KR20150082729A - 이동성이 조절된 탐침이 결합된 지지형 지질 이중층을 포함하는 인공세포막 및 이를 이용하여 분자 간 상호작용을 분석하는 방법 - Google Patents

이동성이 조절된 탐침이 결합된 지지형 지질 이중층을 포함하는 인공세포막 및 이를 이용하여 분자 간 상호작용을 분석하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기재 및 상기 기재 상에 이동성이 감소된 입자가 결합된 지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer; SLB)을 포함하는 인공세포막(artificial cell membrane); 상기 인공세포막을 포함하는 분자 간의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치에 있어서, 하나의 분자는 상기 인공세포막에 결합된 이동성이 감소된 입자의 표면에 결합되고, 다른 분자는 낮은 결합가로 지질에 결합된 이동성이 큰 입자의 표면에 결합된 것이 특징인 분석장치; 및 상기 분석장치를 이용하여, 분자 간의 상호작용을 확인하는 방법에 관한 것이다.

Description

이동성이 조절된 탐침이 결합된 지지형 지질 이중층을 포함하는 인공세포막 및 이를 이용하여 분자 간 상호작용을 분석하는 방법{Artificial cell membrane comprising supported lipid bilayer connected with probes having controllable mobility and method for analyzing interaction between molecules using the same}
본 발명은 기재 및 상기 기재 상에 이동성이 감소된 입자가 결합된 지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer; SLB)을 포함하는 인공세포막(artificial cell membrane); 상기 인공세포막을 포함하는 분자 간의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치에 있어서, 하나의 분자는 상기 인공세포막에 결합된 이동성이 감소된 입자의 표면에 결합되고, 다른 분자는 낮은 결합가로 지질에 결합된 이동성이 큰 입자의 표면에 결합된 것이 특징인 분석장치; 및 상기 분석장치를 이용하여, 분자 간의 상호작용을 확인하는 방법에 관한 것이다.
단일-나노입자-해상도(single-nanoparticle-resolution)의 제자리(in situ) 측정은 역동적인 개별 나노입자의 시간의존적 스냅샷을 제공하며, 따라서 나노입자 간의 불균일한 상호작용을 밝히고 앙상블로부터 구별할 수 있다. 이러한 접근법은 콜로이드 나노결정 성장에 대한 직접적이고 상세한 정보와 조립기전(assembly mechanism) 및 반응속도론(reaction kinetics)을 규명한다. 그러나, 전자현미경을 포함하는 기존의 고해상도 영상화 방법은 일반적으로 제자리 정보 없이 구조의 정적 정보를 제공하며 복잡한 장치 및 극한의 조건(예컨대 진공)에서의 과정을 요구한다. 이러한 이유로, 분자간 상호작용에 대한 동력학적 정보 수집에는 형광체-기반 단일-분자-수준 광학 영상화(fluorophore-based single-molecule-level optical imaging) 및 분석방법이 주로 사용된다. 그러나, 이들 방법은 형광체가 깜빡(blinking)이며 탈색(bleaching)되는 문제가 있다. 또한, 형광표지를 갖는 여러 성분들의 짧은 범위 내에서의 분자 상호작용을 식별하는 것은 매우 어렵다. 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer)을 이용할 때에도 측정 가능한 거리는 10 nm로 제한되며, 복수의 성분을 포함하는 시스템에 대한 해석은 난해해진다. 이는 분자간 및 나노입자간 상호작용의 실시간 연구 및 많은 분석물에 대해 재현가능하며 신뢰할만한 정량 데이터의 획득에 있어서 중요한 이슈이다. 이들 기존의 고해상도 광학적 분석법의 다른 중요한 이슈는 조절 불가능한 3차원적 움직임과 광학적으로 모든 관심 물체를 추적하는 것이 불가능하므로 역동적으로 움직이는 물체를 용액 상태에서 개별적으로 그리고 신뢰할 수 있게 분석하고 연구할 수 없다는 사실이다. 한편 고해상도 광학 분석을 위해 이들 물체를 표면에 고정하였을 때는 이들 물체의 역동적 거동을 연구할 수 없음을 고려해야 한다. 이런 모든 이유로, 단일-입자 민감도(single-particle sensitivity)로 자유롭게 움직이는 나노입자 간의 상호작용의 제자리 영상화 및 분석할 수 있는 방법을 개발하는 것은 매우 유용할 수 있다. 상호작용하는 입자의 연구로부터 보다 신뢰할만한 정보를 얻고 새로운 원칙를 유도하기 위하여, 단일-입자-수준의 정량 데이터로 다중 반응 자리로부터 상호작용을 동시에 추적할 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 입자의 자유로운 움직임을 보장하면서 2차원 평면상에서 입자간의 상호작용을 고해상도로 관찰할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 연구노력한 결과, 지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer; SLB) 상에 스트렙타비딘-바이오틴 결합을 통해 도입한 나노입자는 입자 상의 바이오틴 결합가를 조절함으로써 입자의 유동성을 조절할 수 있고, 상기 나노입자 표면에 도입된 상보적인 서열의 DNA 가닥의 상호작용에 의한 입자 간의 상호작용에 대한 반응동력학을 단일 입자 수준의 고해상도로 추적 및 분석할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기재 및 상기 기재 상에 배치된 지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer; SLB)을 포함하는 인공세포막(artificial cell membrane)에 있어서, 상기 지지형 지질 이중층은 지질 일부 또는 전부가 이중층 내에서 위치이동가능하며, 제1리간드가 결합된 제1지질을 포함하고, 상기 제1리간드에 특이적으로 결합하는 제2리간드를 100 내지 100,000 개/㎛2 이상의 밀도로 포함하는 제1입자가, 제1리간드와 제2리간드의 결합을 통해 2개 이상의 제1지질과 결합하여, 평균 0 내지 0.5×10-8 cm2/sec로 지지형 지질 이중층 내 이동성이 감소된 것 특징인 인공세포막을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치에 있어서, 지지형 지질 이중층이 제1리간드와 동일 또는 상이한 제3리간드가 결합된 제2지질을 포함하는 상기 인공세포막; 상기 인공세포막 중 제1입자 표면 상에 결합된 A 분자; 상기 제3리간드에 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하는 제2입자로서, 제3리간드와 제4리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제2지질과 결합하되, 제1입자 보다 지지형 지질 이중층 내 이동성이 큰 제2입자; 및 상기 인공세포막 중 제2입자 표면 상에 결합된 B 분자를 포함하는 것이 특징인 분석장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분석장치를 이용하여, A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치에 있어서, 기재 및 상기 기재 상에 배치된 지지형 지질 이중층을 포함하는 인공세포막으로서, 상기 지지형 지질 이중층은 지질 일부 또는 전부가 이중층 내에서 위치이동가능하며, 제1리간드가 결합된 제1지질 및 제1리간드와 동일 또는 상이한 제3리간드가 결합된 제3지질을 포함하는 것인 인공세포막; 상기 제1리간드에 특이적으로 결합하는 제2리간드를 포함하는 제1입자로서, 제1리간드와 제2리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제1지질과 결합된 제1입자; 상기 제1입자 표면 상에 결합된 A 분자; 상기 제3리간드에 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하는 제2입자로서, 제3리간드와 제4리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제3지질과 결합하는 제2입자; 및 상기 인공세포막 중 제2입자 표면 상에 결합된 B 분자를 포함하는 것이 특징인 분석장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유체 채널에서 특정 영역 내로 입자를 농축시키는 방법으로서, 지질 일부 또는 전부가 이중층 내에서 위치이동가능하고, 제1리간드가 결합된 제1지질을 포함하는 지지형 지질 이중층을 상기 유체 채널 내부에 준비하는 단계; 상기 제1리간드에 특이적으로 결합하는 제2리간드를 포함하는 제1입자를 상기 지지형 지질 이중층 상에 적용시키는 단계; 및 유체 채널에 유체 흐름을 적용하여 제1입자들을 특정 영역 내로 이동시키는 단계를 포함하는 입자 농축 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 기재 및 상기 기재 상에 배치된 지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer; SLB)을 포함하는 인공세포막(artificial cell membrane)에 있어서, 상기 지지형 지질 이중층은 지질 일부 또는 전부가 이중층 내에서 위치이동가능하며, 제1리간드가 결합된 제1지질을 포함하고, 상기 제1리간드에 특이적으로 결합하는 제2리간드를 100 내지 100,000 개/㎛2 이상의 밀도로 포함하는 제1입자가, 제1리간드와 제2리간드의 결합을 통해 2개 이상의 제1지질과 결합하여, 평균 0 내지 0.5×10-8 cm2/sec로 지지형 지질 이중층 내 이동성이 감소된 것 특징인 인공세포막을 제공한다. 보다 바람직하게 상기 인공세포막 상에 도입된 제1입자는 지지형 지질 이중층 내 이동성이 0 내지 0.1×10-8 cm2/sec로, 보다 더 바람직하게는 현미경 하에서 검출 불가능한 수준인 0 내지 0.01×10-8 cm2/sec로 감소된 것일 수 있다. 상기 이동성이 0인 경우는 완전히 정지된 상태를 나타낸다.
본 발명의 용어, "기재(substrate)"는 지질 이중층을 지지할 수 있는 지지체로서 일정한 형태를 갖는 고체일 수 있다. 바람직하게는 유리, 금, 은, 백금, TiO2 등의 투명 고체기판; 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate); PMMA) 등의 아크릴계 고분자(Acrylic polymers); 폴리에틸렌(polyethylene; PE), 폴리프로필렌(polypropylene; PP), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에테르설폰 (Polyethersulfone; PES), 폴리시클로올레핀 (Polycycloolefin; PCO), 폴리우레탄 (polyiourethane) 또는 폴리카보네이트(polycarbonate; PC)와 같은 투명한 고체일 수 있다. 또는 코팅막 상에 도입된 지질 이중층이 유동성을 유지할 수 있는 한 셀룰로오스와 같이 수화될 수 있는 코팅제를 기판에 코팅하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 용어, "지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer)"은 자연적인 세포 막 또는 핵과 같은 준세포 구조물을 둘러싼 이중층에 대한 시험관 내에서 조립된 이중층을 의미하는, 합성 또는 천연 지질로 구성되는, 모델 지질 이중층의 일종으로, 고체 기재에 고정되어(anchored) 증가된 안정성을 가지며, 따라서 벌크 용액에서는 불가능한, 특성화 도구(characterization tools)로서 사용될 수 있다. 지질 이중층이 닫힌 쉘로 둥글어져 합쳐진 비히클이나 세포막과는 달리 지지형 이중층은 고체 지지체 상에 존재하는 평면 구조이다. 따라서, 이중층의 윗면(upper face) 만이 자유 용액(free solution)에 노출된다. 이러한 배치는 지질 이중층 연구와 관련하여 장단점을 갖는다. 지지형 이중층의 가장 큰 장점은 안정성이다. SLB는 빠른 유속이나 진동에 노출되어도 크게 손상되지 않고 유지될 수 있으며, 다른 모델 지질 이중층인 검은 지질막(black lipid membrane; BLM)과 달리 홀의 존재가 전체 이중층을 파괴하지 않는다. 이러한 안정성으로 인해 수 주 심지어 수 개월간 지속되는 실험이 가능한 반면, BLM 실험은 보통 수시간에 제한된다. SLB의 다른 장점은 편평하고 딱딱한 표면 상에 존재하므로 자유롭게 떠다니는 시료에 대해서는 수행이 불가능하거나, 낮은 해상도를 제공하는 많은 특성화 도구로 사용할 수 있다는 점이다.
이러한 장점 중 가장 명확한 예는 시료와 직접적인 물리적 상호작용을 요구하는 기계적 탐침 기법의 사용할 수 있다는 것이다. 지질 상분리, 단일 단백질 분자 흡착으로 이어지는 막관통 나노기공의 형성 및 단백질 조립(protein assembly)을 염료 표지 없이도 서브나노미터 정확도로 영상화하기 위하여 원자력현미경(Atomic force microscopy; AFM)을 사용하고 있다. 최근에는, 단일 이중층의 기계적 성질을 직접 탐지하기 위하여, 개별 막 단백질 상에서 힘 분광법을 수행하기 위하여 AFM을 사용하기도 한다. 세포나 소포(vesicle)의 표면은 상대적으로 푹신하며(soft) 시간에 따라 이동하고 변화하므로 SLB를 사용하지 않고는 상기한 연구는 어렵거나 불가능할 수 있다.
또한 다양한 현대적 형광 분광법에서도 강하게 지지된 평면 표면(rigidly-supported planar surface)을 필요로 한다. 전반사 형광현미경(total internal reflection fluorescence microscopy; TIRF) 및 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR)과 같은 표면장 기법(evanescent field method)은 분석물 결합 및 이중층 광학적 성질의 고도로 민감한 측정이 가능하지만, 시료가 특별하게 광학적 기능성 재질 상에 지지되었을 때만 기능할 수 있다. 지지된 이중층에 대해서만 적용가능한 다른 검출방법의 예는 광학적 간섭을 기반으로 하는 형광 간섭 대비 현미경법(fluorescence interference contrast microscopy; FLIC) 및 반사 간섭 대비 현미경법(reflection interference contrast microscopy; RICM) 등이다.
일반적으로 SLB는 기재 표면에 직접 접촉하지 않고, 매우 얇은 물층으로 분리되어 있다. 상기 물층의 크기 및 성질은 기재 물질 및 지질의 종류에 의존하나, 가장 보편적으로 사용되는 실험 시스템인 실리카 상에 지지된 쯔비터이온성 지질(zwitterionic lipid)에 대해 일반적으로 1 nm 정도이다. 상기 물층은 매우 얇으므로, 이중층과 기재 사이에는 광범위한 유체역학적 커플링(hydrodynamic coupling)이 존재하여 같은 조성의 자유 이중층에 비해 지지된 이중층에서 보다 낮은 확산계수를 갖는다. SLB 내의 지질 일부는 완전히 고정되어 있을 수 있다. 양질의 SLB 지질상에 대해, 이러한 고정된 분획이 1 내지 5% 이다.
본 발명의 용어, "인공세포막(artificial cell membrane)"은 세포막 단백질, 막관통 단백질 및 이들과 관련된 상호작용과 같은, 체내에서 세포 표면에서 일어나는 세포막과 관련된 현상을 연구하기 위하여 인위적으로 제작한, 시험관 내에서 체내의 세포막 시스템을 모방하기 위한 지질막을 포함하는 시스템을 의미한다. 이러한 인공세포막을 제공하는 모델 시스템으로는 검은 지질막(black lipid membrane; BLM), 지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer; SLB), 한계된 이중층 지질막(tethered bilayer lipid membrane; tBLM), 소포(vesicle), 마이셀(micelle), 바이셀(bicelle) 및 나노디스크 등이 있다. 특히, SLB 막은 생물물리적 세포막 현상을 규명하기 위한 유용한 수단이다. pH 및 온도 등과 같은 환경적 변수뿐만 아니라 화학적 조성의 변화에 의해 이동성 및 활성 등을 조절할 수 있다.
상기 제1리간드 및 제2리간드는 각각 독립적으로 항원, 항체, 리간드, 수용체, 킬레이트, DNA, RNA, 앱타머(aptamer), 서로 특이적으로 결합하는 화학분자 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 제1리간드가 항체인 경우, 제2리간드는 이에 특이적인 항원일 수 있다. 또는 제2리간드는 상기 항원에 추가로 결합된 항체를 모두 포함하여 제1리간드인 항체와 항체-항원-항체 복합체를 형성하는 샌드위치 면역반응에 의해 결합될 수 있다. 다른 예로는, 제1리간드와 제2리간드가 서로 상보적인 서열의 DNA 단편일 수 있으며, 이러한 경우 이들 DNA 단편의 혼성화에 의해 결합을 형성할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 제1리간드로서 바이오틴을, 제2리간드로서 바이오틴 및 이의 수용체인 스트렙타비딘이 결합된 컨쥬게이트를 이용하여 스트렙타비딘의 비어있는 다른 결합자리에 제1리간드인 바이오틴이 결합하도록 하였다.
또한 상기 제1입자는 상기 지질 상의 제1리간드와 입자 표면의 제2리간드 간의 특이적인 항원-항체 결합, 리간드-수용체 결합, DNA 혼성화, 킬레이트 결합, 공유결합, 정전기적 결합 또는 화학반응에 의한 결합에 의해 지질에 결합될 수 있다. 이때, 입자는 표면에 복수의 제2리간드를 포함할 수 있고 그 밀도에 따라 하나의 입자가 다수의 지질입자와 결합을 형성할 수 있다. 이러한 경우, 지질막 상에서 개별 지질 분자의 움직임은 자유로우나, 복수의 지질 분자가 하나의 입자에 결합된 경우 상기 입자를 움직이기 위해서는 이에 결합된 복수의 지질 분자가 동시에 2차원 지질 평면 상에서 유기적으로 이동해야하므로 상대적으로 그 움직임을 제약될 수 밖에 없다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 단위 입자당 결합가가 증가할수록 입자의 움직임은 현저하게 저해되었으며, 결과적으로 결합가가 486에 이르렀을 때에는 고정된 것과 같이 거의 움직임이 포착되지 않았다(도 2 및 도 6).
상기 입자의 움직임을 모니터링하는 방법은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라즈몬 산란을 측정함으로서 수행될 수 있다. 따라서, 상기 입자는 플라즈몬 산란을 발생시킬 수 있는 금속 나노입자, 반도체 나노입자, 자성 나노입자, 실리카 나노입자 또는 고분자 나노입자인 것이 바람직하다.
바람직하게, 상기 제1리간드가 결합된 제1지질을 상기 지지형 지질 이중층의 전체 지질에 대해 0.05 내지 0.5 몰%로 포함할 수 있다. 상기 제1리간드는 제2리간드와의 결합을 통해 입자가 도입될 수 있는 자리로, 전체 지질에서 상기 제1리간드가 결합된 제1지질의 비율이 0.05 몰% 미만으로 낮아지면, 지질 표면에서 제1리간드의 빈도가 낮아 즉, 제1리간드 간의 거리가 멀어서 하나의 입자가 복수의 제1리간드와 결합하여 지질 이중층 상에 고정되기 어려우며, 0.5 몰%를 초과하는 경우에는 제1리간드의 밀도가 너무 높아져 이와 특이적으로 결합하는 제2리간드를 포함하는 제1입자의 응집이 유도되어 결합가와 무관하게 입자의 움직임을 저해하거나 분석을 방해할 수 있다.
바람직하게, 상기 지지형 지질 이중층은 전체 지질에 대해 1 내지 10 몰%의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 제2지질을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량은 500 내지 2000인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리에틸렌글리콜은 지질 이중층을 물리적으로 안정화시켜 이중층의 수명 및 안정도를 증가시키며 나노입자 간, 나노입자와 지질 이중층 간의 비특이적 결합을 감소시켜 유동성을 증가시킨다. 그러나, 분자량이 상기 범위를 초과하는 경우 가리움 효과를 유발하여 지질막에 대한 나노입자의 접근 및/또는 제1리간드와 제2리간드의 결합을 방해할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치에 있어서, 제1리간드와 동일 또는 상이한 제3리간드가 결합된 제3지질을 추가로 포함하는 지지형 지질 이중층을 포함하는 인공세포막; 상기 인공세포막 중 제1입자 표면 상에 결합된 A 분자; 상기 제3리간드에 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하는 제2입자로서, 제3리간드와 제4리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제2지질과 결합하되, 제1입자 보다 지지형 지질 이중층 내 이동성이 큰 제2입자; 및 상기 인공세포막 중 제2입자 표면 상에 결합된 B 분자를 포함하는 것이 특징인 분석장치를 제공한다.
상기 제4리간드는 제2리간드와 동일 또는 상이할 수 있다.
상기 A 분자 및 B 분자는 각각 DNA, RNA, 항원, 항체, 리간드, 킬레이트, 수용체, 앱타머, 폴리머, 유기화합물, 금속이온 또는 폴리펩티드일 수 있다.
따라서, 상기 본 발명의 분석 장치로 확인하고자 하는 A 분자와 B 분자의 상호작용은 항원-항체 결합, 리간드-수용체 결합, 단백질-단백질 결합, 핵산 혼성화, 킬레이트 결합, 공유결합 또는 정전기적 결합일 수 있다. 상기 핵산 혼성화는 DNA, RNA, PNA 및 이들의 조합 간의 혼성화를 제한없이 포함한다.
상기 제1입자는 복수의 지질과의 결합을 통해 지지형 지질 이중층 상에 고정되고, 제2입자는 상호작용 부재시 지지형 지질 이중층 상에서 2차원적 자유 브라운 운동(2-dimensional brownian motion) 가능한 것이 바람직하다. 이에 따라, 제1입자 상의 A 분자와 제2입자 상의 B 입자 간에 상호작용으로 인한 자극 즉, 상기 입자 간의 인력 또는 척력이 발생할 때, 제1입자는 고정되어 있고 제2입자는 제1입자 쪽으로(인력에 의해) 또는 제1입자와 먼 쪽으로(척력에 의해) 이동할 수 있다. 따라서, 고정된 제1입자에 대한 제2입자의 상대적인 움직임을 확인하여 A 입자 및 B 입자 간의 상호작용을 확인할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 분석장치를 이용하여, A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하는 방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, 상기 분석장치에 있어서, 제1입자는 지지형 지질 이중층 평면 상에 고정되어 있으며, 제2입자는 별도의 자극이 가해지지 않는 한 자유 브라운 운동을 한다.
따라서, 제1입자의 위치 및 제1입자에 의한 신호의 세기 또는 파장의 변화를 모니터링할 수 있다.
또한, 제2입자의 실시간 이동 궤적 또는 속도, 또는 제2입자에 의한 신호의 세기 또는 파장의 변화를 모니터링할 수 있다.
상기 모니터링 방법으로는 플라즈몬 산란 또는 형광 등 당업계에 공지된 나노입자를 모니터링할 수 있는 방법을 제한없이 이용할 수 있다. 바람직하게는, 제1입자 및 제2입자의 플라즈몬 산란을 측정함으로서 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 플라즈몬 산란을 발생하는 나노입자는 입자 간의 거리가 가까워질 때, 플라즈몬 커플링에 의해 산란신호를 증강시킬 수 있으며, 일정거리 즉, 플라즈몬 커플링 커리 이내로 더욱 가까워질 경우에는 산란 파장이 장파장으로 이동한다. 따라서, 원거리에서는 입자의 궤적으로부터 입자 간의 거리를 측정할 수 있으며, 일정 거리 미만으로 가까워진 경우에는 측정된 산란 신호의 세기 및 파장으로부터 입자 간의 거리를 유추할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상보적인 서열의 DNA를 표지한 금 나노입자를 사용하되 입자 당 2개 이상의 DNA를 결합시켜 복수의 입자가 DNA 혼성화에 의해 가까워질 수 있도록 하였다. 그 결과, 결합된 입자의 수가 증가하여 이량체, 3량체에서 4량체로 발전함에 따라 산란 세기가 단계적으로 증가하였으며, 그 신호는 장시간 지속되었다. 반면, 비특이적 일시적 상호작용에 의해서는 신호 증가가 관찰되기는 하였으나, 해당 신호는 수 초까지도 지속되지 못함을 확인하여 비특이적 상호작용에 의한 신호증가와 특이적 상호작용에 의한 신호증가가 서로 구별될 수 있음을 확인하였다(도 6). 이러한 입자 응집에 의해서는 신호 세기가 증가할 뿐만 아니라 산란 파장이 장파장으로 이동하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명의 방법은 추가로 특정 방향으로 힘을 가하여 입자의 밀도를 높이고 입자 간 충돌빈도를 증가시킴으로써 분석감도를 향상시키고 검지시간을 단축시킬 수 있는 것이 특징이다. 이때, 가해질 수 있는 힘은 자기장, 전기장, 유체의 흐름 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치에 있어서, 기재 및 상기 기재 상에 배치된 지지형 지질 이중층을 포함하고, 상기 지지형 지질 이중층은 지질 일부 또는 전부가 이중층 내에서 위치이동가능하며, 제1리간드가 결합된 제1지질을 포함하며, 제1리간드와 동일 또는 상이한 제3리간드가 결합된 제3지질을 추가로 포함하는 지지형 지질 이중층을 포함하는 인공세포막; 상기 제1리간드에 특이적으로 결합하는 제2리간드를 포함하는 제1입자로서, 제1리간드와 제2리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제1지질과 결합된 제1입자; 상기 제1입자 표면 상에 결합된 A 분자; 상기 제3리간드에 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하는 제2입자로서, 제3리간드와 제4리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제3지질과 결합하는 제2입자; 및 상기 인공세포막 중 제2입자 표면 상에 결합된 B 분자를 포함하는 것이 특징인 분석장치를 제공한다.
전술한 바와 같이, 2개 분자의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치로서 이들 분석하고자 하는 분자 중 하나의 분자가 결합된 입자는 인공세포막 상에 고정되고 다른 하나의 분자는 상대적으로 이동성이 높은 입자에 결합된 분석장치를 이용하는 것이 검출의 편의상 바람직하나, 현재의 광학적 검출 기술로는 지질 이중층 상에서 자유롭게 이동하는 입자의 모니터링이 가능하므로 A 분자 및 B 분자가 모두 이동성이 높은 입자에 결합되어 있어 지질 이중층 상에서 자유롭게 이동가능하더라도 개별 입자의 모니터링이 가능하므로 이러한 시스템 역시 A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치로서 이용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 유체 흐름을 이용하여 지지형 지질 이중층 상의 특정 영역 내로 입자를 농축시키는 방법으로서, 채널 내의 일면에 배치된 지지형 지질 이중층을 포함하고, 상기 지지형 지질 이중층은 지질 일부 또는 전부가 이중층 내에서 위치이동가능하며, 제1리간드가 결합된 제1지질을 포함하는 지지형 지질 이중층; 및 상기 제1리간드에 특이적으로 결합하는 제2리간드를 포함하는 제1입자로서, 제1리간드와 제2리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제1지질과 결합된 제1입자를 구비한 유체 채널에 유체 흐름을 적용하는 단계를 포함하는 입자를 농축시키는 방법을 제공한다.
사용 목적에 따라 상기 입자는 추가로 유전자, 단백질 등이 결합된 것을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 리간드 결합을 통해 지질 상에 결합된 입자를 포함하는 지지형 지질 이중층을 포함하는 유체 채널에 유체 흐름을 적용하면 상기 입자들은 지질 이중층 상에서 자유로운 브라운 운동이 가능하므로 유체의 흐름 방향에 따라 이동하여 유체 채널 내의 특정 부분에 농축될 수 있다. 종래 지질 이중층 상에 위치한 입자를 농축시키기 위한 방법으로는 전기장 등의 자극을 가하는 방법이 사용되었으나, 전기장을 적용하는 경우 노출되는 시간이 길어짐에 따라 입자 상에 결합된 단백질이나 유전자 등이 변성되거나, 지질 이중층 자체가 파괴될 수 있으며, 이에 따라 pH나 온도가 변화하거나, 공기방울이 발생하는 등 실험조건의 변화를 야기할 수 있으나, 본 발명에 따른 유체의 흐름을 이용하는 경우 이와 같은 단점을 극복할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 기판 상에 플로우 채널을 제작하고, 상부 슬라이드 글라스의 양쪽에 구멍을 형성하여 일정한 방향으로 유체의 흐름을 적용할 수 있도록 하였다. 상기 플로우 채널 내에 본 발명에 따른 금 또는 은 나노입자가 결합된 지질 이중층을 형성하고 유체 흐름 속도를 조절하면서 상기 금속 나노입자의 움직임을 모니터링하였다. 흐름이 가해지기 전 입자들은 2차원 지질 이중층 상에서 자유 확산운동을 하였으나, 유체의 흐름이 가해지면서 이들 나노입자는 흐름과 동일한 방향으로 이동하기 시작하였으며, 흐름이 빨라지면 나노입자의 움직임도 함께 빨라졌다. 또한 이와 같이 한쪽 방향으로 입자들이 이동함에 따라 특정 구획에서 입자의 밀도가 증가하면서 플라즈몬 커플링에 의한 산란파장의 이동이 확인되었다(도 11 및 12).
본 발명의 입자가 결합된 지지형 지질 이중층을 포함하는 인공세포막은 입자 상에 결합된 리간드 수를 조절함으로써 지질 상에서 입자의 이동성을 조절할 수 있으며, 따라서 이동성이 다른 두 가지 입자 상에 상호작용을 분석하고자 하는 표적 분자를 각각 도입하여 상기 인공세포막 상에 도입함으로써 입자의 움직임을 모니터링하여 표적 분자 간의 상호작용을 분석할 수 있다.
도 1은 PNP 탐침 상의 바이오틴화된 DNA 서열의 평균 개수를 지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer; SLB) 결합 서열의 몰분율에 대한 함수로 나타낸 도이다. 독립적으로 준비한 3개의 다른 시료에 대한 값을 평균하였다. 0.00125 내지 0.0625 범위의 실험값으로부터 선형 핏(linear fit)을 계산하였다.
도 2는 SLB 상에서 PNP 탐침의 확산 동력학에 대한 바이오틴 결합가의 효과를 나타낸 도이다. (a)는 상응하는 PNP의 평균 제곱 이동(mean square displacement)을 시간 간격의 함수로 나타낸 도이다. (b)는 SLB 상에서 플라즈몬 탐침의 평균 확산 계수(average diffusion coefficient)를 나타낸 도이다. 바이오틴 결합가의 변화에 따른 확산 계수의 분포를 나타내었다. (c) 내지 (f)에서 탐침 당 바이오틴 결합가는 각각 (c) 1, (d) 5, (e) 25 및 (f)128이다.
도 3은 SLB 상에 도입된 PNP 탐침의 이미지를 나타낸 도이다. (a)는 STV-코팅된 SLB 상의 486의 바이오틴 결합가를 갖는 I-PNP의 암시야 현미경 이미지이다. (b)는 I-PNP-개질된 SLB 상의 Cy3-개질된 STV의 형광현미경 이미지이다. 스케일바는 10 μm이다.
도 4는 PNP 클러스터의 산란세기 분포를 클러스터링 정도에 대한 함수로 나타낸 도이다. (a)는 단량체, (b)는 이량체, (c)는 3량체 및 (d)는 4량체에 대한 결과이다.
도 5는 SLB 상에 동력학적으로 결합된 나노입자의 단일-나노입자-해상도 제자리 영상화 및 분석방법을 나타낸 개략도이다. (a)는 두 가지 다른 형태의 탐침(이동 및 고정 플라즈몬 탐침; 좌측)을 포함하는 플라즈몬 나노탐침-결합된 SLB와 표적 DNA 혼성화-유도 2D 클러스터 형성 및 플라즈몬 커플링(우측)을 개략적으로 나타낸 도이다. (b)의 좌측 및 가운데는 단일 나노입자 해상도를 갖는 암시야 현미경을 이용한 SLB-결합된 플라즈몬 나노탐침의 초병렬 제자리 관찰(massively parallel in situ observation) 및 분석 방법을 나타낸 도이다(스케일바=10 μm). (b)의 우측은 단일 플라즈몬 나노탐침의 산란세기 및 색 스펙트럼의 암시야 현미경 이미지-기반 분석을 나타낸 도이다.
도 6은 SLB 상에서 상호작용하는 플라즈몬 나노입자의 확산 동력학의 조절 및 광학적 분석결과를 나타낸 도이다. (a)는 바이오틴-결합가에 기반한 나노입자 이동성의 조절(좌; 증가하는 결합가는 보다 낮은 이동성을 유도한다), 플라즈몬 나노입자의 대표적인 확산 궤적(diffusion trajectories; 중앙) 및 바이오틴 결합가의 함수로서의 이동 분율(mobile fraction)을 나타낸 도이다. (b)는 표적 DNA 서열 부재시 고정된 플라즈몬 탐침 자리에 대한 산란세기의 변화의 시간 추적(time trace) 및 이를 개략적으로 나타낸 도이다. (c)는 표적 DNA 혼성화-유도 플라즈몬 나노입자 클러스터의 암시야 현미경 이미지를 나타낸 도이다. 고정된 탐침 자리 내(흰색 점선 원)에 포획된 이동 탐침의 15-단계 궤적을 흰색 실선으로 강조하였으며, 빨간색 화살표는 각 궤적의 시작 위치를 나타낸다. 각 궤적 단계에 대한 시간 간격(time interval)은 0.188 s이다. (d)는 탐침 클러스터의 암시야 현미경 이미지에 대한 녹색에 대한 빨간색의 비를 클러스터 당 탐침 수의 함수로 나타낸 도이다(R2=0.970). (e)는 나노입자 클러스터의 조립(assembly; 상부) 및 분해(disassembly; 하부) 과정에 대한 산란세기의 대표적인 시간 추적을 나타낸 도이다.
도 7은 M-PNP 쌍으로 수식된 SLB에서 단량체 PNP 부착 및 PNP 클러스터 간 융합의 조합을 통한 클러스터 성장을 나타낸 도이다. (a)는 서로 접근하는 두 개의 단량체 PNP를, (b)는 두 개의 PNP 단량체의 원거리 광학적 중첩을, (c)는 DNA 혼성화-매개된 PNP 이량체 형성 및 그 결과로서의 플라즈몬 커플링을, (d)는 서로 접근하는 PNP 이량체 및 PNP 3량체를, 마지막으로 (e)는 PNP 이량체 및 PNP 3량체 간의 융합을 나타낸다.
도 8은 플라즈몬 나노입자 클러스터의 성장 동력학에 대한 제자리 영상화 및 분석결과를 나타낸 도이다. (a)는 넓은 SLB 표면적에서 나노입자 탐침의 DNA 혼성화-유도 플라즈몬 커플링의 초병렬 제자리 모니터링을 나타낸 도이다. 좌측 이미지는 30 nM 표적 DNA 서열 첨가 후 330초에 얻었다. 표적 DNA 서열 첨가 전(0 s) 및 후(330 s) 흰 점선 영역의 확대된 이미지를 나타내었다. (b)는 (a)의 암시야 현미경 이미지에 알파벳으로 도시한 10개 개별 나노입자 클러스터링 반응에 대한 시간-의존적 산란세기를 도시한 그래프이다. 산란세기는 단량체 탐침의 평균세기(average intensity)에 대해 표준화하였다. 신호는 330초 동안 매 1초마다 기록하였다. (c)는 30 nM 표적 DNA 서열 첨가시(빈 원) 플라즈몬 클러스터 성장에 대한 반응속도를 나타낸 도이다. 각각의 단일 탐침 추가 반응을 성장하는 클러스터의 산란세기의 단계적인 증가를 모니터링하여 검출하였다(N=150 입자). 클러스터 형성 속도는 3-단계 연속 반응모델(실선)에 대해 최적화하였다. (d)는 클러스터된 플라즈몬 나노탐침의 투과 전자 현미경 이미지를 나타낸 도이다. (e)는 플라즈몬 탐침을 순차적으로 첨가하여 이량체로부터 3량체 또는 3량체로부터 4량체를 형성하는 경우 2D 입체장애인자(steric hindrance factor)의 계산방법을 나타낸 도이다. 회색 영역은 다음 입자 첨가를 위한 가능한 접근각을 나타낸다. 4량체 형성에 있어서, 입체장애인자를 3번째 입자(삽도의 검은색 실선)의 상대적인 위치에 의해 결정되는 θ의 함수로 도시하였다. 평균 ftri는 0.375이다(빨간색 점선).
도 9는 SLB 상에서 플라즈몬 커플링에 기반한 정량적인 DNA 검출 에세이를 나타낸 도이다. (a)는 산란세기 검정표준(calibration standard)을 클러스터 내의 플라즈몬 탐침 수의 함수로 나타낸 도이다(R2=0.999). (b)는 300 fM의 표적 DNA와 4시간 동안 반응시킨 PNP-개질된 패턴화된 SLB를 나타낸 도이다. (c)는 표적 DNA 에세이의 플롯을 DNA 농도의 함수로 나타낸 도이다(검정색 도트). 단일-염기-불일치된 DNA 서열에 대한 에세이 결과를 빨간 색 도트로 표시하였다.
도 10은 유체를 이용한 패턴화된 SLB 상에 도입된 금속 나노입자의 운동성 조절을 통한 나노입자간 상호작용 조절방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 11은 유체 흐름에 의한 SLB 상에 도입된 나노입자의 이동성을 나타낸 도이다. (a)는 유체 흐름속도에 따른 나노입자의 이동 궤적을 나타낸 도이며, (b)는 상기 나노입자의 운동속도를 나타낸 도이다. (c)와 (d)는 각각 패턴화된 SLB 표면에서 유체 흐름에 의해 이동 농축되는 금 나노입자와 은 나노입자의 암시야 현미경 이미지를 나타낸다.
도 12는 패턴화된 SLB에서 유체 흐름에 의해 농축된 금속 나노입자의 산란 스펙트럼 변화를 나타낸 도이다. (a) 내지 (c)는 금 나노입자, (d) 내지 (f)는 은 나노입자에 관한 것으로, (a)와 (d)는 다양한 염(NaCl) 농도 하에서의 산란 스펙트럼을, (b)와 (e)는 암시야 현미경 이미지를, 그리고 (c)와 (f)는 플라즈몬 산란 피크와 제타전위의 변화를 나타낸다.
도 13은 나노입자가 도입된 인공 세포막 기반 세포 인터페이싱 플랫폼을 이용한 세포의 신호전달 메커니즘 분석방법을 나타낸 개략도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 물질
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(캡 바이오티닐) 소디움 염(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) sodium salt; biotinylated DOPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-1000] 암모늄 염(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-1000] ammonium salt; PEG-DOPE)을 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)로부터 구입하였다. Cy3-수식된 스트렙타비딘(streptavidin; STV)은 Molecular Probes(Eugene, OR, USA)로부터 구입하였다. 카르복시메틸 폴리에틸렌글리콜(carboxymethyl polyethylene glycol; M.W. 5000)은 Laysan Bio Inc.(Arab, AL, USA)로부터 구입하였다. 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS) 및 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 0.15 M PBS 용액은 NaH2PO4, Na2HPO4와 NaCl(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 탈이온수(DI water)에 녹여 150 mM NaCl을 포함하는 10 mM 인산 완충 용액(pH 7.4)으로 제조하였다. 0.025 M PBS는 동일한 시약으로 25 mM NaCl을 포함하도록 제조하였다. 모든 실험에 최소저항(>18 MΩ/cm)을 갖는 나노퓨어 워터를 사용하였다. 소포(vesicle) 제조(소포 압출; vesicle extrusion)를 위하여, 기공 직경이 100 nm인 폴리카보네이트(polycarbonate; PC) 필터(Whatman, Fisher Scientific)를 사용하였다. 클로로포름, 아세톤 및 에탄올과 같은 유기 용매는 Duksan Pure Chemicals Co. Ltd.(Gyeonggi-do, Korea)로부터 구입하였다. 황산 및 과산화수소는 Daejung Chemicals & Metals Co. Ltd.(Gyeonggi-do, Korea)로부터 구입하였다. 50 nm 금 나노입자 및 올리고뉴클레오티드는 각각 BBI Life Sciences(Cardiff, UK) 및 Integrated DNA Technology(Coralville, IA, USA)로부터 구입하였다. I-PNP에 대한 표적 포획 서열은 5'-HS-(CH2)6-PEG6-CTTTGAGCACATCCTTATCAATATT-3', I-PNP에 대한 SLB 결합(tethering) 서열은 5'-HS-(CH2)6-PEG6-CTTTGAGCACTGTTAGCGTGTGTGGAATTTTAAT-바이오틴-3'이다. M-PNP 에 대한 표적 포획 서열은 5'-TAACAATAATCCCTCCACGAGTTTC-PEG6-(CH2)3-SH-3', M-PNP에 대한 SLB 결합(tethering) 서열은 5'-바이오틴-TAATTTTAAGGTGTGTGCGATTGTCACGAGTTTC-PEG6-(CH2)3-SH-3'이다. 표적 서열은 5'-GAGGGATTATTGTTAAATATTG A TAAGGAT-3'이다. 표적 포획 서열의 밑줄 부분은 표적 DNA 서열로 혼성화하였다(hybridize). 단일-염기-쌍-불일치 DNA 서열로는 표적 DNA 서열에서 A를 T로 치환한 것을 사용하였다. 비상보적 DNA 서열은 5'-CTGATTACTATTGCATCTTCCGTTACAACT-3'였다.
실시예 2: SUV ( small unilamellar vesicle )의 제조
97.4 몰%의 DOPC, 0.1 몰%의 바이오틴화-DOPE 및 2.5 몰%의 PEG-DOPE를 포함하는 SUV의 확산에 의해 커버글라스 상에 지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer; SLB)을 형성하였다. 클로로포름에 적당량의 지질을 용해시켜 SUV 용액을 제조하였다. 회전 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 50 ml 둥근 바닥 플라스크에서 지질 용액을 증발시켰다. 질소 흐름 하에서 지질 박막(lipid film)을 완전히 건조시켰다. 건조된 혼합물은 탈이온수에 재현탁시키고 동결-융해 순환(freeze-thaw cycle)을 3회 반복하여 수행하였다. 총 지질 농도는 2 mg/ml이었다. 용액을 25℃에서 100 nm 기공 직경의 PC 막을 통해 21회 이상 압출하였다. 생성된 SUV 용액은 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
실시예 3: DNA 를 이용한 금 플라즈몬 나노탐침(nanoprobe)의 기능화 및 바이 오틴 결합가(valency)의 정량
100 mM PB(pH 8.0)에 녹인 100 mM DTT와 2시간 동안 인큐베이션하여 티올화된 올리고뉴클레오티드를 환원시키고 NAP-5 컬럼(GE health care, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 분리하였다. DNA 기능화를 위해, 신선하게 환원시킨 4 μM 올리고뉴클레오티드를 50 pM의 50 nm 금 나노입자와 혼합하여 실온에서 밤새도록 인큐베이션하였다. I-PNP에 대해, SLB 결합 서열과 표적 포획 서열의 몰비를 200:600(SLB 결합 서열의 몰분율=0.25)이었다. M-PNP에 대해, 몰비는 1:799(SLB 결합 서열의 몰분율=0.00125)이었다. 이후 용액을 조절하여 10 mM 인산 완충액 및 0.1%(wt/vol) SDS를 얻었다. 상기 조절된 용액을 30분간 궤적교반기(orbital shaker)에서 추가 인큐베이션하고, 2 M NaCl 6 aliquot을 첨가하여 0.05 M 단계로 증가하여 최종 NaCl 농도가 0.3 M이 되도록 하였다. 각각의 2 M NaCl 첨가 후, 용액을 55℃에서 10분간 가열하고 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. DNA-금 나노입자 혼합물을 밤새도록 방치한 후 용액을 원심분리하였다(4500 rpm, 10분). 상등액을 제거하고 침전은 탈이온수에 재분산시켰다(상기 과정을 3회 반복하였다). DNA-기능화된 금 나노입자 용액은 사용시까지 4℃에서 보관하였다. 금 나노입자 당 SLB 결합 서열의 수를 정량하기 위하여 Cy3-표지 올리고뉴클레오티드-개질 금 나노입자를 30 mM KCN 용액에 용해시켰다. 그리고 여기광원으로서 제논램프(500 W)를 구비한 Acton 분광광도계(Spectra Pro, MA, USA)로 Cy3의 형광방출세기를 측정하였다.
실시예 4: SLB 및 이에 연결된 금 플라즈몬 나노입자의 제조
유리 흐름 챔버에서 SLB 및 결합된 금 플라즈몬 나노입자를 제조하였다. 흐름 챔버는 서로 100 μm 두께의 열가소성 간격자(thermoplastic spacer)로 분리된 상부(top) 및 하부(bottom) 유리기질(glass substrate)로 구성된다. 입구 및 출구 기공은 상부 유리의 양 끝에 구멍을 뚫었다. 상부 슬라이드 글라스는 0.15 M BPS에 녹인 10 mg/ml BSA로 1시간 동안 선처리하여 SLB 침착(deposition)에 불활성이도록 하였다. 하부 커버 글라스는 클로로포름, 아세톤 및 에탄올에서 10분간 음파처리하여 세척하였다. 음파처리 후 커버 글라스를 탈이온수로 세척하고 질소 흐름에 의해 건조하였다. 다음으로 하부 커버 글라스를 1시간 동안 1 M NaOH로 선처리하고 증류수로 완전히 세척하였다. 유리기질은 샌드위치된 열가소성 플라스틱 간격자와 함께 디지털 핫플레이트 상에서 120℃에서 가열하여 조립하였다. 제조된 SUV 용액을 0.15 M PBS와 1:1 v/v로 혼합하여 입구를 통해 유리 흐름 챔버에 도입하였다. 약 70 μl의 SUV 용액을 흐름 채널에 채웠다. 25℃에서 45분간 인큐베이션 후, 과량의 비융합(excess and unfused) SUV를 200 μl 탈이온수로 2회 세척하였다. 흐름 채널 내의 탈이온수를 PBS로 치환한 후 0.15 M PBS에 녹인 1 nM STV를 바이오틴화된 SLB와 1시간 동안 반응시켰다. 미반응 STV를 0.15 M PBS로 세척하고 흐름 채널을 0.025 M PBS로 채웠다. 다음으로, 2 pM I-PNP와 15 pM M-PNP 탐침을 도입하여 10분간 반응시켰다. 결합하지 않은 PNP를 제거하고 미반응 STV의 결합 자리를 1 μM 자유 바이오틴을 포함하는 0.025 M PBS로 세척하여 억제하였다. 15분 후, 완충액을 0.15 M PBS로 교환하였다. 일반적으로, 상기 과정을 통해 1:3의 비율로 SLB-결합된 I-PNP 및 M-PNP를 얻을 수 있다.
4.1. 금 나노입자 당 바이오틴 결합가의 결정 및 정량
먼저 PNP의 바이오틴 결합가를 변화시킴으로써 지질-결합된 PNP의 확산을 조절하였다. 이로부터 입자 당 리간드 수는 지질막 상에서 나노입자의 횡적 이동성에 현저한 효과를 나타냄을 확인하였다. 본 발명자들은 표적 포획 DNA 서열과 SLB 결합 DNA 서열 간의 몰비율을 변화시킴으로써 DNA 기능화 단계 동안 AuNP 상의 바이오틴 분자의 결합가를 조절하였다. 상기 화학량론적 조절 방법으로 높은 재현성 있는 결과를 획득하였다. KCN 용액에 AuNP를 용해시킨 후 SLB 결합 서열에 수식된 Cy3 분자의 형광방출세기를 측정함으로써 PNP 당 SLB 결합 서열의 수를 계산하였다. 평균 바이오틴 결합가는 SLB 결합 DNA 링커의 첨가량이 증가함에 따라 약 0.57로부터 128까지 선형적으로 증가하였다(도 1 및 표 1). 제조한 PNP 탐침을 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 SLB 표면에 결합시켰다. 0.57의 바이오틴 결합가를 갖는 SLB 상의 PNP 탐침은 바이오틴을 포함하지 않는 PNP는 SLB에 결합할 수 없고 표면으로부터 완전히 세척될 수 있으므로 하나의 바이오틴을 갖는 것으로 간주하였다.
Figure pat00001
4.2. SLB 상에서 PNP 탐침의 확산 동력학에 대한 바이오틴 결합가의 영향
암시야 현미경을 이용하여 단일 나노입자 해상도로 SLB 결합 PNP 탐침의 횡적 움직임을 관찰하였고 이미지 분석 프로그램을 이용하여 개별적인 궤적을 분석하였다(ImageJ 소프트웨어; 구체적인 실험 및 분석방법은 추후 기술). 다른 바이오틴 결합가를 갖는 SLB-결합 PNP 탐침의 사건의 함수로 평균 제곱 변이(mean square displacement; MSD) 값을 각각 도 2a에 나타내었다. 다결합가 PNP는 소수결합가(paucivalent) PNP와 비교하여 훨씬 더 느리게 확산하고 더 짧은 거리를 이동하는 경향을 나타내었다. 486개 바이오틴을 포함하는 PNP는 거의 이동성이 없으며 거의 동일한 위치에 머무름을 확인하였다. 486개 바이오틴을 포함하는 경우를 제외하고 이들 궤적의 MSD 플롯은 MSD와 시간간격 간의 선형 관계를 뚜렷이 나타내었다. 이러한 결과는 이들 나노입자들이 SLB 표면 상에서 임의의 2D 브라운 운동을 나타냄을 의미한다. PNP 탐침의 확산계수를 계산하기 위하여, 본 발명자들은 각 바이오틴 결합가에 대해 100개 입자 궤적을 분석하고 상응하는 MSD 플롯을 하기의 수식으로 최적화하였다:
Figure pat00002
, 상기 <r 2>은 MSD, D는 확산계수이며 t는 시간간격이다. 1, 5, 28 및 128의 바이오틴 결합가에 대한 확산계수의 평균값은 각각 1.79±0.87×10-8, 0.72±0.35×10-8, 0.38±0.29×10-8 및 0.18±0.14×10-8 cm2/s로 계산되었다(도 2b). 계산된 D 값의 분포를 도 2에 나타내었다. 이들 값은 지질 움직임을 가시화하기 위하여 SLB를 30 내지 50 nm AuNP로 개질한 다른 문헌적 결과와 일치하였다. PNP가 보다 다결합가화 됨에 따라, 이동성 분획은 보다 감소하고 대부분의 입자들은 바이오틴 결합가가 486에 달하였을 때 실질적으로 고정되었다. 나아가, 다결합가 PNP의 암시야 현미경 이미지를 관찰하여 연관성을 확인하고 PNP의 위치를 입증하기 위하여 SLB 상의 Cy3-수식 STV의 형광현미경 이미지를 국부적으로 집중된 STV의 위치와 매치하였다. 그 결과 두 가지 이미지는 서로 잘 일치하였으며 이는 다결합가 PNP 하에서 STV의 국소 축적이 입자 이동성의 소실을 유발함을 나타낸다(도 3).
4.3. 금 나노입자의 광학적 안정성 테스트
금속 나노입자의 공명 광산란은 유기염료로부터의 형광과는 다른 물리적 기원을 갖는다. 국부화된 표면 플라즈몬의 방사성 감폭(radiative damping)은 산란된 광자를 형성하며 이러한 과정은 점멸 및 광표백의 영향을 받지 않는다. PNP의 광안정성을 확인하기 위하여, SLB 상의 50 nm AuNP를 30분간 지속적으로 암시야 현미경 조사에 노출시키고 산란세기를 매 6초 간격으로 기록하였다(도 4). 입자들은 전체 실험시간에 걸쳐 세기 변화 없이 반짝임(shining)을 유지하였다. 이는 AuNP가 단일-입자 추적을 위해 복수의 염료를 사용하는 경우에도 실질적으로 수분 내에 신호를 잃는 형광 염료에 비해 실시간 광학연구에 있어서 보다 강한(robust) 광학적 표지임을 나타내는 바이다.
4.4. SLB 상에 결합된 나노입자의 단일-나노입자-해상도 제자리 영상화 및 그 분석법
유동성 SLB에 PNP를 동적으로 연결하였고, 입자의 결합가를 조절함으로써 PNP의 동력학적 거동을 조절하였다. 또한, 단일-입자-수준의 해상도로 제자리 DNA 혼성화에 의해 유도된 입자 클러스터 성장 동력학과 상호작용하는 PNP 간의 실시간 플라즈몬 커플링을 사용하여 상기 플랫폼 상에서 정량을 분석하였다(도 5). 복수 입자 반응 자리로부터의 상호작용을 동시에 모니터하고 분석하였다. 이량체, 3량체 및 4량체 나노입자 클러스터 형성에 대한 속도론적 연구를 수행하였고 본 방법의 적용사례로서 다중-평행 단일-입자-분석-기반 DNA 검출 에세이를 개시하였다. 상기 플라즈몬 나노입자(PNP)는 효과적으로 공명광을 산란시키며 광표백 및 깜빡임의 영향을 받지 않으므로 이러한 접근에 사용되며, 장기간에 걸쳐 뛰어난 시공간적 해상도로 단일 나노입자 추적할 수 있다(~1.5 nm와 ~10 μs 해상도로 1시간 이상). 개별 금 또는 은 나노입자(AuNP 또는 AgNP)의 플라즈몬은 거리 의존적 방식으로 서로 상호작용하며 이는 추가적인 표지 없이 산란세기 또는 분광학적 반응의 변화를 모니터링 함으로써 수십 나노미터 이내의 분자 상호작용의 측정의 기반이 되는 기본적 원리를 형성한다. SLB는 고체 기질 상에 2D 유동적 표면을 합성하고 조절하며 측방유동성을 갖는 다양한 막종을 포함할 수 있는 매우 강력한 플랫폼이다. SLB에 나노입자를 연결합으로써, 나노입자를 2D 관심있는 모든 입자의 효율적인 영상화 및 추적을 위하여 광학현미경의 초점면(focal plane)에 감금할 수 있는 한편 SLB의 유동적 성질로 인해 나노입자의 자유 움직임을 보존할 수 있다. 연결된 PNP가 입사광을 공명산란시키고 항상 평면의 지질 이중층 표면 상에서 이동함에 따라, 단일-입자 해상도로 2D 확산 궤적 및 광학적 신호를 암시야 현미경(Axiovert 200M, Carl Zeiss, Gottingen, Germany)으로 제자리 기록할 수 있다(도 5b). 암시야 현미경 관찰 결과로부터 연결된 PNP가 2D 막표면을 통해 균일하게 분산되어 막표면에 걸친 자유 확산으로 우수한 측방 이동성을 나타냄을 확인하였다. 상기 입자의 동력학적 2D 구속 및 PNP 표지의 사용은 입자 간의 효율적인 충돌 및 나노입자 상의 분자 간의 거의 모든 반응의 제자리 관찰 및 분석을 용이하게 한다.
실시예 5: 패턴화된 SLB 의 제조
DNA 에세이를 위하여, 유리기질 상에 패턴화된 금 필름에 120×120 μm2 SLB를 형성하였다. 금 패턴은 기존의 포토리소그래피와 리프트 오프 공정(lift-off process)에 의해 제조하였다. 금 표면은 SLB 형성에 대해 불활성이므로, SUV 용액의 도입으로 노출된 유리 표면 상에 SLB를 선택적으로 침착시킬 수 있었다. SLB를 형성한 후, PNP와 표적 DNA의 비특이적 결합을 억제하기 위하여 금 표면을 PBS에 녹인 2 mg/ml BSA와 10 μM 카르복시메틸 폴리에틸렌글리콜로 불활성화(passivate)하였다. 이후, DNA 에세이 실험에 사용하기 위하여 PNP를 결합시켰다.
실시예 6: 암시야 현미경법 -기반 PNP 탐침의 제자리( in situ ) 관찰 및 광학적 분석
40× 대물렌즈(NA 0.6)을 구비한 암시야 현미경(Axiovert 200M, Carl Zeiss, Gottingen, Germany)에 의해 SLB-결합된 PNP 탐침의 이동과 플라즈몬 커플링을 관찰하였다. 모든 이미지 분석 과정은 ImageJ 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 이용하여 수행하였다. 개별적인 SLB-결합 PNP 탐침의 추적 및 궤적 분석을 위하여, MOSAIC 플러그인을 사용하였다(http://www.mosaic.ethz.ch/Downloads/ParticleTracker). 산란세기 및 RGB 색 스펙트럼은 각각 ImageJ 소프트웨어의 기본세기측정 및 RGB 색 세기분할 기능에 의해 측정하였다. Cy3-개질 STV를 532 nm 레이저로 여기시켜 60× 렌즈(NA 1.49)를 구비한 epifluorescence 현미경(TE-2000, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
6.1. 상호작용하는 입자의 고해상도 영상화 에세이
고해상도 영상화 에세이의 다른 중요한 점은 상호작용하는 입자를 관찰할 수 있는 안정하고 신뢰할만한 방법이라는 것이다. 이를 용이하게 하기 위하여, 현저히 다른 측방 이동성을 갖는 두 가지 형태의 DNA-수식된 플라즈몬 나노입자(DNA-PNP)를 고안하고 제조하여 SLB 표면에 연결시켰다(높은 이동성의 PNP 및 거의 고정된 PNP(각각 M-PNP 및 I-PNP) 탐침; 도 5a). 고정된 I-PNP 자리로부터의 산란신호는 안정적으로 모니터 및 분석될 수 있으며 M-PNP는 I-PNP 자리로 확산하여 플라즈몬 커플링-기반 산란신호의 변화를 유도할 수 있다. I-PNP 및 M-PNP 탐침은 각각 5'-티올-개질된 DNA 및 3'-티올-개질된 DNA 탐침으로 제조하였다. 두 가지 다른 티올화된 DNA 서열(표적 포획 서열 및 SLB 연결 서열)을 사용하여 각각의 PNP 탐침을 기능화하였다. SLB 연결 서열은 티올과 다른 말단에 바이오틴기를 포함하며 스트렙타비딘-개질된 SLB에 안정한 결합을 형성한다. PNP 탐침의 이동성을 DNA 수식 과정에서 SLB 연결 서열의 몰분율을 달리하여 탐침의 바이오틴 결합가에 의해 조절하였다(PNP 당 바이오틴화된 DNA의 당량조절 및 정량에 대한 상세한 방법은 보충 정보를 참조). PNP가 보다 다결합성 일수록, 확산계수 및 이동분율은 보다 감소하였으며, 0.15625 몰 분율의 SLB 연결서열로 달성되는 바이오틴 결합가가 486에 달하였을 때 모든 입자는 사실상 고정되었다(도 6a; PNP의 확산 동력학에 대한 바이오틴 결합가의 효과에 대한 상세한 연구는 보충자료 참조). M-PNP 탐침을 제조하기 위해, 0.00125 몰분율의 SLB 연결서열을 첨가하여 1 바이오틴 결합가를 얻었다. M-PNP 탐침은 소수결합가(paucivalent)이며 임의의 2D 브라운 모션으로 훨씬 더 자유롭게 확산할 수 있다. 반면, 다결합가 I-PNP 탐침은 거의 완전히 막표면 상에 고정되었다. 산란세기는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 본 발명에 사용된 현미경 장치의 광학해상도, d와 유사한 500 nm 반경의 I-PNP 자리(site)-중심의 원형구역(nanoparticle-centered circular area)을 평균하여 분석하였다(d=λ/2NA; λ는 50 nm AuNP의 공명 산란 파장인 530 nm, NA는 대물렌즈의 개구수(numerical aperture)인 0.6).
M-PNP 및 I-PNP 탐침은 SLB에서 STV 링커를 통해 바이오틴화된 지질에 결합하므로 PNP-결합된 지질의 국소 위치 및 움직임은 암시야 현미경에서 공명 광산란 신호로 추적할 수 있다. 입자-결합된 표적 DNA 부재시, M-PNP 탐침은 고정된 I-PNP 자리에 접근할 수 있고, 상기 탐침들은 암시야 현미경에서 일시적으로 중첩될 수 있다. 결과적으로 I-PNP 자리의 산란세기는 초기에는 일정하지만 M-PNP가 광학적 회절 한계 내로 진입함에 따라 변동되었다(도 6b). 흥미롭게도, 신호에서 두 가지 순간적인 예리한 상승이 관찰되었다. 보다 잦은 한 케이스에서, 산란세기는 초기 값의 약 2배에 달했다. 이는 두 개의 PNP가 광학적 해상도 이내에 존재하나 플라즈몬 커플링을 야기할 만큼 서로 충분히 가깝지는 않은 먼 광학적 중첩에 기인할 수 있다(도 6b-i). 다른 케이스에서, 산란세기의 약 3.5배 상승이 관찰되었고 이러한 높은 향상은 플라즈몬 커플된 두 개의 PNP 간의 근접장 상호작용으로부터 기인하였다(도 6b-ii). 대부분의 이러한 신호 변화는 입자 간의 특이적인 상요작용의 부재로 인해 0.5초 미만 동안 지속되었다. 지질 간의 일시적인 분자간 근접을 플라즈몬 커플링에 의해 준-회절 길이 스케일에서 확인하였다. 상기한 바와 같이 본 발명의 방법을 이용하여 PNP 탐침 간의 정박(docking) 및 플라즈몬 커플링에 의해 야기되는 분자간 상호작용을 모니터할 수 있음을 제시한다. 다음으로 본 발명자들은 SLB 상에서 DNA-수식 PNP 탐침의 조립 및 분해에 의해 유발되는 제자리 DNA 혼성화 및 탈혼성화(dehybridization) 이벤트를 관찰하고, 단일 나노입자 해상도에서 실시간으로 상응하는 산란세기의 변화를 기록하였다. 표적 DNA 서열이 존재할 때, 소수결합가의 M-PNP는 고정되어 추적 중심으로서 모니터할 수 있는 다결합가의 I-PNP에 의해 포획되어 다입자 클러스터를 형성하였다. 암시야 현미경 이미지에서 조립과정은 단일-나노입자 첨가 이벤트를 관찰함에 있어서 성공적으로 분석되었다(resolved). 단량체로부터 4량체로 입자-by-입자 PNP 클러스터 성장이 관찰되었으며 포획된 M-PNP 탐침의 궤적은 흰색 실선으로 강조하였다(도 6c). 클러스터가 발달됨에 따라, I-PMP 자리에 대한 모든 단일 M-PNP 첨가 단계에 있어서 산란세기 및 색 모두에서 갑작스런 변화가 관찰되었다. 산란효율 및 공명 파장에서의 변화는 클러스터된 AuNP에서의 플라즈몬 커플링에 의해 야기되었다. 3 nM 표적 DNA 농도에서 반응은 15분 이내에 완결되었으며 많은 단량체 M-PNP 탐침이 소모되면서 클러스터를 형성하였다. M-PNP 수가 제한적이며 단일 자리에서 4개를 초과하는 입자의 조립에 대한 입자 상에서 DNA 가닥 간의 큰 입제장애가 존재하므로, 클러스터 성장은 보통 4량체 이내에서 제한되었으며, 4량체를 넘어서는 추가적인 성장은 거의 관찰되지 않았다. 고정된 I-PNP의 사용은 불규칙한 2D 응집체를 형성하고 정량성을 손상시키는 소형 클러스터 간의 융합을 효과적으로 제거함으로써 단량체 부착에 대한 클러스터 성장 경로를 제한한다(M-PNP 쌍-수식 SLB에서 관찰되는 융합과정(coalescence process)에 대해서는 도 7 참조). PNP 탐침 간의 플라즈몬 커플링은 공명 파장의 적색편이(장파장이동; red-shift)를 유발하고 따라서, 플라즈몬 커플된 녹색 AuNP는 암시야 현미경 이미지에서 적색으로 변하였다. RGB 채널을 분할하여 플라즈몬 색 변화를 분석하였다(도 5b). 클러스터가 성장함에 따라, 녹색과 적색 신호가 증가하는 반면, 청색 신호는 일정하게 유지되었다. 이에 기초하여 본 발명자들은 적색에 대한 녹색의 비율을 그래프로 나타내었으며, 클러스터된 입자의 수가 증가함에 따라 비율의 선형적 증가가 관찰되었다(도 6d). 색 검정 표준은 실질적으로 입자간 상호작용의 상태를 정확하게 정의하고 정량하는 것과 비특이적 광학 중첩으로부터 특이적 상호작용-기반 플라즈몬 커플링을 구별하는데 유용하다. 표적 DNA 인식 및 혼성화를 통해 I-PNP 자리에 M-PNP 탐침을 하나씩(particle-by-particle) 첨가하는 것을 관찰하였으며, 산란세기의 시간추적으로 정량하였다(도 6e 상단 그래프). 상기 결과는 각각의 M-PNP가 I-PNP 탐침에 첨가됨에 따라 순차적으로 이량체, 3량체 및 4량체가 형성되어 산란신호세기가 단계적으로 증가함을 나타낸다. 고염 PBS 용액(167 mM Na+)을 훨씬 적은 염(17 mM Na+)을 포함하는 저염 PB 용액으로 교환하였을 때, 표적 DNA는 탈혼성화되고 M-PNP는 I-PNP 탐침으로부터 해리되어 자유롭게 SLB 표면에 걸쳐 확산되었으며, 그 결과 산란세기에서 단계적인 일련의 감소가 유발되었다(도 6e 하단 그래프). 이는 산란신호세기가 매 탐침 첨가 단계에 대해 다단계 변화를 경험하며 다음 입자가 첨가되거나 탈락될 때까지 일정하게 유지됨을 나타낸다.
6.2. 클러스터 성장 속도( cluster growth kinetics ) 분석
단량체로부터 4량체로 클러스터 성장 속도를 I-PNP에 비해 M-PNP가 과량으로 존재하는 것으로 가정하여 3-단계 1차 연속 반응으로 최적화하였다.
Figure pat00003
(a)
각 종의 변화 속도에 대한 미분형은 하기와 같다.
Figure pat00004
(b)
Figure pat00005
(c)
Figure pat00006
(d)
Figure pat00007
(e)
상기 미분 방정식을 풀어 각 종의 시간 의존적 농도를 묘사하는 해법을 얻을 수 있다:
Figure pat00008
(f)
Figure pat00009
(g)
Figure pat00010
(h)
Figure pat00011
(i)
이때, 초기 I-PNP 단량체 농도, [M]0은 여기서 분석된 입자수인 150이다. 상기 방정식을 이용하여 속도 데이터를 최적화함으로써 속도 상수값 k 1, k 2 및 k 3을 확인하였다.
넓은 표면적에 걸친 PNP 탐침의 개별 플라즈몬 커플링을 동시에 분석함으로써 다중 상호작용의 고도의 병렬 제자리 관찰을 실현하였다(일반적으로 ~30,000 μm2; 도 8A). 본 발명에 따른 330초의 관찰 시간 동안(80 ms 노출시간 및 1 s 시간간격) 제자리 병렬 입자 클러스터 성장 분석 결과는 연속적인 particle-by-particle 클러스터 성장이 일반적으로 관찰됨에도 불구하고(도 8b-i 및 iv) 많은 다른 클러스터링 모드 또한 다른 클러스터링 속도로 관찰됨을 나타낸다. 어떤 탐침들은 단지 희미하게 형성되며 더 이상 성장하지 않았다(도 8b-ii 및 iii). 또한 4량체를 형성하는 추가적인 성장 없이 탐침 클러스터가 성장하여 3량체를 형성하는 경우도 있다. I-PNP 탐침에 대한 두 가지 탐침의 동시 첨가(도 8b-iii 및 vi) 및 매우 짧은 시간 프레임 내에서 I-PNP 탐침에 대한 두 가지 또는 세가지 탐침의 잇따른 첨가를 관찰하고 분석하였다(도 8b-vii, ix 및 x; 삽도 참고). 본 발명에서는 상기 제자리 병렬 단일-입자 해상도 분석능에 기초하여 DNA-혼성화-유도 클러스터 형성 반응 속도를 연구하였다. 이를 위하여 150개 개별 I-PNP 자리의 산란세기를 동시에 모니터하였다. 단량체로부터 4량체까지의 성장 속도(단량체 이량체 3량체 4량체)를 M-PNP가 I-PNP 단량체에 비해 과량으로 존재하는 것을 가정하여 3-단계 연속 반응으로 최적화하였다(자세한 최적화 과정은 보충자료 참고). 이량체, 3량체 및 4량체 형성에 대한 속도 상수는 각각 0.0165, 0.0116 및 0.0061 s-1로 계산되었다. 상기 모델은 나노입자 클러스터 성장 동력학이 180초 이내에 시간에 수행됨을 설명한다. 상기 결과는 이량체로부터 3량체의 형성이 단량체로부터 이량체의 형성보다 어렵고 느린 과정이며 DNA-수식 PNP 탐침들 간의 입체장애로 인해 4량체의 형성은 가장 어렵고 시간-소모적 과정이라는 가정에 대한 직접적인 증거이다. 입체장애인자(f)를 고려하여 3량체 및 4량체 형성의 속도상수는 각각 및 로 표현될 수 있다. 입체인자는 최적화된 속도상수로부터 계산될 수 있다(fdim에 대해 0.7040, ftri에 대해 0.3716). 투과 전자 현미경 측정은 PNP 클러스터가 다른 기하학적 형태로 형성됨을 나타낸다(도 8d). 이러한 관찰을 기초로 하여 본 발명자들은 2D 이량체 및 2D 3량체에 대한 다음 PNP의 첨가에 대해 입체인자를 기하학적으로 계산하였다(기하학적으로 계산된 입체장애인자; fdim=0.6667 및 ftri=0.3750; 도 9D). 이들 수치는 최적화된(fitted) 속도상수로부터 획득한 입체인자와 일치하며, 이는 3단계 연속반응모델이 DNA-수식 PNP 탐침의 2D 클러스터 성장을 설명함을 제시한다.
마지막으로 본 발명자들은 클러스터에서 반응한 입자 수에 대한 광학적 검정 표준을 도시하였으며, 상기 표준 곡선에 기초하여 표적 DNA 검출을 수행하고 PNP-결합 SLB 플랫폼의 검출 민감도를 평가하였다. 30개 개별 클러스터를 동시에 분석하여 검정 표준 플롯을 획득하고 클러스터의 입자 수를 입자 첨가 이벤트를 전부 분석하고 기록하여 확인하였다. 단일 프레임 수집 내에 복수의 PNP 탐침을 동시에 첨가하는 것을 방지하기 위하여 프레임 속도를 초 당 5.3 프레임으로 상승시켰다. 본 발명자들은 평균화된 산란세기를 플롯하고 클러스터된 입자 수와의 선형관계를 확인하였다(R2=0.999, 도 9a). 도 4에 상응하는 분포를 도시하였다. 그 결과는 좁은 표준편차를 나타내었으며 본 발명자들은 클러스터된 상태를 명확히 구분할 수 있다.
6.3. SLB 상에 연결된 상보적 DNA 가 수식된 PNP 와의 상호작용을 이용한 표적 DNA 검출 한계
표적 DNA와 이의 상보적인 서열과의 상호작용에 의해서 형성된 금나노입자 클러스터의 경우 산란 신호의 세기 증가가 명확하고 단일나노입자 수준에서 관찰이 가능하기 때문에 클러스터 형성 정도를 정량화할 경우 표적 DNA를 검지하는 바이오 센서로 응용할 수 있다. 따라서, 표적 DNA 농도에 따라 나노입자 클러스터가 형성되며 변화하는 암시야 현미경 이미지의 신호 밝기를 분석하여 검출가능한 농도 범위를 확인하였다. 금 필름에 삽입된(embeded) 120×120 μm2 SLB 패턴 상에서 DNA 검출을 수행하였다(도 9b). PNP-수식된 SLB를 4시간 동안 300 aM 내지 300 fM 범위의 다른 농도의 표적 DNA와 반응시켰다. 대조시료를 포함한, 모든 시료는 본 발명에 따른 에세이의 선택성을 검증하기 위하여 300 fM의 비상보적 DNA 서열을 포함하였다. 본 발명에 사용된 표적 DNA 농도 범위에서 PNP는 3량체 및 4량체로의 추가적인 성장 없이 이량체만을 형성하였다. 커플된 이량체 산란 세기를 나타내는 I-PNP 자리(>3.5-배-향상; 도 9a)를 표적 DNA 서열에 대한 광학적 신호로서 계수하였다(도 9b). 에세이 결과는 최적화 과정 없이 30 fM의 검출 한계를 나타내었다(도 9c). 또한, 단일-염기-쌍-불일치 DNA 서열도 명확히 구분되었다(도 9c).
이와 같은 높은 민감도는 SLB 위에서 움직이는 M-PNP와 움직이지 않는 I-PNP가 같은 2차원 평면에서 이동하고 반응하므로 충돌확률이 높아져 빠른 반응을 나타낼 수 있음을 의미한다. 실제로 M-PNP를 지지형 지질 이중층에 도입하지 않고 용액 상에 분산시킨 후 SLB 상에 고정된 I-PNP와 반응시킬 경우 매우 느리고 비효율적인 반응을 일으키는 것을 관찰하였다.
6.4. 외부 자극에 의한 SLB 상에 연결된 나노입자의 분포 조절 및 플라즈몬 커플링 유도
SLB 상에 도입된 금속나노입자의 바이오틴 결합가를 적절히 조절하면 나노입자는 SLB 상에서 유동성을 가지게 된다. 유동적인 나노입자는 자유로운 2차원 확산운동을 하게 되는데, 외부자극(예컨대, 전기장 혹은 유체흐름)을 이용하여 SLB 상에서 나노입자가 원하는 방향으로 이동하도록 조절할 수 있으며 이때, 자극의 세기 즉, 가해지는 전기장의 크기 또는 유속을 변화시킴으로서, 입자의 이동속도 또한 조절 가능하다. 도 10에 나타난 바와 같이 패턴화된 SLB에서 나노입자의 공간적 분포를 조작할 경우 특정 부분에서 입자의 밀도를 높이고 입자간 충돌 빈도를 크게 향상시킬 수 있다. 따라서 SLB 상에서 나노입자간 상호작용을 증가시켜 반응속도를 향상시켜 바이오센서의 감도를 증가시키고 검지시간을 단축시킬 수 있다. 또한 입자간 거리를 조절하여 플라즈몬 커플링을 조절하는 플랫폼으로 사용할 수도 있다.
구체적으로 SLB 플랫폼에 도입된 금속나노입자의 움직임을 조절하기 위하여 유리기판 상에 플로우 채널을 제작하였다. 상부 슬라이드 글라스의 양쪽에 구멍을 형성하여 유체 흐름을 만들기 위한 완충 용액을 도입할 수 있도록 하였다. 이와 같은 방법으로 채널 내부에 유체의 흐름을 도입하면 나노입자는 2차원 자유 확산운동에서 조금씩 경로를 변화하면서 특정한 방향으로 이동하게 된다. 유속을 증가시킬수록 이러한 이동 경향이 뚜렷이 관찰되었다(도 11a 및 b). SLB을 Cr을 이용하여 패턴화할 경우 나노입자가 Cr 장벽 외부로 나가지 못하고 갇힌다(도 10 우측 하단). 이때 유체 흐름으로 나노입자의 운동방향을 한쪽으로 조절하면 나노입자가 유체 흐름과 같은 방향으로 이동해 농축되는 현상을 관찰할 수 있다(그림 11c 및 d). 금과 은 나노입자 모두 유동성 나노입자가 한쪽 방향에 축적되어 특유의 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resnonace) 파장의 색을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 유체의 흐름을 반대방향으로 바꿀 경우 농축되어있던 나노입자가 반대방향으로 이동해 마찬가지로 축적되는 것을 관찰하였다.
패턴을 좀 더 확장하여 수 mm2 크기로 제작할 경우 보다 많은 수의 나노입자를 한 곳에 집중시킬 수 있다. 넓은 영역의 나노입자를 모으기 위해 사다리꼴 모양의 패턴을 제작하였으며 6 ml/h의 유속으로 약 30분간 나노입자를 밀집시켰다. 밀집된 나노입자는 패턴의 끝 부분에서 암시야 현미경에서 특유의 플라즈몬 산란 색을 띄고 있는 것을 확인하였다. 이때 나노입자는 유체 흐름으로 밀어주는 힘과 DNA가 수식된 나노입자간의 반데르발스(Van der Walls) 상호작용과 DNA 분자간 입체 반발력(steric repulsion), 정전기적 반발력(electrostatic repulsion)에 의해 평형을 이루고 있다. 나노입자간 거리를 줄이기 위해 본 연구에서는 유체에 포함된 NaCl 염의 농도를 증가시켰다. NaCl 농도를 증가시킴에 따라 나노입자간 정전기적 반발력이 감소하여 입자간 거리가 보다 가까워져 플라즈몬 커플링이 유도되는 것을 확인하였다. 이때의 산란 스펙트럼을 측정하여 분석하였다(도 12 a, b, d 및 e). 산란 스펙트럼의 최대 피크는 염의 농도가 증가함에 따라 장파장 이동(red shift)을 나타내었다. 나노입자의 제타전위 측정결과 염 농도가 증가함에 따라 나노입자의 표면전하가 감소하는 것을 확인하였으며, 그 결과 입자간 정전기적 반발력이 감소하여 거리가 가까워진 것을 확인하였다(도 12 c 및 f).
6.5. 생체 모방형 인공 세포막 플랫폼의 개발
세포막은 세포 내부와 외부를 구분해 주는 구조물로 인지질 및 단백질 분자로 구성된 얇은 인지질 이중층이다. 세포막은 선택적인 투과성을 지니며 여러 단백질을 통해 세포 기능 및 조직 구성을 유지하는 기능을 수행한다. 이렇듯 세포막에서는 세포의 항상성 유지 및 필수 기능을 위한 다양한 생물학적 현상이 이루어지고 있으며, 따라서 세포막에서의 생물학적 및 세포생물학적 이해는 매우 중요하다.
이러한 점에서 착안하여, 상기 실시예 6.4.에 개시한 전기적 또는 유체학적으로 조절 가능한 인공 세포막 구조인 SLB 플랫폼을 이용하여 세포의 거동을 관찰할 수 있다. 인공 세포막인 SLB에 화학적, 생물학적 결합 방법을 사용하여 생체 물질을 포함하는 금속 나노입자와 같은 표지물질을 도입하고 상기 표지물질의 광학적 특성을 검출하여 세포의 거동을 모니터링할 수 있다. SLB에 도입된 생체 물질은 세포 내부적으로 신호전달을 유도하거나 외부적으로 표현형을 조절하는 등의 반응을 유도할 수 있다. 이러한 관찰은 실제 세포막에서 일어나는 생물학적 반응과 흡사하다는 점에서 그동안 밝혀지지 않았던 새로운 생물학적 메커니즘을 밝히는데 도움을 줄 수 있다.
플라즈몬 공명과 같은 광학적 특성을 가지고 있는 금속 나노입자는 주변 입자와의 거리에 의존하여 혼성화할 수 있다. 이러한 특성 때문에 주변 금속입자와의 거리 및 클러스터링 정도에 따라 암시야 현미경으로 관찰할 때 각기 다른 색을 띄게 된다. 또한 금속나노입자는 강한 플라즈몬 산란으로 장시간 동안 높은 신호 대 잡음 비(S/N ratio)로 관찰이 가능하다. 플라즈몬 산란 신호뿐만 아니라 여러 가지 다중검지가 가능한 표면증강 라만산란(surface-enhanced Rman scattering) 신호를 발생하는 세포 모니터링 탐침을 세포막에 도입함으로써 세포반응을 관찰할 수 있다.
따라서, 생체물질를 포함하는 금속나노입자를 SLB 표면에 도입하고 세포를 배양한 후 세포로 인한 금속나노입자의 움직임을 광학적으로 분석할 수 있다. 이는 세포의 거동을 실시간으로 관찰할 수 있다는 장점뿐만 아니라 세포와 생체물질의 상호작용을 나노수준에서 실시간 모니터링할 수 있다는 점에서 세포신호전달 메커니즘을 보다 정밀하게 분석할 수 있게 할 것이다(도 13).

Claims (19)

  1. 기재 및 상기 기재 상에 배치된 지지형 지질 이중층(supported lipid bilayer; SLB)을 포함하는 인공세포막(artificial cell membrane)에 있어서,
    상기 지지형 지질 이중층은 지질 일부 또는 전부가 이중층 내에서 위치이동가능하며, 제1리간드가 결합된 제1지질을 포함하고,
    상기 제1리간드에 특이적으로 결합하는 제2리간드를 100 내지 100,000 개/㎛2 이상의 밀도로 포함하는 제1입자가, 제1리간드와 제2리간드의 결합을 통해 2개 이상의 제1지질과 결합하여, 평균 0 내지 0.5×10-8 cm2/sec로 지지형 지질 이중층 내 이동성이 감소된 것 특징인 인공세포막.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1리간드 및 제2리간드는 각각 독립적으로 항원, 항체, 리간드, 수용체, 킬레이트, DNA, RNA, 앱타머, 서로 특이적으로 결합하는 화학분자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 인공세포막.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1입자는 항원-항체 결합, 리간드-수용체 결합, 핵산 혼성화, 킬레이트 결합, 공유결합 또는 정전기적 결합에 의해 지질에 결합된 것인 인공세포막.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 입자는 금속 나노입자, 반도체 나노입자, 자성 나노입자, 실리카 나노입자 및 고분자 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 인공세포막.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1리간드가 결합된 제1지질을 상기 지지형 지질 이중층의 전체 지질에 대해 0.05 내지 0.5 몰%로 포함하는 것인 인공세포막.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 지지형 지질 이중층의 전체 지질에 대해 1 내지 10 몰%의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 제2지질을 추가로 포함하는 것인 인공세포막.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량은 500 내지 2000인 것인 인공세포막.
  8. A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치에 있어서,
    제1리간드와 동일 또는 상이한 제3리간드가 결합된 제3지질을 추가로 포함하는 지지형 지질 이중층을 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 인공세포막;
    상기 인공세포막 중 제1입자 표면 상에 결합된 A 분자;
    상기 제3리간드에 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하는 제2입자로서, 제3리간드와 제4리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제3지질과 결합하되, 제1입자 보다 지지형 지질 이중층 내 이동성이 큰 제2입자; 및
    상기 인공세포막 중 제2입자 표면 상에 결합된 B 분자를 포함하는 것이 특징인 분석장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 A 분자 및 B 분자는 각각 독립적으로 DNA, RNA, 항원, 항체, 리간드, 킬레이트, 수용체, 앱타머, 폴리머, 유기화합물, 금속이온 및 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 분석 장치.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 A 분자와 B 분자의 상호작용은 항원-항체 결합, 리간드-수용체 결합, 핵산 혼성화, 킬레이트 결합, 공유결합 및 정전기적 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 분석 장치.
  11. 제8항에 있어서,
    제1입자는 지지형 지질 이중층 상에 고정되고, 제2입자는 상호작용 부재시 지지형 지질 이중층 상에서 2차원적 자유 브라운 운동(2-dimensional brownian motion) 가능한 것이 특징인 분석 장치.
  12. 제8항에 기재된 분석장치를 이용하여, A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    제1입자의 위치 및 제1입자에 의한 산란 세기 또는 파장의 변화를 모니터링 하는 것이 특징인 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    제2입자의 실시간 이동 궤적 또는 속도, 또는 제2입자에 의한 신호의 세기 또는 파장의 변화를 모니터링 하는 것이 특징인 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 모니터링은 제1입자의 플라즈몬 산란 또는 형광을 측정함으로서 달성되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 모니터링은 제2입자의 플라즈몬 산란 또는 형광을 측정함으로서 달성되는 것인 방법.
  17. 제12항에 있어서,
    추가로 특정 방향으로 힘을 가하여 입자의 밀도를 높이고 입자 간 충돌빈도를 증가시키는 것이 특징인 방법.
  18. A 분자와 B 분자의 상호작용을 확인하기 위한 분석장치에 있어서,
    기재 및 상기 기재 상에 배치된 지지형 지질 이중층을 포함하는 인공세포막으로서, 상기 지지형 지질 이중층은 지질 일부 또는 전부가 이중층 내에서 위치이동가능하며, 제1리간드가 결합된 제1지질 및 제1리간드와 동일 또는 상이한 제3리간드가 결합된 제3지질을 포함하는 것인 인공세포막;
    상기 제1리간드에 특이적으로 결합하는 제2리간드를 포함하는 제1입자로서, 제1리간드와 제2리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제1지질과 결합된 제1입자;
    상기 제1입자 표면 상에 결합된 A 분자;
    상기 제3리간드에 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하는 제2입자로서, 제3리간드와 제4리간드의 결합을 통해 1개 이상의 제3지질과 결합하는 제2입자; 및
    상기 인공세포막 중 제2입자 표면 상에 결합된 B 분자를 포함하는 것이 특징인 분석장치.
  19. 유체 채널에서 특정 영역 내로 입자를 농축시키는 방법으로서,
    지질 일부 또는 전부가 이중층 내에서 위치이동가능하고, 제1리간드가 결합된 제1지질을 포함하는 지지형 지질 이중층을 상기 유체 채널 내부에 준비하는 단계;
    상기 제1리간드에 특이적으로 결합하는 제2리간드를 포함하는 제1입자를 상기 지지형 지질 이중층 상에 적용시키는 단계; 및
    유체 채널에 유체 흐름을 적용하여 제1입자들을 특정 영역 내로 이동시키는 단계를 포함하는 입자 농축 방법.
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