, 각각의 나노입자는 표면에 하나 이상(예컨대, 2개 이상 또는 복수)의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드. 이 때, 상기 나노입자 및 부분적 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 앞서 설명한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 조성물, 어레이, 키트, 및/또는 장치는 다음을 포함할 수 있다:
(a) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부(제1 부분)와 혼성화 가능하거나 상보적 서열을 가지는 하나 이상(예컨대, 2개 이상 또는 복수)의 표적-포획 가닥이 표면에 고정(부착, 접착)된 기질입자, 및
(b) 하나 이상(예컨대, 2개 이상 또는 복수)의 나노입자, 이 때, 각각의 나노입자는 표면에 하나 이상(예컨대, 2개 이상 또는 복수)의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 다음을 포함함:
(1) 다음을 포함하는 제1 가닥 (주형 가닥):
(i) 표적 올리고뉴클레오타이드와 혼성화 가능한 (상보적인) 표적-클로닝 부위(target-cloning site), 및
(ii) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부 (제2 부분)와 혼성화 가능하거나 상보적인 표적-결합 부위, 이 때, 상기 표적-클로닝 부위 및 표적-결합 부위는 서로 연결됨 (예를 들어, 표적-클로닝 부위의 3'-말단과 표적-결합 부위의 5'-말단이 결합되거나, 표적-클로닝 부위의 5'-말단과 표적-결합 부위의 3'-말단이 연결될 수 있음); 및
(2) 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함(즉, 상기 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 상보적 (혼성화 가능한) 서열을 포함)하는 제2 가닥 (표적-클로닝 가닥),
이 때, 상기 표적-클로닝 가닥은 상기 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 혼성화 하여 이중가닥 구조(즉, 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 이중가닥 부분(부위))를 형성하고, 상기 주형 가닥의 표적-결합 부위는 단일가닥 형태로 노출됨.
상기 표적-포획 가닥은 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부(제1 부분)과 혼성화 가능한 부위를 필수로 포함하고, 그의 일 말단(예컨대 5’ 말단 또는 3’ 말단)이 직접 또는 링커(제2 링커)를 통하여 기질입자 표면에 고정(부착)된 것일 수 있다.
상기 표적 올리고뉴클레오타이드에 있어서, 상기 기질입자 상의 표적-포획 가닥이 혼성화되는 부분 (제1 부분)과, 상기 나노입자 상의 제1 가닥의 표적-결합 부위가 혼성화되는 부분 (제2 부분)은 서로 중복되지 않도록 설계된 것일 수 있다. 예를 들어, 표적-포획 가닥이 표적 올리고뉴클레오타이드의 5’ 말단쪽 일부(제1 부분)와 혼성화되는 경우, 표적-결합 부위는 상기 표적 올리고뉴클레오타이드의 3’ 말단쪽 일부(제2 부분)와 혼성화되는 것일 수 있고, 다른 예에서, 표적-포획 가닥이가 표적 올리고뉴클레오타이드의 3’ 말단쪽 일부(제1 부분)와 혼성화되는 경우, 표적-결합 부위는 상기 표적 올리고뉴클레오타이드의 5’ 말단쪽 일부(제2 부분)와 혼성화되는 것일 수 있다.
본 출원에서 제공되는 조성물, 어레이, 키트, 및/또는 장치에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드(단일가닥) 또는 이를 포함한 시료가 상기 기질입자와 접촉하면, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부(제1 부분)가 기질입자 상의 하나 이상의 표적-포획 가닥과 혼성화되어, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드의 혼성화되지 않고 단일가닥 상태로 노출된 제2 부분을 하나 이상 생성한다. 이와 같이 노출된 하나 이상의 제2 부분은 상기 나노입자 상의 주형 가닥 내의 표적-결합 부위와 결합함으로써, 하나 이상의 나노입자가 기질입자에 결합하여 기질입자-나노입자 샌드위치 복합체를 형성한다. 그 후, 탈혼성화 처리를 통하여, 상기 각각의 나노입자에 표적-클로닝 가닥이 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 탈혼성화되어 방출된다. 이와 같이 방출된 표적-클로닝 가닥은 상기 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 핵산 서열을 가지므로, 다시 기질입자 상의 표적-포획 가닥과 제1 부분에서 혼성화되어 다음 사이클을 반복할 수 있다. 이러한 과정에 의하여, 사이클이 반복됨에 따라서 기질입자 표면에 결합된 나노입자가 개수가 기하급수적으로 증가하여 축적(농축)된다. 이론적으로, 하나의 기질입자를 기준으로, 나노입자에 포함된 표적-클로닝 가닥 개수를 사이클 회수만큼 곱한 수의 나노입자가 기질입자에 결합하여 축적(농축)된다 [(나노입자 당 표적-클로닝 가닥 개수)n, n은 사이클 회수]. 이는 표적 올리고뉴클레오타이드의 증폭 및/또는 나노입자의 검출가능한 수준, 예컨대 육안으로 검출 가능한 수준으로의 농축 효과를 나타낸다 (즉, 축적(농축)된 나노입자로 인한 용액의 색 변화 등을 통하여 표적 올리고뉴클레오타이드의 존재 여부 및/또는 농도의 검출이 용이함).
다른 예는 상기한 기질입자 및 나노입자를 이용한 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음을 포함할 수 있다:
(A) 표적 올리고뉴클레오타이드 또는 시료를 표면에 복수의 표적-포획 가닥을 포함하는 기질입자에 첨가(또는 적용 또는 접촉)하여, 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부(제1 부분)와 표적-포획 가닥을 혼성화시키는 단계;
(B) 상기 단계 (A)에서 얻어진 혼합물에 복수의 나노입자를 첨가(또는 적용 또는 접촉)하여 기질입자와 나노입자 간 복합체를 형성하는 단계로서, 상기 나노입자는 각각 표면에 복수의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 다음을 포함하고:
(1) 다음을 포함하는 제1 가닥 (주형 가닥):
(i) 표적 올리고뉴클레오타이드와 혼성화 가능한 (상보적인) 표적-클로닝 부위, 및
(ii) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부 (제2 부분)와 혼성화 가능하거나 상보적인 표적-결합 부위; 및
(2) 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함하는 제2 가닥 (표적-클로닝 가닥),
기질입자 표면에 표적-포획 가닥과 부분적으로 혼성화된 표적 올리고뉴클레타이드의 다른 부분(제2 부분)과 상기 표적-결합 부위와의 혼성화에 의하여 기질입자와 나노입자 간 복합체가 형성됨; 및
(C) 상기 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 탈혼성화(dehybridizing) 및/또는 상기 복합체의 분해(disassembling)를 수행하여, 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 핵산 서열을 가지는 표적-클로닝 가닥을 방출하는 단계.
상기 단계 (A)에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드 또는 시료를 표면에 복수의 표적-포획 가닥을 포함하는 기질입자에 첨가하면, 상기 표적-포획 가닥은 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부 (제1 부분)에 혼성화 가능하여, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드 시료 내 존재하는 표적 올리고뉴클레오타이드(시료 내 존재하는 경우)를 포획할 수 있다.
상기 단계 (B)에서 사용되는 복수의 나노입자는 각각 표면에 복수의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 다음을 포함할 수 있다:
(1) 다음을 포함하는 제1 가닥 (주형 가닥):
(i) 표적 올리고뉴클레오타이드와 혼성화 가능한 (상보적인) 표적-클로닝 부위(target-cloning site), 및
(ii) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부 (제2 부분)와 혼성화 가능하거나 상보적인 표적-결합 부위, 이 때, 상기 표적-클로닝 부위 및 표적-결합 부위는 서로 연결됨 (예를 들어, 표적-클로닝 부위의 3'-말단과 표적-결합 부위의 5'-말단이 결합되거나, 표적-클로닝 부위의 5'-말단과 표적-결합 부위의 3'-말단이 연결될 수 있음); 및
(2) 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함(즉, 상기 제1 가닥의 표적-클로닝 부위와 상보적 (혼성화 가능한) 서열을 포함)하는 제2 가닥 (표적-클로닝 가닥).
이 때, 상기 표적-클로닝 가닥은 상기 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 혼성화 하여 이중가닥 구조(즉, 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 이중가닥 부분(부위))를 형성하고, 상기 주형 가닥의 표적-결합 부위는 단일가닥 형태로 노출되어, 상기 기질입자 상의 표적-포획 가닥과 (제1 부분에서) 부분적으로 혼성화된 표적 올리고뉴클레오타이드의 다른 일부(제2 부분)와 표적-결합 부위 간 혼성화 가능하도록 하여, 기질입자와 나노입자 간 샌드위치 복합체 어셈블리(sandwich complex assembly)를 형성하도록 할 수 있다. 즉, 표적 올리고뉴클레오타이드 내의 제1 부분은 나노입자 상의 주형 가닥의 표적-결합 부위와, 제2 부분(상기 제1 부분과 중복되지 않음)은 기질입자 상의 표적-포획 가닥과 결합(혼성화)된다.
상기 단계 (C)에 있어서, 상기 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이의 탈혼성화(dehybridizing) 및/또는 상기 복합체 (sandwich complex assembly)의 분해(disassembling)(예컨대, 상기 탈혼성화에 의한 것일 수 있음)는 통상적인 탈혼성화 수단에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 탈혼성화는, 혼성화 반응과 비교하여, pH 증가 (예컨대, 염기 조건), 온도 증가 (예컨대, 50 내지 100℃, 52 내지 100℃, 55 내지 100℃, 50 내지 90℃, 52 내지 90℃, 55 내지 90℃ 등의 범위로 증가), 염(salt) 농도 감소 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의하여 수행될 수 있으며, 일 구체예(본 출원의 실시예)에서는 염 용액을 증류수로 교체하고 온도를 낮추어 수행하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이를 통하여, 표적-포획 가닥 및 표적-결합 부위와 혼성화된 표적 올리고뉴클레오타이드 및/또는 표적-클로닝 부위와 혼성화된 표적-클로닝 가닥 (서로 동일한 핵산 서열을 가짐)이 각각 탈혼성화되어 단일가닥 형태로 방출된다. 또한, 상기 과정에서, 탈혼성화에 의한 표적 올리고뉴클레오타이드와, 나노입자 상의 주형 가닥의 표적-결합 부위 및 기질입자 상의 표적-포획 가닥 간의 결합(혼성화)도 분해되어, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드를 통하여 복합체를 형성하던 나노입자와 기질입자가 분리(방출)된다. 이와 같이 방출된 표적-클로닝 가닥과 나노입자는 이후 사이클에 사용될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 (B) 이후에, 상기 복합체를 분리, 수집, 및/또는 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며(B-1), 여기서 분리, 수집, 및/또는 농축된 복합체에 대하여 단계 (C)를 수행할 수 있다. 상기 복합체의 분리, 수집, 및/또는 농축은 자기장 인가 (예컨대, 자석 사용 등; 기질입자가 자성입자인 경우), 및/또는 원심분리 등의 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용된 입자의 재질, 특성 등을 고려하여 적절히 선택된 통상의 방법으로 수행할 수 있다.
일 예에서, 상기 단계 (A) 내지 (C)는 2회 이상 반복될 수 있다 (단계 (A) 내지 (C)가 1 사이클). 이 때, 상기 단계 (C)에서 단일가닥 형태로 방출된, 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 가지는 표적-클로닝 가닥은 다시 단계 (A)의 표적 올리고뉴클레오타이드로서 사용되고, 단계 (C)에서 방출된 나노입자는 NCR 프로브로서 사용되어 다음 사이클이 수행될 수 있다. 이 때, 하나의 표적 올리고뉴클레오타이드가 하나의 나노입자에 포함된 표적-클로닝 가닥의 개수만큼 증폭되어, 다음 사이클에서는 하나의 기질입자에 상기 표적-클로닝 가닥 개수만큼의 나노입자가 결합되어 단계가 진행된다. 따라서, 하나의 표적 올리고뉴클레오타이드가 나노입자 당 포함된 표적-클로닝 가닥의 개수가 사이클 회수만큼 곱해진 수만큼 증폭되게 된다. 즉, 사이클 수행에 따른 표적 올리고뉴클레오타이드 수는 최초 개수의 mn 배(m은 나노입자당 표적-클로닝 가닥의 개수 (실시예에서 174개가 예시됨), n은 사이클 회수)일 수 있다. 통상적인 PCR의 증폭 수준이 최초 개수의 2n 배인 것과 비교하면, 본 명세서에서 제공하는 NCR 기술의 증폭수준은 현저히 높다.
일 예에서, 상기 나노입자당 표적-클로닝 가닥 개수(m)는 2개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 70개 이상, 100개 이상, 120개 이상, 150개 이상, 또는 170개 이상 (상한값은 특별한 제한은 없고, 나노입자 표면에 부착 가능한 올리고뉴클레오타이드의 최대 개수일 수 있으며(나노입자 표면적을 기준으로 적절히 정해질 수 있음), 예컨대, 10,000개, 5,000개, 2,500개, 1,000개, 750개, 500개, 250개, 또는 200개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 나노입자당 표적-클로닝 가닥 개수(m)는 2 내지 1,000 개, 2 내지 500 개, 50 내지 1,000 개, 50 내지 500 개, 100 내지 1,000 개, 또는 100 내지 500 개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 사이클 회수(n)는 1 내지 20 회, 1 내지 15 회, 1 내지 10 회, 1 내지 5 회, 2 내지 20 회, 2 내지 15 회, 2 내지 10 회, 2 내지 5 회, 3 내지 20 회, 3 내지 15 회, 3 내지 10 회, 또는 내지 3 내지 5 회일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 표적물질이 핵산 분자 이외의 생체활성물질인 경우, 상기 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 조성물, 어레이, 키트, 장치 및/또는 방법에 있어서,
상기 (a)의 기질입자는, 앞서 설명한 표적-포획 가닥에 더하여, 상기 표적물질의 포획 물질을 추가로 포함하고,
상기 (b)의 나노입자는 앞서 설명한 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드에 더하여, 상기 표적물질의 결합 물질을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 표적물질의 결합 물질은 표적물질이 일부와 결합(예컨대 특이적 결합) 가능한 항체, 압타머, 소분자 화학물질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 이 때, 기질입자에 포함되는 표적물질의 포획 물질과 나노입자에 포함되는 표적물질의 결합 물질은 표적물질의 서로 다른 부위에 결합하는 것일 수 있다. 즉, 표적물질에서, 상기 포획 물질과 결합 물질의 결합하는 부위는 서로 중복되지 않는 것일 수 있다.
표적물질이 핵산분자 이외의 생체활성물질인 경우, 상기 표적물질 또는 시료를 상기 표적물질의 포획물질이 고정화된 기질입자와 접촉시키면, 상기 표적물질의 일부가 상기 포획물질과 결합하고, 여기에 표적물질의 결합물질이 포함된 나노입자를 처리하면 상기 결합물질이 상기 포획물질과의 결합부위와 다른 부위에서 표적물질과 결합함으로써 기질입자와 나노입자의 복합체를 형성한다. 이와 같이 복합체가 형성되면, 상기 나노입자 상의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 탈혼성화시켜, 표적-클로닝 가닥을 방출시킨다. 상기 방출된 표적-클로닝 가닥은 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 핵산 서열을 가지므로, 그 일부가 상기 기질입자 표면의 표적-포획 가닥과 혼성화하고, 그 이후 과정은 앞서 설명한 (A) 내지 (C)와 동일한 과정을 거침으로써, 핵산분자 이외의 생체활성물질이 표적-클로닝 가닥에 의하여 증폭 및/또는 검출될 수 있다. 즉, 시료 내 상기 생체활성물질의 존재 여부 및/또는 수준을 상기와 같이 증폭된 표적-클로닝 가닥 및/또는 축적(농축)된 나노입자를 통하여 측정할 수 있다.
본 출원에서 제공되는 표적 핵산분자 또는 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법에 있어서, 나노입자가 기질입자 표면에 농축되도록 하기 위하여, 나노입자를 기질입자보다 충분히 많은 양(개수)으로 사용할 수 있으며, 이론적으로, 기질입자 1개당 나노입자의 최소 개수를 2개 내지 기질입자 1개당 표적-포획 가닥 개수 중에서 적절히 선택할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 나노입자와 기질입자의 사용량은 검출 조건, 표적 서열의 특성 등에 따라서 적절히 조절할 수 있다 (예컨대, 표적 서열이 혼성화(결합) 강도가 센 핵산서열 (예컨대, “GC-rich” 서열)을 가지는 경우, 나노입자 사용량을 비교적 적게 할 수 있고, 혼성화 정도가 약한 서열(예컨대, “AT-rich” 서열)을 가지는 경우, 나노입자의 사용량을 비교적 많게 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님).
본 출원에서 제공되는 표적 핵산분자 또는 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법은 폴리머라제의 사용을 수반하지 않는 것일 수 있다(enzyme-free 또는 polymerase-free).
또한, 본 출원에서 제공되는 표적 핵산분자 또는 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 방법은 액상에서 수행되는 것 일수 있다.
일 예에서, 가시화 가능한 나노입자를 사용함으로 인한 나노입자 자체에 의한 검출/정량/가시화에 추가하거나 이를 대체하여, 상기 표적-클로닝 (표적-증폭) 가닥을 라벨링하여 검출/정량/가시화할 수 있다. 예컨대, 상기 표적-클로닝 (표적-증폭) 가닥은 통상적인 표지 물질로 라벨링될 수 있다. 사용 가능한 표지 물질은 특별한 제한이 없으며, 올리고뉴클레오타이드의 라벨링에 사용 가능한 모든 표지물질 중에서 선택하여 사용할 수 있고, 예컨대, 형광물질 (예, 형광 염료 및/또는 형광 단백질)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 NCR 기술은 서로 다른 표적 물질에 대한 2종 이상의 나노입자를 사용함으로써, 서로 다른 2종 이상의 표적물질의 다중 검출(bionsensing) 및/또는 증폭에 적용될 수 있다 (multiplexibility).
보다 구체적으로, 본 명세서에서 제공되는 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화를 위한 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법은 서로 다른 표적물질 (표적 핵산분자)에 대한 주형 가닥 및 표적-클로닝 가닥을 포함하는 2종 이상의 나노입자 및/또는 서로 다른 표적물질 (표적 핵산분자에 대한 표적-포획 가닥을 포함하는 2종 이상의 기질입자를 사용함으로써, 2종 이상의 표적물질 (표적 핵산분자)을 동시에 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화할 수 있는, 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법을 제공한다. 상기 다중 검출/증폭에 있어서, 2종 이상의 표적물질 중 하나 이상이 핵산분자 이외의 물질인 경우, 상기 나노입자는 상기 핵산분자 이외의 표적물질에 대한 결합물질을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 다중 검출/증폭에 있어서, 각 표적물질 별로 표적-클로닝 가닥에 상이한 표지를 함으로써, 2종 이상의 표적물질을 한번에 증폭, 검출, 정량화, 확인, 및/또는 가시화할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법에 의하여, 표적물질에 대한 상당히 높은 검출 감도를 달성할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법의 표적물질 검출 감도는, 시료 내 표적물질 (예컨대 DNA (e.g., gDNA) 또는 RNA)의 양 기준, 10-7ng 이상, 10-6ng이상, 10-5ng 이상, 10-4ng 이상, 또는 10-3ng 이상일 수 있다 (즉, 검출 가능한 시료 내 표적물질 양의 하한값(검출 한계)은 10-7ng, 10-6ng, 10-5ng, 10-4ng 또는 10-3ng일 수 있음). 이는 중합효소를 사용한 통상적인 PCR보다 현저히 높은(예를 들어, 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 1,000배, 또는 적어도 10,000배) 검출 감도를 보이는 것이다 (도 12b 참조). 일 구체예에서, 나노입자 하나당 174개의 표적-클로닝 가닥이 로딩된 NCR 프로브를 사용하여, 3회 NCR 사이클 수행 후, solution color change 또는 UV-Vis absorbance change(예컨대, 400~650nm 파장에서 측정)를 기초로 하는 표적물질(DNA)의 dynamic range는 100 zM 내지 100 pM 정도로 나타났다. 또한, UV-Vis spectrum 통합 영역으로 확인된 검출 한계(Limitation of detection, LoD)는, NCR의 경우, PCR과 비교하여, 약 2배 이상, 약 10배 이상, 약 50배 이상, 약 100배 이상, 약 500배 이상, 약 1,000배 이상, 약 5,000배 이상, 또는 약 10,000배 이상 높은 것으로 확인 되었다 (도 12c 참조).
본 명세서에서 제공되는 NCR 기술(조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법)은 정량화 진단 플랫폼 (quantitative diagnostic platform)에 적용 가능하다. 본 명세서에서 제공되는 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법은 기존의 통상적인 PCR 기술을 대체/확장하여 다양한 표적물질 증폭/검출/정량에 적용될 수 있으며, 상기 표적물질과 관련된 질병 및/또는 증상의 진단에도 적용될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 제공되는 조성물, 어레이, 키트, 장치, 및/또는 방법은 LFA(Lateral Flow Assay)와 같은 신속진단 기술에도 적용될 수 있으며, 예를 들어, 스트립센서와 같은 신속진단키트에 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 출원에서는, enzyme-based target-amplifying thermal cycles을 반복하는 PCR을 변형하여, 가시화 가능한 나노입자를 이용하여 표적물질을 검출(예, colorimetric detection)하는 나노입자 연쇄반응 기법(nanoparticle chain reaction; NCR)을 개발하였다. 이하, 표적물질이 DNA이고 나노입자가 금 나노입자(AuNPs)인 경우를 예로 들어 도면을 참조로 본 출원을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다:
표적 DNA와 동일한 서열(표적-클로닝 DNA; target-cloning DNA) 및 상보적 서열이 부분적으로 이중가닥을 형성하는 DNA가 결합된 나노입자(DNA-AuNPs)에서 방출되는 다수의 혼성화된 표적-클로닝 DNA를 통하여 표적 DNA를 증폭한다. 상기 증폭은, DNA 변조(결합) 자성 입자를 사용하여 표적 DNA 샌드위치 복합체를 형성 및 분리하고, desalting process를 통해 상기 나노입자로부터 표적 DNA 가닥과 함께 표적 클로닝 DNA 가닥을 방출시킴으로써 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 NCR 기법은 (나노입자당 표적-클로닝 DNA의 수)n 만큼 표적 DNA를 기하급수적으로 증가시킬 수 있고, 여기서 n은 사이클 회수이다. 또한, NCR 기법은 용액에서 나노입자의 수를 극적으로 증가시킴으로써 플라즈몬 나노입자에 의해 유도된 뚜렷한 용액 색상 변화는 육안으로 감지할 수 있도록 할 수 있다. NCR은 축적된 DNA-나노입자의 수가 육안 기반 비색 검출 또는 UV-Vis 분광 광도계 기반 정량화를 수행하는데 충분히 높을 수준이 될 때까지 사이클을 반복할 수 있다.
보다 구체적으로, 자기장을 인가하여 샌드위치 복합체를 분리한 후, 표적-클로닝 DNA 로딩 AuNP(NCR 프로브)가 탈혼성화에 의해 상기 복합체로부터 방출된다. 표적-클로닝 DNA 서열은 표적 DNA의 표적 부위 서열과 정확히 동일하며, assay 전에 NCR 프로브 표면에 preloading되어 있다. 이 과정에서 표적 가닥과 함께 다수의 표적-클로닝 DNA 가닥도 함께 방출된다. 방출된 표적-클로닝 가닥은 후속 사이클에서 NCR 프로브-자성 입자(자성 프로브) 간 샌드위치 복합체 형성에 사용되어, NCR 프로브-자성 입자 복합체 형성 기회를 높은 수준으로 유도한다 (도 1a). 일단 표적-클로닝 가닥이 로딩된 NCR 프로브가 표적-클로닝 가닥을 방출(dehybridization)하면, NCR 프로브는 표적-클로닝 가닥이 없는 unloaded NCR 프로브가 된다(도 3 참조). 도 3은 로딩된 NCR 프로브로부터 표적-클로닝 가닥의 방출을 모식적으로 보여주는 것으로, 로딩된 NCR 프로브에는 미리 하이브리드화된 표적-클로닝 가닥(녹색)과 주형 가닥(붉은색)의 표적 결합 부위가 포함되어 있으며, 로딩된 NCR 프로브가 탈혼성화되면 미리 하이브리드화된 표적-클로닝 가닥이 방출됨으로써, 로딩된 NCR 프로브는 unloaded NCR 프로브가 되어 표적 증폭을 위한 다음 사이클에 사용됨을 보여준다.
NCR 사이클이 반복됨에 따라 NCR 프로브도 높은 수준으로 축적되며, 이로 인하여 플라즈몬 AuNP의 농도가 높아져서 용액이 상기 농도에 비례하여 적색을 띠게 되고, 반응 용액에서 표적 가닥과 포획된 NCR 프로브의 총 수는 기하급수적으로 증가한다(도 1b). NCR 프로브-자성 입자 샌드위치 복합체의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 통하여 NCR 사이클이 반복됨에 따라 자성 입자 표면에 포획된 NCR 프로브의 수가 증가하고 용액의 적색 색상 강도가 증가함을 확인할 수 있다(도 1c, 2d 및 4).
상기 내용을 실험적으로 증명하기 위하여, 본 출원에서 제공되는 NCR 기술을 사용하여 탄저병 치사 인자 (anthrax lethal factor) DNA 염기서열을 검출하였다. 감염성 병원체의 검출에 있어서, 특별한 장비 없이 신속하고 민감하게 검출할 수 있는 현장 감지 기술의 중요성이 높기 때문에, 이러한 감염성 병원체의 대표예로서 탄저병 관련 유전자를 시험하였다.
실시예 1.3에 예시되는 바와 같이, NCR 프로브는 금 나노입자(AuNPs)에 티올화된 주형 가닥을 부착(접합)시킨 후, 과량의 표적-클로닝 가닥을 첨가하여, 상기 표적-클로닝 가닥이 주형 가닥에 부분적으로 혼성화되도록 하여 생성할 수 있다.
이 경우, 주형 가닥에 포함된 표적-결합 부위가 표적-클로닝 가닥의 일부와 상보적이어서, 표적-클로닝 가닥과 상기 표적-결합 부위 간 원하지 않은 혼성화가 있을 수 있으며, 이는 비활성 NCR 프로브를 생성하여 제기능을 하지 못하게 하고 NCR 어세이의 선택성 및 감도를 심각하게 저하시킬 수 있다. 따라서, 표적 상보체(target complements; toehold sequence) 첨가하여 toehold-mediated displacement를 유발시킴으로써, 주형 가닥의 표적-결합 부위에 원하지 않게 혼성화된 표적-클로닝 가닥을 제거하고, 주형 가닥의 표적-결합 부위를 완전히 노출시켜 표적 가닥과의 결합을 위한 표적-결합 부위를 오픈시킴으로써, 활성 NCR 프로브를 형성할 수 있다 (도 1d). 비활성 NCR 프로브 및 NCR 프로브(toehold 서열 첨가)의 젤 전기영동 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에 나타난 바와 같이, toehold 서열 첨가에 의하여 표적-결합 부위를 노출시키는 의도된 toehold-mediated displacement가 일어났음을 확인할 수 있다. 또한, 비활성 NCR 프로브와 활성 NCR 프로브의 동적 광산란(dynamic light scattering) 측정 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되는 바와 같이, 비활성 NCR 프로브가 활성 NCR 프로브보다 지름이 크고, unloaded NCR 프로브가 가장 큰 지름을 나타내었다. 또한, 제타 전위 측정 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9의 제타 전위 결과는 NCR 프로브 표면에 접합된 DNA에 의한 표면 음전하 상태를 보여주고, 도 10은 AuNP, 주형 가닥-변조(접합) AuNP, 비활성 NCR 프로브, 및 활성 NCR 프로브들이 다양한 UV-Vis 스펙트럼을 생성함을 보여준다. 특히 260 nm 에서는 DNA에 의한 흡수 피크, 532 nm 에서는 금나노입자에 의한 흡수 피크가 확인되었다. 중요하게도, NCR 2 cycles 수행 후, 비활성 및 활성 NCR 프로브 간 비교에 의하여, 활성 NCR 프로브의 개선된 선택성이 입증되었다(도 2b, 8). 활성 NCR 프로브는 표적 가닥에서만 적색을 나타내는 반면, 비표적 및 단일 염기 불일치 서열(single-base mismatch sequences)에 대해서는 검출 가능한 색상이 거의 관찰되지 않았다. 반면, 비활성 NCR 프로브는 표적, 비 표적 및 단일 염기 불일치에 서열 모두에 대해 강한 적색을 나타내어, 표적 서열에 대하여 매우 낮은 선택성이 나타내었다.
포획된 NCR 프로브의 증가된 개수는 NCR 사이클 반복에 따른 표적 핵산의 증폭된 수에 대응한다. 중요하게도, NCR 사이클 회수가 증가함에 따라 NCR 어세이 산물의 AuNP 유도 적색 강도가 증가한다(도 2c). 육안에 의한 NCR 어세이의 검출 한계는 1회, 2회 및 3회 NCR 사이클 후에 각각 1pM, 1fM 및 100zM 정도의 낮은 수준을 보이는 것으로 확인되었다. 전반적으로 NCR 어세이 산물의 적색 강도는 표적 DNA 농도가 증가함에 따라 점차적으로 증가하였다. 비교를 위해 NCR 어세이를 통하여 10pM의 비표적 및 단일 염기 불일치 서열 검출을 수행하였으며, 그 결과, 두 경우 모두 감지 가능한 용액 색상 변화가 없었다. AuNP 기반 스펙트럼 변화를 통합하여 표적 DNA의 양을 보다 정확하게 정량하기 위하여 UV-Vis 측정도 수행하였으며, AuNP-유도 스펙트럼 변화를 광범위하게 포함하기 위하여, AuNPs의 양은 400~650 nm 파장에서 UV-Vis 스펙트럼 영역을 적분하여 구하였다(도 2d). 중요하게도, NCR 사이클의 회수가 증가함에 따라 표적 농도가 증가함에 따른 검출 신호 강도의 보다 뚜렷한 증가가 관찰되었으며, 3회 NCR 사이클 후, 100zM 내지 100pM 표적 농도까지의 매우 넓은 동적 범위(dynamic range)가 얻어졌다.
그런 다음, Cy3-표지 주형 가닥과 Cy5-표지 표적-클로닝 가닥으로 형광 신호를 측정하여 NCR 사이클의 증가가 표적 DNA의 양에 미치는 영향을 정량화 하였다. 상기 형광단-변조(표지) 가닥을 사용하여 NCR 프로브를 형성하고, AuNP를 최종적으로 KCN으로 용해시켜, 올리고뉴클레오티드의 형광 기반 정량화를 위해 DNA 가닥을 완전히 방출하였다. 도 2e는 NCR 사이클 회수가 5번째 사이클까지 증가함에 따라 매우 넓은 동적 범위에 걸쳐 훨씬 더 가파르게 표적-클로닝 가닥 수가 증가함을 보여준다. 나노입자는 높은 surface-to-volume ratio를 제공하여 많은 수의 핵산분자가 AuNP의 표면에 접합될 수 있다. 본 실시예의 경우, 주형 가닥의 평균 수는 AuNP당 430 가닥이고, 미리 혼성화된(pre-hybridized) 표적-클로닝 가닥의 수는 AuNP당 174가닥이다 (도 9, 10). 따라서, 단일 NCR 프로브는 NCR 사이클당 최대 174개의 표적-클로닝 가닥을 방출할 수 있다. 원칙적으로 PCR은 표적 가닥을 2n배로 증폭하는 반면, 본 출원에서 제공되는 NCR은 이론적으로 하나의 나노입자에 결합된 표적-클로닝 가닥 수인 174의 n승 (174n) 배로 표적 가닥을 증폭할 수 있다 (n은 사이클 회수를 나타냄). 그러나, 축적된 unloaded NCR 프로브는 loaded NCR 프로브와 DNA-접합된 자성 입자 사이의 표적 매개 혼성화를 방해할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 본 실시예에서의 분석 결과는 unloaded NCR 프로브가 표적 결합에 있어서 loaded NCR 프로브보다 더 선호되는 것을 나타내었다 (도 11). 따라서, NCR 사이클의 증폭 효율은 현재 어세이에서 최대화되지 않았으며, 추가의 최적화가 필요하다. 그럼에도 불구하고, NCR 어세이는 단지 3회 NCR 사이클 수행 후에 zeptomolar 표적 농도의 육안 검출을 가능하게 하였다.
새로운 나노입자 연쇄반응(NCR) 기술을 이용하여, 극소량의 표적물질도 안정적으로 증폭/검출/가시화할 수 있는 검출 및/또는 진단 기술을 제공한다. 상기 NCR 기술은 효소를 사용하지 않으므로, 별도의 장비가 필요하지 않으면서도, 매우 우수한 검출 감도를 달성하 수 있어서, 현장 검출/진단 수단으로 적용 가능하며, 기존의 PCR과 비교하여 더 긴 DNA(예: 게놈 DNA 등)를 매우 높은 감도로 검출할 수 있어 검출 한계를 개선할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 제공하는 NCR은 현장 감지를 위한 lateral flow assay(신속 키트)의 검출한계 개선에 기여하므로, lateral flow assay(신속 키트)에도 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 나노입자 연쇄 반응의 원리를 보여주는 것으로,
1a는 나노입자 연쇄 반응의 1회 사이클 과정을 보여주고;
1b는 반복적 NCR 어세이 주기를 모식적으로 나타내며;
1c는 표적 분석물의 10pM 농도에 의해 시작된 NCR 프로브와 자성 기질입자의 샌드위치 복합체의 SEM 이미지이고 (Scale bar, 200 nm; 삽입도는 언로딩된 NCR 프로브의 수가 증가함에 따라 육안으로 감지할 수 있는 color appearance임).
1d는 toehold-mediated strand displacement reaction을 통한 NCR 프로브의 합성 준비 과정을 모식적으로 보여주고;
1e는 표적-클로닝 가닥(녹색) 및 주형 가닥(붉은색) 상에 표적-결합 부위(빨간색)를 포함하는 NCR 프로브의 개략도이다.
도 2는 비색 NCR 어세이(Colorimetric NCR assay) 결과를 보여주는 것으로,
2a는 원하는 NCR 프로브 준비 과정을 보여주기 위해 겔 전기영동을 수행한 결과로서, NCR 프로브 준비의 각 단계에는 다른 DNA 길이가 얻어짐을 보여주고,
2b는 다양한 농도의 분석물질(표적물질)에 대한 NCR 결과 (UV-Vis spectrum)를 보여주는 그래프로서, 비표적 가닥(N; non-target sequence) 및 단일 염기 불일치 가닥(S: single-base mismatch sequence)은 검출하지 않는 반면, 표적 물질은 높은 감도 (100zM 이상)로 검출하며, 검출능은 사이클 회수에 비례함을 보여주고,
2c 및 2d는 육안으로 검출가능한 NCR 어세이 결과를 보여준다.
도 3은 로딩된 NCR 프로브로부터 표적-클로닝 가닥의 방출을 모식적으로 보여준다.
도 4는 NCR 어세이 동안의 샌드위치 복합체의 SEM 이미지를 보여주는 것으로, NCR 어세이는 표적 가닥 농도 10pM에서 수행되었으며, NCR 사이클 회수가 증가할수록 샌드위치 복합체 생성이 증가함을 보여준다 (Scale bar: 1μm).
도 5는 2회 NCR 어세이 사이클 수행 후의 UV-Vis 흡광도 영역 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 NCR 프로브 상의 표적-클로닝 가닥을 정량한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 NCR 프로브 상의 주형 가닥을 정량한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 NCR 프로브의 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 NCR 프로브의 제타 전위 측정 결과를 보여준다.
도 10은 NCR 프로브의 UV-Vis 스펙트럼 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 로딩(표적-클로닝 가닥 혼성화된 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 포함) 및 언로딩(주형 가닥만 포함) NCR 프로브의 표적 가닥의 포획 정도를 보여주는 그래프이다.
도 12는 colorimetric NCR assay 결과를 PCR과 비교하여 보여주는 것으로.
12a는 NCR과 PCR 간 gDNA 검출 과정 비교 개략도이고,
12b는 박테리아에서 추출한 gDNA를 NCR 또는 PCR로 검출한 결과를 보여주는 것으로, NCR 어세이는 육안 검출 가능하지만(검출한계: 10-7ng), PCR는 겔 전기영동 결과를 통해 확인 가능함을 보여주고 (검출한계: 10-3ng),
12c는 NCR 및 PCR 분석 결과 (UV-Vis spectrum)를 비교하여 보여주는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되지 아니한다.
실시예 1
1.1. 재료 준비
50-nm 시트레이트-안정화 금 나노입자를 BBI Solutions (Cardiff, UK)에서 구입하였다. Dynabeads® M-270 carboxylic acid은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하고, 입수된 상태로 추가 정제 없이 사용하였다. 하기 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 Integrated DNA Technologies, Inc.로부터 입수하였다. 증류수는 Millipore system (>18.0MΩ, Milli-Q)로부터 입수하고, 모든 실험에 사용하였다. Perfect HybTM Plus Hybridization buffer (Sigma-Aldrich) 및 1x PBS buffer를 1:3의 비율로 혼합한 혼합 용액을 NCR 어세이의 혼성화 완충액 (hybridization buffer)으로서 사용하였다.
본 출원의 효과를 실험적으로 증명하기 위하여, 검출 대상 표적 올리고뉴클레오타이드(이하, 표적 가닥 또는 표적 서열로도 기재됨)는 탄저병 치사 인자 (anthrax lethal factor) DNA 염기서열 (GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT; 서열번호 1)을 선택하여, 이후 시험을 진행하였다. 감염성 병원체의 검출에 있어서, 특별한 장비 없이 신속하고 민감하게 검출할 수 있는 현장 감지 기술의 중요성이 높기 때문에, 검출 대상으로서 감염성 병원체의 대표예인 탄저병 관련 유전자를 선택하였다.
1.2. 기질입자 (자성 프로브)의 제작
카르복실산-관능화된 자성 입자 (지름 2.8μm)는 사용 전 10분간 완전히 볼텍싱하였다. 자성 입자 200μl를 새 튜브로 옮겼 담았다. 상기 자성 입자를 25mM 2-[N-모르폴리노]에탄 설폰산(2-[N-morpholino] ethane sulphonic acid; MES) 완충액 (pH 4.8)으로 2회 세척하고, 동일한 완충액 20 μl에 재현탁시켰다. 100mM MES (pH 4.8)에 용해된 N-에틸-N'-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 염산염 (100mg/ml) 8μl 및 5'-아민화 올리고뉴클레오티드(표적-포획 가닥) (10 nmol; 5’-NH2-(CH2)3-A10-ATC CTT ATC AAT ATT-3’: NH2-(CH2)3-A10-[서열번호 3])의 혼합물을 상기 세척된 자성입자 용액에 첨가하였다. 실온에서 4시간 동안 볼텍싱하면서 인큐베이션한 후, 자성 입자를 3회 세척하고 혼성화 완충액에 분산시켰다. 상기 얻어진 자성 입자는 하기 실시예에서 표적물질 검출을 위한 기질입자로 사용하였다.
1.3. NCR 프로브의 제작
디설파이드-변조된 주형 가닥 (5’-TAA CAA TAA TCC CTC ATC CTT ATC AAT ATT TAA CAA TAA TCC CTC (A)10-3’; [서열번호 2]-(A)10)은 실온에서 2시간 동안 인큐베이션을 통해 100mM 포스페이트 완충액 (pH 8)에 용해된 100mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol; DTT)을 사용하여 환원시켜, 3’-티올화 주형 가닥(5’-[서열번호 2]-PEG6-A10-SH-3’)을 준비하였다. 환원 후, NAP-5 컬럼(Fisher Scientific)을 사용하여 과량의 DTT를 제거하였다. 새로 환원된 티올화 주형 가닥을 103 pmole의 양으로 0.1%(v/v)의 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 및 평균지름 50nm의 금 나노입자(AuNPs) 5.17 mole이 포함된 증류수 용액에 첨가하였다. 이와 같이 얻어진 혼합 용액을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 최종 인산염 농도가 100mM (pH 7.4)이 되도록 조정하였다. 0.01% SDS가 포함된 2M NaCl의 6개 분취량을 30분 간격으로 첨가하여, 최종 염 농도가 0.3M이 되도록 하였다. 상기 얻어진 혼합물을 각 염 첨가 후 10분 동안 80℃로 가열하였다. 최종 혼합물을 실온으로 천천히 냉각시켜 밤새 인큐베이션하여, 표면에 다수의 주형 가닥이 결합(접합)된 금 나노입자 현탁액을 얻었다. 현탁액을 원심분리 (8000 rpm, 10분)를 통해 세척하고, 얻어진 입자 용액을 증류수에 재분산시켰다. 주형 가닥-접합된 금 나노입자를 300mM NaCl 완충액에서 과량의 표적-클로닝 가닥 (5’-GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT-3’; 서열번호 1)과 함께 55°C에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 1시간 동안 실온으로 냉각시켰다. 과량의 표적-클로닝 가닥을 원심분리 (11000rpm, 2분)로 제거하였다. 0.1%(v/v) SDS가 포함된 40-mM MgCl2 완충액에 있는 과량의 toehold DNA(서열번호 4)를 동일한 튜브에 첨가하고, 43°C에서 30분 동안 인큐베이션한 후 3시간 동안 실온으로 냉각하여, 표면에 주형 가닥이 결합되고, 상기 주형 가닥에 표적-클로닝 가닥이 부분적으로 혼성화되어 있는 형태의 NCR 프로브를 얻었다. 연속적인 혼성화 후, 얻어진 NCR 프로브를 원심분리(11000 rpm, 2분)를 통해 4회 세척하고 혼성화 완충액에 재분산시켰다.
상기 실시예 1.2 및 1.3에 사용된 올리고뉴클레오타이드의 서열을 아래의 표 1에 정리하였다:
NCR 사이클에 사용된 DNA 서열
Synthetic oligonucleotides Sequences (5’ → 3’) 서열번호
Magnetic particle strand (target-capturing strand) NH2-(CH2)3-A10-ATC CTT ATC AAT ATT NH2-(CH2)3-[서열번호 3]
Template strand TAA CAA TAA TCC CTC ATC CTT ATC AAT ATT TAA CAA TAA TCC CTC-PEG6-A10-SH [서열번호 2] -PEG6-A10-SH
Target-cloning strand GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT 서열번호 1
Toehold strand ATC CTT ATC AAT ATT TAA CAA TAA TCC CTC 서열번호 4
Target strand GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT 서열번호 1
Single-base mismatch strand GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT TAT AAG GAT 서열번호 5
Nonspecific strand CTG ATT ACT ATT GCA TCT TCC GTT ACA ACT 서열번호 6
1.4. NCR 어세이
증폭 전에, PerfectHybTM Plus Hybridization buffer (Sigma-Aldrich)를 1x PBS buffer와 1:3의 비율로 혼합하여 준비하였다. 혼성화를 위하여, 표적 가닥 (GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT; 서열번호 1) 100 μl와 자성 기질입자 (실시예 1.2) 10 μl (5 mg/ml)를 튜브에 넣고 혼합한 후 10분간 인큐베이션하였다. 상기 튜브에 NCR 프로브 (실시예 1.3) 15μl(1OD)(5.17x10-2 pmole/ml)(775amole)를 첨가한 다음, 20분 동안 인큐베이션하였다. 자성 분리기를 통해 자성 기질입자를 혼성화 완충액으로 3회 세척한 후, 30ul의 증류수에 분산시키고 80℃에서 2분 동안 인큐베이션하여 탈혼성화시켰다. 다음 사이클 어세이를 위해, 혼성화 완충액을 첨가하여 염 농도를 증가시킨 후, 10분 동안 인큐베이션하였다. NCR 프로브 15μl(1OD)(5.17x10-2 pmole/ml)(775amole) 첨가, 20분 동안 인큐베이션, 핵산의 세척 및 방출 과정을 반복하여 어세이 산물 (assay product)가 보다 높은 적색 강도를 나타내도록 하였다.
1.5. NCR 어세이 산물의 UV-Vis 측정
NCR 어세이 산물을 자기 분리기를 통해 즉시 분리하고, UV-Vis 측정 전에 핵산 방출을 위해 80°C에서 배양하였다. 각각의 방출된 NCR 어세이 산물의 흡광도 스펙트럼은 ultraviolet-visible spectrometer (S-3100, SCINCO)를 사용하여 측정하였다. 금 나노입자 프로브 (NCR 프로브)로부터 측정된 적색 UV-Vis 강도를 532 nm에서 측정하였다.
1.6. 폴리아크릴아미드젤 전기영동 (Polyacrylamide gel electrophoresis)
toehold-매개 변위 반응을 포함한 활성 NCR 프로브 제작 과정을 검증하기 위하여 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하였다. 30%(w/v) acrylamide/Bis 용액, 탈이온수, 5X TBE (Tris-Borate-EDTA) 완충액, 암모늄 퍼설페이트, 및 TEMED (tetramethylethylenediamine)를 사용하여 15%(w/v) 폴리아크릴아미드 젤을 제조하였다. DNA가 결합된 금 나노입자 (실시예 1.3)를 0.1M KCN 용액으로 처리하여 용해시켰다. 로딩 염료가 포함된 금-용해된 DNA 샘플을 1.5mm 두께 젤의 각 웰에 첨가하였다. 젤 상에서의 DNA 분자량 확인을 위하여, 20bp DNA ladder를 다른 웰에 로딩하였다. 전원 공급 장치를 사용하여 상기 젤에 전기장(130V)을 70분 동안 인가하여 전기영동하였다. 전기영동 후, SYBR Green I(Lonza)를 사용하여 젤을 10분 동안 염색하고, gel imager에 의하여 306 nm에서 UV 광여기를 사용하여 젤을 영상화하였다.
1.7. Scanning electron microscopy (SEM)
각 사이클에서의 표적 가닥(서열번호 1)의 존재 하의 자성 기질입자와 NCR 프로브의 샌드위치 복합체를 전계방출형 주사전자현미경 (Field Emission Scanning Electron Microscope; FE-SEM; SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany)로 관찰하였다. 샌드위치 복합체 구조 입자를 구리 그리드에 로딩하고 Pt 코팅 (EM ACE200, Leica, Austria) 처리하고, 이미지화했습니다. FE-SEM 이미징은 NICEM (National Instrumentation Center for Environmental Management; Seoul National University, Seoul, South Korea)에서 수행하였다.
1.8. 올리고뉴클레오티드의 정량화
표적 올리고뉴클레오티드의 정량화를 위하여 형광 염료 부착된 (Fluorescent dye-modified) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 AuNP 기반의 PCR 프로브를 제작하였다. 형광광도계(F200 Pro, TECAN)를 이용하여 형광 신호를 측정하였다. 주형 가닥과 표적-클로닝 가닥은 5’ 말단에 각각 Cy3 염료 (주형 가닥)와 Cy5 염료 (표적-클로닝 가닥)를 사용하여 표지하였다. salting 및 NCR 어세이 후, 금 나노입자를 10mM KCN에 용해시켰다. 잔존하는 형광-표지 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형광 강도를 측정하였다. 염료 샘플의 알려진 농도의 검량선 (calibration curve)을 정량화에 사용하였다.
1.9. 동적광산란법(dynamic light scattering; DLS) 및 제타전위 측정을 통한 입자 특성 분석
NCR 프로브와 자성 기질입자의 크기특성 및 표면 전하특성 분석을 위하여, 상기 NCR 프로브 및/또는 자성 기질입자를 증류수 용액에 분산시킨 후, 동적광산란계광도계 (Malvern Instrument, Malvern)를 이용하여 입자 크기 및 전하를 측정하였으며, 세 번의 측정 후 평균값을 이용하였다.
Data availability
The data that support the plots within this paper and other findings of this study are available from the corresponding author upon reasonable request.
실시예 2. 비색 NCR 어세이(Colorimetric NCR assay)
실시예 1.2 및 1.3에서 각각 제작된 자성 프로브와 NCR 프로브에 10pM 농도의 표적 올리고뉴클레오타이드 (GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT; 서열번호 1)를 처리한 후, 각 사이클에서의 NCR 프로브와 자성 프로브 간 형성된 샌드위치 복합체를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하고 (실시예 1.7 참조), 반응액의 색 변화를 육안으로 관찰하였다. 이와 같이 얻어진 SEM 이미지 및 용액 색 변화를 도 1c (Scale bar, 200 nm; 삽입도는 언로딩된 NCR 프로브의 수가 증가함에 따라 육안으로 감지할 수 있는 color appearance임) 및 도 4(Scale bar: 1μm)에 나타내었다. 이들 결과에 나타난 바와 같이, NCR 사이클이 반복됨에 따라 자성 프로브 표면에 포획된 NCR 프로브의 수가 증가하고 용액의 적색 색상 강도가 증가함을 확인할 수 있다.
또한, 실시예 1.3에서와 같이 toehold 서열(서열번호 4)을 첨가하여 제작된 NCR 프로브에서, 주형 가닥의 표적-결합 부위와 표적-클로닝 가닥 간 원하지 않는 결합이 일어나는지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 1.6을 참조하여 젤 전기영동을 수행하였다. 비교를 위하여, toehold DNA를 처리하지 않은 NCR 프로브에 대하여 동일한 시험을 수행하였다. 상기 얻어진 젤 전기영동 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 실시예 1.3에서와 같이 toehold 서열이 첨가된 경우, 주형 가닥의 표적-결합 부위와 표적-클로닝 가닥 간 결합 없이, 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 표적-클로닝 가닥 간 적합한 결합이 이루어지고 표적-결합 부위가 단일가닥으로 노출된 활성화(active) 상태의 NCR 프로브가 얻어지는 반면, toehold 서열이 첨가되지 않은 경우에는 주형 가닥의 표적-결합 부위와 표적-클로닝 가닥 간 결합이 일어나 표적-결합 부위가 노출되지 않은 불활성화(inactive) 상태의 NCR 프로브가 얻어짐을 확인할 수 있다. 이러한 결과는, toehold 서열 첨가에 의하여 표적-결합 부위를 노출시키는 의도된 toehold-mediated displacement가 일어났음을 보여준다.
실시예 3. NCR Assay (UV-Vis spectrum)
표적 올리고뉴클레오타이드 농도 또는 toehold 서열 사용 여부에 따른 NCR 어세이 결과를 UV-Vis spectrum으로 확인하였다 (실시예 1.4 및 1.5 참조).
표적 특이성 확인을 위하여, 비교예로서, 비표적 가닥(N; non-target sequence; 서열번호 6) 및 단일 염기 불일치 가닥(S: single-base mismatch sequence; 서열번호 5)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.
상기 얻어진 결과를 도 2b 내지 2d에 나타내었다.
도 2b는 다양한 농도의 표적 가닥에 대한 NCR 결과 (UV-Vis spectrum)를 보여주는 그래프로서, 비표적 가닥(N; non-target sequence) 및 단일 염기 불일치 가닥(S: single-base mismatch sequence)은 검출하지 않는 반면, 표적 가닥은 높은 감도 (검출 한계: 100zM 이상)로 검출하며, 검출능은 사이클 회수에 비례함을 보여준다. 도 2c (1 사이클 수행) 및 2d (1~3 사이클 수행)는 NCR 어세이 결과를 육안으로 확인한 결과를 보여주는 것으로, 이 또한, NCR 어세이가 비표적 가닥 및 단일염기불일치가닥은 검출하지 않는 반면, 표적 가닥은 높은 감도로 검출할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 본 출원에서 제공되는 NCR 어세이가 표적-특이적이면서 높은 감도로 표적 물질을 증폭/검출/가시화할 수 있음을 보여준다. 또한, 도 2c는 주형 가닥의 표적-결합 부위가 노출된 활성화 NCR 프로브가 N 및 S 가닥과 표적 가닥을 육안으로 뚜렷하게 구분 가능하도록 함을 보여준다.
또한, 2회 NCR 어세이 사이클 수행 후의 UV-Vis 흡광도 영역을 측정하여, 도 5에 나타내었다. 도 5에서, 초기 표적 가닥 농도는 10pM으로 하고, N과 S는 각각 non-target sequence와 single-base mismatch sequence를 나타내고, optical extinction 값은 532 nm에서 측정하였다 (Error bars show the s.d. of the extinction values from three independent experiments). 도 5에 나타난 바와 같이, 주형 가닥의 표적-결합 부위가 노출된 활성화 NCR 프로브가 N 및 S 가닥과 표적 가닥을 육안으로 뚜렷하게 구분 가능하도록 함을 보여준다.
실시예 4. 올리고뉴클레오타이드의 정량화
실시예 1.8의 방법으로 실시예 1.3에서 준비된 NCR 프로브 상의 올리고뉴클레오타이드의 정량화를 수행하여, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6은 NCR 프로브 상의 표적-클로닝 가닥을 정량한 결과를 보여준다. AuNP 상의 표적 클로닝 가닥의 수는 형광 강도를 측정하여 계산하였다. Cy5 염료로 표지된 표적-클로닝 가닥을 사용하여 제작된 NCR 프로브를 시험에 사용하였다. Cy5 염료의 알려진 농도와 연속 희석된 샘플은 표준 곡선을 준비하였다. NCR 프로브 (AuNP)는 10mM KCN에 용해하여 사용하였고, 표준 곡선의 파란색 삼각형 표시가 NCR 프로브 용액에서 측정된 형광 강도를 보여준다.
도 7은 NCR 프로브 상의 주형 가닥을 정량한 결과를 보여준다. AuNP 당 주형 가닥의 수는 형광 강도를 측정하여 계산하였다. Cy3 염료로 표지된 주형 가닥을 AuNP에 접합시켜 얻어진 NCR 프로브를 시험에 사용하였다. 희석된 시료들 및 Cy3 염료의 알려진농도에 의하여 표준 곡선을 준비하였다. NCR 프로브(AuNP)는 10mM KCN에 용해하여 사용하였다. 표준 곡선의 빨간색 삼각형 표시는 주형 가닥-결합 AuNP에서 측정된 형광 강도이다.
실시예 5. 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 측정 결과
실시예 1.9를 참조하여 NCR 프로브의 동적광산란(dynamic light scattering; DLS) 측정을 수행하고, 그 결과를 도 8 내지 11에 나타내었다.
도 8은 NCR 프로브의 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 측정 결과를 보여준다. NCR 프로브 제조 과정 중의 입자 크기 변화를 DLS로 측정하였다. 주형 가닥으로 변형(결합)된 금 나노입자는 78.82 nm의 Z-평균 크기를 나타낸다. 표적-클로닝 가닥 혼성화를 통해 제조된 비활성 NCR 프로브는 Z-average size가 91.28 nm로 측정되어, 주형 가닥 결합된 금 나노입자보다 DNA 길이가 길게 나타났다. Toehold sequence를 통해 과량의 표적-클로닝 가닥을 제거한 후의 활성 NCR 프로브는 Z-average size가 69.51 nm로 측정되어, 감소된 DNA 길이를 가짐을 확인하였다. 주형 가닥 변형 AuNP와 NCR 프로브의 염기 수는 동일하지만 활성 NCR 프로브는 이중 가닥 나선 구조의 DNA를 포함하기 때문에 Z-평균 크기가 더 작게 측정되었다.
도 9는 NCR 프로브의 제타 전위 측정 결과를 보여준다. NCR 프로브 제작 과정 중의 표면 전하 변화는 제타 전위로 측정될 수 있다.
도 10은 NCR 프로브의 UV-Vis 스펙트럼 측정 결과를 보여준다. NCR 프로브 제작 중의 다양한 단계의 UV-Vis 흡광도 스펙트럼을 측정하였다. NCR 프로브는 DNA 가닥이 금 나노입자의 표면에 접합됨에 따라 UV-Vis 데이터가 청색 이동함을 보여준다.
도 11은 로딩(표적-클로닝 가닥 혼성화된 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 포함) 및 언로딩(주형 가닥만 포함) NCR 프로브의 표적 가닥의 포획 정도를 보여주는 그래프이다. 언로딩 NCR 프로브는 NCR 어세이 중에 생성되며 다음 사이클에서 원하는 샌드위치 복합체 형성을 방해한다. NCR 어세이 동안 언로딩된 NCR 프로브의 영향을 결정하기 위해, 언로딩된 NCR 프로브와 로딩된 NCR 프로브의 동역학을 단일 사이클 NCR 어세이를 통해 측정하였다. 비교를 위해, 두 프로브 모두 표적 가닥과 동일한 농도, 즉 10pM에 대해 각각 첨가된 혼합물에 대하여 동일한 시험을 수행하였다. 로딩된 NCR 프로브와 언로딩 NCR 프로브의 혼합물은 1:1 비율로 준비하였다. 언로딩 NCR 프로브가 로딩 NCR 프로브에 비해 양호한 반응을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 6. colorimetric NCR assay와 PCR과의 비교
박테리아 (Bacillus cereus)의 유전체 DNA (gDNA)를 본 출원의 colorimetric NCR assay 및 기존의 PCR로 검출하여, 그 결과를 비교하였다.
상기 박테리아는 실시예 1.1 내지 1.3에서 표적으로 사용된 서열번호 1을 공유하므로, 상기 NCR assay는 실시예 1.1 내지 1.3에서 준비된 자성 프로브 및 NCR 프로브를 사용하여, 실시예 1.4의 방법으로 수행하였다.
PCR은 하기의 프라이머 서열 및 조건으로 수행하였다:
F-primer : 5’-CTGGCTCAGGATGAACGC-3’(서열번호 7)
R-primer : 5’-CGACTTCGGGTGTTACAA-3’(서열번호 8)
PCR 조건 : 95 C에서 1분, 53 C에서 30초, 72 C에서 1분 30초의 세 단계를 35 사이클 반복함.
상기 얻어진 colorimetric NCR assay 및 PCR의 비교 결과를 도 12a 내지 12c에 나타내었다. 도 12a는 NCR과 PCR 간 gDNA 검출 과정 비교 개략도로서, NCR assay의 경우, 검출을 위한 장비가 필요하지 않고, PCR보다 단시간에 수행 가능하다. 도 12b는 박테리아에서 추출한 gDNA를 NCR 또는 PCR로 검출한 결과를 보여주는 것으로, NCR 어세이는 육안 검출 가능하지만(검출한계: 10-7ng), PCR는 겔 전기영동 결과를 통해 확인 가능함을 보여준다 (검출한계: 10-3ng). 도 12c는 NCR 및 PCR 분석 결과 (UV-Vis spectrum)를 비교하여 보여주는 그래프로서, NCR assay가 PCR assay보다 대략 104배 높은 감도를 보이는 것을 확인할 수 있다.

Claims (11)

  1. (1) 다음을 포함하는 주형 가닥(template strand):
    (i) 표적 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 표적-클로닝 부위(target-cloning site), 및
    (ii) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부와 상보적인 표적-결합 부위; 및
    (2) 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함하는 표적-클로닝 가닥(target-cloning strand)
    을 포함하고,
    상기 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 상기 표적-클로닝 가닥이 상보적 결합하여 이중가닥을 형성하고 상기 표적-결합 부위는 단일가닥인,
    부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드(partially double-stranded oligonucleotide).
  2. 제1항에 있어서, 상기 주형 가닥은 10-100 nt 길이인, 올리고뉴클레오타이드.
  3. 복수의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
    각각의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는
    (1) 다음을 포함하는 주형 가닥(template strand):
    (i) 표적 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 표적-클로닝 부위(target-cloning site), 및
    (ii) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부와 상보적인 표적-결합 부위; 및
    (2) 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함하는 표적-클로닝 가닥(target-cloning strand)
    을 포함하고,
    상기 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 상기 표적-클로닝 가닥이 상보적 결합하여 이중가닥을 형성하고 상기 표적-결합 부위는 단일가닥이고,
    상기 주형 가닥의 일 말단이 표면에 고정화된, 나노입자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 나노입자는 금, 은, 실리카, 백금, 구리, 또는 금, 은, 백금, 구리 등으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 합금인, 나노입자.
  5. (a) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부(제1 부분)와 상보적인 복수의 표적-포획 가닥이 표면에 고정된 기질입자, 및
    (b) 복수의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자
    를 포함하고,
    각각의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는,
    (1) (i) 표적 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 표적-클로닝 부위, 및
    (ii) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부 (제2 부분)와 상보적인 표적-결합 부위를 포함하는 주형 가닥; 및
    (2) 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함하는 표적-클로닝 가닥
    을 포함하고,
    상기 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 상기 표적-클로닝 가닥이 상보적 결합하여 이중가닥을 형성하고 상기 표적-결합 부위는 단일가닥이며,
    상기 주형 가닥의 일 말단이 상기 나노입자의 표면에 고정화된 것이고,
    상기 표적 올리고뉴클레오타이드의 제1 부분과 제2 부분은 중복되지 않는 것인,
    표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 또는 가시화용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 기질입자 및 나노입자는 서로 다른 표적 올리고뉴클레오타이드에 대한 2종 이상의 것이고, 2종 이상의 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 또는 가시화에 사용하기 위한 것인, 조성물.
  7. 다음 단계를 포함하는, 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 또는 가시화 방법:
    (A) 표적 올리고뉴클레오타이드 또는 시료를 표면에 복수의 표적-포획 가닥을 포함하는 기질입자에 첨가하여, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부(제1 부분)와 상기 표적-포획 가닥을 혼성화시키는 단계;
    (B) 상기 단계 (A)에서 얻어진 혼합물에 복수의 나노입자를 첨가하여 기질입자와 나노입자 간 복합체를 형성하는 단계로서, 각각의 나노입자는 표면에 복수의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 다음을 포함하고:
    (1) (i) 표적 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 표적-클로닝 부위, 및
    (ii) 표적 올리고뉴클레오타이드의 일부 (제2 부분)와 상보적인 표적-결합 부위를 포함하는 주형 가닥; 및
    (2) 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함하는 표적-클로닝 가닥,
    상기 주형 가닥의 표적-클로닝 부위와 상기 표적-클로닝 가닥이 상보적 결합하여 이중가닥을 형성하고 상기 표적-결합 부위는 단일가닥이며,
    상기 기질입자 표면에 표적-포획 가닥과 부분적으로 혼성화된 표적 올리고뉴클레타이드의 다른 부분(제2 부분)과 상기 표적-결합 부위와의 혼성화에 의하여 기질입자와 나노입자 간 복합체가 형성됨; 및
    (C) 상기 부분적 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 탈혼성화(dehybridizing), 상기 복합체의 분해(disassembling), 또는 이들 모두를 수행하여, 표적 올리고뉴클레오타이드와 동일한 핵산 서열을 가지는 표적-클로닝 가닥을 방출하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단계 (C)에서 방출된 표적-클로닝 가닥을 상기 단계 (A)의 표적 올리고뉴클레오타이드로 사용하여, 단계 (A) 내지 (C)를 2회 이상 반복하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 기질입자 및 나노입자는 서로 다른 표적 올리고뉴클레오타이드에 대한 2종 이상의 것이고, 2종 이상의 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 또는 가시화하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제를 사용하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제5항 또는 제6항의 조성물을 포함하는, 표적물질의 증폭, 검출, 정량화, 또는 가시화용 키트.
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