KR101823990B1 - 살아있는 세포에서 막 단백질 간의 상호작용을 정량적으로 측정하는 방법 - Google Patents

살아있는 세포에서 막 단백질 간의 상호작용을 정량적으로 측정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살아있는 세포에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 살아있는 세포에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법에 있어서, 표적 막단백질에 대한 캡처 프로브를 분석 대상 세포에 처리하여 상기 표적 막단백질을 기재 상에 고정시키고 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질의 확산계수 분포의 변화를 측정함으로써 상호작용에 대한 해리상수를 계산할 수 있으며 따라서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용을 정량적으로 측정하는 것이 가능하게 된다.

Description

살아있는 세포에서 막 단백질 간의 상호작용을 정량적으로 측정하는 방법{A Method for Quantitative Analysis of Transient Interactions of Membrane Proteins in a Single Living Cell}
본 발명은 살아있는 세포에서 막 단백질 간의 상호작용을 정량적으로 측정하는 방법에 관한 것이다.
생체 분자들 사이의 일시적이고 약한 상호작용은 살아있는 세포가 활발하게 유지되기 위해 필수적인 기능을 수행한다. 대표적으로 키나아제, 포스파타아제, 프로테아제를 포함하는 효소 반응은 특정한 기질과의 일시적인 상호작용을 통해 이루어지며, 세포 내 골격이나 소포체를 포함하는 세포 구조체 또한 일시적인 상호작용을 통해 역동적으로 생성되고 해체된다. 그러나 기존에는 살아있는 세포 내에서 매우 빠르게 발생하는 일시적인 상호작용을 정량적으로 측정하는데 있어서 기술적 한계가 존재하기 때문에 생체 분자들 사이의 상호작용에 대해 여전히 많은 부분이 알려지지 않고 있다. 시험관 내에서 일시적인 상호작용을 하는 두 단백질을 생화학적 교차연결시킴으로써 영구적으로 결합하도록 한 후 공동 면역 침강법을 이용하게 되면 두 단백질의 결합 여부에 대한 측정이 가능하지만 정량적인 정보는 잃게 된다. 또한 형광 공명 에너지 전달 측정, 광퇴색 후 형광 회복 측정, 단백질-단편 상보성 방법을 이용하여 세포 내에서 상호작용을 분석할 수 있다. 그러나 이러한 방법들은 단백질 복합체가 단일 단백질로 해리되는 경향성을 가리키는 절대적인 수치인 해리상수와 같은 평형 상수를 결정하는 정량적인 정보를 제공할 수 없다는 문제점을 가지고 있다.
본 발명자들은 대한민국 특허출원 제 10-2014-0059027호(특허문헌 1)를 통해 살아있는 세포내 막 단백질 결합 양상을 분석하는 방법을 제시한 바 있다. 또한, 대한민국 특허출원 제10-2015-0060619호(특허문헌 2)를 통해 초해상도 단일 입자 추적 데이터의 실시간 분석 기술을 통한 막단백질 확산의 역학적 분석 방법을 제시한 바 있다.
단일 입자 추적 방법은 살아있는 세포의 세포막에서 개별 단백질들의 확산에 대한 정보를 제공하는 기법이다. 비록 단백질이 가진 고유의 확산성을 기반으로 역동적이고 빠른 분자 수준의 기능들을 밝히는 데 있어서 단일 입자 추적 방법이 가지고 있는 잠재적 강점이 있지만, 단백질 간의 상호작용, 미세영역 얽매임, 세포골격 정착 등 다양한 요소들이 경로 데이터에 혼합되어 나타나기 때문에 이러한 데이터의 해석에 있어서 특정한 생물학적 현상을 구분하여 접근하는 것이 제한적이다. 단일 입자 추적 방법에 두 가지의 서로 다른 색을 지닌 양자점(quantum dot)을 도입하여 이 두 가지 경로가 겹쳐짐을 관찰함으로써 위에서 발생한 문제를 해결할 수 있으나 각기 다른 색으로 표지된 두 개의 막 단백질이 동일한 시간에 동일한 위치에서 만날 확률은 극단적으로 낮기 때문에 이러한 접근법은 상호작용하는 분자들의 수를 분석하는 데 있어서 불리하다.
따라서, 살아있는 단일 세포에서 세포막 단백질들 간의 일시적인 상호작용을 정량적으로 분석할 수 있는 방법의 개발이 여전히 요구되고 있다.
대한민국 특허출원 제 10-2014-0059027호 대한민국 특허출원 제 10-2015-0060619호
본 발명은 살아있는 단일 세포에서 세포막 단백질들 사이의 일시적인 상호작용을 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
보다 구체적으로, 본 발명은
살아있는 세포에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법에 있어서,
분석 대상 세포를 기재 상에 위치시키고,
기재와 상기 표적 막단백질 양자에 대한 결합능을 갖는 캡처 프로브를 분석 대상 세포에 처리하여 상기 표적 막단백질을 기재 상에 고정시키고,
상기 캡처 프로브의 처리 전과 후의 상기 결합 파트너 막단백질의 확산계수 분포를 얻는 것을 포함하는
막단백질의 상호작용 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 「분석 대상 세포」는 특정 막단백질과 이와 상호작용할 수 있는 막단백질 간의 상호작용을 분석하기 위해 사용되는 세포를 의미한다. 본 발명에 있어서 분석 대상 세포는 살아있는 세포이며, 그 종류는 어떠한 것이라도 관계없다.
한 구체예에서, 분석 대상 세포는 표적 막단백질을 선택적으로 과발현시킨 세포일 수 있다. 표적 막단백질의 과발현은 본 발명의 분석 방법에 있어서 필수적인 것은 아니다.
본 발명은 살아있는 세포 상에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막 단백질 간의 일시적인 상호작용을 정량적으로 분석하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 있어서, 「표적 막단백질」은 세포막에 위치하는 막단백질로서, 다른 막단백질과의 상호작용을 파악하길 원하는 막단백질을 의미하며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서의 하기 실시예에서는 「표적 막단백질」을 「미끼 단백질(Bait)」로도 표현한다. 본 명세서에 있어서, 「표적 막단백질」과 「미끼 단백질(Bait)」은 상호교환적으로 사용된다. 하기 실시예에서는 EGFR을 표적 막단백질로 하여 이와 상호작용하는 막단백질의 움직임 변화를 파악하였으나, EGFR 외의 막단백질들도 표적 막단백질로서 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「결합 파트너 막단백질」은 표적 막단백질과 상호작용을 하는 단백질을 의미한다. 표적 막단백질과의 상호작용을 하는 것으로 알려져 있거나 표적 막단백질과 상호작용을 할 것으로 예상되는 막단백질을 결합 파트너 막단백질로서 설정하고 표적 막단백질과의 상호작용을 분석할 수 있다. 본 명세서의 하기 실시예에서는 「결합 파트너 막단백질」을 「먹이 단백질(Prey)」로도 표현한다. 본 명세서에 있어서, 「결합 파트너 막단백질」과 「먹이 단백질(Prey)」은 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 「표적 막단백질」과 표적 막단백질에 대한 「결합 파트너 막단백질」은 내재성 막 단백질(integral membrane protein), 표재성 막 단백질(peripheral membrane protein), 막관통 단백질(transmembrane protein), 막 당단백질(membrane glycoprotein) 및 지질 공정 막 단백질(lipid anchored membrane protein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 「표적 막단백질」과 상기 표적 막단백질에 대한 「결합 파트너 막단백질」은 막단백질의 세포막 내 이동 양상을 추적하기 위해 「검출가능한 모이어티(detectable moiety) 」에 의해 레이블링될 수 있다. 「검출가능한 모이어티」에 의해 「표적 막단백질」과 상기 표적 막단백질에 대한 「결합 파트너 막단백질」의 존재, 위치, 양 등을 파악할 수 있게 된다. 막단백질을 추적하기 위한 검출가능한 모이어티는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 형광(fluorescent), 발광(luminescent), 화학발광(chemiluminescent), 방사성(radioactive)모이어티일 수 있다.
한 구체예에서, 막단백질은 검출가능한 모이어티로서 형광 모이어티에 의해 레이블링되어 있는 것일 수 있다. 예를 들어, 막단백질은 형광 단백질과의 융합 단백질의 형태로 발현시켜 탐지하기 용이하도록 제공될 수 있다. 다르게는 막단백질은 유기형광염료가 결합될 수 있는 태그와의 융합단백질이면서 상기 융합단백질의 태그에 형광물질이 레이블링되어 있는 상태일 수 있다. 상기 유기형광염료가 결합될 수 있는 태그로는 SNAP tag나 CLIP tag을 들 수 있다. 예를 들어 SNAP tag나 CLIP tag를 막단백질에 발현시키고, 이들 태그에 결합하는 벤질구아니딘 유도체 또는 O2-벤질사이토신 유도체의 말단에 형광물질을 결합시킴으로써 막단백질에 형광모이어티를 레이블링시킨다. 또 다른 예로, 막단백질에 특이적으로 결합하는 프로브에 의해 레이블링되어 있고, 여기에 다시 형광물질이 결합되는 형태로 형광 모이어티에 의한 레이블링이 구현될 수도 있다. 본 발명의 하기 실시예에서는 EGRF의 C 말단에 mEos3.2 단백질이 결합되어 있는 EGFR-mEos3.2로 발현시키거나, EGFR의 N 말단에 SNAP tag를 결합시켜 CF660R 형광염료로 표지한 EGFR을 표적 막단백질 및/또는 결합 파트너 막단백질의 레이블링에 사용한 예를 보여준다. 다르게는 막단백질은 탐지가능한 모이어티에 의해 레이블링되어 있는 항체와의 바인딩을 통해 레이블링될 수도 있다.
한 구체예에서, 막단백질과 융합되는 상기 형광 단백질은 GFP(Green Fluorescent Protein) 계열, BFP(Blue fluorescent protein) 계열, Cyan 계열, YFP(Yellow Fluorescent Protein) 계열, RFP(Red Fluorescent Protein) 계열, Orange 계열, Far-red 계열, Near-IR, 광활성 단백질(Photoactivatable protein), 광전환 단백질(Photoconvertible protein), 및 광스위치 단백질(Photoswitchable protein)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder GFP, Azami green mWasabi, TagGFP, AcGFP, T-sapphire, mUKG, Clover, mNeonGreen, EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite, mTagBFP, mKalama1, Sirius, ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP(monomeric ECFP), Cerulean, mTurquoise, mTurquoise2, CyPet, TagCFP, mTFP1(Teal), SCFP3A, monomeric Midoriishi Cyan, EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Benus, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, mBanana, SYFP2, mRuby, mRuby2, mApple, mStrawberry, mRFP1, mCherry, mRaspberry, dKeima-Tandem(monomeric version), HcRed-Tandem(monomeric version), mPlum, mKate2, mNeptune, mKate2, mNeptune, TagRFP657, IFP1.4, PA-GFP, PAmCherry1, PaTagRFP, PS-CFP2, mEos2, mEos3.2, PSmOrange 및 Dronpa로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것일 수 있다.
막단백질과 형광단백질의 융합단백질은 막 단백질과 형광단백질의 유전적 융합이나 화학결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 여기에서, “유전적 융합”이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다. 융합단백질의 제조는 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 예컨대, 유전자 재조합 기술을 이용하여 융합단백질을 제조할 수 있다.
상기 융합단백질을 발현하는 세포는 발현벡터를 형질전환시켜 준비할 수 있다. 융합단백질의 발현을 위해 개발된 공지의 발현벡터를 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스또는 코스미드 벡터일 수 있다. 융합단백질을 발현하는 숙주세포는 문헌(Sambrook, J., et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화칼슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학
적 처리방법, 유전자총(gene gun)을 이용하는 방법 및 바이러스 트랜스펙션(virus transfection) 등의 형질전환방법을 이용하여 준비될 수 있다. 예컨대, 표적 막 단백질과 형광단백질의 융합단백질이 포함된 발현벡터를 리포펙타민(lipofectamine), 퓨진 (fugene), 또는 메타팩틴(metafectin)을 이용하여 숙주세포에 형질전환시켜 융합단백질을 발현하는 세포를 준비할 수 있다.
한편, 상기 형광물질은 유기형광염료일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 유기형광염료는 CF660R, Alexa Flour 647, Atto 488, Alexa Flour 488, Dy505, Rhodamine 123, Atto 520, Dy 530, ATTO 532, Alexa Fluor 532, Fluorescein, FITC, Cy2, Cy3B, Alexa Flour 568, TAMRA, Cy3, Cy3.5, SNAP-Cell TMR-Star, Atto 565, Atto 590, Alexa Fluor 647, Cy5, Atto 647, Atto 647N, Dyomics 654, Atto 655, TMP-ATTO 655, Atto 680, Cy5.5, Atto 680, Alexa Fluor 680, Atto 700, Alexa Fluor 700, DyLight 750, Cy7, Alexa Flour 750, Atto 740, Alexa Flour 790, silicon-rhodamine (SiR) 또는 IRDye 800 CW 등과 같은 공지의 유기형광염료로부터 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「기재」는 분석 대상 세포의 막 단백질을 고정화시키고 막단백질의 고정 및 확산 양상을 관찰하기 위해 사용되는 플레이트, 웰 등을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 기재는 슬라이드 글라스 또는 커버글라스일 수 있다. 본 발명에 따른 기재는 소재의 제한은 없으나, 막단백질의 움직임을 추적할 수 있도록 레이블링되는 형광물질 등의 검출가능한 모이어티를 검출하기에 용이한 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 「캡처 프로브」는 표적 막단백질을 기재 상에 고정하기 위해 사용되는 프로브를 의미한다. 한 구체예에서, 상기 캡처 프로브는 항체, 항원-결합 단편, 어피바디(affibody), 또는 앱타머일 수 있다.
캡처 프로브는 막단백질과 기재 간의 적절한 접촉이 일어날 수 있는 높이로 제공될 수 있다. 예를 들어, 캡처 프로브가 항체일 때 기재와 세포 간의 접촉이 잘 일어나지 않는 경우 상기 캡처 프로브로 사용되는 항체에 적절한 높이를 제공해 줄 수 있는 2차 항체를 추가적으로 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 캡처 프로브는 기재와 상기 표적 막단백질 양자에 대한 결합능을 갖는다. 이는 캡처 프로브의 처리 전과 후의 결합 파트너 막단백질의 확산계수 분포를 얻기 위해서인데, 예를 들어, 아비딘-비오틴 결합법(avidin-biotin complex technique)를 이용하면 캡처 프로브가 기재와 상기 표적 막단백질 양자에 대한 결합능을 갖도록 설계하기가 용이하다. 예를 들어, 기재 상에 아비딘을 결합시키고, 캡처 프로브에 비오틴을 컨쥬게이션하는 방법을 채택하게 되면, 아비딘이 결합된 기재만을 준비해 두면, 막단백질의 종류의 변경에 따라 비오틴이 컨쥬게이션된 캡처 프로브의 종류만 변경하여 본 발명의 방법을 수행하면 된다. 본 발명의 구체예에서, 기재는 뉴트라비딘, 스트렙타비딘, 또는 아비딘이 결합되어 있는 것일 수 있다. 뉴트라비딘, 스트렙타비딘, 또는 아비딘을 공유결합을 통해 기재 상에 결합시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
용어 「확산계수(diffusion coefficient)」는 확산하는 분자의 평균속도를 의미하는데, 본 발명에서는 막단백질의 세포막 내 이동성을 나타내는 지표이다.
한 구체예에서, 막단백질의 확산계수는 단일 입자 추적(single particle tracking, SPT)을 통해 막단백질의 세포막 내 이동궤적을 탐지함으로써 얻을 수 있다. 단일 입자 추적이란 어떠한 medium 안에서 단일 입자의 움직임을 관찰하는 것으로 시간에 따른 움직임의 좌표를 궤도(trajectory)로 표현하며, 이로부터 움직임 양식, 불균질성 등에 대해서 분석하는 기술이다(Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 1997;26(373-399).
막 단백질의 세포막 내 이동 궤적의 탐지는 당해 기술분야에서 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 예컨대, TIRF(total internal reflection fluorescence)를 이용하여 형광을 탐지할 수 있다. TIRF 현미경은 전반사 현미경으로서 빛의 전반사 현상을 이용하여 다른 빛에 의한 간섭을 배제하고 특정 200nm 이하 영역의 형광만을 관찰할 수 있기 때문에 세포막과 그 주변의 현상을 연구하는데 적합하다. 이러한 TIRF 현미경을 이용하여 막 단백질의 시간에 따른 위치에서의 이미지를 얻고, 이를 궤도로 표현하여 확산계수를 구하게 된다.
막단백질의 확산계수는 하기 [수학식 1] 및 [수학식 2]를 이용하여 구할 수 있다. 예를 들어, 결합 파트너 막단백질 단일 입자의 확산계수는 단일 입자 추적 분석을 통해 결합 파트너 막단백질 단일 입자의 궤적을 얻고, 상기 [수학식 1] 및 [수학식 2]를 통해 구할 수 있게 된다.
막단백질 단일 입자의 궤적은 단일 입자 추적 분석을 통해 시간에 따른 막단백질의 위치 변화를 보여주는 복수 개의 막단백질 이미지를 얻고, 상기 이미지로부터 막단백질의 위치를 탐지하고, 탐지된 위치들을 연결하여 얻어진다. 예컨대, 막단백질에 연결된 형광단백질의 형광이나 유기형광염료의 형광을 탐지하여 시간에 따른 막단백질의 위치, 즉 좌표를 소정의 시간 동안 여러 개의 이미지로 얻고, 이러한 좌표의 움직임을 하나의 표적 막 단백질의 궤적으로 표현할 수 있다. 그런 다음, 하기 수학식 1 및 2에 측정된 시간에 따른 궤적의 좌표들을 대입하여 하나의 궤적에 대한 확산계수를 구할 수 있다. 위와 같은 계산에서 하나의 막단백질 입자의 위치를 결정하기 위해 형광을 탐지하는 시간(한 좌표에서의 막단백질 입자를 이미징하는데 걸리는 시간)은 분석 조건에 따라 적절히 변경할 수 있는데, 예를 들어, 약 30내지 70 ms, 예컨대, 50 ms일 수 있다. 또한 하나의 표적 막 단백질 입자가 하나의 궤적을 만들 때 필요한 좌표는 이에 제한되는 것은 아니나 5개 이상인 것이 바람직하다. 이에 제한되는 것은 아니나, 단일 입자 추적 분석에 사용되는 막단백질 단일 입자의 궤적의 수는 3천개 내지 1만개, 바람직하게는 5천개 이상의 궤적일 수 있다. 불확실성을 줄이면서 수렴된 확산 계수 값을 얻기 위한 궤적의 수는 세포의 종류나 상태 등에 따라 다를 수 있으므로 적합한 분석을 위한 궤적의 수는 상황에 따라 달리 조절할 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112016087101143-pat00001
(MSD: 이동한 거리 제곱 평균(Mean Square Displacement), Δ: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 지연 시간, T: 하나의 궤적을 이루는 표적 막 단백질 입자의 좌표의 총 수, (x0, y0): 시작 위치, (xt,yt): 시간 t에서의 위치)
[수학식 2]
MSD(Δ) = 4DΔ
(D: 확산계수,Δ: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 지연 시간)
위와 같은 계산에서 MSD는 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기에 따른 함수로 나타나며 해당 궤적을 브라운 운동에 의한 것으로 가정하였을 때 MSD는 선형함수로 나타난다. 따라서 [수학식 2]에 의해 각 막단백질의 궤적의 MSD를 선형함수 (f(X)=aX)에 fit 하였을 때의 기울기로부터 그 궤적의 확산계수 (a/4)를 얻을 수 있다. MSD는 평균값을 나타내기 때문에 해당 궤적을 이루는 막단백질 입자의 좌표가 많을수록 (즉, 추적하는 궤적이 길어지거나 좌표 밀도가 높아질수록) 더 정확한 확산계수를 얻을 수 있다. 따라서 확산계수의 계산은 일정한 길이 이상의 궤적을 사용하며 선형함수의 fit은 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기를 두 프레임 이상으로 하여 (선형함수의 fit은 두 점이 있으면 가능하기 때문에) 확산계수의 측정의 정확도를 높인다. 이러한 확산계수를 전체 궤적에 대해 평균하여 각 세포 내의 막단백질의 평균 확산계수를 계산할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 결합 파트너 막단백질의 확산계수는 FRAP(Fluorescence recovery after photobleaching) 또는 FCS(Fluorescence Correlation Spectroscopy)에 의해 얻을 수 있다. FRAP은 세포막에서 막단백질의 측방 확산을 측정하는 방법으로 잘 알려져 있다. 표적 막단백질을 형광 표지한 후 세포막에 도입하여 세포의 특정 부분에 레이저광을 조사하여 형광을 퇴색시킨 후, 주위에서 표적 막단백질의 측방확산에 의해 형광이 회복되는 상태를 측정하는 방법이다. FRAP에서 표적 막단백질의 확산 계수 D는 D = (w 2/4τ 1 / 2)γ에서 산출한다. 여기서 w는 레이저 광속 폭으로 광속이 정규(가우스) 분포를 하는 것으로 가정할 때, 중심부 밝기가 e-2로 감쇠하는 거리에서 τ 1 /2는 형광이 반 분가량 회복하는 시간이고, γ는 형광 퇴색 강도에 의존하는 보정치가 된다. FCS는 시간에 따른 형광 세기의 요동을 측정하고, 자기 상관(auto-correlation)을 분석함으로써 액체 안에서 움직이는 형광체의 확산계수를 구할 수 있다. 매우 작은 초점 공간에서 광학적으로 관찰하고 있는 형광의 세기는 평균값을 중심으로 시간에 따라 무작위하게 변화하는데, 이 무작위한 요동은 형광체가 브라운 운동(Brownian motion)을 함에 따라 초점 공간에 들어왔다 나갔다하는 정보를 담고 있다. 따라서, 확산계수가 낮을수록 초점 공간 안에 들어왔다 나갔다 하는 속도가 느리기 때문에 자기 상관 시간이 느려지게 된다. FCS를 통한 자기 상관 G(τ)은 G(τ)=[G(0)/{(1+(τ/τD))*(1+a- 2(τ/τD))1 /2)}]+G(∞)로 나타난다. 여기서 a는 wz/wxy로 초점 공간 부피에 대한 초점 평면과 그 수직 축의 반지름에 대한 비율이고, 각각의 광학 현미경의 상태에 따른 고유 수치로 미리 결정이 되어있다. 따라서, 자기 상관을 측정함으로써 τD를 결정할 수 있다. 이 때 형광체의 확산 계수 D는 D=wxy 2/4τD로 산출된다.
본 발명의 분석 방법에 따라, 캡처 프로브를 분석 대상 세포에 처리하면 기재 상에 표적 막단백질이 고정되게 되는데, 만일 캡처 프로브의 처리 후 결합 파트너 막단백질의 이동성, 즉 결합 파트너 막단백질의 확산계수가 변화하게 되면, 이는 결합 파트너 막단백질 부분모집단의 확산계수 분포의 변화로 나타나게 된다. 확산계수 분포도라는 것은 이런 단일 분자 수준의 확산계수들의 히스토그램을 의미하는데, 가로축은 확산계수를, 세로축은 해당 확산계수를 갖는 단분자의 개수 또는 표준화 이후에는 전체 대비 해당 단분자의 비율을 나타낸다. 분포도의 불확실성과 오차 범위를 줄이고 가우시안 그래프로서 피팅하기 위해서는 1,000개 이상의 단분자 확산계수가 측정되는 것이 유리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 결합 파트너 막단백질이 기재 상에 고정된 표적 막단백질과 상호작용하는 경우, 단일 분자 수준에서 살펴볼 때 결합 파트너 막단백질의 확산계수는 낮아지게 될 것이다. 그런데, 세포막에는 이질적(heterogenous)인 상태로 존재하는 다수의 표적 단백질과 다수의 결합 파트너 막단백질이 혼재되어 있다. 다시 말해, 표적 막단백질과 결합 파트너 막단백질은 양자 모두 이질적 상태의 단일분자들의 모집단(population)의 형태로 존재하며 각 단일분자의 확산계수에 따라 부분모집단(subpopulation)으로 분류할 수 있다. 세포막에 존재하는 표적 막단백질 모집단이 캡처 프로브에 의해 기재 상에 고정되면 캡처 프로브의 처리 전과 비교하였을 때 표적 막단백질의 확산계수 분포는 변화를 겪게 되는데, 캡처 프로브에 의하여 직접적으로 기재 상에 고정화되는 과정에 의해서 확산계수가 높은 부분모집단은 사라지고, 확산계수가 낮은 부분 모집단의 수는 늘어나는 확산계수 분포의 변화를 관찰할 수 있다.
마찬가지로, 기재 상에 고정된 표적 막단백질의 부분모집단과 상호작용하는 결합 파트너 막단백질은 세포막 상에 자유롭게 돌아다니고 있던 결합 파트너 막단백질 모집단 중 일부이며, 이러한 일부 결합 파트너 막단백질을 결합 파트너 막단백질의 부분모집단으로 일컫는다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 캡처 프로브의 처리에 의해 표적 막단백질이 기재 상에 고정화됨에 따라 이와 상호작용하고 있는 결합 파트너 막단백질의 확산계수가 단일 분자 수준에서 감소하게 되며, 이는 확산계수가 높은 부분모집단의 수는 줄고, 확산계수가 낮은 부분모집단의 수가 증가하는 것으로 표현된다. 이러한 확산계수 분포의 변화는 결합 파트너 막단백질이 표적 막단백질과 상호작용하는 경향성이 클수록 더욱 크게 나타나게 된다.
다시 말해, 상기 캡처 프로브의 처리 후의 상기 결합 파트너 막 단백질의 확산계수 분포에서 확산계수가 낮은 부분모집단의 수가 증가하는 것은 상기 표적 막단백질과의 일시적인 상호작용, 즉, 복합체 형성이 일어났음을 의미한다.
한편, 표적 막단백질과 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용은 “일시적”인 것으로, 결합 파트너 단백질은 일시적으로 표적 막단백질과 복합체를 형성하였다가 해리되게 되는데, 본 발명에 따른 막단백질의 상호작용 분석 방법은 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 단백질의 해리상수를 구하는 것을 가능하게 해 준다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 막단백질의 상호작용 분석 방법은 상기 캡처 프로브의 처리에 따른 확산계수 분포의 변화로부터 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 해리상수를 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
「해리 상수」는 표적 막단백질과 결합 파트너 막단백질이 복합체를 형성하였다가 다시 단일 단백질로 해리되는 경향성을 의미한다. 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 해리상수는 하기 [수학식 3], [수학식 4] 또는 [수학식 5]를 통해 구할 수 있다.
[수학식 3]
KD = [R][I] / [RI]
여기에서, [I], [R], [RI]는 각각 표적 막단백질의 농도, 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질의 농도 및 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 복합체의 농도를 나타낸다.
[수학식 4]
KD = [R]0(1-ρR)([I]0-[RI]) / [R]0ρR
여기에서, [R]0와 [I]0, 그리고 ρR은 각각 상호작용이 발생하기 이전의 초기 표적 막단백질 및 결합 파트너 막단백질의 농도, 캡쳐 프로브 처리 전과 비교하여 처리 후에 증가된 결합 파트너 막단백질의 부분모집단 비율이다.
[수학식 5]
KD = (1-ρR)[I]0 / ρR
여기에서,
ρR은 캡처 프로브 처리 전과 비교하여 처리 후에 증가된 결합 파트너 막단백질의 부분모집단 비율이고, [I0]는 고정화된 표적 막단백질의 절대 농도를 나타낸다.
일반적으로 해리 상수는 [수학식 3]과 같이 표적 막단백질, 결합 파트너 막단백질의 농도와 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 복합체의 농도 사이의 비율로서 정의된다.
캡처 프로브 처리 전과 비교하여 처리 후에서 증가된 결합 파트너 막단백질의 부분모집단 비율을 나타내는 ρR은 캡처 프로브 전과 후의 확산계수 분포도에서 부분모집단의 비율을 직접적으로 비교함으로써 구할 수 있다. 보다 구체적으로 단일 분자 수준에서 측정된 확산계수들에 대하여 표준화한 분포도를 그리고, 각 부분모집단에 대하여 하위 면적을 계산함으로써 전체 모집단 대비 부분모집단의 비율을 계산할 수 있다. 캡처 프로브 전과 비교하였을 때, 처리 후의 확산계수 분포도에서 낮은 확산계수를 갖는 부분모집단의 비율이 증가한 정도를 계산함으로써 ρR의 수치값을 구할 수 있다. 캡처 프로브의 처리 전후의 두 개의 확산계수의 분포를 직접적으로 비교하기 위해서는 캡처 프로브 처리 전과 후의 확산계수 분포도가 갖는 전체 단일분자수가 동일해야 하기 때문에 먼저 각 확산계수 분포도의 하위 면적이 1이 되도록 각 그래프를 표준화한다. 확산계수 분포도는 상대적으로 높은 확산계수를 갖는 피크들과 확산 운동이 거의 없는 것으로 간주할 수 있는 낮은 확산계수를 갖는 갖는 피크로 분류되며 각 피크들에 대해 가우시안 그래프(Gaussian graph)로 피팅(fitting)을 수행하면 전체 면적 1 중에서 각 그래프가 갖는 비율을 계산할 수 있다. 그 중 낮은 확산계수를 갖는 피크에 대한 비율을 이용하여 캡처 프로브 처리 전후에 상호작용한 막단백질의 증가량을 확인할 수 있다. 예를 들어 캡처 프로브의 처리 전에 확산계수 분포도를 그려서 표준화한 후 피팅을 수행했을 때 가우시간 그래프에서 가장 낮은 확산계수를 갖는 피크의 면적이 각각 0.2로 나타났고, 캡처 프로브의 처리 후에 0.5로 변화되었을 때 ρ값은 0.5-0.2=0.3으로 계산한다.
[수학식 3]의 표적 막단백질, 결합 파트너 막단백질, 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 복합체의 농도는 ρR을 활용하여 [수학식 4]와 같이 다시 표현될 수 있으며, 표적 막단백질의 농도가 표적 막단백질과 결합 파트너 단백질 간의 복합체 농도보다 매우 높은 경우 [수학식 5]와 같이 단순화하여 정의할 수 있다.
본 발명에 따른 막단백질의 상호작용 분석 방법은 후보약물의 처리에 따른 막단백질 상호작용의 변화를 확인하는 것을 통해 표적 막단백질에 효과적으로 작용할 수 있는 후보약물을 스크리닝하는데 활용될 수 있다.
막 단백질은 약물 개발의 주요 표적이며, 현재 개발된 모든 약물들 중 50% 이상이 막 단백질을 표적으로 하고 있다(Overington, J. P., How many drug targets are there?, Nature reviews. Drug discovery. 5, 993-996, 2006). 예컨대, 심차단(heart block) 또는 서맥(bradycardia)의 치료제인 이소프레날린(isoprenaline)은 adrenergic receptor를 표적으로 하는 약물이며, 당뇨치료제인 인슐린은 insulin receptor를 표적으로 하는 약물로 공지되어 있다(Peter Imming. et al. Drugs, their targets and the nature and number of drug target. Nature reviews. Drug discovery, 2006). 또한 개발된 많은 항암제들은 막 단백질을 표적으로 하고 있다. 예컨대, ErbB family는 암에서 중요한 역할을 하며, 이를 표적으로 하는 항암제의 개발에 대한 중요성은 이미 공지된 상태이며(Eric K. Rowinsky. THE ERBB FAMILY: Targets for Therapeutic Development Against Cancer and Therapeutic Strategies Using Monoclonal Antibodies and Tyrosine Kinase Inhibitors. Annu. Rev. Med. 55, 433-57, 2004), 일례로 대장암 치료제인 세툭시맙(cetuximab)은 ErbB family를 표적으로 하는 약물이다. 따라서, 막단백질과 리간드와 결합 등에 대한 연구는 표적 막단백질에 특이적으로 작용하는 약물 개발에 응용될 수 있으며, 구체적으로 표적 막 단백질에 대한 약물을 스크리닝 하는 방법으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로
후보약물의 처리에 따른 살아있는 세포에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용의 변화를 분석하는 것을 포함하는 표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법에 있어서,
분석 대상 세포를 기재 상에 위치시키고,
상기 분석 대상 세포에 상기 표적 막단백질에 영향을 미칠 것으로 예상되는 후보약물을 처리하고,
기재와 상기 표적 막단백질 양자에 대한 결합능을 갖는 캡처 프로브를 처리하여 상기 표적 막단백질을 기재 상에 고정시키고,
상기 캡처 프로브의 처리 전과 후의 상기 결합 파트너 막단백질의 확산계수 분포를 얻고,상기 결합 파트너 막 단백질의 확산계수 분포의 변화를 후보약물 무처리군에서의 캡처 프로브 처리 전과 후의 결합 파트너 막단백질의 확산계수 분포의 변화와 비교하여 상기 표적 막단백질과의 상호작용에 대해 영향을 미치는 후보약물을 선별하는 것을 포함하는
표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
후보약물의 처리에 따른 살아있는 세포에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용의 변화를 분석하는 것을 포함하는 표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법에 있어서,
분석 대상 세포를 기재 상에 위치시키고,
상기 분석 대상 세포에 상기 표적 막단백질에 영향을 미칠 것으로 예상되는 후보약물을 처리하고,
기재와 상기 표적 막단백질 양자에 대한 결합능을 갖는 캡처 프로브를 처리하여 상기 표적 막단백질을 기재 상에 고정시키고,
상기 캡처 프로브의 처리 전과 후의 상기 결합 파트너 막단백질의 표적 막단백질에 대한 해리상수를 얻고,
후보약물 처리에 따른 결합 파트너 막 단백질의 해리상수의 변화를 후보약물 무처리군에서의 캡처 프로브 처리 전과 후의 결합 파트너 막단백질 해리상수의 변화와 비교하여 상기 표적 막단백질과의 상호작용에 대해 영향을 미치는 후보약물을 선별하는 것을 포함하는
표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
표적 막단백질에 영향을 미치는 후보약물로는 화합물, 핵산, 당, 탄수화물, 지질, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 단백질은 예를 들어 항체일 수 있으며, 여기에서 항체는 전체 또는 일부, 이를테면 팹(Fab) 부분 또는 힌지 (hinge) 부위만을 선택적으로 잘라낸 부분 (half-immunoglobulin fragment) 모두를 포함하는 개념이다. 한 구체예에서, 상기 후보물질은 핵산일 수 있으며, 여기에서 핵산은 2-200개 염기를 포함하는 올리고 뉴클레오티드 혹은 c-DNA 모두를 포함하는 개념이다. 상기 후보물질은 표적 막단백질과 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용을 분석하기 위해 적절한 양으로 상기 세포에 처리될 수 있으며, 처리는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예컨대, 후보물질 0.01 내지 1000 ug/ml를 현탁한 세포배양액을 기재 상에 위치시킨 분석 대상 세포에 직접 처리할 수 있다.
후보약물의 처리에 의해 결합 파트너 막 단백질의 확산계수 분포의 변화가 있거나 결합 파트너 막단백질의 표적 막단백질에 대한 해리상수의 변화가 있는 경우, 후보약물은 표적 막단백질과 결합 파트너 막단백질 사이의 상호작용에 영향을 미치는 주요한 인자로서 간주할 수 있다. 후보약물의 처리에 의한 결합 파트너 막 단백질의 확산계수 분포의 변화나 해리상수의 변화가 유의수준(significance level)인 경우, 예를 들어, 그러한 변화가 2% 이상, 3% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상인 경우, 상기 후보물질을 표적 막단백질과 결합 파트너 막단백질 사이의 상호작용에 영향을 미치는 약물로 판단할 수 있다.
하기 실시예에서는, 본 발명의 일 실시예로서 캡처 프로브로서 표적 막단백질에 특이적인 항체를 사용하여 특정 표적 막단백질만을 기재 상에 고정화하고 다른 막단백질들은 영향을 받지 않고 움직일 수 있도록 하였다. 자유롭게 움직이는 막단백질 중에서 표적 막단백질과 상호작용하는 막단백질, 즉 결합 파트너 막단백질은 고정되어 있는 표적 막 단백질과 상호작용이 발생하는 동안 자유롭게 움직이던 막 단백질이 일시적으로 함께 멈추게 되고 이를 통해 복잡한 경로 데이터 중에서 확산계수를 기반으로 일시적인 상호작용에 의한 경로 데이터만을 특이적으로 구별하여 해석할 수 있게 된다. 확산계수 분포도로부터 일시적인 상호작용에 의해 멈추는 단분자 경로들의 숫자를 계산함으로써 전체 분자에 대한 상호작용 복합체를 형성하는 분자들의 비율을 측정할 수 있고 이를 통해 두 단백질 간의 상호작용에 대한 해리상수를 결정할 수 있다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 막단백질의 상호작용 분석 방법을 “공동 면역 고정법(Co-ImmunoImmobilization, Co-II)” 이라고 명명하였다. 이 방법을 이용하면 살아있는 단일 세포의 세포막 위에서 발생하는 리간드 의존적/독립적인 막단백질 간의 상호작용을 정량적으로 분석할 수 있으며, 이를 통해 단백질의 구조와 세포막이 형성하는 미세환경 등에 의해 복합적으로 조절되는 막단백질 간의 상호작용에 대해 밝혀낼 수 있다.
본 발명에 따르면, 살아있는 세포에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법에 있어서, 표적 막단백질에 대한 캡처 프로브를 분석 대상 세포에 처리하여 상기 표적 막단백질을 기재 상에 고정시키고 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질의 확산계수 분포의 변화를 측정함으로써 상호작용에 대한 해리상수를 계산할 수 있으며 따라서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용을 정량적으로 측정하는 것이 가능하게 된다.
도 1은 확산계수를 기반으로 살아있는 단일 세포에서 막 단백질 간의 일시적인 상호작용을 정량적으로 조사하는 방법에 대한 모식도를 나타낸다. (a) 항체를 처리하기 전에 형광으로 표지된 먹이(Prey) 단백질은 상호작용 상태에 상관없이 다양한 확산운동을 하고 있기 때문에 특정한 상호작용 복합체를 확산만으로 구분해내는 것은 불가능하다. 미끼(Bait) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 처리하여 커버슬립 표면에 미끼 단백질을 고정하게 되면 먹이 단백질 중 미끼 단백질과 상호작용하고 있는 부분모집단만이 미끼 단백질과 함께 고정화된다. (b) 형광으로 표지된 먹이 단백질의 단분자 경로를 추적할 때, 미끼 특이적인 항체의 처리에 의해 낮은 확산계수를 갖는 경로들이 증가하게 되는데 이 경로들의 수는 곧 고정화된 미끼 단백질과 상호작용하여 형성한 상호작용 복합체의 양을 의미하게 된다. 이 부분모집단의 비율은 먹이 단백질의 확산계수 분포도에서 증가된 낮은 확산계수를 갖는 부분모집단 비율(ρR)로서 계산된다. (c) 결합 파트너 막단백질 R과 표적 막단백질 I 사이에서 일시적인 상호작용을 통해 형성되는 복합체 RI의 해리상수(KD)는 단백질 I를 커버슬립 위에 고정한 후에 증가한 고정화된 부분모집단의 비율 ρR을 측정함으로써 계산될 수 있다.
도 2는 커버슬립 표면으로부터 고정된 항체의 높이에 따른 EGFR 고정화 정도의 의존성을 나타내는 모식도와 실험 결과를 보여준다.
(a-c) 커버슬립 표면에 고정시킨 항체의 숫자(항체 1개 (a), 항체 2개 복합체 (b), 항체 3개 복합체 (c))에 따라 각기 다른 높이를 갖는 EGFR 단백질 고정화 시스템의 도해. (d) EGFR이 발현된 COS7 세포에 EGFR 특이적인 항체를 처리했을 때 EGFR의 고정화된 부분모집단의 비율.
도 3은 고정화의 막단백질의 발현량에 대한 독립성을 보여주는 실험 결과를 나타낸다.
(a) mEos3.2-EGFR이 발현된 COS7 세포는 mEos3.2의 형광 세기기준의 발현 정도에 따라 low (#1), middle (#2), and high (#3) 로 나누어 분류되었다. (b) 웨스턴 블롯을 이용하여 분류된 세 집단의 EGFR 발현 정도를 확인하였다. 1번 낮은 발현 집단은 내재적 EGFR의 발현과 유사한 정도를 보였고, 2번 중간 발현 및 3번 높은 발현 집단은 내재적 EGFR의 발현보다 훨씬 더 높은 발현 정도를 보였다. (c) mEos3.2의 형광 세기로 계산된 mEos3.2 항체 처리 전(빈 원) 후(채워진 원)의 mEos3.2-EGFR의 고정화 정도는 발현 정도에 따른 세 집단 (검정색-낮은 발현; 파란색-중간 발현, 빨간색-높은 발현) 모두에서 일정한 수준으로 나오는 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 다양한 항체 사용시 고정화 정도의 효율성을 확인한 결과를 나타낸다.
(a-c) COS7세포에서 EGFR의 서로 다른 결합부위에 특이적으로 결합하는 mAb 199.12 (a), mAb R-1 (b), 및 mAb 528 (c) 등의 항체들을 처리하였을 때의 EGFR의 고정화 비율. (d) SNAP-EGFR이 발현된 COS7세포에 SNAP 항체 처리 전후의 고정화된 부분모집단의 비율. (e,f) N말단(e)과 C말단(f)에 mEos3.2 형광 단백질이 연결된 EGFR이 발현된 COS7 세포에 mEos3.2 단백질 특이적 항체를 처리하였을 때의 고정화된 부분모집단의 비율. 각 검정색 점은 단세포에서 측정된 고정화 비율을 의미하고, 빨간색 선은 평균값을 의미한다.
도 5는 다양한 세포주에서 고정화 정도의 효율성을 확인한 결과를 나타낸다.
EGFR-mEos3.2가 발현된 각각의 COS7세포, HEK293세포, HeLa세포, CHO-K1세포에서 EGFR 특이적 항체의 처리 전후에 고정화된 EGFR의 비율을 측정하였다. 모든 세포주에서 고정화된 EGFR의 비율은 비슷함을 알 수 있다.
도 6은 살아있는 세포의 세포막에서 분자 특이적인 고정화를 실험한 결과를 나타낸다. (a,b) EGFR 특이적인 항체 처리 전후의 COS7세포에서 동시에 발현된 SNAP-EGFR와 β2-AR-mEos3.2 도해 및 경로 지도. 5,000개의 경로가 한 개의 경로 지도에 그려져있다. Scale bar, 5μm. (c) EGFR 특이적인 항체 처리 전(검은 선)과 후(붉은 선)의 SNAP-EGFR(위)와 β2-AR-mEos3.2(아래)의 확산계수 분포도. 고정화되어 나타나는 부분모집단을 구분하는 확산계수 기준은 파란 세로선으로 표시되어 있다. (d) IgG와 EGFR 특이적인 항체 처리 전후의 SNAP-EGFR(검은 바)와 β2-AR-mEos3.2(붉은 바)의 고정화된 부분모집단의 비율(%). (e) EGFR 특이적인 항체 처리 전후의 PMT, EGFR, ErbB2, ErbB3, InsR, 및 β2-AR의 고정화된 부분모집단의 비율(%). 단일 점은 하나의 세포로부터 얻은 데이터이며 붉은 가로 선은 평균값을 의미한다. n.s. 는 통계적으로 유의미하지 않음을 뜻한다. **P < 0.0001 and *P<0.01 (Student's t-test).
도 7은 EGFR 전-동종 이합체 형성에서 일시적인 상호작용의 해리상수를 측정한 결과를 나타낸다. (a) EGFR 전-동종 이합체에 대한 해리상수의 측정을 위한 시스템 도해. EGFR-mEos3.2는 움직이는 상태에 있다가 고정화된 SNAP-EGFR과 상호작용을 할 때에만 움직이지 않는 상태로 있게 된다. (b) 동일 COS7 세포에서 SNAP tag 특이적인 항체 처리 전과 후의 EGFR-mEos3.2(왼쪽)과 SNAP-EGFR(오른쪽)의 경로 지도. 100개의 경로가 각 경로 지도에 표시되었다. Scale bar, 2μm. (c) SNAP tag 특이적인 항체 처리 전(검은 선)과 후(붉은 선)의 SNAP-EGFR과 EGFR-mEos3.2의 확산계수 분포. (d, e) SNAP tag 특이적인 항체 처리 전과 후의 SNAP-EGFR(d)과 EGFR-mEos3.2(e)의 고정화된 부분모집단의 비율. ρI는 항체 처리에 의해 증가한 EGFR-mEos3.2의 고정화된 부분모집단의 비율을 의미한다. (f) SNAP-EGFR에 대한 전체 및 단분자 발현 수준에 대한 형광 이미지. Scale bar, 5μm and 2μm. 단분자는 이미징 중에 형광 세기 그래프에서 단일 광탈색 단계를 보이는 것으로 구분된다. (g) COS7 세포에서 EGFR 전-동종 이합체의 해리상수는 SNAP-EGFR의 발현 수준에 독립적이며 그 평균값은 약 2727±126molecules/μm2이다. (h) SNAP-EGFR의 발현량에 따른 EGFR-mEos3.2의 고정화된 부분모집단의 비율 및 EGFR-mEos3.2의 고정화된 부분모집단의 비율에 따른 SNAP-EGFR의 결합/비결합 비율을 나타낸 그래프이다. (i) 다양한 세포주에서 측정된 해리상수.
도 8은 고정된 SNAP- EGFR과 EGFR - mEos3 .2 경로가 공존하고 있는 양상을 보여주는 사진이다.
빨간색 선은 EGFR-mEos3.2 단분자 중 하나의 경로를 의미하고, 흰색 점은 SNAP tag 특이적 항체에 의해 고정화된 SNAP-EGFR을 의미한다. 고정화된 SNAP-EGFR의 위치와 일시적으로 고정화되는 EGFR-mEos3.2의 경로 일부가 완전히 동일한 위치에서 공존함을 알 수 있다.
도 9는 고정화된 막단백질의 총 농도를 정량한 실험 결과를 나타낸다.
(a) SNAP-CF660R 과 Cetuximab-Alexa fluor 647을 이용해 얻은 총 형광 신호와 단분자 형광 신호 이미지. HeLa세포에 SNAP-EGFR을 발현시키고 CF660R을 결합시켜 전체 형광 신호 이미지를 얻고 충분한 광탈색 후 단분자 형광 신호 이미지를 얻었다. CF660R의 완전한 광탈색 이후, Alexa fluor 647 염료가 결합되어 있는 EGFR 특이적 항체인 Cetuximab을 처리하여 세포 표면에 발현되어 있는 모든 EGFR을 레이블링하여 유사한 방식으로 전체 형광 신호 이미지와 단분자 형광 신호 이미지를 얻었다. (b) 원 이미지로부터 정량화된 단백질의 농도 비율. ImageJ 프로그램을 이용해 원 이미지로부터 형광 신호를 정량화 하였고, 단백질의 농도는 총 형광신호를 단분자의 형광신호로 나누어 줌으로써 계산하였다. 동일한 세포의 EGFR 대해서 CF660R-SNAP를 이용해 구한 결과와 Cetuximab Alexa flour 647을 이용해 구한 단백질의 농도는 0.91±0.13의 비율을 나타내었다.
도 10은 막 단백질의 발현 정도에 따른 고정화된 부분모집단의 비율의 의존성을 확인한 결과를 보여준다.
COS7세포 내 발현된 SNAP-EGFR에 SNAP tag 특이적 항체를 처리한 후 고정화된 부분모집단의 비율은 발현 수준에 따라 양의 상관관계를 나타낸다. 데이터 상 하나의 점은 하나의 세포에서 나온 정보를 나타낸다.
도 11은 EGFR 고정화 후에도 영향을 받지 않는 EGFR의 신호전달을 확인한 결과를 보여준다.
COS7 세포에 발현된 mEos3.2-EGFR은 mEos3.2 단백질 특이적 항체를 이용해 커버슬립에 고정되었다. 유사한 수준의 mEos3.2-EGFR 발현 수준을 갖는 세포에 대해서 EGF 유무에 따른 EGFR의 인산화 정도를 EGFR의 Y1068 아미노산의 인산화기 항체와 Alexa 647이 결합된 2차 항체를 사용해 측정하였다. ImageJ 프로그램을 사용해 원 이미지로부터 형광 신호를 정량화하였다. EGFR이 고정화 되어 있음에도 불구하고 NT와 비교시 EGF 처리된 환경에서 EGFR의 인산화 정도가 유의미하게 증가하였다.
도 12는 EGFR 동종이합체의 해리상수에 대한 티로신 인산화 저해제의 직접적인 결합의 효과를 확인한 결과이다. (a) 굶긴 COS7세포에서 mock, Erlotinib, Lapatinib의 처리 후에 EGF 유무에 따른 EGFR 동종이합체의 해리상수. (b) EGFR의 이합체 형성에 있어서 티로신 인산화 저해제(TKI)의 효과에 대한 도해. TKI는 EGFR에 결합하여 세포 안쪽의 구조에 영향을 줌으로써 이 부위를 통한 EGFR의 결합을 촉진하고 이를 통해 EGF가 없는 상황에서도 EGFR 이합체 형성에 유리한 환경을 형성한다.
도 13은 EGFR 동종 이합체의 해리상수에 대한 세포막의 환경변화의 효과를 확인한 결과이다. (a) 굶긴 COS7세포에서 Latrunculin B의 처리 후에 EGF 유무에 따른 EGFR 동종 이합체의 해리상수. (b) 액틴 구조의 붕괴에 따른 EGF에 의해 유도된 EGFR 이합체 형성에의 효과에 대한 도해. 액틴 골격은 EGFR 이합체를 안정화하는 기능을 수행하기 때문에 Latrunculin B의 처리에 의해 액틴이 부서지게 되면 EGFR 이합체의 안정성이 감소하여 그 비율이 감소하게 된다. (c) 굶긴 COS7세포에서 Nystatin의 처리 후에 EGF 유무에 따른 EGFR 동종 이합체의 해리상수. (d) 콜레스테롤 제거에 따른 EGFR 전-이합체 형성에의 효과에 대한 도해. EGFR의 세포밖 부위는 세포막의 콜레스테롤과 상호작용하여 접힌 형태를 보이는 경향성을 가진다. Nystatin에 의해 콜레스테롤이 제거되면 EGFR 단량체가 펼쳐진 형태로 자유롭게 되어 리간드의 결합 없이도 EGFR 이합체 형성을 촉진하게 된다.
이하에서, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 공동 면역 고정법의 원리
살아있는 단일 세포에서 세포막 단백질들간의 상호작용을 정량적으로 측정하기 위해 공동 면역 고정법은 커버슬립에 코팅되어 있는 특이적인 항체에 의해 고정된 '미끼' 단백질(표적 막단백질)을 사용한다. 이 상황에서 '먹이' 단백질(상호작용 후보 단백질, 즉 결합 파트너 막단백질)은 자유롭게 운동하고 있다가 고정된 미끼 단백질과 상호작용하게 되면 일시적으로 함께 멈추게 된다(도 1a). 이러한 일시적인 상호작용의 순간은 광전환이 가능한 형광 단백질이나 유기 형광 염료를 이용하여 초해상도 현미경을 활용한 단일 추적 방법으로 관찰할 수 있다. 이를 통해 살아있는 하나의 세포에서 상호작용에 대한 정량적인 정보를 얻어내기 위해 통계적으로 충분한 수의 경로 데이터를 얻을 수 있다. 미끼 단백질을 고정화하기 위한 항체 처리 전과 후의 조건에서 먹이 단백질의 확산계수 분포를 비교함으로써 일시적인 상호작용에 의해 증가한 고정화된 경로들의 부분모집단의 양을 정량화함으로써 미끼 단백질과 먹이 단백질이 이루는 복합체의 양을 계산할 수 있다(도 1b). 두 단백질의 상호작용에 대한 해리상수를 구하기 위해서는 일반적으로 두 단백질의 해리된 상태에서의 농도와 평형상태에서의 두 단백질의 복합체 농도의 세 가지 변수가 필요하다. 우리는 여기에서 움직이는 먹이 단백질인 R과 고정화된 미끼 단백질인 I 사이에서 일어나는 상호작용을 측정하기 때문에(도 1c) 기술적으로 해리상수는 다음 [수학식 3]과 같이 정의될 수 있다.
KD = [R][I] / [RI] … [수학식 3]
고정화된 미끼 단백질의 양이 복합체의 양보다 월등히 많은 경우, 동역학적인 평형상태에 도달했을 때 미끼 단백질의 절대 농도는 초기 농도와 같다고 가정할 수 있다. 따라서 [수학식 3]에서 [R]/[RI]가 무차원의 값인 미끼 단백질과 결합하지 않은 먹이 단백질과 결합한 먹이 단백질의 비율로 치환됨으로써 먹이 단백질의 절대적인 농도 정보가 필요하지 않게 되고, 이에 따라 2차 이분자 반응 수학식은 유사 1차 반응으로 계산될 수 있게 된다. 미끼 단백질을 고정하기 전과 비교하였을 때, 고정화 후에 증가한 둘 사이의 상호작용에 의해 고정화된 확산계수를 가지는 먹이 단백질의 비율 ρR을 측정함으로써 이 값을 바로 먹이 단백질의 미끼 단백질에 대한 비결합/결합 비율로 치환하여 사용할 수 있다. 따라서 해리상수를 구하기 위한 [수학식 3]은 본 발명에서 제안하는 실험 디자인에서 다음의 [수학식 5]와 같이 변환될 수 있다. (더 자세한 치환 과정은 Methods에서 확인할 수 있다.)
KD = (1-ρR)[I]0 / ρR … [수학식 5]
그러므로 살아있는 단일 세포에서 공동 면역 고정법을 이용하여 두 세포막 단백질 사이의 해리상수를 계산하기 위해서는 [수학식 5]에서 보는 것과 같이 크게 2개의 변수가 요구된다.
1) 미끼 단백질의 고정화 전과 비교하여 처리 후의 조건에서 증가된 먹이 단백질의 고정화 비율
2) 고정화된 미끼 단백질의 절대적 농도
실험예 2. 살아있는 세포의 세포막에서 막 단백질의 분자 특이적 고정화
미끼 단백질이 항체에 의해 커버슬립에 고정화되는 효율은 공동 면역 고정법의 민감도에 중요한 요소이다. 따라서 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)을 사용하여 이 효율을 측정하였다.
먼저 EGFR 특이적인 항체가 코팅되어 있는 커버슬립을 만들기 위해서 3-머캅토프로필트리메톡시실란(3-mercaptopropyltrimethoxysilane)을 사용하여 티올 반응기가 활성화되어 있는 커버슬립을 준비하였다. 그 다음, 말레이미드(maleimide)가 활성화되어 있는 뉴트라비딘(neutravidin)을 처리하여 반응기 사이의 공유결합을 유도함으로써 뉴트라비딘이 결합된 커버슬립을 만든 후 여기에 마지막으로 비오틴이 결합되어 있는 EGFR 특이적인 항체를 처리하였다.
COS7 세포에서 C말단에 mEos3.2가 연결된 EGFR(EGFR-mEos3.2)을 발현시킨 다음, 다중 입자 추적 방법을 사용하여 biotin이 결합되어 있는 EGFR 특이적인 항체의 처리로 인해 발생하는 EGFR의 고정화된 부분모집단의 비율을 측정하였다(도 2a). 의도적으로 발현시킨 EGFR뿐 아니라 내재적으로 발현되어 있는 EGFR까지 고정화할 수 있는 충분한 양의 항체를 처리하였음에도 불구하고 고정화된 EGFR의 비율은 ~61% 정도로 충분하지 않았다(도 2d). 일반적으로 50nm 이상에 달하는 세포막과 커버슬립 표면 사이의 거리에 반해 말레이미드, 비오틴, 그리고 항체가 연결되어 이루는 높이는 커버슬립 표면으로부터 약 ~30nm이며 EGFR의 높이는 약 ~15nm에 달한다고 추측되므로 이 정도 높이로는 커버슬립에 밀착되어 있는 세포에서 일부 표면에만 물리적으로 결합할 수 있어 EGFR이 충분히 고정화되지 못했다고 판단되었다. 따라서 우리는 뉴트라비딘과 EGFR 특이적인 항체 사이에 한 개의 추가적인 항체(2차 항체)를 처리하여 커버슬립으로부터의 높이를 높이고자 하였다(도 2b). 2차 항체를 사용함으로써 예상되는 높이는 약 ~45nm가 되었고 그 결과 커버슬립에 잘 부착된 COS7세포에서 >97.3%의 EGFR이 고정화었다(도 2d). 추가적으로 3차 항체를 도입하여 예상 높이를 ~60nm까지 높였을 때에도 EGFR의 고정화 비율에 있어서 유의미한 개선은 관찰할 수 없었다(도 2c,d). 2차 항체까지 활용하여 커버슬립에 코팅한 EGFR 특이적인 항체의 양은 COS7 세포에서 넓은 범위의 발현 수준에서 모든 EGFR을 고정화시키기에 충분하였다(도 3). 또한 mAb 199.12, mAb R-1, mAb 528 등과 같이 EGFR의 서로 다른 부위에 결합하는 다양한 항체를 사용하여 고정화에 사용되는 EGFR 특이적인 항체의 종류를 달리하여도 비슷하게 충분한 수준으로 EGFR이 고정화되는 것을 확인하였다(도 4a-c). 추가적으로 EGFR의 N말단에 SNAP tag이 결합된 EGFR(SNAP-EGFR)과 mEos3.2 단백질이 결합된 EGFR(mEos3.2-EGFR)을 가지고 각각 SNAP tag 특이적인 항체와 mEos3.2 단백질 특이적인 항체에 대한 고정화 효율을 알아보았다. SNAP-EGFR과 mEos3.2-EGFR은 각각 SNAP tag 특이적인 항체와 mEos3.2 단백질 특이적인 항체에 대해서 거의 완전한 고정화 효율을 보였지만, EGFR의 C말단에 mEos3.2가 연결된 EGFR-mEos3.2는 mEos3.2 단백질 특이적 항체에 의해 전혀 영향을 받지 않았다(도 4d-f). 뿐만 아니라, HEK293세포, HeLa세포 및 CHO-K1세포 등의 서로 다른 세포주에서도 90% 이상의 EGFR이 효과적으로 고정화됨을 확인하였다(도 5). 위와 같은 결과를 통해 커버슬립 표면으로부터 세포에 닿기까지 항체의 높이만 충족한다면, 항체의 결합 부위나 세포막의 미세환경의 차이는 고정화의 효율에 크게 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있다.
공동 면역 고정법을 시행하는 데 있어서 가장 큰 우려는 살아있는 세포의 세포막에서 미끼 단백질의 고정화가 다른 전체 막 단백질에 영향을 주지 않고 특이적으로 이루어지는지에 대한 것이었다. 만약 커버슬립에 코팅된 EGFR 특이적인 항체가 세포막 위의 다른 막 단백질을 비특이적으로 심각한 수준으로 고정화시키게 되면 먹이 단백질의 고정화 부분모집단 비율의 증가가 고정화된 미끼 단백질이 아닌 다른 비특이적으로 고정화된 막 단백질과의 상호작용에 의한 것일 수 있기 때문이다. 따라서 우리는 EGFR 특이적인 항체를 이용하여 특정 항체의 처리가 표적이 아닌 다른 막 단백질의 고정화를 유도할 수 있는지 확인하였다.
먼저 EGFR과 물리적으로 상호작용하지 않는다고 알려진 beta2 adrenergic receptor (β2-AR)를 선택하여(도 6a) SNAP tag을 기반으로 CF660R 형광염료로 레이블링된 EGFR과 mEos3.2 형광단백질로 레이블링된 β2-AR를 함께 발현시킨 동일 COS7 세포에서 EGFR 특이적인 항체 처리 전후 조건에서 동시에 두 가지 막 단백질의 움직임을 관찰하였다(도 6b). 경로 데이터로부터 고정화된 부분모집단의 양을 정량화하기 위해서 확산에 대한 관계식 MSD = 4DΔt (0 < Δt < 780 ms)를 경로 데이터에 적용하여 확산계수를 계산하였으며, 고정화를 정의하기 위한 확산계수의 기준은 위치 오류를 바탕으로 결정되었다(도 6c). 실제로는 고정되어 있는 경로가 마치 움직이는 것처럼 나타날 때 평균 확산계수 σ^2/t로부터 위치 오류 σ를 도출할 수 있으므로 이를 이용하여 CF660R 염료와 mEos3.2 단백질의 위치 오류를 추정함으로써 각 단백질의 부분모집단을 구분짓는 확산계수 기준을 정의하였다. SNAP-EGFR이 EGFR 특이적인 항체에 의해 완전히 고정화되어 약 98.2%의 고정화된 부분모집단의 비율을 보이는 동안 β2-AR의 고정화 비율에는 유의미한 변화가 나타나지 않았다(도 6d). 비록 β2-AR의 움직이는 부분모집단의 확산계수가 ~13.4% 정도로 약간 감소하였으나, 이는 세포막과 커버슬립 사이의 혼잡도가 증가했기 때문으로 추측되며, 이와 같은 감소는 고정화된 부분모집단의 비율을 정량하는 데 있어서는 미미한 영향을 보였다.
우리는 추가적으로 EGFR에 특이적인 고정화가 다른 막 단백질에 미치는 영향도 알아보고자 하였다. 세포막에 특이적으로 위치할 수 있는 PMT(plasma membrane targeting) 신호 펩티드와 ErbB2 단백질 및 ErbB3 단백질, 그리고 인슐린 수용체 단백질(InsR)에 mEos3,2 형광 단백질을 표지한 후 EGFR 특이적 항체에 의한 고정화 비율을 측정하였다(도 6e). EGFR 특이적 항체를 처리하였을 때 EGFR의 고정화 비율이 90%가 넘는데 비해, PMT, ErbB3, InsR 및 β2-AR에서는 항체 처리 전후에 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 다만 ErbB2 단백질의 경우 평균적으로 약 ~8.7%의 고정화 효율이 증가하였는데 이는 유의미한 수준의 ErbB2가 EGFR과 상호작용을 하기 때문으로 해석된다. EGFR과 상호작용에 의해 유도된 고정화 비율의 증가를 최소화하고 EGFR 특이적인 항체에 의한 비특이적 고정화 비율만을 효과적으로 확인하기 위해서 내재된 EGFR의 발현량에 비해 이러한 막 단백질들을 과발현시켜서 측정을 진행하였으며, 이 중에서 오직 ErbB2와 ErbB3만이 EGFR과 상호작용한다고 알려져 있다는 점에서 ErbB3에 비해서 ErbB2이 EGFR과 상호작용을 통해 형성하는 이종이합체가 특히 강할 것으로 추측할 수 있다. 이러한 결과는 오로지 ErbB2 단백질만이 세포밖 영역이 펼쳐져 있는 구조를 갖고 있다는 기존의 구조 특성에 대한 연구결과와도 일맥상통한다.
실험예 3. 살아있는 단일 세포에서 EGFR 전- 이합체화에 대한 해리상수의 측정
EGFR의 전-동종 이합체(리간드 독립적인 이합체)에 대한 해리상수를 측정하기 위해 SNAP-EGFR과 EGFR-mEos3.2가 함께 발현된 세포에 SNAP tag 특이적인 항체를 처리하여 SNAP-EGFR만을 특이적으로 고정화하였다(도 7a). SNAP tag 대신 다른 단백질 tag이나 형광 단백질 또한 사용될 수 있지만 높은 밀도의 경로 데이터를 얻고 완전한 SNAP-EGFR의 고정화를 확인하기 위하여 SNAP tag을 사용하였다. EGFR의 전-동종 이합체화를 유사 1차 반응으로 가정하기 위해서는 SNAP-EGFR과 EGFR-mEos3.2의 발현 비율이 중요하기 때문에 EGFR-mEos3.2를 낮은 수준으로 안정적으로 발현하는 COS7 세포에 SNAP-EGFR을 과발현하였다. 그런 다음, SNAP tag 특이적 항체를 처리하기 전후의 조건에서 CF660R 형광 염료가 레이블링된 SNAP-EGFR과 EGFR-mEos3.2를 추적하여 각각의 경로 데이터를 얻었다(도 7b). SNAP-EGFR의 확산계수 분포도는 움직이는 상태의 경로들이 항체 처리 후에 완전히 고정화된 상태로 전환된 것(~95.2%)을 보여주는 반면 EGFR-mEos3.2는 약 ~22.7%의 부분적인 고정화된 상태로의 전환만을 보여주었다(도 7c-e). 여기에서 증가된 EGFR-mEos3.2의 고정화된 부분모집단의 비율은 결국 EGFR 전-동종 이합체의 양을 나타내는 것으로 볼 수 있다. 또한 단분자 수준에서 고정화된 SNAP-EGFR과 EGFR-mEos3.2의 경로에서 일시적으로 고정화 되는 위치가 정확히 겹쳐지는 것으로 보아 EGFR-mEos3.2의 일시적 고정화는 SNAP-EGFR과 이합체를 형성하기 때문인 것으로 생각할 수 있다(도 8).
다음으로 표면의 총 형광 신호를 단분자 신호로 나눔으로써 COS7 세포 표면에서 발현되어 있는 SNAP-EGFR의 농도를 결정하였다(도 7f). 경로를 추적하기 전에 CF660R 형광 염료로 레이블링된 SNAP-EGFR의 전반사 형광 이미지를 얻었으며 여기에서 총 형광 신호의 세기가 바로 COS7 세포 표면에서의 SNAP-EGFR의 전체량이 된다. 모든 경로 추적 단계가 완료된 후 광탈색을 통해 SNAP 단백질이 개별 분자 수준에서의 관찰이 가능해질 때까지 형광 신호를 끈 다음 전반사 형광 이미지를 다시 얻었다. 이중에서도 특히 한 단계의 광탈색이 되는 것을 통해 단일 분자의 형광 신호를 골랐으며 이들의 평균을 취함으로써 한 개의 CF660R 형광 염료로부터 발생하는 단분자 형광 신호를 결정하였다. 추가적으로 CF660R 형광이 활성화되지 않아 고정화는 되었지만 탐지되지 않은 SNAP-EGFR의 비율을 고려하여 전체 SNAP-EGFR의 개수를 교정하였다(도 9). 이렇게 계산된 SNAP-EGFR의 농도는 ~650±54 molecules/μm2로 나타났다. 막 단백질은 2차원의 세포막 위에서 좌우로만 확산하기 때문에 세포막에서의 몰 농도의 정의가 명확하지 않기 때문에 기존에 사용하는 몰 농도 대신 2차원의 밀도로 계산되는 표기법을 사용하였다. SNAP-EGFR의 농도가 증가할수록 EGFR-mEos3.2가 고정화된 SNAP-EGFR과 만날 확률이 증가하게 되므로 따라서 이를 확인하기 위해 SNAP-EGFR의 발현 수준에 따른 EGFR-mEos3.2의 고정화 비율의 경향성을 분석하였으며 수학식 5에서 보여지는 관계와도 마찬가지로 SNAP-EGFR의 발현량과 EGFR-mEos3.2의 고정화된 SNAP-EGFR에 대한 비결합/결합 비율 사이의 선형 비례관계를 관찰할 수 있었다(도 10).
위에서 구한 수치들을 수학식 4에 대입한 결과 EGFR의 전-동종 이합체의 해리상수는 ~2727±126 molecules/μm2로 계산되었으며 이 수치값은 SNAP-EGFR의 발현량이 변하더라도 일정하게 나타나는 것을 확인하였다(도 7g). EGFR의 전-동종 이합체에 대한 결합 양상을 확인하기 위해 측정된 결과값들을 결합 플롯에 대입했으며 이를 통해 COS7 세포에서 측정된 범위의 발현 수준 안에서 EGFR은 협동성이 없는 단순한 이합체만을 형성하는 것을 확인하였다(도 7h). 또한 HEK293 세포, HeLa 세포 및 CHO-K1 세포에서 EGFR의 전-이합체의 해리상수를 측정하였을 때 모두 COS7 세포와 유의미한 차이가 없는 유사한 값이 측정되었다(도 7i).
실험예 4. 리간드 의존적/독립적인 일시적인 EGFR의 이합체화
다음으로 우리는 EGFR의 리간드인 EGF의 유무에 따른 EGFR의 이합체화를 정량적으로 분석하였다. 비록 SNAP-EGFR을 고정화하기 위해 사용되는 SNAP tag 특이적인 항체가 EGF의 결합을 방해하지는 않지만 EGFR이 고정화된 상태에 있더라도 EGF의 처리에 의해 인산화가 되는지 관찰함으로써 고정화에 의한 생리학적 영향이 없음을 확인하고자 하였다. mEos3.2 형광 단백질에 특이적 항체가 코팅되어 있는 커버슬립 위에 안착되어 있는 mEos3.2-EGFR이 발현되어 있는 세포에 EGF를 처리한 후 용해시켜 커버슬립 표면에 고정화된 mEos3.2-EGFR만을 남겼다. EGFR의 Y1068번 아미노산의 인산화를 표적으로 하는 항체를 이용하여 남아있는 EGFR에 표지하였을 때, 기본 인산화 수준과 비교하여 EGF 처리에 의한 고정화된 mEos3.2-EGFR의 유의미한 수준의 인산화 정도를 확인할 수 있었다(도 11).
SNAP-EGFR과 EGFR-mEos3.2가 함께 발현된 COS7 세포를 4시간 동안 굶긴 다음 공동 면역 고정법을 이용하여 EGF 유무에 따른 EGFR의 이합체화에 대한 해리상수를 측정하였다. 유사 1차 반응의 조건을 충족시키기 위해 SNAP-EGFR의 발현 수준은 EGFR-mEos3.2의 발현 수준보다 최소 10배 이상 높도록 유지하였다. EGF가 없는 EGFR 전-이합체의 해리상수는 ~7244 molecules/μm2로 측정되었으며, EGF에 의해 형성된 EGFR 이합체의 해리상수는 ~369 molecules/μm2로 측정되었다. EGF의 처리는 해리상수를 20배 가량 차이나도록 함으로써 EGF에 의한 EGFR의 인산화를 유의미한 수준으로 증가시키는 데 기여했을 것으로 추측할 수 있다. 또한 세포가 굶주린 환경에서 EGFR 전-이합체의 해리상수는 세포가 성장하는 일반적인 조건(10% FBS)에서의 해리상수보다(도 7g) 약 2.6배 정도 더 높은 값을 갖는 것을 확인할 수 있었으며 이는 다른 간접적인 요소들이 EGFR의 이합체의 형성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 의미한다.
EGFR에 대한 다른 인공적인 리간드들의 결합이 EGFR의 이합체화에 미치는 영향을 더 탐구하기 위하여 EGFR의 세포내 부위에 있는 ATP 결합 포켓을 표적하는 티로신 인산화 효소 저해제(Tyrosine kinase inhibitor, TKI)인 Erlotinib과 Lapatinib를 처리하였을 때 EGFR 이합체화의 해리상수를 측정하였다(도 12a). 그 결과 Erlotinib과 Lapatinib의 결합이 EGFR의 인산화를 저해함에도 불구하고 두 TKI 모두 EGF가 없는 환경에서도 EGFR 이합체화의 경향성을 증가시킴을 확인하였다. 이는 이러한 저해제의 결합이 EGFR의 세포 안쪽 부위의 변화를 통해 이합체화 가능성을 증가시킨 결과로 해석할 수 있다(도 12b). 흥미롭게도 Erlotinib은 EGF가 처리된 환경에서는 해리상수에 변화가 없었지만 Lapatinib은 EGF의 처리에도 불구하고 EGFR 이합체의 형성을 유의미하게 저해함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 Lapatinib의 결합이 EGFR의 구조적 형태를 EGFR 이합체의 안정성이 낮아지는 방향으로 유도하여 이합체의 형성이 불리한 형태로 변화됨을 알 수 있으며 이는 이전의 연구들과도 일관된 결과이다.
실험예 5. 세포막의 미세환경에 다른 EGFR의 이합체화
세포막의 골격인 액틴을 분해하거나 세포막으로부터 콜레스테롤을 제거함으로써 세포막 주변의 미세환경의 변화에 의한 EGFR의 이합체화에 대한 간접적인 효과에 대해 알아보고자 하였다. 이전의 연구에서 세포막 아래에 형성되어 있는 액틴의 그물구조가 EGFR의 이합체화에 영향을 미칠 수 있다는 보고가 되어 있었기 때문에 이를 직접적으로 증명하고자 액틴 구조를 적당히 분해시키는 Latrunculin B를 처리한 후 EGFR의 이합체에 대한 해리상수를 측정하였다. 그 결과 Latrunculin B를 처리한 후의 EGFR 이합체의 해리상수는 증가하였으며 액틴 그물구조에 갇혀있던 EGFR이 풀려나게 됨으로써 EGFR의 움직임이 더 자유로워짐을 관찰하였다(도 13a). 따라서 EGF에 의한 EGFR의 이합체 형성은 자유롭게 움직이는 EGFR의 국소적인 갇힘 현상에 의해 큰 영향을 받음을 알 수 있다(도 13b).
놀랍게도 Nystatin의 처리에 의한 콜레스테롤의 제거는 EGF 의존적인 EGFR 이합체뿐 아니라 EGF 독립적인 EGFR의 이합체의 해리상수에도 상당한 영향을 미쳤음을 확인하였다. 특히 EGF가 없는 상태에서 Nystatin의 처리에 의해 EGFR의 이합체의 해리상수는 ~1665 molecules/μm2 정도로 크게 감소하였는데 이 수치는 같은 조건 하에서 EGF에 의해 형성된 EGFR의 이합체의 해리상수와 비슷한 값이다(도 13c). 이 결과는 콜레스테롤의 제거가 EGFR의 이합체 형성 가능성을 높여주는 반면 EGFR의 이합체 형성에 중요하게 작용하던 EGF 자체의 기능은 완전히 없애버린다고 해석할 수 있다. 콜레스테롤이 많은 세포막 내 구역에서 EGF가 없는 경우 EGFR은 세포밖 부위가 접혀서 묶여있는 구조로 존재하는 경향이 있기 때문에 콜레스테롤의 제거가 EGFR의 접힌 구조를 펼치는 작용을 용이하게 하고 따라서 결과적으로 이합체 형성에 유리한 환경을 조성하는 것으로 추측된다. 그러나 동시에 세포막에서 콜레스테롤은 EGF에 의해 유도된 EGFR 이합체화를 안정화하는 기능을 할 것으로 보이기 때문에 Nystatin의 처리가 EGF에 의한 EGFR 이합체의 해리상수를 부분적으로 높이는 작용을 한 것으로 판단할 수 있다. EGFR 이합체화에 대한 콜레스테롤의 이러한 이중적인 특성은 리간드의 유무에 따른 EGFR의 이합체화의 차이를 더욱 크게 벌리게 되기 때문에 세포막에서 리간드에 의해 유도된 EGFR의 신호전달을 위한 지질 뗏목(lipid raft)의 중요한 기능을 보여준다고 할 수 있다.
우리는 초해상도 현미경을 활용한 단일 입자 추적 기술을 도입하여 공동 면역 고정화 현상을 감지함으로써 살아있는 단일 세포에서 막 단백질 간의 일시적인 상호작용을 정량적으로 분석하는 공동 면역 고정법을 개발하였다. 또한 이 방법 하에서 일시적인 상호작용에 대한 해리상수를 계산하기 위한 공식을 도출하였다. 비록 본 연구에서는 EGFR의 이합체 형성을 일시적인 상호작용에 대한 대표적인 모델로 제시하였지만 공동 면역 고정법의 활용은 약하고 일시적인 상호작용에만 제한되는 것은 아니다. 두 막 단백질의 결합강도가 미끼 단백질과 고정화를 위한 항체 사이의 결함 강도와 비슷한 정도로 강한 것이 아니라면 미끼 단백질의 발현 수준을 조절함으로써 강한 상호작용을 포함한 넓은 범위의 상호작용을 조사할 수 있다. 미끼 단백질의 최적 발현 수준은 상호작용의 해리상수에 따라 수학식 5를 통해 분석적으로 결정될 수 있다. 미끼 단백질을 고정화하는 효율은 측정 정확도의 관점에서 중요한 요소지만 굉장히 높게 과발현(백만개 이하의 수용체)된 세포에서도 이러한 고정화 효율이 크게 떨어지지 않는 것을 이미 확인한 바 있기 때문에(도 3) 대부분의 경우 충분한 정확성을 가지고 측정이 가능할 것으로 예상된다. 따라서 EGFR 전-이합체 보다 10배 이상 일시적으로 형성하는 상호작용까지도 공동 면역 고정법을 통해 분석이 가능하다.
우리는 공동 면역 고정법을 이용하여 EGFR의 전-동종 이합체화에 대해 분석하였다. 본 기술은 단일 세포에서 통계적으로 고정화된 부분모집단의 비율을 분석하는데 있어서 만 개 이하의 경로만으로도 충분하기 때문에 내재 막 단백질과 같은 낮은 발현 수준을 가진 단백질의 일시적인 상호작용도 측정이 가능하다. EGFR 항체의 Fab fragment에 Alexa fluor 647과 같은 형광 염료를 결합시켜서 EGFR을 레이블링하는 데 사용하면 별다른 발현 없이도 내재된 EGFR의 전-이합체화에 대한 해리상수를 측정할 수 있었으며 그 수치는 외부에서 발현시킨 EGFR-mEos3.2를 이용하여 측정한 해리상수 값과 유사하게 나타났다.
우리는 EGFR 단량체들 사이의 상호작용을 유사 1차 반응으로 가정하고 해리상수를 계산하였으나 매우 높은 농도의 EGFR이 세포막에 발현되면 본 가정과는 다르게 높은 수준의 EGFR 복합체가 동시에 형성될 수 있다. 비록 EGFR 단량체 간의 해리상수가 EGFR의 발현 수준과는 무관함을 보여주긴 했으나(도 7g, h) 본 연구에서 측정한 범위를 넘어서서 극단적으로 높은 농도의 EGFR이 발현된 환경에서는 높은 수준의 저중합체가 형성될 수 있어서 측정된 결과값이 이로 인해 영향을 받을 수 있다.
본 공동 면역 고정 기술은 일반적으로 살아있는 세포에서 넓은 범위의 결합강도를 가진 다양한 세포막 단백질의 상호작용에 적용될 수 있다. 다양한 생리학적 환경에서 막 단백질들의 정량적인 상호작용 특성을 밝혀내는 것은 살아있는 세포에서 막 단백질 간 상호작용이 갖는 역동적인 본질에 대한 심도 있는 이해를 위한 새로운 관점을 제시할 것이다.
재료 및 방법
1. 플라스미드, 항체, 시약
SNAP tag이 연결된 융합 단백질을 만들기 위해 pSNAPf 벡터(N9183S, New England Biolabs)로부터 SNAP tag 부분을 얻어 이를 pcDNA3.1/mEos3.2-EGFR 벡터에 넣음으로써 pcDNA3.1/SNAP tag-EGFR을 얻을 수 있었다. 사용된 모든 플라스미드는 다음 참고문헌 1(Kim, D.H. et al. Analysis of Interactions between the Epidermal Growth Factor Receptor and Soluble Ligands on the Basis of Single-Molecule Diffusivity in the Membrane of Living Cells. Angew . Chem . Int . Ed. Engl. 54, 7028-32 (2015))에서 확인할 수 있다. 항체와 시약의 출처는 다음과 같다: mAb 199.12 와 Alexa fluor 647 연결된 anti-mouse 항체는 Invitrogen에서 구매; mAb 528 과 mAb R-1 는 Santa Cruz에서 구매; Rabbit anti-Mouse IgG 와 biotin 연결된 EGFR 항체는 Thermo Scientific에서 구매; anti-mEos3.2 항체는 Badrilla에서 구매; anti-phosphorylated EGFR 항체(Y1068) 는 abcam에서 구매; the anti-actin 항체는 MP Biomedicals에서 구매; Erlotinib 과 lapatinib 은 Roche에서 구매; Nystatin 과 latrunculin B 는 Sigma Aldrich에서 구매하였다.
2. 세포 배양 및 형질 전환
COS7, HEK293, HeLa 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구매하였고, 10 % FBS(Gibco)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Lonza)배지로 37°C와 5% CO2 그리고 95% 습도 환경에서 세포 배양하였다. 동일하게 ATCC에서 구매한 CHO-K1 세포는 DMEM과 F-12 배지(Thermo Scientific)를 1:1로 섞고 10% FBS가 추가된 배지로 37°C와 5% CO2 그리고 95% 습도 환경에서 세포 배양하였다. 모든 세포의 형질전환은 Lipofectamine LTX(Invitrogen)을 이용해 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
3. 시료 준비
커버슬립은 처음에 클로로포름/메탄올(50:50)로 24시간 동안 씻어주고, 그 후 에탄올에 넣어서 보관하였다. 커버슬립을 건조시킨 후에 플라즈마 챔버(Femto Science)에 1분 30초 동안 산화시키고, 메탄올에 탈이온수 4.5%, 아세트산 0.9%, 3 mercapto-pro-pyulrimethoxy silane(S10475, Fluorochem) 2.5%가 포함된 실레인용액에 넣어 4℃에서 약 9-12시간 동안 반응 시킨다. 처리된 커버슬립을 Phosphate Buffered Saline 용액으로 3회 세척 후, 50 μg/ml 농도로 fibronectin 용액에 희석된 maleimide 반응기가 활성화된 neutravidin 단백질(31007, Thermo Scientific)과 1시간 동안 상온에서 반응시키고, 세포를 안착시키기 전에 biotin이 결합된 goat anti-rabbit IgG H&L 항체(ab7089, abcam) 혹은 biotin이 결합된 goat anti-mouse IgG Fc 항체(A16088, Invitrogen)와 추가적으로 1시간 동안 반응시켜 주었다. 형광 이미징을 하는 동안 페놀레드로 인한 간섭을 없애고자, 세포는 커버슬립에 안착 후 페놀레드가 없는 10% serum이 포함된 DMEM(Thermo Scientific)로 계속 유지시켰다.
4. 이미징을 위한 형광 염료 및 표지된 세포의 준비
succinimidyl ester 반응기를 가진 CF660R(92134, biotium)는 디메틸포름아미드(DMF)에 있는 BG-NH2 (New England Biolabs)와 제조사의 지시에 따라 30°C에서 약 9-12시간 동안 반응시켰다. 반응 후 용매는 진공에서 증발시켰고, 생성물은 HPLC로 정제 후에 증류수에 녹였다.
SNAP-EGFR이 발현된 세포는 EGFR에 형광 표지를 위해 기 준비된 BG-CF660R 혹은 SNAP-Surface Alexa Fluor 647(New England Biolabs)와 함께 반응시키고, 그 후 항체가 코팅된 커버슬립 위에 안착시켰다. Alexa flour 647를 이용한 형광 이미징의 경우에는 미디어에 추가적으로 탈산소제와 함께 환원제를 참고문헌 1과 같이 넣어준다.
5. 광학 설비 및 이미지 데이터의 확보와 처리
형광 이미징은 XYZ축 자동화 스테이지가 장착된, 대물렌즈 기반의 TIRF 형광 현미경(IX-71, Olympus)에서 수행하였다. 실험에 사용된 레이저와 형광 필터는 참고문헌 1과 같이 사용하였다. 모든 형광 이미지는 전자증폭 결합소주 장치(EM-CCD/ iXon3 897, Andor Technology)를 사용해 얻어졌다. 보다 높은 배율의 이미지를 얻기 위해 현미경에 장착된 1.6x 증폭장치와 함께 1.43x의 튜브 렌즈를 사용하였다. 이미징을 하는 동안 살아있는 세포를 유지하기 위해 라이브셀 이미징 장치(Chamlide TC-A, Live cell instrument)를 사용하였다. 모든 장비의 조작과 이미징 데이터 확보는 MetaMorph (Molecular Devices)와 직접 작성한 MATLAB(The MathWorks) 플러그인을 사용해 이루어졌다. 대칭의 가우시안 함수를 이용한 비선형 최소 자승 근사법을 기반으로 하여, 원 이미지에서 다중 입자 추적을 할 수 있는 MATLAB 코드를 작성하였다. 이미지 프레임과 프레임 사이의 입자들 연결은 참고문헌 2(Jaqaman, K. et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods 5, 695-702 (2008)) 에서 제시하는 단일 입자 추적 방법에 사용되는 u-track 프로그램으로 선형 할당 문제를 해결함으로써 가능해졌다. 그러나 연속된 프레임에서 추적 과정에서 사라지거나 두 개의 경로가 합쳐지는 경우에는 개별 입자의 추적을 즉시 종료하였다. 실험에 사용된 광학 부품의 조작과 이미징 데이터의 처리는 참고문헌 1과 같이 진행되었다.
6. 해리상수의 계산
확산계수는 입자가 2차원의 공간에서 보통의 확산현상을 하는 것을 가정하고 수학식 1과 수학식 2의 평균 자승의 변위(the mean squared displacements, MSD)를 사용하여 계산되었다.
[수학식 1]
Figure 112016087101143-pat00002
(MSD: 이동한 거리 제곱 평균(Mean Square Displacement), Δ: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 지연 시간, Δ는 자연수다, T: 하나의 궤적을 이루는 표적 막 단백질 입자의 좌표의 총 수, (x0, y0): 시작 위치, (xt,yt): 시간 t에서의 위치)
[수학식 2]
MSD(Δ)= 4DΔ
(D: 확산계수,Δ: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 지연 시간)
'먹이' 단백질 R과 '미끼' 단백질 I 사이의 상호작용으로 인해 복합체 RI가 만들어질 때, 해리상수는 다음 수학식 3과 같이 정의된다.
KD = [R][I] / [RI] … (수학식 3)
단, [R], [I], [RI]는 각각 개별 단백질 R, I, 복합체 RI의 농도를 나타낸다.
막 단백질 I를 고정화시킨 후 막 단백질 R의 확산계수를 확률 밀도 함수로 측정하면 R과 I의 복합체 형성에 따라 R의 고정화 비율 역시 증가하게 된다. 이 고정화 비율을 ρR로 나타내면 해리상수는 다음 수학식 4과 같이 표현될 수 있다.
KD = [R0](1-ρR)([I0]-[RI]) / [R0]ρR … (수학식 4)
단, [R0]와 [I0]는 단백질 R과 I의 초기 농도이다.
초기 I의 농도 [I0]가 복합체 RI의 농도 [RI]보다 훨씬 높은 조건을 가정하면 해리상수의 수식은 다음 수학식 5와 같이 단순화될 수 있다.
KD = (1-ρR)[I]0 / ρR … (수학식 5)
따라서 해리상수는 I의 초기 농도인 [I0]와 I에 특이적인 항체 처리 후에 증가된 고정화 비율인 ρR의 두 값을 이용하여 계산될 수 있다.
7. 막 단백질 발현 수준의 정량화
세포의 막 단백질과 함께 발현된 mEos3.2 형광 단백질은 488nm 파장의 레이저에 의해서, 그리고 막 단백질에 표지된 유기 형광 염료 CF660R 및 Alexa Flour 647은 642nm 파장의 레이저에 의해서 각각 조사되었다. 공간적인 편차를 최소화하기 위해 ImageJ 프로그램을 이용하여 동일한 세포에서 최소 다섯 곳의 위치와 세 장 이상의 이미지에서 배경 신호를 제거한 평균 형광 신호를 측정함으로써 총 발현 정도를 정량화하였다. 경로 추적을 위한 이미징이 종료된 후, 형광 분자들은 단분자 수준으로 관찰이 가능하도록 높은 파워의 레이저로 광탈색 과정을 진행하였다. 다섯 장 이상의 연속적인 이미지에 존재하는 형광 분자 중 단일 단계로 광탈색되는 분자들만을 골라서 그 평균 값을 단분자의 형광 신호 세기로 사용하였다. 단일 세포에서 발현된 특정한 막 단백질의 총 농도는 발현 정도에 따른 총 형광 세기를 단분자의 형광 세기로 나눔으로써 계산하였다.

Claims (16)

  1. 살아있는 세포에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법에 있어서,
    분석 대상 세포를 기재 상에 위치시키고,
    기재와 상기 표적 막단백질 양자에 대한 결합능을 갖는 캡처 프로브를 분석 대상 세포에 처리하여 상기 표적 막단백질을 기재 상에 고정시키고,
    상기 캡처 프로브의 처리 전과 후의 상기 결합 파트너 막단백질의 확산계수 분포를 얻는 것을 포함하는
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    막단백질은 내재성 막 단백질(integral membrane protein), 표재성 막 단백질(peripheral membrane protein), 막관통 단백질(transmembrane protein), 막 당단백질(membrane glycoprotein) 및 지질 공정 막 단백질(lipid anchored membrane protein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    막단백질은 검출가능한 모이어티에 의해 레이블링되어 있는 것인
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    막단백질은 형광 단백질과의 융합 단백질이거나; 유기형광염료가 결합될 수 있는 태그와의 융합단백질이면서 상기 융합단백질의 태그에 형광물질이 레이블링되어 있거나; 형광물질이 결합되어 있고, 막 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 프로브에 의해 레이블링되어 있는 상태인
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 캡처 프로브는 항체, 항원-결합 단편, 어피바디, 또는 앱타머인
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 기재는 뉴트라비딘, 스트렙타비딘, 또는 아비딘이 결합되어 있는 것인
    막 단백질의 상호작용 분석 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 캡처 프로브는 항체이고, 비오틴이 결합되어 있는 것인
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 결합 파트너 막단백질의 확산계수는 단일 입자 추적(single particle tracking, SPT)을 통해 막 단백질의 세포막 내 이동 궤적을 탐지함으로써 얻는 것인
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 확산계수는 하기 수학식 1 및 수학식 2를 이용하여 얻는 것인
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
    [수학식 1]
    Figure 112016087101143-pat00003

    (MSD: 이동한 거리 제곱 평균(Mean Square Displacement), Δ: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 지연 시간, Δ는 자연수다, T: 하나의 궤적을 이루는 표적 막 단백질 입자의 좌표의 총 수, (x0, y0): 시작 위치, (xt,yt): 시간 t에서의 위치)
    [수학식 2]
    MSD(Δ) = 4DΔ
    (D: 확산계수,Δ: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 지연 시간)
  10. 제1항에 있어서,
    상기 결합 파트너 막단백질의 확산계수는 FRAP(Fluorescence recovery after photobleaching) 또는 FCS(Fluorescence Correlation Spectroscopy)에 의해 얻는 것인
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 캡처 프로브의 처리에 따른 확산계수 분포의 변화로부터 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 해리상수를 얻는 것을 추가로 포함하는
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 해리상수는 하기 [수학식 3], [수학식 4] 또는 [수학식 5]를 이용하여 얻는 것인
    막단백질의 상호작용 분석 방법.
    [수학식 3]
    KD = [R][I] / [RI]
    [수학식 4]
    KD = [R]0(1-ρR)([I]0-[RI]) / [R]0ρR
    [수학식 5]
    KD = (1-ρR)[I]0 / ρR

    수학식 3에서, [I], [R], [RI]는 각각 표적 막단백질의 농도, 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질의 농도 및 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 복합체의 농도를 나타내고,
    수학식 4에서 [R]0와 [I]0, 그리고 ρR은 각각 상호작용이 발생하기 이전의 초기 표적 막단백질 및 결합 파트너 막단백질의 농도, 캡쳐 프로브 처리 전과 비교하여 처리 후에 증가된 결합 파트너 막단백질의 부분모집단 비율을 나타내며,
    수학식 5에서, ρR은 캡처 프로브 처리 전과 비교하여 처리 후에서 증가된 결합 파트너 막단백질의 부분모집단 비율이고, [I0]는 고정화된 표적 막단백질의 절대 농도를 나타낸다.
  13. 후보약물의 처리에 따른 살아있는 세포에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용의 변화를 분석하는 것을 포함하는 표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법에 있어서,
    분석 대상 세포를 기재 상에 위치시키고,
    상기 분석 대상 세포에 상기 표적 막단백질에 영향을 미칠 것으로 예상되는 후보약물을 처리하고,
    기재와 상기 표적 막단백질 양자에 대한 결합능을 갖는 캡처 프로브를 처리하여 상기 표적 막단백질을 기재 상에 고정시키고,
    상기 캡처 프로브의 처리 전과 후의 상기 결합 파트너 막단백질의 확산계수 분포를 얻고,
    상기 결합 파트너 막 단백질의 확산계수 분포의 변화를 후보약물 무처리군에서의 캡처 프로브 처리 전과 후의 결합 파트너 막단백질의 확산계수 분포의 변화와 비교하여 상기 표적 막단백질과의 상호작용에 대해 영향을 미치는 후보약물을 선별하는 것을 포함하는
    표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 후보약물은 화합물, 핵산, 당, 탄수화물, 지질, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인
    표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법.
  15. 후보약물의 처리에 따른 살아있는 세포에서 표적 막단백질과 상기 표적 막단백질에 대한 결합 파트너 막단백질 간의 상호작용의 변화를 분석하는 것을 포함하는 표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법에 있어서,
    분석 대상 세포를 기재 상에 위치시키고,
    상기 분석 대상 세포에 상기 표적 막단백질에 영향을 미칠 것으로 예상되는 후보약물을 처리하고,
    기재와 상기 표적 막단백질 양자에 대한 결합능을 갖는 캡처 프로브를 처리하여 상기 표적 막단백질을 기재 상에 고정시키고,
    상기 캡처 프로브의 처리 전과 후의 상기 결합 파트너 막단백질의 표적 막단백질에 대한 해리상수를 얻고,
    후보약물 처리에 따른 결합 파트너 막 단백질의 해리상수의 변화를 후보약물 무처리군에서의 캡처 프로브 처리 전과 후의 결합 파트너 막단백질 해리상수의 변화와 비교하여 상기 표적 막단백질과의 상호작용에 대해 영향을 미치는 후보약물을 선별하는 것을 포함하는
    표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 후보약물은 화합물, 핵산, 당, 탄수화물, 지질, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인
    표적 막단백질에 대한 후보약물의 스크리닝 방법.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5578999A (en) * 1998-09-24 2000-04-10 Duke University Method of measuring protein-protein interactions in living cells
WO2009067548A1 (en) * 2007-11-19 2009-05-28 The Regents Of The University Of California Novel assay for inhibitors of egfr
KR20140137296A (ko) * 2013-05-16 2014-12-02 포항공과대학교 산학협력단 초해상도 단일 입자 추적 기술을 통한 실시간 막단백질 세포내 섭취의 분석
KR101568565B1 (ko) * 2014-01-06 2015-11-23 서울대학교산학협력단 이동성이 조절된 탐침이 결합된 지지형 지질 이중층을 포함하는 인공세포막 및 이를 이용하여 분자 간 상호작용을 분석하는 방법

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