ES2862048T3 - Membrana celular artificial que comprende la bicapa lipídica soportada conectada con sondas que tienen movilidad controlable y método para analizar la interacción entre moléculas mediante el uso de la misma - Google Patents

Abstract

Una membrana celular artificial, que comprende: un sustrato; y una bicapa lipídica soportada (SLB) dispuesta sobre el sustrato, en donde la bicapa lipídica soportada, dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, comprende un primer lípido unido con un primer ligando; y un tercer lípido unido con un tercer ligando que es igual o diferente del primer ligando, una primera partícula metálica que comprende un segundo ligando a una densidad de 100 a 100 000/μm2, que se une específicamente al primer ligando, se une al menos a dos de los primeros lípidos a través de la unión entre el primer ligando y el segundo ligando, para disminuir la movilidad de la primera partícula metálica en la capa lipídica soportada de 0 a 0,5x10-8 cm2/s, y una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando, que se une específicamente al tercer ligando, se une al menos a uno de los terceros lípidos a través de la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando, y tiene una mayor movilidad en la capa lipídica soportada en comparación con la de la primera partícula metálica por el ajuste del número de ligandos unidos a las partículas metálicas.

Description

DESCRIPCIÓN

Membrana celular artificial que comprende la bicapa lipídica soportada conectada con sondas que tienen movilidad controlable y método para analizar la interacción entre moléculas mediante el uso de la misma

Campo técnico

La presente invención se refiere a una membrana celular artificial como se define en las reivindicaciones que incluye una bicapa lipídica soportada (SLB) que incluye un sustrato y partículas metálicas de movilidad reducida unidas al sustrato; un dispositivo o kit de análisis según se define en las reivindicaciones que incluye la membrana celular artificial y el examen de las interacciones entre moléculas, en el que una molécula se une a la superficie de una partícula metálica con movilidad reducida unida a la membrana celular artificial y la otra molécula se une a la superficie de una partícula metálica de movilidad aumentada unida a un lípido de baja valencia; un método para examinar las interacciones entre moléculas mediante el uso del dispositivo de análisis; un kit como se define en las reivindicaciones para el análisis cuantitativo o cualitativo de un material diana que incluye la membrana celular artificial mediante mediciones de dispersión plasmónica; y un kit de análisis múltiple como se define en las reivindicaciones que puede detectar una pluralidad de materiales diana mediante el uso de una pluralidad de partículas metálicas que tienen diferentes longitudes de onda de dispersión plasmónica y/o que tienen una movilidad diferente sobre una bicapa lipídica soportada.

Antecedentes de la técnica

Las mediciones in situ de resolución de nanopartículas individuales proporcionan instantáneas dependientes del tiempo de las nanopartículas individuales dinámicas y, por lo tanto, las interacciones heterogéneas entre las nanopartículas pueden dilucidarse y distinguirse del conjunto. Este enfoque revela información directa y detallada sobre el crecimiento de nanocristales coloidales y el mecanismo de ensamblaje y la cinética de reacción. Sin embargo, los métodos convencionales de obtención de imágenes de alta resolución, que incluyen la microscopía electrónica, típicamente, proporcionan la información de estructuras estática sin información in situ y requieren una configuración y procedimientos complicados en condiciones difíciles (por ejemplo, vacío). Por estas razones, los métodos de análisis e imágenes ópticas a nivel de una molécula individual basados en fluoróforos se usan principalmente para obtener la información dinámica sobre las interacciones intermoleculares, pero tienen los problemas de parpadeo y blanqueamiento de los fluoróforos. Además, discernir interacciones moleculares de corto alcance de múltiples componentes con marcadores de fluoróforo es un gran desafío, e incluso con la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, la distancia medible se limita a 10 nm y la interpretación se vuelve difícil para los sistemas de múltiples componentes. Estos son problemas graves para los estudios en tiempo real de las interacciones entre moléculas y nanopartículas y la obtención de datos cuantitativos reproducibles y fiables para muchos análisis. Otro problema importante de estos métodos ópticos convencionales de alta resolución es que los objetos que se mueven dinámicamente no pueden analizarse y estudiarse de manera individual y confiable en un estado de solución debido a sus movimientos tridimensionales incontrolables y a la incapacidad de la óptica para rastrear todos los objetos de interés. Además, debe señalarse que, cuando estos objetos se fijan en una superficie para un análisis óptico de alta resolución, no pueden estudiarse los comportamientos dinámicos de estos objetos. Por todas estas razones, sería extremadamente beneficioso desarrollar un método que permita la obtención de imágenes y el análisis in situ de las interacciones entre nanopartículas que se mueven libremente con sensibilidad de una partícula individual. Para obtener información más confiable y deducir nuevos principios del estudio de partículas que interactúan, uno debe, además, rastrear las interacciones de múltiples sitios de reacción simultáneamente con datos de cuantificación a nivel de una partícula individual.

Y.H.M Chan y otros, (Proceedings of the national Academy of Sciences, vol.104, núm. 48, 27 de noviembre de 2007, páginas 18913-18918) describe una bicapa lipídica soportada (SLB) que comprende un primer ligando y un tercer ligando, una molécula A unida a la superficie de una primera partícula que comprende un segundo ligando y una segunda partícula que comprende una molécula B y un cuarto ligando, pero este documento no describe partículas metálicas ni una primera partícula que esté unida al menos a dos de los primeros lípidos a través de la unión entre el primer ligando y el segundo ligando, como se definen en los temas de las reivindicaciones.

Descripción

Problema Técnico

En consecuencia, los presentes inventores han estudiado y se han esforzado por encontrar métodos para observar las interacciones entre partículas en un plano bidimensional con alta resolución mientras aseguran el libre movimiento de las partículas. Como resultado, han descubierto que la fluidez de las partículas metálicas formadas en una bicapa lipídica soportada (SLB) mediante enlaces estreptavidina-biotina puede ajustarse mediante el ajuste de la valencia de la biotina en las partículas, y que la cinética de reacción de las interacciones entre las partículas debido a la interacción entre las cadenas de ADN que tienen secuencias complementarias formadas en la superficie de las partículas metálicas pueden rastrearse y analizarse con alta resolución al nivel de una partícula individual. Basado en estos descubrimientos, se ha completado la presente invención.

Solución Técnica

Para lograr los objetos anteriores, un primer aspecto de la presente invención proporciona una membrana celular artificial como se define en las reivindicaciones, que comprende: un sustrato; y una bicapa lipídica soportada (SLB) dispuesta sobre el sustrato, en donde la bicapa lipídica soportada, dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, comprende un primer lípido unido con un primer ligando, y una primera partícula metálica que comprende un segundo ligando que se une específicamente al primer ligando a una densidad de 100 a 100000/pm2 se une a al menos dos de los primeros lípidos a través de la unión entre el primer ligando y el segundo ligando, a fin de disminuir la movilidad de la primera partícula metálica en la capa lipídica soportada de 0 a 0,5x10'8 cm2/s.

Un segundo aspecto de la presente invención proporciona un dispositivo de análisis como se define en las reivindicaciones para examinar la interacción entre la molécula A y la molécula B mediante el uso de una membrana celular artificial, que comprende: la membrana celular artificial del primer aspecto, en la que una bicapa lipídica soportada además comprende un tercer lípido unido con un tercer ligando que es igual o diferente del primer ligando; la molécula A unida a la superficie de la primera partícula metálica en la membrana celular artificial; una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando que se une específicamente al tercer ligando, en donde la segunda partícula metálica se une al menos a uno de los terceros lípidos a través de la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando, y tiene mayor movilidad en comparación con la de la primera partícula metálica como se define en la reivindicación; y la molécula B unida a la superficie de la segunda partícula metálica en la membrana celular artificial, en donde la segunda partícula metálica que tiene mayor movilidad se acerca a la primera partícula metálica y después se confina a la primera partícula metálica por la interacción entre la molécula A y la molécula B.

Un tercer aspecto de la presente invención proporciona un método como se define en la reivindicación para examinar la interacción entre la molécula A y la molécula B mediante el uso del dispositivo de análisis del segundo aspecto.

Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona un kit como se define en las reivindicaciones y su uso para determinar la unión entre la molécula A y la molécula B mediante la determinación de la distancia entre una primera partícula metálica y una segunda partícula metálica de las señales de dispersión plasmónica de la primera partícula metálica unida con la molécula A y la segunda partícula metálica unida con la molécula B sobre una membrana celular artificial, dicho kit comprende: una membrana celular artificial que comprende un sustrato, una bicapa lipídica soportada que se dispone sobre el sustrato y dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, y un primer lípido se une con un primer ligando y un tercer lípido se une con un tercer ligando, que es igual o diferente del primer ligando, como una parte de la bicapa lipídica soportada; una primera partícula metálica que comprende un segundo ligando que se une específicamente al primer ligando, en donde la primera partícula metálica puede unirse al menos a uno de los primeros lípidos mediante la interacción entre el primer ligando y el segundo ligando; y una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando que se une específicamente al tercer ligando, en donde la segunda partícula metálica puede unirse al menos a uno de los terceros lípidos mediante la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando.

Un quinto aspecto de la presente invención proporciona un kit y como se define en las reivindicaciones y su uso para el análisis cualitativo o cuantitativo de un material diana que puede unirse a la molécula A y a la molécula B que se usa para determinar la unión entre la molécula A y la molécula B mediante la determinación de la distancia entre una primera partícula metálica y una segunda partícula metálica a partir de las señales de dispersión plasmónica de la primera partícula metálica unida con la molécula A y la segunda partícula metálica unida con la molécula B sobre una membrana celular artificial, dicho kit comprende: una membrana celular artificial que comprende un sustrato, una bicapa lipídica soportada que se dispone sobre el sustrato y dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, y un primer lípido unido con un primer ligando y un tercer lípido unido con un tercer ligando, que es igual o diferente del primer ligando, como una parte de la bicapa lipídica soportada; una primera partícula metálica que comprende un segundo ligando que se une específicamente al primer ligando, en donde la primera partícula metálica puede unirse al menos a uno de los primeros lípidos mediante la interacción entre el primer ligando y el segundo ligando; la molécula A que se une a la superficie de la primera partícula metálica y que se une específicamente a una porción del material diana; una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando que se une específicamente al tercer ligando, en donde la segunda partícula metálica puede unirse al menos a uno de los terceros lípidos mediante la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando; y la molécula B que se une a la superficie de la segunda partícula metálica en la membrana celular artificial y que se une específicamente a otra porción del material diana en el que la molécula A no se une.

Un sexto aspecto de la presente invención proporciona un kit de análisis múltiple como se define en las reivindicaciones para el análisis cualitativo o cuantitativo de materiales diana en la cantidad de imáx x mmáx mediante la medición de dispersión plasmónica (imáx y mmáx son valores máximos de las siguientes variables i y m, respectivamente, y son cada una independientemente un número entero de 1 o más, pero no imáx = mmáx = 1), que comprende: una membrana celular artificial que comprende un sustrato, una bicapa lipídica soportada que se dispone sobre el sustrato y dentro del cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, y un lípido Ii unido con un ligando I¡ y un lípido Mm unido con un ligando Mm (en la presente descripción, el ligando I¡ y el ligando Mm pueden ser iguales o diferentes entre sí); una partícula metálica li que comprende un ligando I'i que se une específicamente al ligando li, en donde la partícula metálica li se une al menos a uno de los lípidos li a través de la interacción entre los ligandos li y el ligando I'i; una molécula Ai que se une a la superficie de la partícula metálica li y se une específicamente a una porción del material diana; una partícula metálica Mm que comprende un ligando M'm que se une específicamente al lípido Mm, en donde la partícula metálica Mm se une al menos a uno de los lípidos Mm a través de la interacción entre el ligando Mm y el ligando M'm; y una molécula Bm que se une a la superficie de la partícula metálica Mm en la membrana celular artificial y que se une específicamente a otra porción del material diana en el que la molécula A no se une, en donde la serie de partículas metálicas li tienen diferentes longitudes de onda de dispersión plasmónicas una de otra, y la serie de las partículas metálica M^m tienen diferentes longitudes de onda de dispersión plasmónicas una de otra.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para concentrar partículas en un área específica de un canal de fluido, que comprende: preparar una bicapa lipídica soportada en el canal de fluido, en donde la bicapa lipídica soportada comprende un primer lípido unido con un primer ligando, y algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición en la bicapa lipídica soportada; aplicar una primera partícula que comprende un segundo ligando que se une específicamente al primer ligando sobre la bicapa lipídica soportada; y transferir las primeras partículas al área específica del canal de fluido mediante la aplicación de un flujo de líquido en el canal de líquido. Efectos ventajosos

De acuerdo con la membrana celular artificial que incluye una bicapa lipídica soportada que contiene partículas metálicas unidas a esta, la fluidez de las partículas metálicas sobre el lípido puede controlarse por el ajuste del número de ligandos unidos a las partículas metálicas. Por lo tanto, en la membrana celular artificial se introducen moléculas diana para analizar las interacciones entre dos tipos de partículas metálicas que tienen diferente fluidez, de esta manera se registran los movimientos de las partículas metálicas mediante dispersión plasmónica para analizar las interacciones entre las moléculas diana. En este caso, puede realizarse un análisis múltiple para detectar y cuantificar simultáneamente una pluralidad de materiales diana mediante el uso de la membrana celular artificial de la presente invención, longitudes de onda de dispersión plasmónica y una pluralidad de partículas que tienen diferente fluidez.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que ilustra el número promedio de secuencias de ADN biotiniladas sobre sondas de PNP como una función de la fracción molar de la secuencia de anclaje a la SLB. Los valores se obtuvieron mediante el promedio de tres muestras diferentes preparadas independientemente. Se calculó un ajuste lineal con valores experimentales que oscilan entre 0,00125 a 0,0625.

La Figura 2 muestra gráficos que ilustran los efectos de la valencia de la biotina sobre la dinámica de difusión de las sondas de PNP en la SLB.

La Figura 2A muestra los desplazamientos cuadráticos medios de PNP como una función del intervalo de tiempo, y la Figura 2B muestra los coeficientes de difusión promedio de las sondas plasmónicas en la SLB.

La Figura 3 muestra gráficos que ilustran las distribuciones de los coeficientes de difusión al cambiar la valencia de la biotina. En las Figuras 3A a 3D, las valencias de la biotina por sonda son 1 en la Figura 3A, 5 en la Figura 3B, 25 en la Figura 3C y 128 en la Figura 3D.

La Figura 4 muestra fotografías que ilustran las imágenes de las sondas PNP sobre la SLB. La Figura 4A muestra la imagen de microscopio de campo oscuro de I-PNP con una valencia de biotina de 486 sobre la SLB recubierta con STV. La Figura 4B muestra la imagen de microscopio de fluorescencia de STV modificada con Cy3 en la SLB modificada con I-PNP. La barra de escala es de 10 pm.

La Figura 5 muestra los gráficos de las distribuciones de intensidad de dispersión de las agrupaciones de PNP como una función del grado de agrupación. La Figura 5A muestra el resultado de un monómero, la Figura 5B muestra el resultado de un dímero, la Figura 5C muestra el resultado de un trímero, y la Figura 5D muestra el resultado de un tetrámero.

La Figura 6 es una vista esquemática que ilustra las interacciones entre nanopartículas ancladas dinámicamente en la SLB. Específicamente, la Figura 6 muestra la ilustración esquemática de las nanosondas plasmónicas ancladas a la SLB con dos tipos diferentes de sondas (sondas plasmónicas móviles e inmóviles; izquierda), y la formación de agrupaciones bidimensionales inducida por hibridación del ADN diana y acoplamiento plasmónico (derecha).

La Figura 7 es una vista esquemática que ilustra el análisis y la obtención de imágenes in situ con resolución de una nanopartícula individual de nanopartículas ancladas dinámicamente sobre la SLB. Las Figuras 7A y 7B muestran la observación in situ masivamente paralela y el análisis de la nanosonda plasmónica anclada sobre la SLB mediante el uso de la microscopía de campo oscuro con una resolución de nanopartícula individual (barra de escala = 10 pm), y la Figura 7C muestra el análisis basado en las imágenes de microscopio de campo oscuro de la intensidad de dispersión y el espectro de color de una nanosonda plasmónica individual.

La Figura 8 muestra los resultados del control de la dinámica de difusión y el análisis óptico de nanopartículas plasmónicas que interactúan en la SLB. La Figura 8A muestra el control basado en la valencia de la biotina de la movilidad de las nanopartículas (el aumento de la valencia resulta en una menor movilidad). La Figura B muestra las trayectorias de difusión representativas de nanopartículas plasmónicas, y la Figura C muestra la fracción móvil de nanopartículas plasmónicas como una función de la valencia de la biotina.

La Figura 9 muestra el análisis de interacciones inespecíficas de partículas. La Figura 9A muestra las trazas de tiempo y los diagramas de representación de cambio en la intensidad de dispersión para un sitio de sonda plasmónica inmóvil en ausencia de una secuencia de ADN diana, y la Figura 9B muestra los diagramas esquemáticos de este.

La Figura 10A muestra las imágenes microscópicas de campo oscuro de agrupaciones de nanopartículas plasmónicas inducidas por hibridación de ADN diana. Las trayectorias de 15 etapas de las sondas móviles, capturadas dentro de un sitio de sonda inmóvil (círculo punteado blanco) están resaltadas con líneas sólidas blancas, y las flechas rojas indican las posiciones iniciales de cada trayectoria. El intervalo de tiempo para cada etapa de la trayectoria es de 0,188 segundo. La Figura 10B muestra el gráfico de la relación de rojo a verde para las imágenes microscópicas de campo oscuro de las agrupaciones de sondas como una función del número de sondas por agrupación (R2 = 0,970). La Figura 10C muestra las trazas de tiempo representativas de la intensidad de dispersión para el proceso de ensamblaje (arriba) y desensamblaje (abajo) de agrupaciones de nanopartículas.

La Figura 11 muestra fotografías que ilustran el crecimiento de la agrupación a través de la combinación de unión y coalescencia de PNP monomérica entre agrupaciones de PNP en una SLB modificada por pares de M-PNP. La Figura 11A muestra los dos PNP monoméricas acercándose entre sí, la FIG. 11B muestra el solapamiento óptico distante de dos monómeros PNP, la Figura 11C muestra la formación de dímeros de PNP mediada por hibridación de ADN y el consiguiente acoplamiento plasmónico. La Figura 11D muestra el dímero PNP y el trímero PNP acercándose entre sí, y la Figura 11E muestra la coalescencia entre el dímero de PNP y el trímero de PNP.

La Figura 12 muestra los resultados de la obtención de imágenes in situ y el análisis de la cinética de crecimiento de agrupaciones de nanopartículas plasmónicas. La Figura 12A muestra el registro in situ masivamente paralelo del acoplamiento plasmónico inducido por hibridación de ADN de sondas de nanopartículas en una gran superficie de SLB. La imagen de la izquierda se tomó 330 segundos después de la adición de 30 nM de la secuencia de ADN diana. Se muestran las imágenes ampliadas del área de trazos blancos antes (0 segundo) y después (330 segundos) de la adición de la secuencia de ADN diana. La Figura 12B muestra los gráficos de intensidad de dispersión dependientes del tiempo para 10 reacciones de agrupaciones de nanopartículas individuales que se muestran en la imagen microscópica de campo oscuro en la Figura 12A. La intensidad de la dispersión se normalizó con respecto a la intensidad media de las sondas monoméricas. La señal se registró cada 1 segundo durante 330 segundos.

La Figura 13 muestra la cinética de crecimiento de la agrupación de nanopartículas plasmónicas y las imágenes de esta. La Figura 13A muestra la gráfica de la cinética de reacción del crecimiento de la agrupación plasmónica a 30 nM de la secuencia de ADN diana (círculos vacíos). Cada reacción de adición de sonda única se detectó mediante el registro del aumento gradual de la intensidad de dispersión de las agrupaciones en crecimiento (N = 150 partículas). La cinética de formación de agrupaciones se ajustó a un modelo de reacción consecutiva de tres etapas (líneas continuas). La Figura 13B muestra las imágenes de microscopio electrónico de transmisión de nanosondas plasmónicas agrupadas.

La Figura 14 muestra el método de cálculo de factores de impedimento estérico 2D para la adición secuencial de una sonda plasmónica a un dímero para formar un trímero o a un trímero para formar un tetrámero. Las regiones grises representan el posible ángulo de aproximación para la siguiente adición de partículas. En la formación del tetrámero, el factor de impedimento estérico se representa como función de 0, determinado por la posición relativa de la tercera partícula (línea sólida negra en el gráfico de inserción). El promedio de ftri es 0,375 (línea discontinua roja).

La Figura 15 muestra el ensayo cuantitativo de detección de ADN basado en acoplamiento plasmónico en la SLB. La Figura 15A muestra los patrones de calibración de intensidad de dispersión como una función del número de sondas plasmónicas en las agrupaciones (R2 = 0,999). La Figura 15B muestra que la SLB estructurada con PNP modificadas reaccionó con 300 fM de ADN diana durante 4 horas. La Figura 15C muestra el gráfico de los resultados del ensayo de ADN diana como una función de la concentración de ADN (puntos negros). El resultado del ensayo para una secuencia de ADN con un error de apareamiento en una única base se representó con un punto rojo.

La Figura 16 es una vista esquemática que muestra un método para controlar las interacciones entre nanopartículas mediante el ajuste de la movilidad de las nanopartículas metálicas en la SLB estructurada mediante el uso de un líquido.

La Figura 17 muestra la movilidad de las nanopartículas formadas en la SLB de acuerdo con el flujo del líquido. La Figura 17A muestra la trayectoria de movimiento de las nanopartículas de acuerdo con el régimen de flujo líquido, y la Figura 17B muestra la velocidad de arrastre de las nanopartículas de acuerdo con el régimen de flujo del líquido. La Figura 18 muestra la movilidad de las nanopartículas formadas en la SLB. Las Figuras 18A y 18B muestran las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas de oro y nanopartículas de plata que se mueven y se concentran sobre la SLB estructurada por un flujo de líquido, respectivamente.

La Figura 19 muestra el cambio en los espectros de dispersión de nanopartículas metálicas concentradas en la SLB estructurada con nanopartículas de oro mediante un flujo de líquido. La Figura 19A muestra los espectros de dispersión de nanopartículas metálicas bajo diversas concentraciones de sal (NaCl), la Figura 19B muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas metálicas, y la Figura 19C muestra los cambios en los máximos de dispersión plasmónica y los potenciales zeta.

La Figura 20 muestra el cambio en los espectros de dispersión de nanopartículas metálicas concentradas en la SLB estructurada con nanopartículas de plata mediante un flujo de líquido. La Figura 20A muestra los espectros de dispersión de nanopartículas metálicas bajo diversas concentraciones de sal (NaCl), la Figura 20B muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas metálicas, y la FIG. 20C muestra los cambios en los máximos de dispersión plasmónica y los potenciales zeta.

La Figura 21 es una vista esquemática que ilustra un método para analizar el mecanismo de transferencia de señales de las células mediante el uso de una plataforma de interfaz celular basada en una membrana celular artificial anclada a nanopartículas.

La Figura 22 muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro y microscopio electrónico de nanopartículas fabricadas respectivamente en diferentes tamaños y diferentes formas para exhibir diferentes colores, y los espectros de absorción/dispersión de estas.

La Figura 23A muestra las nueve combinaciones de partículas metálicas de tres colores fabricadas para fijarse sobre la bicapa lipídica soportada o moverse libremente mediante el ajuste de las valencias, respectivamente.

La Figura 23B muestra los pares de partículas unidas no específicamente a las moléculas diana respectivas seleccionadas entre partículas metálicas fijas de tres colores y partículas metálicas de tres colores que se mueven libremente para la detección simultánea de nueve tipos de miARN.

La Figura 23C muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de partículas metálicas de tres colores en diferentes momentos (0 minutos y 60 minutos), como un ejemplo de análisis múltiple mediante el uso de las partículas metálicas de tres colores.

La Figura 23D es un gráfico que muestra las valencias acumuladas de cada material diana con respecto al tiempo a través de la detección simultánea de nueve tipos de miARN.

La Figura 24A muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas rojas fijas y nanopartículas rojas móviles que interactúan con las nanopartículas rojas fijas, y el cambio en la intensidad de los espectros de dispersión plasmónica de tres colores en la posición de las nanopartículas rojas fijas con respecto al tiempo.

La Figura 24B muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas verdes fijas y una o más nanopartículas rojas móviles que interactúan con las nanopartículas verdes fijas, y el cambio en la intensidad de los espectros de dispersión plasmónica de tres colores en la posición de las nanopartículas verdes fijas con respecto al tiempo.

La Figura 24C muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas azules fijas y una o más nanopartículas rojas móviles que interactúan con las nanopartículas azules fijas, y el cambio en la intensidad de los espectros de dispersión plasmónica de tres colores en la posición de las nanopartículas azules fijas con respecto al tiempo.

La Figura 25A muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas rojas fijas y una o más nanopartículas verdes móviles que interactúan con las nanopartículas rojas fijas, y el cambio en la intensidad de los espectros de dispersión plasmónica de tres colores en la posición de las nanopartículas rojas fijas con respecto al tiempo.

La Figura 25B muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas verdes fijas y una o más nanopartículas verdes móviles que interactúan con las nanopartículas verdes fijas, y el cambio en la intensidad de los espectros de dispersión plasmónica de tres colores en la posición de las nanopartículas verdes fijas con respecto al tiempo.

La Figura 26A muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas rojas fijas y una o más nanopartículas azules móviles que interactúan con las nanopartículas rojas fijas, y el cambio en la intensidad de los espectros de dispersión plasmónica de tres colores en la posición de las nanopartículas rojas fijas con respecto al tiempo.

La Figura 26B muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas verdes fijas y una o más nanopartículas azules móviles que interactúan con las nanopartículas verdes fijas, y el cambio en la intensidad de los espectros de dispersión plasmónica de tres colores en la posición de las nanopartículas verdes fijas con respecto al tiempo.

La Figura 26C muestra las imágenes de microscopio de campo oscuro de nanopartículas azules fijas y una o más nanopartículas azules móviles que interactúan con las nanopartículas azules fijas, y el cambio en la intensidad de los espectros de dispersión plasmónica de tres colores en la posición de las nanopartículas azules fijas con respecto al tiempo.

La Figura 27 es una vista esquemática que muestra los comportamientos de una pluralidad de partículas que tienen diferentes colores (diferentes longitudes de onda de dispersión plasmónica) y/o que tienen movilidad y el procedimiento de registro de estas mediante el uso de un microscopio de campo oscuro.

La Figura 28 es una vista que muestra un ejemplo (miR-21) de detección de miARN mediante el reconocimiento de secuencia complementaria.

Descripción detallada de la descripción y el mejor modo de la invención

De acuerdo con un aspecto, la presente descripción proporciona una membrana celular artificial, que comprende: un sustrato; y una bicapa lipídica soportada (SLB) dispuesta sobre el sustrato, en donde la bicapa lipídica soportada, dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, comprende un primer lípido unido con un primer ligando, y una primera partícula metálica que comprende un segundo ligando que se une específicamente al primer ligando a una densidad de 100 a 100000/pm2 se une al menos a dos de los primeros lípidos a través de la unión entre el primer ligando y el segundo ligando, a fin de disminuir la movilidad de la primera partícula metálica en la capa lipídica soportada de 0 a 0,5x10-8 cm2/segundo. La movilidad de la primera partícula metálica en la capa lipídica soportada puede reducirse de 0 a 0,1x10-8 cm2/s segundo, y con mayor preferencia de 0 a 0,01x10-8 cm2/s segundo, que no puede detectarse con un microscopio. Cuando la movilidad de esta es 0, los lípidos se detienen por completo.

Como se usa en la presente descripción, el término "sustrato", que es un soporte que puede soportar una bicapa lipídica, puede ser un sustrato sólido que tiene una forma predeterminada. Preferentemente, el sustrato puede ser un sustrato sólido transparente hecho de vidrio, oro, plata, platino o Tiܲ, o puede ser un sustrato sólido transparente hecho de un polímero acrílico, tal como polimetilmetacrilato (PMMA), polietileno (PE), polipropileno (PP), poliestireno (PS), polietersulfona (PES), policicloolefina (PCO), poliuretano o policarbonato (PC). Además, como sustrato, un sustrato recubierto con un agente de recubrimiento que puede hidratarse, tal como celulosa, puede usarse, además, siempre que pueda mantenerse la fluidez de la bicapa lipídica introducida sobre una película de recubrimiento. Como se usa en la presente descripción, el término "capa lipídica soportada" puede ser una bicapa lipídica ensamblada in vitro que rodea una estructura cuasicélula, tal como una membrana celular natural o un núcleo, puede ser un tipo de bicapa lipídica modelo hecha de lípido sintético o natural, y puede anclarse a un sustrato sólido para tener una estabilidad mejorada. Por lo tanto, la capa lipídica soportada puede usarse como una herramienta de caracterización que no puede usarse en una solución a granel. La capa lipídica soportada, a diferencia de una vesícula o membrana celular que se obtienen mediante la combinación de bicapas lipídicas en forma de una célula redonda cerrada, es una estructura plana formada sobre un sustrato sólido. Por lo tanto, solo la superficie superior de la bicapa lipídica se expone a una solución libre. Una configuración de este tipo tiene ventajas y desventajas en relación con el estudio de las bicapas lipídicas. La principal ventaja de la bicapa lipídica soportada es la estabilidad. La bicapa lipídica soportada (SLB) no se daña seriamente incluso cuando se expone a un flujo rápido o vibración. En la bicapa lipídica soportada (SLB), a diferencia de una membrana lipídica negra (BLM), que es otro modelo de bicapa lipídica, la presencia de agujeros no destruye toda la bicapa. Debido a tal estabilidad, los experimentos de SLB pueden realizarse durante varias semanas o varios meses, mientras que los experimentos de BLM se limitan a varias horas. La SLB tiene la ventaja, además, de que no puede usarse para muestras que flotan libremente o puede usarse como una herramienta de caracterización para proporcionar baja resolución.

El ejemplo más obvio de estas ventajas es que pueden usarse técnicas de sondeo mecánicas que requieren la interacción física directa con las muestras. Para obtener imágenes de la separación de fases de los lípidos, la formación de nanoporos que penetran en la membrana que conducen a la adsorción de una molécula de proteína individual y el ensamblaje de la proteína con una precisión subnanométrica sin marcaje con colorante, se usa la microscopía de fuerza atómica (AFM). Recientemente, para detectar directamente las propiedades mecánicas de una única bicapa lipídica, se usa la AFM para realizar espectroscopía de potencia en las proteínas de membrana individuales. Dado que la superficie de una célula o vesícula es relativamente blanda y cambia según el tiempo, el estudio antes mencionado puede ser difícil o imposible sin usar la SLB.

Mientras tanto, incluso en varias espectroscopias de fluorescencia modernas, se requiere una superficie plana con un soporte rígido. Los métodos de campo evanescente, tales como la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y la resonancia de plasmón de superficie (SPR), pueden medir la unión de un analito y las propiedades ópticas de una bicapa con alta sensibilidad, pero solo pueden operarse cuando se sostiene una muestra sobre un sustrato que tiene una función óptica. Los ejemplos de otros métodos aplicables solo a la bicapa soportada incluyen microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia (FLIC) y microscopía de contraste de interferencia de reflexión (RICM).

Generalmente, la SLB no está en contacto directo con la superficie de un sustrato y se separa del sustrato a través de una capa de agua muy fina. El tamaño y las propiedades de la capa de agua dependen del material del sustrato y del tipo de lípido, pero el grosor de la capa de agua es generalmente de aproximadamente 1 nm con respecto a un lípido de ion híbrido soportado en sílice, que es el sistema experimental más usado dado que la capa de agua es muy fina, existe un acoplamiento hidrodinámico extenso entre la bicapa lipídica soportada y el sustrato, y por lo tanto la bicapa lipídica soportada tiene un coeficiente de difusión más bajo que una bicapa lipídica libre. Una parte de los lípidos en la SLB puede estar completamente fija. La fracción de lípidos fijos en la SLB es de 1 % a 5 %.

Generalmente, la "membrana celular artificial" puede ser un sistema que contiene una membrana lipídica para imitar el sistema de membrana celular in vivo en un tubo de ensayo, el sistema se fabrica artificialmente para estudiar los fenómenos relacionados con la membrana celular que ocurren en la superficie de las células in vivo, tales como proteínas de la membrana celular, proteínas que penetran en la membrana e interacciones relacionadas con estas. Los ejemplos de los sistemas modelo que proporcionan la membrana celular artificial incluyen una membrana lipídica negra (BLM), una bicapa lipídica soportada (SLB), una membrana de bicapa lipídica anclada (tBLM), una vesícula, una micela, una bicela y un nanodisco. En particular, la SLB es un medio útil para identificar fenómenos biofísicos de la membrana celular. La SLB puede controlar la movilidad y la actividad debido al cambio de composición química, así como también a variables ambientales, tales como el pH y la temperatura.

Cada uno del primer ligando y el segundo ligando puede seleccionarse de antígenos, anticuerpos, ligandos, receptores, quelatos, ADN, a Rn , aptámeros, moléculas químicas que se unen específicamente entre sí y combinaciones de estos, pero no limitados a estos. Por ejemplo, cuando el primer ligando es un anticuerpo, el segundo ligando puede ser un antígeno específico del anticuerpo. Además, el segundo ligando puede unirse con el primer ligando mediante una reacción inmunitaria en sándwich para formar un complejo anticuerpo-antígenoanticuerpo mediante la combinación de todos los anticuerpos unidos adicionalmente al antígeno con el anticuerpo. Como otro ejemplo, el primer ligando y el segundo ligando pueden ser fragmentos de ADN que tienen secuencias complementarias entre sí, y en este caso, el primer ligando y el segundo ligando pueden unirse entre sí mediante la hibridación de estos fragmentos de ADN.

En particular, la biotina, como primer ligando, se une a otros sitios de unión que no contienen estreptavidina mediante el uso de la biotina como el primer ligando y mediante el uso de un conjugado de biotina y estreptavidina (receptor de biotina) como el segundo ligando.

La primera partícula metálica puede unirse a un lípido mediante unión antígeno-anticuerpo específico, unión ligandoreceptor, hibridación de ADN, quelación, unión covalente, unión electrostática o unión por reacción química, entre el primer ligando en el lípido y el segundo ligando sobre la superficie de una partícula metálica. En este caso, la primera partícula metálica puede incluir la pluralidad de segundos ligandos, y una partícula metálica puede unirse a una pluralidad de partículas lipídicas en dependencia de la densidad. En este caso, el movimiento de una molécula lipídica individual en una membrana lipídica es libre. Sin embargo, en el caso donde la pluralidad de moléculas lipídicas se une a una partícula metálica, el movimiento de esta está relativamente restringido porque la pluralidad de moléculas lipídicas unida a una partícula metálica debe moverse orgánicamente en un plano bidimensional para mover la partícula metálica.

De acuerdo con la presente descripción, a medida que aumenta la valencia por unidad de partícula, el movimiento de las partículas se retarda notablemente. Como resultado, el movimiento de partículas casi no se captura, ya que las partículas están fijas, cuando la valencia llega a 486 (consulte las Figuras 2 y 6).

El método de registro del movimiento de la primera partícula metálica no está particularmente limitado, pero, preferentemente, puede realizarse midiendo la dispersión plasmónica.

Preferentemente, el segundo ligando incluye un grupo tiol y puede estar unido covalentemente a la primera partícula metálica a través del grupo tiol.

La membrana celular artificial de la presente invención se caracteriza porque las partículas metálicas se unen a estas como sondas. Debido a que las partículas metálicas son estables en comparación con las partículas, tales como vesículas compuestas por un polímero o una bicapa lipídica, no se descomponen incluso en condiciones de concentración de sal o pH relativamente bajo o alto para mantener sus formas y propiedades físicas. Además, preferentemente, debido a que las partículas metálicas incluyen partículas metálicas plasmónicas y exhiben dispersión plasmónica, las propias partículas metálicas pueden detectarse sin sondas adicionales y no provocan parpadeo o extinción de manera que pueda realizarse un registro estable durante un largo período de tiempo. Además, debido a que las partículas metálicas pueden formar directamente enlaces covalentes fuertes junto con un grupo funcional, tal como un grupo tiol, pueden proporcionarse ligandos a la superficie de estas mediante el uso de este grupo funcional.

Preferentemente, el primer lípido unido con el primer ligando puede incluirse en una cantidad de 0,05 % en moles a 0,5 % en moles con respecto a la cantidad total de lípidos en la bicapa lipídica soportada. El primer ligando es un sitio en el que se disponen las partículas mediante la unión con el segundo ligando. Cuando la relación entre la cantidad del primer lípido unido con el primer ligando y la cantidad total de lípidos es inferior al 0,05 % en moles, la frecuencia de los primeros ligandos en la superficie del lípido se vuelve baja, es decir, la distancia entre los primeros ligandos aumentan y, por lo tanto, una partícula se une a la pluralidad de primeros ligandos, por lo que es difícil que las partículas estén fijas en la bicapa lipídica. Cuando la relación de estos es superior al 0,5 % en moles, la densidad de los primeros ligandos se vuelve excesivamente alta, se provoca la agregación de las primeras partículas, que incluye los segundos ligandos que se unen específicamente a los primeros ligandos para inhibir el movimiento de las partículas o hacer que el análisis de estos difícil.

Preferentemente, la bicapa lipídica soportada puede incluir, además, un segundo lípido unido con polietilenglicol (PEG) en una cantidad de 1 % en moles a 10 % en moles con respecto a la cantidad total de lípidos. En este caso, el peso molecular promedio del polietilenglicol es preferentemente de 500 a 2000, pero no se limita a esto. Por ejemplo, cuando se usa PEG que tiene un peso molecular relativamente bajo de 2000 o menos, incluso aunque el contenido del segundo lípido unido con PEG aumenta a un nivel de 10 % en moles, que es un contenido algo más alto que el contenido usado para estabilizar una bicapa lipídica, no se produce un efecto de cribado, la capa lipídica se estabiliza físicamente para aumentar la vida útil y la estabilidad de la bicapa lipídica, y la unión inespecífica entre las nanopartículas y entre las nanopartículas y la bicapa lipídica se reduce de manera eficiente para aumentar la fluidez. Sin embargo, cuando el peso molecular de PEG excede el rango anterior o el contenido del segundo lípido excede el rango anterior, el acercamiento de nanopartículas a una membrana lipídica y/o la unión entre el primer ligando y el segundo ligando puede inhibirse porque produce un efecto de cribado, por lo que es preferible que el peso molecular de PEG usado y el contenido del segundo lípido unido con PEG se combinen y se seleccionen de manera apropiada.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo de análisis para examinar la interacción entre la molécula A y la molécula B mediante el uso de una membrana celular artificial, que comprende: la membrana celular artificial, en la que una bicapa lipídica soportada comprende, además, un tercer lípido unido con un tercer ligando que es igual o diferente del primer ligando; la molécula A unida a la superficie de la primera partícula metálica en la membrana celular artificial; una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando que se une específicamente al tercer ligando, en donde la segunda partícula metálica se une al menos a uno de los terceros lípidos a través de la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando, y tiene mayor movilidad en comparación con la de la primera partícula metálica como se define en la reivindicación; y la molécula B unida a la superficie de la segunda partícula metálica en la membrana celular artificial, en donde la segunda partícula metálica que tiene mayor movilidad se acerca a la primera partícula metálica y después se confina a la primera partícula metálica por la interacción entre la molécula A y la molécula B.

El cuarto ligando puede ser igual o diferente del segundo ligando.

Cada una de las moléculas A y la molécula B pueden seleccionarse entre ADN, ARN, antígenos, anticuerpos, ligandos, quelatos, receptores, aptámeros, polímeros, compuestos orgánicos, iones metálicos y polipéptidos.

Por lo tanto, la interacción entre la molécula A y la molécula B a examinar por el dispositivo de análisis de la presente descripción puede ser la unión antígeno-anticuerpo, unión ligando-receptor, unión proteína-proteína, hibridación de ácido nucleico, quelación, unión covalente o unión electrostática. La hibridación de ácidos nucleicos puede incluir las hibridaciones de ADN, ARN, PNA y combinaciones de estos sin limitación.

Las primeras partículas metálicas se fijan sobre la bicapa lipídica soportada mediante la unión con una pluralidad de lípidos, y las segundas partículas metálicas pueden realizar un movimiento Browniano libre bidimensional sobre la bicapa lipídica soportada en ausencia de la interacción entre la molécula A y la molécula B.

Por lo tanto, cuando se genera el estímulo debido a la interacción entre la molécula A de la primera partícula metálica y la molécula B en la segunda partícula metálica, es decir, la fuerza de atracción o fuerza repulsiva entre la primera partícula metálica y las segundas partículas metálicas, la primera partícula metálica puede fijarse y la segunda partícula metálica puede moverse hacia la primera partícula metálica mediante la fuerza de atracción o puede alejarse de la primera partícula metálica mediante la fuerza de repulsión. Por lo tanto, la interacción entre la molécula A y la molécula B puede examinarse mediante la observación del movimiento de la segunda partícula metálica con respecto a la primera partícula metálica fija.

Aún de acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para examinar la interacción entre la molécula A y la molécula B mediante el uso del dispositivo de análisis.

Como se describió anteriormente, en el dispositivo de análisis, la primera partícula metálica está fija en el plano de la bicapa lipídica soportada, y la segunda partícula metálica realiza un movimiento Browniano libre siempre que no se apliquen estímulos adicionales.

Por lo tanto, puede registrarse la posición de la primera partícula metálica y el cambio en la intensidad de dispersión o longitud de onda debido a la primera partícula metálica.

Además, puede registrarse la trayectoria o velocidad del movimiento en tiempo real de la segunda partícula metálica, o el cambio en la intensidad o longitud de onda de la señal debido a la segunda partícula metálica.

Preferentemente, el registro se realiza midiendo la dispersión plasmónica de la primera partícula metálica y/o la segunda partícula metálica. Las nanopartículas que provocan la dispersión plasmónica pueden mejorar la señal de dispersión a través del acoplamiento plasmónico cuando la distancia entre ellas disminuye, y las longitudes de onda de dispersión se desplazan a longitudes de onda largas cuando la distancia entre ellas disminuye aún más dentro de una distancia predeterminada, es decir, una distancia de acoplamiento plasmónico. Por lo tanto, cuando las partículas están lejos unas de otras, la distancia entre las partículas puede medirse a partir de la trayectoria de las partículas, y cuando las partículas están más cerca entre sí dentro de una distancia predeterminada, la distancia entre las partículas puede estimarse a partir de la intensidad y longitud de onda de la señal de dispersión medida. En una modalidad ilustrativa de la presente descripción, se usan nanopartículas de oro marcadas con ADN de secuencia complementaria, y dos o más ADN se unen a una nanopartícula de oro y, por lo tanto, la pluralidad de nanopartículas de oro están más cerca entre sí mediante la hibridación de ADN. Como resultado, el número de nanopartículas de oro unidas entre sí aumenta y, por lo tanto, las nanopartículas de oro crecen en orden de dímeros, trímeros y tetrámeros, de manera que la intensidad de la dispersión aumenta gradualmente y las señales de dispersión continúan durante mucho tiempo. Por el contrario, el aumento de señales se observa mediante interacciones transitorias no específicas, pero las señales correspondientes no continúan ni siquiera durante varios segundos. Por lo tanto, se comprueba que el aumento de señales por interacciones no específicas y el aumento de señales por interacciones específicas se distinguen entre sí (consulte la Figura 6). Además, se determina que, debido a la agregación de las partículas, aumenta la intensidad de la señal y las longitudes de onda de dispersión se convierten en longitudes de onda largas.

Este método se caracteriza porque la densidad de las partículas y la frecuencia de colisión de las partículas aumentan por la aplicación de una fuerza adicional en una dirección predeterminada, de esta manera se mejora la sensibilidad analítica y se acorta el tiempo de detección. En este caso, la fuerza aplicada puede ser un campo magnético, un campo eléctrico o un flujo de líquido, pero no se limita a estos.

Aún de acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un kit de análisis como se define en las reivindicaciones y su uso para determinar la unión entre la molécula A y la molécula B mediante la determinación de la distancia entre una primera partícula metálica y una segunda partícula metálica a partir de señales de dispersión plasmónica de la primera partícula metálica unida con la molécula A y segunda partícula metálica unida con la molécula B sobre una membrana celular artificial, dicho kit comprende: una membrana celular artificial que comprende un sustrato, una bicapa lipídica soportada que se dispone sobre el sustrato y dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, y un primer lípido se une con un primer ligando y un tercer lípido se une con un tercer ligando, que es igual o diferente del primer ligando, como parte de la bicapa lipídica soportada; una primera partícula metálica que comprende un segundo ligando que se une específicamente al primer ligando, en donde la primera partícula metálica puede unirse al menos a uno de los primeros lípidos mediante la interacción entre el primer ligando y el segundo ligando; y una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando que se une específicamente al tercer ligando, en donde la segunda partícula metálica puede unirse al menos a uno de los terceros lípidos mediante la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando.

Como se describió anteriormente, para examinar la interacción entre dos moléculas, es preferible para la conveniencia de la detección que se use un dispositivo de análisis, que se configura de manera que la partícula metálica unida con una molécula de las dos moléculas a analizar se fija en la membrana celular artificial y la otra molécula se una a la partícula metálica que tiene una movilidad relativamente alta. Sin embargo, de acuerdo con las técnicas actuales de detección óptica, dado que pueden registrarse las partículas que se mueven libremente en una bicapa lipídica, la partícula individual puede registrarse, además, incluso aunque estas partículas puedan moverse libremente en la bicapa lipídica porque tanto la molécula A como la molécula B se unen a la partícula metálica que tiene alta movilidad. Por lo tanto, este sistema puede usarse, además, como un kit de análisis para examinar la interacción entre la molécula A y la molécula B. Este kit de análisis puede aplicarse, además, a un sistema de detección de dispersión plasmónica comúnmente conocido.

Aún de acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un kit como se define en las reivindicaciones y su uso para el análisis cualitativo o cuantitativo de un material diana que puede unirse a la molécula A y a la molécula B que se usa para determinar la unión entre la molécula A y la molécula B la molécula B mediante la determinación de la distancia entre una primera partícula metálica y una segunda partícula metálica a partir de las señales de dispersión plasmónica de la primera partícula metálica unida con la molécula A y la segunda partícula metálica unida con la molécula B sobre una membrana celular artificial, que comprende: una membrana celular artificial que comprende un sustrato, una bicapa lipídica soportada que se dispone sobre el sustrato y dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, y un primer lípido unido con un primer ligando y un tercer lípido unido con un tercer ligando, que es igual o diferente del primer ligando, como parte de la bicapa lipídica soportada; una primera partícula metálica que comprende un segundo ligando que se une específicamente al primer ligando, en donde la primera partícula metálica puede unirse al menos a uno de los primeros lípidos mediante la interacción entre el primer ligando y el segundo ligando; la molécula A que se une a la superficie de la primera partícula metálica y que se une específicamente a una porción del material diana; una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando que se une específicamente al tercer ligando, en donde la segunda partícula metálica puede unirse al menos a uno de los terceros lípidos mediante la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando; y la molécula B que se une a la superficie de la segunda partícula metálica en la membrana celular artificial y que se une específicamente a otra porción del material diana en la que la molécula A no se une.

Como se describió anteriormente, cada uno de los materiales diana, la molécula A, la molécula B, el primer ligando y el segundo ligando pueden seleccionarse de antígenos, anticuerpos, ligandos, receptores, quelatos, ADN, ARN, aptámeros, moléculas químicas que se unen específicamente a entre sí, y combinaciones de estos

Aunque no se limita a ello, cuando la valencia se ajusta de manera que la primera partícula metálica se fija sobre la bicapa lipídica soportada y la segunda partícula metálica puede realizar un movimiento Browniano libre bidimensional en la bicapa lipídica soportada a través del material diana en el momento de ausencia de la interacción entre la molécula A y la molécula B, puede rastrearse el movimiento relativo de la segunda partícula metálica a la primera partícula metálica fija para facilitar el registro.

En este caso, las interacciones entre la molécula A y el material diana y entre la molécula B y el material diana en presencia del material diana pueden examinarse midiendo los cambios en la intensidad y/o longitud de onda de una señal de dispersión plasmónica en la posición de la primera partícula metálica, los cambios son causados por la unión entre la molécula A y el material diana y entre la molécula B y el material diana cuando la segunda partícula metálica que tiene alta movilidad se acerca a la primera partícula metálica.

Aún de acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un kit de análisis múltiple como se define en las reivindicaciones para el análisis cualitativo o cuantitativo de materiales diana en la cantidad de imáx x mmáx mediante la medición de dispersión plasmónica (imáx y mmáx son valores máximos de las siguientes variables i y m, respectivamente, y son cada una independientemente un número entero de 1 o más, pero no imáx = mmáx = 1), que comprende: una membrana celular artificial que comprende un sustrato, una bicapa lipídica soportada que se dispone sobre el sustrato y dentro del cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, y un lípido Ii unido con un ligando Ii y un lípido Mm unido con un ligando Mm (en la presente descripción, el ligando Ii y el ligando Mm pueden ser iguales o diferentes entre sí); una partícula metálica Ii que comprende un ligando I'i que se une específicamente al ligando Ii, en donde la partícula metálica Ii se une al menos a uno de los lípidos Ii a través de la interacción entre los ligandos Ii y el ligando I'i; una molécula Ai que se une a la superficie de la partícula metálica Ii y se une específicamente a una porción del material diana; una partícula metálica Mm que comprende un ligando M'm que se une específicamente al lípido Mm, en donde la partícula metálica Mm se une al menos a uno de los lípidos Mm a través de la interacción entre el ligando Mm y el ligando M'm; y una molécula Bm que se une a la superficie de la partícula metálica Mm en la membrana celular artificial y que se une específicamente a otra porción del material diana en el que la molécula A no se une, en donde la serie de partículas metálicas Ii tiene diferentes longitudes de onda de dispersión plasmónicas una de otra, y la serie de las partículas metálicas M^m tienen diferentes longitudes de onda de dispersión plasmónicas una de otra.

En particular, se prepararon nanopartículas de oro/plata que tienen diferentes colores, es decir, colores rojo, verde y azul, y se proporcionaron ADN que tienen una secuencia de captura y una secuencia complementaria y se adhirieron a una bicapa lipídica a la superficie de las nanopartículas de oro/plata a una velocidad predeterminada para controlar la valencia con la bicapa lipídica, de esta manera se proporcionan seis tipos de partículas metálicas diferentes, es decir, partículas metálicas fijas en la bicapa lipídica y partículas metálicas que se mueven libremente sobre la bicapa lipídica. Además, los ADN de secuencia complementaria que pueden unirse a algunos de los nueve tipos de miARNa, que se usan como materiales diana, se proporcionaron a la superficie de las nanopartículas de oro/plata (consulte la Figura 23B, la Figura 28 y la Tabla 3). En este caso, por conveniencia del registro, las secuencias de ADN se combinaron de manera que cada uno de los materiales diana se une a una partícula metálica fija en la bicapa lipídica y otra partícula metálica que se mueve libremente sobre la bicapa lipídica. Por ejemplo, la dispersión plasmónica de una partícula metálica roja fija en la bicapa lipídica, la trayectoria de otra partícula metálica que se acerca a esta partícula metálica roja en dependencia del tiempo y de la intensidad de la dispersión plasmónica en tres longitudes de onda de color se registran para identificar la longitud de onda, la intensidad de la cual se aumenta de acuerdo al acercamiento de otra partícula metálica, entre las tres longitudes de onda de color para identificar el tipo de otra partícula metálica, y el número de otras partículas metálicas unidas a una partícula metálica roja fija se determina midiendo el aumento de la intensidad. Es decir, puede determinarse que el patrón de dispersión plasmónica de la partícula metálica roja fija es diferente al de tres tipos de partículas metálicas que pueden moverse libremente sobre la bicapa lipídica que pueden unirse a la partícula metálica roja mediante el registro de la posición de la partícula metálica roja fija (consulte las Figuras 24A, 25A y 26A). Este resultado se obtiene de manera similar en el caso de usar partículas metálicas verdes fijas y partículas metálicas azules fijas (consulte las Figuras 24 a 26B y 26C), y la combinación de estas provoca diferentes cambios de dispersión plasmónica (consulte la Figura 23D). Por lo tanto, puede determinarse que una pluralidad de materiales diana pueden analizarse simultáneamente cualitativa y cuantitativamente mediante el uso de una pluralidad de partículas metálicas que tienen diferente movilidad y/o longitudes de onda de dispersión plasmónica.

Aún de acuerdo con otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para concentrar partículas en un área específica de un canal de líquido, que comprende: preparar una bicapa lipídica soportada en el canal de líquido, en donde la bicapa lipídica soportada comprende un primer lípido unido con un primer ligando y algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición en la bicapa lipídica soportada; aplicar una primera partícula que comprende un segundo ligando que se une específicamente al primer ligando sobre la bicapa lipídica soportada; y transferir las primeras partículas al área específica del canal de líquido mediante la aplicación un flujo de líquido en el canal de líquido.

Si es necesario, como primeras partículas, pueden usarse partículas unidas con genes o proteínas.

Cuando se aplica un flujo de líquido al canal de líquido que incluye la capa lipídica soportada, que incluye las partículas unidas a un lípido a través de la unión del ligando, las partículas pueden realizar un movimiento Browniano libre sobre la bicapa lipídica soportada y, por lo tanto, las partículas se mueven a lo largo de la dirección del flujo del líquido para concentrarse en una porción específica. Convencionalmente, como método para concentrar las partículas dispuestas sobre la bicapa lipídica, se han usado métodos para aplicar un estímulo, tal como un campo eléctrico. Sin embargo, cuando se aplica un campo eléctrico, a medida que aumenta el tiempo de exposición, las proteínas o los genes unidos a las partículas pueden desnaturalizarse, o la propia bicapa lipídica puede destruirse y, por lo tanto, pueden cambiarse las condiciones experimentales, tales como el pH, la temperatura y la generación de burbujas de aire. Sin embargo, cuando se usa el flujo de líquido de acuerdo con la presente descripción, pueden superarse las desventajas anteriores.

En particular, se proporciona un canal de flujo sobre un sustrato, y se forman orificios en ambos lados de un vidrio deslizante superior para permitir que el líquido fluya en una dirección predeterminada. La bicapa lipídica unida con nanopartículas de oro o plata de acuerdo con la presente descripción se forma en el canal de flujo, y el movimiento de las nanopartículas metálicas se registra mientras se ajusta la velocidad de flujo del líquido. Las nanopartículas metálicas se mueven y se difunden libremente antes de que se aplique el flujo de líquido, pero estas nanopartículas metálicas comienzan a moverse en la misma dirección que el flujo de líquido mientras se aplica el flujo de líquido, y el movimiento de las nanopartículas metálicas se acelera con el aumento en el flujo de líquido. Además, a medida que las nanopartículas metálicas se mueven en una dirección, la densidad de las nanopartículas metálicas en el área específica aumenta y las longitudes de onda de dispersión se desplazan por acoplamiento plasmónico (consulte las Figuras 11 y 12).

Modo de invención y descripción

En lo adelante, la presente descripción e invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se exponen para ilustrar la presente descripción e invención, y el alcance de la presente invención no se limita a estos.

Ejemplo 1: Materiales

1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinil) sal de sodio (DOPE biotinilado), y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilen glicol)-1000] sal de amonio (PEG-DOPE) se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, Ee . UU.). La estreptavidina modificada con Cy3 (STV) se adquirió de Molecular Probes (Eugene, OR, EE.UU.). El carboximetil polietilenglicol (PM 5000) se adquirió de Laysan Bio Inc. (Arab, AL, EE. UU.). La albúmina de suero bovino (BSA), el dodecilsulfato de sodio (SDS) y el ditiotreitol (DTT) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Se preparó una solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,15 M mediante la disolución de NaH2PO4, Na2HPO4, y NaCl (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) en agua desionizada (agua DI), lo que produjo una solución tampón de fosfato 10 mM con NaCl 150 mM (pH 7,4). Además, se preparó PBS 0,025 M para contener NaCl 25 mM con los mismos reactivos. En todos los experimentos se usó agua nanopura con la resistencia mínima (>18 MQ/cm). Para la preparación de vesículas (extrusión de vesículas) se usaron filtros de policarbonato (PC) (Whatman, Fisher Scientific) con un diámetro de poro de 100 nm. Los disolventes orgánicos tales como el cloroformo, la acetona y el etanol se adquirieron de Duksan Pure Chemicals Co. Ltd. (Gyeonggi-do, Corea del Sur). El ácido sulfúrico y el peróxido de hidrógeno se adquirieron de Daejung Chemicals & Metals Co. Ltd. (Gyeonggi-do, Corea del Sur). Se adquirieron nanopartículas de oro de 50 nm y oligonucleótidos de BBI Life Sciences (Cardiff, Reino Unido) y de Integrated DNA Technology (Coralville, IA, EE. UU.), respectivamente. La secuencia de captura de la diana para I-PNP (PNP inmóvil) es 5'-HS-(CH2)6-PEG6-CTTTGAGCACATCCTTATCAATATT-3' (SEQ ID #1) y la secuencia de anclaje a la SLB para I-PNP es 5'-HS-(CH2)6-PEG6-CTTTGAGCACTGTTAGCGTGTGTGGAATTTTAAT-biotina-3' (SEQ ID #2). La secuencia de captura de la diana para M-PNP (PNP móvil) es 5'-TAACAATAATCCCTCCACGAGTTTC-PEGs-(CH?)3-SH-3' (SEQ ID #3) y la secuencia de anclaje a la SLB para M-PNP (PNP móvil) es 5'-biotina-TAATTTTAAGGTGTGTGCGATTGTCACGAGTTTC-PEG6-(CH2)3-SH-3' (SEQ ID #4). La secuencia de la diana es 5'-GAGGGATTATTGTTAAATATTGATAAG GAT-3' (SEQ ID #5). Las partes subrayadas de las secuencias de captura de la diana se hibridan con la secuencia de ADN diana. Como la secuencia de ADN con error de apareamiento de un único par de base, se usó una secuencia de ADN diana en la que A se sustituye por T. La secuencia de DNS no complementaria fue 5'-CTGATTACTATTGCATCTTCCGTTACAACT-3' (SEQ ID #6).

Ejemplo 2: Preparación de una pequeña vesícula unilaminar (SUV)

Se formó una bicapa lipídica soportada (SLB) sobre un cubreobjetos mediante la difusión de SIV que contiene 97,4 % en moles de DOPC, 0,1 % en moles de DOPE biotinilado y 2,5 % en moles de PEG-DOPE. Se preparó una solución de SUV mediante la disolución de una cantidad apropiada de un lípido en cloroformo. Se evaporó una solución de lípidos en un matraz de fondo redondo de 50 ml mediante el uso de un evaporador rotatorio. Se secó completamente una película lipídica bajo una corriente de N². La mezcla seca se resuspendió en agua DI y se sometió a tres ciclos repetitivos de congelación-descongelación. La concentración total de lípidos fue de 2 mg/ml. La solución se extruyó más de 21 veces a través de una membrana de PC con un diámetro de poro de 100 nm a 25 °C. La solución de ^s U^v resultante se mantuvo a 4 °C hasta su uso.

Ejemplo 3: Funcionalización de nanosondas plasmónicas de oro mediante el uso de ADN y cuantificación de la valencia de la biotina

Los oligonucleótidos tiolados se redujeron mediante incubación con PB 100 mM (pH 8,0) durante 2 horas y se separaron mediante columnas NAP-5 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Para la funcionalización del ^a Dⁿ , se mezclaron 4 pM de oligonucleótidos recién reducidos con AuNP 50 pM de 50 nm y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche. Para I-PNP, la relación molar de la secuencia de anclaje a la SLB a la secuencia de captura de la diana fue 200:600 (fracción molar de la secuencia de anclaje a la SLB: 0,25). Para M-PNP, la relación molar fue 1:799 (fracción molar de la secuencia de anclaje a la SLB: 0,00125). Después, la solución se ajustó para producir 10 mM de tampón fosfato y SDS al 0,1 % (peso/volumen). La solución ajustada se incubó adicionalmente en un agitador orbital durante 30 minutos y se añadieron seis alícuotas de NaCl 2 M en incrementos de 0,05 M para obtener una concentración final de NaCl de 0,3 M. Después de cada adición de NaCl 2 M, la solución se calentó a 55 °C durante 10 minutos y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de ADN-AuNP se dejó reposar durante la noche a temperatura ambiente y después la solución se centrifugó (4500 rpm, 10 min). Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se dispersó nuevamente en agua DI (este procedimiento se repitió tres veces). La solución de AuNP funcionalizada con ADN se mantuvo a 4 °C hasta su uso. Para la cuantificación del número de secuencias de anclaje a la SLB por AuNP, las AuNP modificadas con oligonucleótidos marcadas con Cy3 se disolvieron con una solución de KCN 30 mM. Además, la medición de la intensidad de emisión de fluorescencia de Cy3 se realizó en un espectrómetro Acton (Spectra Pro, MA, EE. UU.) con una lámpara Xe (500 W) como fuente de excitación.

Ejemplo 4: Preparación de SLB y nanopartículas plasmónicas de oro ancladas a la SLB

La preparación de SLB y Au PNP ancladas a la SLB se realizó en una cámara de flujo de vidrio. La cámara de flujo de vidrio consta de sustratos de vidrio superior e inferior que están separados entre sí por un espaciador termoplástico de 100 pm de espesor. Se perforaron orificios de entrada y salida en ambos extremos del sustrato de vidrio superior. La lámina de vidrio superior se trató previamente con 10 mg/ml de BSA en BPS 0,15 M durante 1 hora para hacerlo inerte a la deposición de SLB. El cubreobjetos inferior se limpió mediante sonicación durante 10 minutos en cloroformo, acetona y etanol. Después de la sonicación, el cubreobjetos se lavó con agua DI y se secó mediante una corriente de N². A continuación, el cubreobjetos inferior se trató previamente con NaOH 1 M durante 1 hora y después se lavó completamente con agua DI. Los sustratos de vidrio se ensamblaron con un espaciador termoplástico intercalado calentando a 120 °C en una placa calefactora digital. La solución de SUV preparada se mezcló 1:1 v/v con PBS 0,15 M y se introdujo en la cámara de flujo de vidrio a través del puerto de entrada. Se requirieron aproximadamente 70 pl de la solución de SUV para llenar el canal de flujo. Después de 45 minutos de incubación a 25 °C, las SUV en exceso y no fusionadas se lavaron con 200 pl de agua DI dos veces. Se hizo reaccionar STV 1 nM en una solución de PBS 0,15 M con SLB biotinilada durante 1 hora después de sustituir el agua DI en el canal de flujo con PBS. La STV sin reaccionar se lavó con PBS 0,15 M, y después el canal de flujo se llenó con PBS 0,025 M. A continuación, se introdujeron 2 pM de sondas de I-PNP y 15 pM de M-PNP y se hicieron reaccionar durante 10 minutos. Las PNP no unidas se eliminaron y los sitios de unión de STV sin reaccionar se inactivaron mediante el lavado con PBS 0,025 M que contenía 1 pM de biotinas libres. Después de 15 minutos, el tampón se cambió a PBS 0,15 M. Típicamente, este procedimiento resultó en I-PNP y M-PNP ancladas a la SLB en una proporción de 1:3.

4.1. Control y cuantificación de la valencia de la biotina por nanopartícula de oro

En primer lugar, los presentes inventores controlaron la difusión de las nanopartículas plasmónicas (PNP) ancladas a lípidos mediante el cambio de la valencia de la biotina de las PNP. A partir de esto, se determinó que el número de ligandos por partícula tiene un efecto significativo sobre la movilidad lateral de las nanopartículas en una membrana lipídica. Los presentes inventores ajustaron la valencia de las moléculas de biotina en las AuNP durante la etapa de funcionalización del ADN variando las relaciones molares entre la secuencia de ADN de captura de la diana y la secuencia de ADN de anclaje a la SLB. Este método de control estequiométrico produjo resultados altamente reproducibles. El número de secuencias de anclaje a la SLB por PNP se estimó midiendo la intensidad de emisión de fluorescencia de las moléculas Cy3 que se modificaron a secuencias del anclaje a la SLB después de disolver las AuNP con una solución de KCN. La valencia promedio de la biotina aumentó linealmente de 0,57 a 128 a medida que aumentaba la cantidad añadida de enlazador de ADN de anclaje a la SLB (consulte la Figura 1 y la Tabla 1). Las sondas de PNP preparadas se anclaron a la superficie de la SLB a través de interacciones biotina-estreptavidina. Se consideró que las sondas de PNP sobre una SLB con una valencia de biotina de 0,57 tenían una biotina porque las PNP sin biotina no podían unirse a la SLB y podían eliminarse completamente de la superficie por lavado.

Tabla 1

4.2. Efectos de la valencia de la biotina sobre la cinética de difusión de las sondas de PNP sobre la SLB

Los movimientos laterales de las sondas de PNP ancladas a la SLB se observaron con una resolución de nanopartícula única mediante el uso del microscopio de campo oscuro, y sus trayectorias individuales se analizaron mediante un programa de análisis de imágenes (programa informático ImageJ; los experimentos detallados y los métodos de análisis se describirán más adelante). Los valores de desplazamiento cuadrático medio (MSD) como una función del tiempo de las sondas de PNP ancladas a la SLB con diferentes valencias de la biotina se muestran en la Figura 2A. Las PNP multivalentes mostraron una tendencia a difundirse mucho más lentamente y viajar una distancia más corta en comparación con las PNP paucivalentes. La PNP con 486 biotinas estaba casi inmóvil y se mantuvo casi en la misma posición. Los gráficos de MSD de estas trayectorias, excepto en el caso que incluye las 486 biotinas, muestran claramente las relaciones lineales entre el MSD y el intervalo de tiempo, lo que sugiere que estas nanopartículas están en un movimiento Browniano 2D aleatorio en la superficie de la SLB. Para calcular los coeficientes de difusión de las sondas PNP, los presentes inventores analizaron 100 trayectorias de partículas para cada valencia de biotina y las correspondientes gráficas de MSD se ajustaron a la siguiente ecuación: <r2>=4Dt, donde <r2> es el MSD, D es el coeficiente de difusión y t es el intervalo de tiempo. El valor promedio de los coeficientes de difusión se estimó en 1,79±0,87x10-8, 0,72±0,35x10-8, 0,38±0,29x10-8, y 0,18±0,14x10-8 cm2/s para valencias de la biotina de 1, 5, 28 y 128, respectivamente (Figura 2B). Las distribuciones de los valores D calculados se representaron en la Figura 3, y estos valores son consistentes con otros resultados de la literatura donde las SLB se modificaron con AuNP de 30 a 50 nm para la visualización del movimiento de los lípidos. A medida que las PNP se volvieron más multivalentes, la fracción móvil se redujo más y la mayoría de las partículas estaban prácticamente inmóviles cuando la valencia de la biotina alcanzó 486. Los presentes inventores observaron y correlacionaron una imagen de microscopio de campo oscuro de PNP multivalentes y una imagen de microscopio de fluorescencia de STV modificadas con Cy3 en la SLB para demostrar que la posición de las PNP coincide con la posición de las STV concentradas localmente. Los resultados muestran que las dos imágenes están bien apareadas entre sí, lo que sugiere que la acumulación local de STV bajo la PNP multivalente es responsable de la pérdida de movilidad de las partículas (Figura 4).

4.3. Ensayo de estabilidad óptica de nanopartículas de oro

La dispersión de la luz resonante de las nanopartículas metálicas tiene un origen físico diferente al de la fluorescencia de los tintes orgánicos. La amortiguación radiativa del plasmón superficial localizado crea fotones dispersos, y este proceso está libre de parpadeo y fotoblanqueo. Para evaluar la fotoestabilidad de las PNP, las AuNP de 50 nm en la SLB se expusieron continuamente a iluminación de microscopía de campo oscuro durante 30 minutos y la intensidad de dispersión se registró cada 6 segundos (Figura 5). Las partículas continuaron brillando sin cambios en la intensidad durante todo el tiempo experimental. Esto indica que las AuNP son marcadores ópticos más robustos para el estudio óptico en tiempo real que los tintes de fluorescencia que pierden sustancialmente sus señales en unos pocos minutos incluso cuando se emplean varios tintes para el seguimiento de una partícula individual.

4.4. Imágenes in situ con resolución de nanopartículas individuales y análisis de nanopartículas ancladas a la SLB

Las PNP están ancladas dinámicamente a una SLB fluídica, y el comportamiento dinámico de PNP se ajustó mediante el control de la valencia de las partículas. Después, se analizó la dinámica de crecimiento de las agrupaciones de partículas inducida por hibridación de ADN in situ con resolución de nivel de partícula individual, y el análisis cuantitativo en esta plataforma se realizó mediante el uso del acoplamiento plasmónico en tiempo real entre las PNP que interactúan (Figuras 6 y 7). Las interacciones de múltiples sitios de reacción de partículas se registraron y se analizaron simultáneamente, se realizaron los estudios cinéticos para la formación de agrupaciones de nanopartículas diméricas, triméricas y tetraméricas, y se mostró un ensayo de detección de ADN multiparalelo basado en el análisis de partículas individuales como una aplicación de este método. Las PNP se usan en este enfoque porque dispersan eficientemente la luz resonante y no son susceptibles al fotoblanqueo y al parpadeo, lo que permite el seguimiento de una nanopartícula individual durante un período prolongado con una buena resolución espacio-temporal (más de 1 hora con una resolución de ~ 1,5 nm y ~ 10 ps). Es importante destacar que los plasmones de nanopartículas de oro o plata individuales (AuNP o AgNP) interactúan entre sí de manera dependiente de la distancia, y esto forma un principio básico que subyace a las mediciones de interacciones moleculares dentro de varias decenas de nanómetros al registrarse el cambio en la intensidad de dispersión o respuesta espectral sin etiquetado adicional. La SLB es una plataforma muy poderosa ya que permite sintetizar y controlar una superficie fluídica 2D sobre sustratos sólidos e incorporar una variedad de especies de membranas con movilidad lateral. Mediante el anclaje de nanopartículas a la SLB, se podrían confinar las nanopartículas en el plano focal 2D de la microscopía óptica para obtener imágenes y rastrear de manera eficiente todas las nanopartículas de interés mientras se preservan los movimientos libres de las nanopartículas debido a la naturaleza fluídica de la SLB. Como las PNP ancladas dispersan resonantemente la luz incidente y siempre viajan sobre la superficie de la bicapa lipídica plana, las trayectorias de difusión 2D y las señales ópticas pueden registrarse in situ mediante el uso de la configuración de microscopía de campo oscuro (Axiovert 200M, Carl Zeiss, Gottingen, Alemania) con una resolución de partícula individual (consulte la Figura 7). Los resultados del campo oscuro demostraron que las PNP ancladas se dispersaron uniformemente por toda la superficie de la membrana 2D y mostraron una excelente movilidad lateral con difusión libre sobre la superficie de la membrana. Este confinamiento dinámico 2D de partículas y el uso de etiquetas PNP permiten facilitar colisiones eficientes entre partículas y la observación y análisis in situ de casi todas las reacciones entre las moléculas sobre las nanopartículas.

Ejemplo 5: Preparación de SLB estructurada

Para el ensayo de ADN, se formó la SLB de 120x120 pm2 en una película de oro estructurada sobre un sustrato de vidrio. Se formó un patrón dorado mediante fotolitografía convencional y un proceso de despegue convencional. La SLB podría depositarse selectivamente sobre la superficie del vidrio expuesta por la introducción de una solución de SUV porque la superficie del oro es inerte a la formación de la SLB. Después de la formación de la SLB, la superficie del oro se pasivó con 2 mg/ml de BSA y 10 pm de carboximetil polietilenglicol disuelto en PBS para suprimir la unión no específica de PNP y ADN diana. Después, las PNP se anclaron para el uso de experimentos de ensayo de ADN.

Ejemplo 6: Observación in situ basada en microscopía de campo oscuro de sondas de PNP y análisis óptico de estas

El movimiento y el acoplamiento plasmónico de las sondas de PNP ancladas a la SLB se observaron mediante microscopía de campo oscuro (Axiovert 200M, Carl Zeiss, Gottingen, Alemania) provista de una lente objetiva de 40x (NA 0,6). Todos los procedimientos de análisis de imágenes se realizaron con el programa informático ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Para el rastreo y análisis de la trayectoria de las sondas de PNP individuales ancladas a la SLB, se usó el complemento MOSAIC (http://www.mosaic.ethz.ch/Downloads/ParticleTracker). La intensidad de dispersión y los espectros de color RGB se midieron mediante la medición de intensidad básica y las funciones de división de intensidad de color RGB del programa informático ImageJ, respectivamente. La STV modificada con Cy3 se observó mediante microscopía de epifluorescencia (TE-2000, Nikon, Tokio, Japón) provista con una lente 60x (Na 1,49) bajo excitación láser de 532 nm.

6.1. Ensayo de imágenes de alta resolución de partículas que interactúan

Otro aspecto importante del ensayo de imágenes de alta resolución es un método de observación estable y confiable de partículas que interactúan. Para facilitar esto, se diseñaron, prepararon y anclaron a la superficie de la SLB dos tipos de nanopartículas plasmónicas modificadas con ADN (ADN-PNP) con diferencia significativa en la movilidad lateral, sondas PNP altamente móviles y casi inmóviles (M-PNP e I-PNP), respectivamente (consulte la Figura 6). La señal de dispersión de un sitio I-PNP fijo se registró y se analizó de manera estable, y las M-PNP se difundieron en un sitio I-PNP para inducir un cambio en la señal de dispersión basada en acoplamiento plasmónico. Las sondas de I-PNP y M-PNP se prepararon por separado con ADN modificado con 5'-tiol y ADN modificado con 3'-tiol, respectivamente. Se usaron dos secuencias de ADN tiolado diferentes (secuencia de captura de la diana y secuencia de anclaje a la SLB) para la funcionalización de cada sonda de PNP. La secuencia de anclaje a la SLB posee un grupo biotina en el extremo opuesto al tiol y forma un enlace estable con la SLB modificada con estreptavidina. La movilidad de las sondas de PNP se controló mediante la valencia de la biotina de una sonda con una fracción molar diferente de la secuencia de unión de SLB en el procedimiento de modificación del ADN. A medida que las PNP se volvieron más multivalentes, los coeficientes de difusión y las fracciones móviles se redujeron aún más, y todas las partículas estaban virtualmente inmóviles cuando la valencia de la biotina alcanzó 486, que se obtiene con una fracción molar de 0,15625 de la secuencia de anclaje a la SLB (consulte la Figura 8). Para las sondas de M-PNP, aquí, se añadió una fracción molar de 0,00125 de la secuencia de anclaje a la SLB para producir 1 valencia de la biotina. La sonda de M-PNP es paucivalente y puede difundir mucho más libremente a través del movimiento Browniano 2D aleatorio. Por otro lado, las sondas de I-PNP multivalentes están casi completamente inmovilizadas en la superficie de la membrana. La intensidad de la dispersión se analizó con el programa informático ImageJ promediando un área circular centrada en el sitio I-PNP con un radio de 500 nm, que es similar a la resolución óptica, d, de la configuración de microscopía que se usó en este estudio (d=A/2NA; A es la longitud de onda de dispersión resonante de 50 nm AuNP, 530 nm; NA es la apertura numérica de una lente de objetivo de 40x, 0,6).

Como las sondas de M-PNP e I-PNP se anclaron a los lípidos biotinilados en la SLB a través de enlazadores de estreptavidina, la posición local y el movimiento de los lípidos conjugados con PNP podrían rastrearse fácilmente con una señal de dispersión de luz resonante en el microscopio de campo oscuro. En ausencia de ADN diana de enlace a la partícula, las sondas de M-PNP pueden acercarse a un sitio I-PNP fijo y estas sondas podrían solaparse temporalmente en la microscopía de campo oscuro. En consecuencia, la intensidad de dispersión de un sitio de I-PNP era inicialmente constante, pero fluctuaba a medida que una M-PNP entraba dentro del límite de difracción óptica (consulte la Figura 9). Curiosamente, se observaron dos tipos de aumentos bruscos transitorios en la señal. En un caso, que fue más frecuente, la intensidad de la dispersión fue aproximadamente el doble del valor inicial. Esto puede atribuirse al solapamiento óptico distante, donde dos PNP residen dentro de la resolución óptica pero no están lo suficientemente cerca entre sí como para causar acoplamiento plasmónico (Figura 9B-i). En el otro caso, se observó un aumento de aproximadamente 3,5 veces en la intensidad de dispersión, y esta alta mejora se originó a partir de la interacción de campo cercano entre dos PNP acopladas plasmónicamente (Figura 9B-ii). Cabe señalar que la mayoría de estos cambios de señal duraron menos de 0,5 segundos debido a la ausencia de interacciones específicas entre partículas. La proximidad intermolecular temporal entre los lípidos se percibió a una escala de longitud de subdifracción por acoplamiento plasmónico. Nuestra estrategia y resultados sugieren que pueden registrarse las interacciones intermoleculares que causan el acercamiento y el acoplamiento plasmónico entre las sondas de PNP. En el siguiente conjunto de experimentos, observamos eventos de hibridación y deshibridación de ADN in situ que desencadenaron el ensamblaje y desensamblaje de las sondas de PNP modificadas con ADN en la SLB y registramos el cambio correspondiente en la intensidad de dispersión a una resolución de una única nanopartícula en tiempo real. En presencia de la secuencia de ADN diana, las M-PNP paucivalentes se capturaron por una I-PNP multivalente y formaron una agrupación de múltiples partículas en donde una I-PNP se fijó y se registró como un centro de rastreo. En la imagen microscópica de campo oscuro, el proceso de ensamblaje se resolvió con éxito para observar eventos de adición de nanopartículas individuales. Se observaron los crecimientos de agrupaciones de PNP partícula por partícula desde el monómero hasta el tetrámero y las trayectorias de las sondas M-PNP que se capturaron se resaltan con líneas continuas blancas (consulte la Figura 10A). A medida que evolucionaron las agrupaciones, observamos un cambio repentino tanto en la intensidad de dispersión como en el color en cada etapa de adición de M-PNP a un sitio de I-PNP. Los cambios en la eficiencia de dispersión y la longitud de onda de resonancia surgieron del acoplamiento plasmónico en las AuNP agrupadas. A una concentración de ADN diana de 3 nM, la reacción finalizó en 15 minutos y se consumieron muchas sondas monoméricas M-PNP para formar las agrupaciones. El crecimiento de la agrupación generalmente estaba restringido a un tetrámero y apenas se observó un crecimiento adicional más allá de un tetrámero, porque hay un número limitado de M-PNP y además un gran impedimento estérico entre las cadenas de ADN en las partículas para el ensamblaje de más de 4 partículas en un solo sitio sobre una superficie 2D en este caso. La utilización de I-PNP fijas restringe una vía de crecimiento de la agrupación a la unión de monómero al eliminar eficazmente la coalescencia entre pequeñas agrupaciones que producen agregados 2D irregulares y altera la cuantitatividad (consulte la Figura 11 complementaria para conocer el proceso de coalescencia observado en un par de SLB modificadas con M-PNP). El acoplamiento plasmónico entre las sondas de PNP provocó un desplazamiento hacia el rojo en una longitud de onda de resonancia y, por lo tanto, las AuNP verdes acopladas plasmónicamente se volvieron rojas en la imagen microscópica de campo oscuro. El cambio de color plasmónico se analizó dividiendo los canales RGB (Figura 7). A medida que la agrupación creció, las señales verde y roja aumentaron mientras que la señal azul se mantuvo constante. En base a estos resultados, trazamos un gráfico de relación de verde a rojo y se observó un aumento lineal en la relación a medida que aumentaba el número de partículas agrupadas (Figura 10B). El estándar de calibración de color debe ser prácticamente útil para definir y cuantificar con precisión el estado de las interacciones entre partículas y para diferenciar los acoplamientos plasmónicos basados en interacciones específicas de los solapamientos ópticos no específicos. Es importante destacar que la adición partícula por partícula de sondas de M-PNP a un sitio de I-PNP mediante el reconocimiento del a Dn diana y la hibridación se mostró y cuantificó en la traza temporal de la intensidad de dispersión (gráfico superior en la Figura 10C). Los resultados muestran que la intensidad de la señal de dispersión se incrementó de manera escalonada cuando se añadió cada M-PNP a una sonda de I-PNP para formar secuencialmente un dímero, un trímero y un tetrámero. Cuando se sustituyó una solución de PBS con alto contenido de sal (167 mM Na+) por una solución de PB con bajo contenido de sal que contenía mucha menos sal (17 mM Na+), el ADN diana se deshibridó y las M-PNP se disociaron de las sondas I-PNP y difundieron libremente sobre la superficie de la SLB nuevamente, lo que dio lugar a una serie de disminuciones escalonadas en la intensidad de la dispersión (gráfico inferior en la Figura 10C). Cabe señalar que la intensidad de la señal de dispersión experimentó múltiples cambios escalonados para cada etapa de adición de sonda y permaneció constante hasta que se añadió o liberó la siguiente partícula.

6.2. Análisis de la cinética de crecimiento de las agrupaciones

La cinética de crecimiento de la agrupación desde monómero a tetrámero se ajustó a las reacciones consecutivas de primer orden de tres etapas asumiendo que las M-PNP están presentes en exceso en comparación con las I-PNP:

Monómero (M ) — —----- ► Dímero ( D ) ----- —-----► Trímero (Tr) ------— ► Tetrámero (Tt)

(a) Las formas diferenciales para las tasas de cambio de cada especie son las siguientes.

Resolver estas ecuaciones diferenciales produce soluciones para describir las concentraciones dependientes del tiempo de cada especie:

[M ]= [M ]0e (0

fi)

Donde una concentración inicial de monómero de I-PNP [M^]0 es 150, que es el número de partículas analizadas aquí. Los valores de la constante de velocidad de k¹, k² y k³ se evaluaron ajustando los datos cinéticos mediante el uso de estas ecuaciones.

Las observaciones in situ altamente paralelas de múltiples interacciones se realizaron mediante el análisis simultáneo del acoplamiento plasmónico individual de las sondas PNP sobre una gran área superficial (típicamente ~ 30000 pm2; Figura 12A). Los resultados del análisis de crecimiento de agrupaciones de partículas paralelas in situ durante un tiempo de observación de 330 segundos (tiempo de exposición de 80 milisegundos e intervalo de tiempo de 1 segundo) de acuerdo con la presente invención muestran que, aunque se observó típicamente un crecimiento secuencial de agrupaciones de partículas por partícula (Figuras 12B-i y iv), también se observaron muchos modos de agrupamiento diferentes con diferentes cinéticas de agrupamiento. Algunas sondas formaron solo dímeros y no crecieron más (Figuras 12B-ii y iii). También hay un caso en el que la agrupación de sondas creció para formar un trímero sin crecer más para formar un tetrámero. De manera interesante, también se observó y se analizó la adición simultánea de dos sondas a una sonda de I-PNP (Figuras 12B-iii y vi) y adiciones consecutivas de dos o tres sondas a una sonda de I-PNP en un período de tiempo muy corto (Figuras 12B-vii, ix y x; consulte los gráficos insertados para estos casos). En la presente invención, basándose en esta capacidad de análisis de resolución de una partícula individual en paralelo in situ, se estudió la cinética de la reacción de formación de agrupaciones inducida por hibridación de ADN. Las intensidades de dispersión de 150 sitios de I-PNP individuales se registraron simultáneamente para este propósito. Las cinéticas de crecimiento de un monómero a un tetrámero (monómero^dímero^trímero^tetrámero) se ajustaron a una reacción consecutiva de tres etapas asumiendo que las M-PNP estaban presentes en exceso en comparación con los monómeros de I-PNP. Se estimó que las constantes de velocidad para las formaciones de dímeros, trímeros y tetrámeros eran k1 = 0,0165, k2 = 0,0116, y k3 = 0,0061 s-1, respectivamente. Este modelo explica la cinética de crecimiento del grupo de nanopartículas en 180 segundos. Este resultado es una evidencia directa de la suposición de que la formación de un trímero a partir de un dímero es un proceso más difícil y más lento que la formación de un dímero a partir de un monómero, y la formación de tetrámeros es el proceso más difícil y lento debido al impedimento estérico entre las sondas de PNP modificadas con ADN. Cuando se tiene en cuenta el factor de impedimento estérico (f), las constantes de velocidad para las formaciones de trímeros y tetrámeros pueden expresarse como k² = fdimk y k3 = ftriki, respectivamente. Los factores estéricos se calcularon a partir de las constantes de velocidad ajustadas (0,7030 para fdim y 0,3697 para ftri). La medición de microscopía electrónica de transmisión muestra que las agrupaciones de PNP se forman en diferentes configuraciones geométricas (Figura 13). Basándose en esta observación, los presentes inventores calcularon geométricamente factores estéricos para la adición del siguiente PNP a un dímero 2D y un trímero 2D (factores de impedimento estérico calculados geométricamente: fdim = 0,6667 y ftri = 0,3750; Figura 14). Estos valores son consistentes con los factores estéricos que se obtienen a partir de las constantes de velocidad ajustadas, lo que sugiere que el modelo de reacción consecutiva de tres etapas describe y explica el crecimiento de agrupaciones 2D de sondas de PNP modificadas con ADN.

Finalmente, los presentes inventores dibujaron los estándares de calibración óptica para el número de partículas que reaccionaron en las agrupaciones y, basándose en esta curva estándar, realizaron una detección de ADN diana y evaluaron la sensibilidad de detección de la plataforma de SLB anclada con PNP. Los gráficos de calibración estándar se obtuvieron mediante el análisis de 30 agrupaciones individuales simultáneamente, y el número de partículas en las agrupaciones se confirmó mediante el análisis y el registro de los eventos de adición de partículas en su totalidad. Para evitar la adición simultánea de múltiples sondas de PNP dentro de la adquisición de un único cuadro, la frecuencia de cuadro se elevó en 5,3 cuadros por segundo en este caso. Los presentes inventores representaron gráficamente el promedio de intensidades de dispersión y encontraron una relación lineal con el número de partículas agrupadas (valor de R2 es 0,999, Figura 15A). Las distribuciones correspondientes se muestran en la Figura 5. Notablemente, los resultados exhibieron desviaciones estándar estrechas y los presentes inventores pueden distinguir claramente los estados agrupados.

6.3. Límite de detección de ADN diana mediante el uso de la interacción con PNP modificadas con ADN complementario ancladas a la SLB

La agrupación de nanopartículas de oro formado por la interacción del ADN diana y la secuencia complementaria de este puede usarse como biosensor para detectar ADN en el caso de cuantificar el grado de formación de la agrupación, porque la intensidad de las señales de dispersión de la agrupación de nanopartículas de oro aumenta claramente y esta agrupación de nanopartículas de oro puede observarse a nivel de una nanopartícula individual. Por lo tanto, dado que la agrupación de nanopartículas de oro se forma en función de la concentración de ADN diana, el intervalo de concentración detectable del ADN diana se determinó mediante el análisis del brillo de las imágenes del microscopio de campo oscuro. La detección de ADN se realizó sobre una SLB estructurada de 120 x 120 pm2 embebida en una película de oro (Figura 15B). Las SLB modificadas con PNP se hicieron reaccionar durante 4 horas con diferentes concentraciones de ADN diana en el intervalo de 300 aM a 300 fM. Todas las muestras, que incluye la muestra de control, contenían 300 fM de una secuencia de ADN no complementaria para validar la selectividad del ensayo de acuerdo con la presente invención. Las PNP formaron solo un dímero sin crecimiento adicional a un trímero y un tetrámero en el intervalo de concentración de ADN diana usado en la presente invención. Los sitios de I-PN^p que representan la intensidad de dispersión de dímeros acoplados (aumento > 3,5 veces; consulte la Figura 15A) se contaron solo como una señal óptica para una secuencia de ADN diana (Figura 15B). Los resultados del ensayo muestran el límite de detección de 30 fM sin procesos de optimización (Figura 15C). Notablemente, también se discriminó claramente una secuencia de ADN con un error de apareamiento de un solo par de bases (Figura 15C).

Una sensibilidad tan alta significa que las M-PNP móviles en la SLB y las I-PNP inmóviles en la SLB se mueven y reaccionan en el plano bidimensional y, por lo tanto, la probabilidad de colisión aumenta para provocar una reacción rápida. En realidad, se observó que se producía una reacción muy lenta e ineficaz cuando las M-PNP se dispersaban en una solución sin ser introducidos en una bicapa lipídica soportada (SLB) y reaccionaban con las I-PNP fijadas en la SLB.

6.4. Ajuste de la distribución de nanopartículas ancladas a la SLB por estímulos externos e inducción de acoplamiento plasmónico

Cuando la valencia de la biotina de las nanopartículas metálicas ancladas a la SLB se ajusta adecuadamente, las nanopartículas metálicas tienen fluidez sobre la SLB. Las nanopartículas metálicas fluídicas conducen un movimiento de difusión bidimensional libre y pueden ajustarse de manera que se muevan sobre la SLB en una dirección deseada por estímulos externos (por ejemplo, campo eléctrico y flujo de líquido). En este caso, la velocidad de movimiento de las nanopartículas metálicas puede ajustarse, además, cambiando la intensidad del campo eléctrico o el régimen de flujo. Como se muestra en la Figura 16, cuando la distribución espacial de las nanopartículas se ajusta en la SLB estructurada, puede aumentarse la densidad de las nanopartículas en una porción específica y puede mejorarse en gran medida la frecuencia de colisión entre las nanopartículas. Por lo tanto, cuando aumenta la interacción entre las nanopartículas sobre la SLB, aumenta la velocidad de reacción y, por lo tanto, se mejora la sensibilidad de un biosensor para acortar el tiempo de detección. Además, la distancia entre las nanopartículas se ajusta para formar una plataforma con el propósito de ajustar el acoplamiento plasmónico.

Específicamente, para ajustar el movimiento de las nanopartículas metálicas introducidas en la plataforma SLM, se proporciona un canal de flujo sobre un sustrato de vidrio. Se forman orificios en ambos lados de un vidrio deslizante superior para introducir una solución tampón para formar un flujo de líquido. Cuando el flujo de líquido se introduce en el canal de flujo de esta manera, las nanopartículas metálicas se mueven en una dirección específica durante el movimiento de difusión bidimensional libre mientras cambian gradualmente la ruta del movimiento. A medida que aumentaba el régimen de flujo, se observó claramente tal tendencia de movimiento (Figuras 17A y 17B). En el caso donde la SLB sea estructurada con cromo (Cr), las nanopartículas metálicas se confinan en una barrera de Cr sin salir de la barrera de Cr (parte inferior derecha de la Figura 16). En este caso, cuando la dirección de movimiento de las nanopartículas metálicas se ajusta en una dirección por un flujo de líquido, puede observarse un fenómeno en el que las nanopartículas metálicas se mueven en la misma dirección que el flujo de líquido para concentrarse (Figuras 18A y 18B). Se encontró que tanto las nanopartículas de oro como las nanopartículas de plata se acumulan en una dirección para exhibir colores de longitudes de onda de resonancia de plasmón de superficie específicas. Además, se observó que, cuando el flujo de líquido cambia en la dirección opuesta, las nanopartículas metálicas acumuladas se mueven en la dirección opuesta para concentrarse.

Cuando la estructura de la SLB se fabrica en un tamaño grande de varios milímetros cuadrados (mm2), puede acumularse una mayor cantidad de nanopartículas metálicas en un solo lugar. Para acumular un mayor número de nanopartículas metálicas, se fabricó una estructura trapezoidal y las nanopartículas metálicas se concentraron a un régimen de flujo de 6 ml/h durante aproximadamente 30 minutos. Se encontró que las nanopartículas metálicas concentradas tienen colores de dispersión plasmónica específicos en los extremos de la estructura trapezoidal. En este caso, las nanopartículas metálicas mantienen un equilibrio por la fuerza del flujo del líquido, interacciones de Van der Waals entre nanopartículas modificadas con ADN, repulsión estérica entre moléculas de ADN y repulsión electrostática. Para reducir la distancia entre las nanopartículas metálicas, en este estudio se aumentó la concentración de NaCl contenida en el líquido. Se encontró que, con el aumento de la concentración de NaCl, la repulsión electrostática entre las nanopartículas metálicas disminuye y, por lo tanto, la distancia entre las nanopartículas metálicas se hace más cercana para inducir el acoplamiento plasmónico. Los espectros de dispersión en este momento se midieron y analizaron (Figuras 19A, 19B, 20A y 20B). El pico máximo de los espectros de dispersión representa el desplazamiento hacia el rojo con el aumento de la concentración de una sal. A partir de los resultados de la medición del potencial zeta de las nanopartículas metálicas, se encontró que la carga superficial de las nanopartículas metálicas disminuye con el aumento de la concentración de una sal y, por lo tanto, la repulsión electrostática entre las nanopartículas metálicas disminuye para disminuir la distancia entre ellas (Figuras 19C y 20C).

6.5. Desarrollo de plataforma de membrana artificial biomimética

La membrana celular, que es una estructura que separa el interior y el exterior de una célula, es una fina bicapa de fosfolípidos compuesta de moléculas de fosfolípidos y proteínas. La membrana celular tiene permeabilidad selectiva y funciona para mantener las funciones celulares y de los tejidos celulares a través de varias proteínas. Así, en la membrana celular se producen diversos fenómenos biológicos para mantener la homeostasis y las funciones esenciales de las células. Por lo tanto, los conocimientos biológicos y citológicos de la membrana celular son muy importantes.

Desde este punto de vista, los comportamientos de las células pueden observarse mediante el uso de la plataforma de SLB descrita en el Ejemplo 6.4., que es una estructura de membrana celular artificial ajustable eléctrica o hidrodinámicamente. Se introduce un material marcador, tal como nanopartículas metálicas, que incluye un biomaterial, en la SLB, que es una membrana artificial, mediante el uso de un método químico o biológico, y se detectan las propiedades ópticas del material marcador, de esta manera se registra el comportamiento de las células. El biomaterial introducido en la SLB puede inducir la transferencia de señales intracelularmente o puede inducir una reacción de modulación fenotípica extracelularmente. Tal observación puede ayudar a identificar nuevos mecanismos biológicos que aún no se han revelado, ya que es similar a una reacción biológica que ocurre en la membrana celular real.

Las nanopartículas metálicas que tienen propiedades ópticas, tales como la resonancia de plasmón, pueden hibridarse en dependencia de la distancia entre la nanopartícula metálica y las partículas metálicas adyacentes. Debido a tales características, estas nanopartículas metálicas exhiben diferentes colores en dependencia de la distancia entre la nanopartícula metálica y las partículas metálicas adyacentes y el grado de agrupamiento de las nanopartículas metálicas en el momento de la observación con un microscopio de campo oscuro. Además, las nanopartículas metálicas pueden observarse a una alta relación señal/ruido (relación S/N) durante un período de tiempo debido a la fuerte dispersión plasmónica. Las respuestas celulares pueden registrarse mediante la introducción de sondas de control celular que generan señales de dispersión Raman mejoradas en la superficie detectables de forma múltiple, así como también señales de dispersión plasmónica en una membrana celular.

Por lo tanto, las nanopartículas metálicas que incluyen los biomateriales se introducen en la superficie de SLM, las células se cultivan y después puede analizarse ópticamente el movimiento de las nanopartículas metálicas debido a las células. Por consiguiente, los mecanismos de transferencia de señales celulares pueden analizarse con mayor precisión porque el comportamiento de las células puede observarse en tiempo real y las interacciones entre células y biomateriales pueden registrarse a nivel de nanoescala en tiempo real (Figura 21).

Ejemplo 7: Detección múltiple mediante el uso de nanosondas de tres colores (rojo/verde/azul (RGB))

Las nanopartículas de metales nobles, tales como las nanopartículas de plata y las nanopartículas de oro, se caracterizan porque presentan una variedad de colores en función de la forma y/o tamaño de estas porque provocan resonancia plasmónica. Debido a estas características, pueden proporcionarse nanopartículas que emiten luz roja, azul o verde cambiando su composición, forma y/o tamaño. Dado que estas nanopartículas exhiben colores diferentes entre sí, pueden distinguirse unas de otras mediante un microscopio de campo oscuro. Por lo tanto, se encontró la aplicabilidad de estas nanopartículas de tres colores diferentes a la detección múltiple de miARN al permitir la distinción entre diferentes combinaciones. Mientras tanto, dado que se conoce que el miARN, que es una cadena corta de ARN que controla la función in vivo, se expresa incorrectamente en pacientes que tienen enfermedades tales como el cáncer, puede servir como un biomarcador para diagnosticar enfermedades tales como el cáncer. En la Tabla 2 más abajo se muestran ejemplos de miARN expresados incorrectamente que se encuentran en varios cánceres.

7.1. Preparación de nanopartículas de tres colores (RGB)

Se prepararon nanopartículas rojas mediante el recubrimiento de nanobarras de oro que tenían un tamaño de 15 nm x 15 nm x 45 nm con una capa de plata hasta un espesor de aproximadamente 5 nm. Como nanopartículas verdes se usaron nanopartículas esféricas de oro que tienen un diámetro de 50 nm. Las nanopartículas azules se prepararon mediante el recubrimiento de nanopartículas de oro esféricas que tenían un diámetro de 20 nm con una capa de plata hasta un espesor de aproximadamente 10 nm. El color y la forma de cada una de las nanopartículas preparadas se observaron mediante el uso de un microscopio de campo oscuro y un microscopio electrónico, y los resultados de estos se muestran en la Figura 22. Además, se midieron los espectros de absorción/dispersión de cada una de las nanopartículas, y los resultados de estos también se muestran en la Figura 22 (derecha).

7.2. Detección múltiple de microARN mediante la combinación de nanosondas de tres colores

Se introdujo ADN en cada una de las nanopartículas obtenidas en el Ejemplo 7.1. de la misma manera como en el Ejemplo 3, y estas nanopartículas se funcionalizaron para sintetizar nanosondas de tres colores. La movilidad de las nanosondas de tres colores se ajustó de la misma manera como en el Ejemplo 4, introduciendo de esta manera un total de seis tipos de nanosondas de I-PNP (en adelante, expresadas como IR, IG e IB) y M-PNP (en adelante, expresado como MR, MG y MB) en la SLB. Como se describe en el Ejemplo 6.1., las nanopartículas metálicas que causan la dispersión por resonancia plasmónica se acercan entre sí de acuerdo con la hibridación del ADN de secuencia complementaria unido a las nanopartículas metálicas para formar una agrupación de dos o más nanopartículas metálicas y, por lo tanto, se cambian la intensidad de la dispersión plasmónica, así como también el color plasmónico (Figuras 5 a 7). Por lo tanto, cuando se aplican tres nanopartículas metálicas que exhiben colores diferentes, puede esperarse que un total de nueve tipos de cambios sean causados por combinaciones de estos (Figura 23A), y estos cambios se confirmaron mediante modalidades ilustrativas (Figuras 23B a 23D). Específicamente, se confirmó que las nanosondas se combinan, y se modifican con ADN complementario para acoplarse con nueve tipos de miARN (Figura 23B), y por lo tanto cada acoplamiento puede analizarse en tiempo real y los nueve tipos de miARN pueden analizarse cuantitativamente. Las imágenes de microscopio de campo oscuro medidas en el mismo marco antes de la unión (0 minutos) y después de la reacción durante 60 minutos se muestran en la Figura 23C, y el cambio en las valencias acumulativas con respecto al tiempo de reacción se muestra en la Figura 23D. Los cambios en los espectros de dispersión plasmónica por el acoplamiento con las mismas o diferentes partículas en las partículas individuales fijas (IR, IG e IB) con respecto al tiempo se muestran en las Figuras 24 a 26, y el comportamiento de una pluralidad de partículas que tienen diferentes colores (diferentes longitudes de onda de dispersión plasmónica) y movilidad y el procedimiento de registro de estas mediante el uso de un microscopio de campo oscuro se muestran en la Figura 27. Por lo tanto, dado que el método de detección múltiple de la presente invención puede analizar simultáneamente nueve o más tipos de miARN cualitativa y/o cuantitativamente, este método de detección múltiple puede usarse para clasificar y diagnosticar seis o más tipos de cánceres diferentes.

Un ejemplo de detección de miARN mediante reconocimiento de secuencia complementaria se muestra en la Figura 28. Las secuencias de nueve tipos de miARN usadas para confirmar la aplicabilidad de detección múltiple anterior y las secuencias de ADN introducidas en las partículas respectivas para detectar las secuencias de miARN se dan en I a Tabla 3 más abajo.

T l 1

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una membrana celular artificial, que comprende:

un sustrato; y

una bicapa lipídica soportada (SLB) dispuesta sobre el sustrato, en donde la bicapa lipídica soportada, dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, comprende un primer lípido unido con un primer ligando; y

un tercer lípido unido con un tercer ligando que es igual o diferente del primer ligando, una primera partícula metálica que comprende un segundo ligando a una densidad de 100 a 100000/pm2, que se une específicamente al primer ligando, se une al menos a dos de los primeros lípidos a través de la unión entre el primer ligando y el segundo ligando, para disminuir la movilidad de la primera partícula metálica en la capa lipídica soportada de 0 a 0,5x10-8 cm2/s, y una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando, que se une específicamente al tercer ligando, se une al menos a uno de los terceros lípidos a través de la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando, y tiene una mayor movilidad en la capa lipídica soportada en comparación con la de la primera partícula metálica por el ajuste del número de ligandos unidos a las partículas metálicas.

2. La membrana celular artificial de acuerdo con la reivindicación 1,

en donde la primera partícula metálica se une al lípido mediante la interacción antígeno-anticuerpo, interacción ligando-receptor, hibridación de ácido nucleico, quelación, enlace covalente o enlace electrostático entre el primer ligando y el segundo ligando.

3. La membrana celular artificial de acuerdo con la reivindicación 1,

en donde la bicapa lipídica soportada comprende, además, un segundo lípido unido con polietilenglicol en una cantidad de 1 a 10 % en moles con respecto a la cantidad total de lípidos en la bicapa lipídica soportada.

4. Un dispositivo de análisis para examinar la interacción entre la molécula A y la molécula B mediante el uso de una membrana celular artificial, que comprende la membrana celular artificial de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula A se une a la superficie de la primera partícula metálica en la membrana celular artificial y;

una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando que se une específicamente al tercer ligando, en donde la segunda partícula metálica se une al menos a uno de los terceros lípidos a través de la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando, y tiene mayor movilidad en comparación con la de la primera partícula metálica por el ajuste del número de ligandos unidos a las partículas metálicas; y la molécula B se une a la superficie de la segunda partícula metálica en la membrana celular artificial, en donde la segunda partícula metálica que tiene mayor movilidad se acerca a la primera partícula metálica y después se confina a la primera partícula metálica mediante la interacción entre la molécula A y la molécula B.

5. El dispositivo de análisis de acuerdo con la reivindicación 4,

en donde la primera partícula metálica se fija sobre la bicapa lipídica soportada, y la segunda partícula metálica puede realizar un movimiento Browniano libre bidimensional sobre la bicapa lipídica soportada en ausencia de la interacción entre la molécula A y la molécula B.

6. Un método para examinar la interacción entre la molécula A y la molécula B mediante el uso del dispositivo de análisis de la reivindicación 4.

7. El método de la reivindicación 6,

en donde se registra la posición de la primera partícula metálica y el cambio en la intensidad o longitud de onda de dispersión debido a la primera partícula metálica.

8. El método de la reivindicación 6,

en donde se registra la trayectoria o velocidad del movimiento en tiempo real de la segunda partícula metálica, o el cambio en la intensidad o longitud de onda de la señal debido a la segunda partícula metálica.

9. El método de la reivindicación 6,

en donde la densidad de partículas y la frecuencia de colisión entre partículas se incrementan adicionalmente mediante la aplicación de una fuerza en una dirección predeterminada.

10. Un kit que comprende:

una membrana celular artificial que comprende un sustrato, una bicapa lipídica soportada que se dispone sobre el sustrato y dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, y un primer lípido unido con un primer ligando y un tercer lípido unido con un tercer ligando, que es igual o diferente del primer ligando, como parte de la bicapa lipídica soportada;

una primera partícula metálica que comprende un segundo ligando que se une específicamente al primer ligando, en donde la primera partícula metálica puede unirse al menos a dos de los primeros lípidos mediante la interacción entre el primer ligando y el segundo ligando; y

una segunda partícula metálica que comprende un cuarto ligando que se une específicamente al tercer ligando, en donde la segunda partícula metálica puede unirse al menos a uno de los terceros lípidos a través de la interacción entre el tercer ligando y el cuarto ligando, y tiene mayor movilidad en la capa lipídica soportada en comparación con la de la primera partícula metálica por el ajuste del número de ligandos unidos a las partículas metálicas.

11. El uso de un kit como se define en la reivindicación 10, para determinar la unión entre la molécula A y la molécula B mediante la determinación de la distancia entre una primera partícula metálica y una segunda partícula metálica a partir de señales de dispersión plasmónica de la primera partícula metálica unida con la molécula A y la segunda partícula metálica unida con la molécula B sobre una membrana celular artificial.

12. El uso de un kit como se define en la reivindicación 10 para el análisis cualitativo o cuantitativo de un material diana que puede unirse a la molécula A y a la molécula B que se usa para determinar la unión entre la molécula A y la molécula B mediante la determinación de la distancia entre una primera partícula metálica y una segunda partícula metálica a partir de señales de dispersión plasmónica de la primera partícula metálica unida con la molécula A y la segunda partícula metálica unida con la molécula B en una membrana celular artificial.

13. El kit de acuerdo con la reivindicación 10,

en donde la primera partícula metálica se fija en la bicapa lipídica soportada, y la segunda partícula metálica puede realizar un movimiento Browniano libre bidimensional sobre la bicapa lipídica soportada en ausencia de interacción a través del material diana entre la molécula A y la molécula B.

14. El kit de acuerdo con la reivindicación 13,

en donde el kit mide los cambios en la intensidad o longitud de onda de una señal de dispersión plasmónica o ambos en la posición de la primera partícula metálica donde la segunda partícula metálica que tiene mayor movilidad se acerca a la primera partícula metálica debido a las interacciones entre la molécula A y el material diana y entre la molécula B y el material diana en presencia del material diana.

15. Un kit de análisis múltiple para el análisis cualitativo o cuantitativo de materiales diana en la cantidad de imáx x mmáx mediante la medición de dispersión plasmónica (imáx y mmáx son valores máximos de las siguientes variables i y m, respectivamente, y cada una de ellas son, independientemente, un número entero de 1 o más, pero no imáx = mmáx = 1), que comprende:

una membrana celular artificial que comprende un sustrato, una bicapa lipídica soportada que se dispone sobre el sustrato y dentro de la cual algunos o todos los lípidos pueden cambiar de posición, y un lípido Ii unido con un ligando Ii y un lípido Mm unido con un ligando Mm (en la presente descripción, el ligando Ii y el ligando Mm pueden ser iguales o diferentes entre sí);

una partícula metálica Ii que comprende un ligando I'i que se une específicamente al ligando Ii, en donde la partícula metálica Ii se une al menos a dos de los lípidos Ii a través de la interacción entre los ligandos Ii y el ligando I'i;

una molécula Ai que se une a la superficie de la partícula metálica Ii y se une específicamente a una porción del material diana;

una partícula metálica Mm que comprende un ligando M'm que se une específicamente al ligando Mm, en donde la partícula metálica Mm se une al menos a uno de los lípidos Mm a través de la interacción entre el ligando Mm y el ligando M'm y tiene una mayor movilidad en la capa lipídica soportada en comparación con la de la partícula metálica Ii por el ajuste del número de ligandos unidos a las partículas metálicas; y una molécula Bm que se une a la superficie de la partícula metálica Mm en la membrana celular artificial y que se une específicamente a otra porción del material diana en el que la molécula A no se une, en donde la serie de partículas metálicas Ii tienen diferentes longitudes de onda de dispersión plasmónica entre sí, y la serie de las partículas metálicas Mm tienen diferentes longitudes de onda de dispersión plasmónica entre sí.