JP2020528278A - Ｇタンパク質共役受容体の活性化の変化を測定する方法 - Google Patents

Ｇタンパク質共役受容体の活性化の変化を測定する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】Ｇタンパク質共役受容体の活性化の変化を測定する方法の提供。【解決手段】本発明は、分子がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる能力を決定する方法に関し、上記方法は、ａ）・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、・ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、および上記ＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンドを第一の容器に導入する工程と；ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；ｃ）（ｉ）工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に、あるいは（ｉｉ）試験分子を第一の容器に導入する工程と；ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中または第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程とを含む。【選択図】図２

Description

本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化の変化を測定する新規な方法、例えば、分子がＧＰＣＲの活性化を変化させる能力を決定する方法に関する。本発明による方法によって、ＧＰＣＲ標本において空のＧタンパク質または完全なＧタンパク質の出現または消失を検出することができる。
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、哺乳類および動物界全体に見られる膜受容体ファミリーである。Ｇタンパク質は、ＧＰＣＲにより活性化されるヘテロ３量体タンパク質（α、β、およびγの３つのサブユニット）である。ＧＰＣＲを介して、Ｇタンパク質は、細胞外からのシグナルを細胞内に伝達する役割（すなわち、外的刺激に対する細胞応答）を果たす。その一般に述べられる作用機序を図１に示し、以下に概要を示す。
・休止している不活性状態では、Ｇタンパク質のαサブユニットはヌクレオチドＧＤＰに結合している（ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質）。
・ＧＰＣＲの活性化後、ＧＰＣＲはＧタンパク質のαサブユニットに結合し、以下の２つの工程からなるＧタンパク質活性化プロセスを引き起こす：１）Ｇタンパク質のＧＤＰが放出されて空のＧタンパク質となり、不活性なＧＰＣＲ／空のＧタンパク質複合体が形成される。２）ＧＴＰが結合してＧＴＰ型の活性Ｇタンパク質が形成される（ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質）。第一の工程では、受容体に結合したＧタンパク質は「空の形態」と呼ばれる状態である。文献では、この状態は一過性とされている。というのは、ヌクレオチドＧＴＰが、Ｇタンパク質のαサブユニットにすぐに結合するといわれているからである。また、活性化Ｇタンパク質のβ／γサブユニットがαサブユニットから解離する。
・次いで、ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質のαサブユニットは、エフェクターに結合してエフェクターを活性化する。すると、エフェクターはシグナル伝達経路を活性化して、細胞応答が起こる。
・次いで、ＧＴＰはＧタンパク質αサブユニットにより加水分解されてＧＤＰとなり、αサブユニットはβ／γサブユニットと再結合して、ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質を再形成する（不活性状態）。
異なるエフェクターに対して異なる選択性プロファイルを有し、そのため、優先的シグナル伝達経路の活性化を誘導するＧαタンパク質サブタイプがいくつか存在する。
ＧＰＣＲは、多くの重要な生理学的機能に関与しており、様々な疾患に対する好ましい治療標的の１つと見なされている。したがって、ＧＰＣＲを変化させることができる分子を同定する多くのインビトロスクリーニング試験が開発されている。開発された試験は、それぞれ異なるＧタンパク質活性化機構を利用し、様々な技術を実施するものである（非特許文献１）。
特に、放射性標識リガンドを用いてＧＰＣＲに対するリガンドの親和性を測定する親和性試験、ＧＰＣＲに結合させたシンチグラフィービーズを用いる近接性シンチグラフィー試験、あるいはＧＴＰγＳなどの低加水分解性もしくは非加水分解性ＧＴＰを用いる機能性試験が挙げられる。しかしながら、これらの試験は実施が難しく、膜ろ過工程を必要とする場合もあるため、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイとして用いることが制限される場合もある。
ＧＰＣＲ活性化を確認する他のアッセイも開発されている。これらの試験は、特に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）などの共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）技術に基づいている。例としては、ＧＰＣＲに融合した供与体とＧタンパク質に融合した受容体（特許文献１および特許文献２）、あるいはＧタンパク質αサブユニットに融合した受容体とＧタンパク質βおよび／またはγサブユニットに融合した供与体（非特許文献２）を用いて、ＧＰＣＲとＧタンパク質との相互作用を明らかにするエネルギー移動技術が挙げられる。しかしながら、これら技術は、融合タンパク質の調製を必要とし、細胞により内因的に発現された（すなわち、無修飾および非過剰発現）ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の研究が可能でないため、制限される。一方、受容体により活性化されるＧαタンパク質の各種サブタイプを識別するために、これらの技術は複数の膜試料の調製（Ｇαタンパク質のサブタイプごとの特定の調製）を必要とする。
また、エネルギー移動技術を用いて、Ｇタンパク質のＧＴＰ（活性）型またはＧタンパク質のＧＤＰ（不活性）型の変化を視覚化する試験が開発されている。一例は、ストレプトアビジンタンパク質に結合した供与体に結合するビオチン標識に融合したＧタンパク質、および非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰ類似体に結合した受容体を用いるフォーマットの使用である（特許文献３）。一方、他のフォーマットでは、ＧＴＰ型とＧＤＰ型とを識別し、供与体に結合したストレプトアビジンタンパク質を介して供与体に結合するＢｉｏＫｅｙ（Ｒ）ビオチン化ペプチド（Ｋａｒｏ Ｂｉｏ）が用いられる。受容体は、抗６ＨＩＳ抗体を用いて、６ＨＩＳタグに融合したＧＰＣＲに結合される（特許文献４）。これらの技術もまた、融合タンパク質の調製を必要とし、細胞により内因的に発現されたＧＰＣＲおよびＧタンパク質の研究が可能でないため、制限される。同様に、受容体により活性化されるＧαタンパク質の各種サブタイプを識別するために、これらの技術は複数の膜試料の調製を必要とする。
そして、最後のエネルギー移動フォーマットでは、上記ビオチン化ＢｉｏＫｅｙ（Ｒ）ペプチド（Ｋａｒｏ Ｂｉｏ）が、供与体に結合したストレプトアビジンおよび受容体に結合したＧＴＰγＳ類似体とともに用いられる（非特許文献３）。しかしながら、この最後のフォーマットは、化合物により活性化された際のＧＰＣＲに結合した形態（空のＧタンパク質）と結合していないＧタンパク質の形態（ＧＤＰまたはＧＴＰヌクレオチドに結合したＧタンパク質）とを識別することができない。
したがって、分子がＧＰＣＲ活性化を変化させる能力を容易に決定すること、および／またはどのＧタンパク質サブタイプがＧＰＣＲにより活性化されるかを決定することなどを目的として、ＧＰＣＲ活性化の変化を容易に決定できる高感度で信頼性の高い方法に対するニーズが実在する。
国際公開第２００６／０８６８８３号 国際公開第２００３／００８４３５号 国際公開第２００６／０３５２０８号 国際公開第２００４／０３５６１４号
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＧＰＣＲ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；（２０１２）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂｕｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００３，２６，１６０７７−１６０８２ Ｆｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｈｔｔｐｓ：／／ｓｈｏｐ．ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ．ｃｏｍ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／ｒｅｌａｔｅｄｍａｔｅｒｉａｌｓ／ｐｏｓｔｅｒｓ／ｓｐｓ＿００６９４３ｇｔｐｌａｎｃｅ．ｐｄｆ
本発明は、ＧＰＣＲを変化させることができる分子のインビトロスクリーニングのための新規な方法を提案することを目的とする。この新規な方法は、特に、Ｇタンパク質の完全な形態（ＧＴＰと結合した完全なＧタンパク質、またはＧＤＰと結合した完全なＧタンパク質）とＧタンパク質の空の形態とを識別する能力に基づいており、発明者らの知見では、ＧＰＣＲの活性化を測定するのに今まで用いられたことがなかった手法である。
特に、本発明は以下の利点を有する。１）蛍光に基づく検出方法を用いるので、放射性ではない。２）いかなる洗浄工程も必要としないため、特に化合物のハイスループットスクリーニング作業について、その実施が簡単である。３）特に無修飾ＧおよびＧＰＣＲタンパク質に対して研究が可能である。４）ＧＰＣＲにより活性化されるＧαタンパク質の各種サブタイプを含む同一の膜標本中でこれらの各種サブタイプを識別することができる（識別は、Ｇαタンパク質サブタイプを識別する検出リガンドを用いて行われる）。
第一の態様によれば、本発明は、分子がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる能力を決定する方法であって、
ａ）１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、および上記ＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド
を第一の容器に導入する工程と；
ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｃ）（ｉ）工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に、あるいは（ｉｉ）試験分子を第一の容器に導入する工程と；
ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中または第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、
ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示す、工程と
を含む方法に関する。
第二の態様によれば、本発明は、分子がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる能力を決定する方法であって、
ａ）１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、および上記ＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド、
ＧＰＣＲ作動薬
を第一の容器に導入する工程と；
ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｃ）工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に導入する工程と；
ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、
ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示す、工程と
を含む方法に関する。
第三の態様によれば、本発明は、本発明による方法を実施するためのキットであって、
ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、および上記ＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド；
一連の指示；
任意で上記試薬用の１種以上の希釈緩衝液；
任意でＧＤＰ源またはＧＴＰ源；
任意で１種以上のＧＰＣＲおよび／または１種以上のタンパク質を担持する膜標本；ならびに
任意でＧαタンパク質
を含むキットに関する。
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の活性化の作用機序を示す。 完全なＧタンパク質である初期形態（ＧＤＰ、ＧＴＰ、または非加水分解性／低加水分解性ＧＴＰに結合）と空の最終形態（ヌクレオチドなし）とを識別することによるＧＰＣＲおよび結合したＧタンパク質の活性化の検出の概念を示す。 図３Ａ〜図３Ｄは、本発明による４つの試験フォーマットを示す。 図３Ａ〜図３Ｄは、本発明による４つの試験フォーマットを示す。 図４Ａおよび図４Ｂは、検出リガンド対のビオチン−ＫＢ１７５３／ＳＡ−ＸＬペプチド＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図５Ａおよび図５Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図６Ａおよび図６Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図７Ａおよび図７Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３Ｓ−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図８Ａおよび図８Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ２６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット１Ａによる活性化試験を示す。 図９Ａおよび図９Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ２６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ａによる活性化試験を示す。 検出リガンド対のビオチン−ＫＢ１７５３／ＳＡ−ＸＬペプチド＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示し、４つの異なるＧＰＣＲ（デルタオピオイド、ガラニンＲ１、ＮＯＰ、５ＨＴ１Ａ）および２つの異なる細胞基材（ＨＥＫ２９３およびＣＨＯ−Ｋ１）に対して試験フォーマットを検証したものである。 検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ２６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ａによる活性化試験を示し、ＧＴＰγＳまたはＧＴＰを用いて試験フォーマットを検証したものである。 図１２Ａおよび図１２Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−ｄ２を用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図１３Ａおよび図１３Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ｓｄＡｂ Ｆ１１−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図１４Ａおよび図１４Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ｓｄＡｂ Ｆ４−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図１５Ａおよび図１５Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ｓｄＡｂ Ｇ６−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ｓｄＡｂ Ｂ１１−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図１７Ａおよび図１７Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ｓｄＡｂ Ｆ９−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図１８Ａおよび図１８Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ｓｄＡｂ Ｇ７−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 図１９Ａおよび図１９Ｂは、検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ｓｄＡｂ Ａ１０−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ｂによる活性化試験を示す。 抗Ｇαｉ抗体ｓｄＡｂ Ｅ２−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂの検出リガンド対がＧαタンパク質の空の形態に対してＧαタンパク質の完全なＧＴＰｇＳ形態を特異的に検出する能力を示す。
定義
本発明において、用語「Ｇタンパク質」は、Ｇαタンパク質、Ｇβタンパク質、およびＧγタンパク質という３つのサブユニットからなるヘテロ３量体タンパク質を指す。
本発明において、用語「Ｇαタンパク質」または「Ｇα」は、Ｇタンパク質αサブユニットを指す。Ｇαタンパク質は、ＧＴＰａｓｅドメインおよびαヘリックスドメインという２つのドメインを有する。少なくとも２０個の異なるＧαタンパク質が存在し、以下の主要タンパク質ファミリーに分類することができる：Ｇαｓ（アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰ合成を高めることが知られている）、Ｇαｉ（アデニル酸シクラーゼを阻害することが知られている）、Ｇαｏｌｆ（嗅覚受容体と結合）、Ｇαｔ（ロドプシンと共に網膜で視覚シグナルを伝達することが知られている）、Ｇαｑ（ホスホリパーゼＣを刺激することが知られている）、またはＧα１２／１３ファミリー（細胞骨格、細胞結合、および他の細胞運動に関連するプロセスを制御することが知られている）。本発明の好ましい一実施形態では、Ｇαタンパク質は、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ１、Ｇαｏ２、Ｇαｑ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｓ、Ｇαｚ、Ｇαｔ１、Ｇαｔ２、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６、およびＧαｇｕｓタンパク質から、好ましくはＧαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３タンパク質から選択される。
本発明において、用語「完全なＧαタンパク質」は、ＧＴＰ、非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰ、またはＧＤＰに結合したＧαタンパク質を指す。したがって、この用語は、ＧＤＰに結合したＧαタンパク質（「ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質」）、およびＧＴＰまたは非加水分解性／低加水分解性ＧＴＰに結合したＧαタンパク質（「ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質」）の両方を指す。完全なＧαタンパク質（ＧＤＰまたはＧＴＰに結合）は図１に示されている。
用語「ＧＤＰ」は、グアノシン二リン酸を指す。
用語「ＧＴＰ」は、グアノシン三リン酸を指す。
用語「ＧＴＰ源」は、ＧＴＰおよび／または非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰ、例えばＧＴＰそのものおよび／または非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰそのものを提供する化合物を指す。
用語「ＧＤＰ源」は、ＧＤＰ、例えばＧＤＰそのものを提供する化合物を指す。
用語「非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰ」は、加水分解しない、あるいはゆっくり加水分解してＧＤＰになるＧＴＰの類似体を指す。例としては、ＧＴＰγＳ（ＣＡＳ番号３７５８９−８０−３）、ＧｐｐＮＨｐ（ＣＡＳ番号１４８８９２−９１−５）、またはＧｐｐＣｐ（ＣＡＳ番号１０４７０−５７−２）が挙げられる。用語「ＧＴＰｇＳ」または「ＧＴＰγＳ」は、用語「ＧＴＰガンマＳ」の略語である。
本発明において、用語「空のＧαタンパク質」は、ＧＴＰ、ＧＤＰ、または非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰに結合していないＧαタンパク質を指す。文献では、空のＧαタンパク質は、ＧＤＰに結合した完全な形態とＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰに結合した完全な形態との間の一過性の状態として説明されている。空のＧαタンパク質は図１に示されている。
本発明において、用語「膜標本」は、細胞膜、細胞膜断片、または１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを担持する（あるいは表面に発現する）細胞膜を模倣した人工系を含む標本を指す。したがって、用語「膜標本」には、全細胞、透過処理した全細胞、溶解細胞、精製細胞膜、および１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを担持する（あるいは表面に発現する）ナノディスク（「ナノスケールリン脂質二重層」とも言う）または洗剤混合物を用いて精製および再構成されたＧＰＣＲ／Ｇαタンパク質複合体が含まれる。
本発明による「抗体」は、哺乳類由来（例えば、ヒト、マウス、またはラクダ）、ヒト化、キメラ、組換えであってもよい。好ましくは、当業者に広く知られている技術を用いて遺伝子改変細胞により組換え産生されたモノクローナル抗体である。抗体は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥであってもよい。
本発明による「抗体断片」は、例えば、断片Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性抗体、シングルドメイン抗体、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）から選択してもよい。
用語「シングルドメイン抗体」および「ｓｄＡｂ」は、言い換え可能であり、抗原との結合を１つの可変領域により行う抗体を指す。ｓｄＡｂは、ｉ）抗原に結合することができる重鎖可変領域（ＨＶ）またはその断片を含むか、あるいはそれからなり、任意の他の可変領域とは独立して抗原に結合する抗体、ｉｉ）抗原に結合することができる軽鎖可変領域（ＬＶ）またはその断片を含むか、あるいはそれからなり、任意の他の可変領域とは独立して抗原に結合する抗体、またはｉｉ）抗原に結合することができるＶＨＨ型の重鎖可変領域（ＶＨＨ）またはその断片を含むか、あるいはそれからなり、任意の他の可変領域とは独立して抗原に結合する抗体であってもよい。
本発明において、用語「空の形態に特異的に結合することができるリガンド」および「完全な形態に特異的に結合することができるリガンド」はそれぞれ、Ｇタンパク質の空の形態または完全な形態に優先的に結合することができるリガンドを指す。すなわち、それぞれＧタンパク質の完全な形態または空の形態に比べて、それぞれＧタンパク質の空の形態または完全な形態との親和性が良好な（すなわち、Ｋｄが低い）リガンドである。選択性倍数（他の形態のＫｄに対する優先的に認識される形態のＫｄの比）は、例えば少なくとも２倍である。
本発明において、用語「組み合わせて空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンド」および「組み合わせて完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンド」は、それぞれ以下のものを指す。
１）Ｇαタンパク質の空の形態に優先的に結合することができるリガンド対、すなわち、２つのリガンドのうち少なくとも１つが、単独でまたは第二のリガンドと組み合わせて、Ｇαタンパク質の完全な形態に比べてＧαタンパク質の空の形態に対して良好な親和性（すなわち、低いＫｄ）を有するリガンド対。選択性係数（完全な形態のＫｄに対する空の形態のＫｄの比）は、例えば少なくとも２倍である。
２）Ｇαタンパク質の完全な形態に優先的に結合することができるリガンド対、すなわち、２つのリガンドのうち少なくとも１つが、単独でまたは第二のリガンドと組み合わせて、Ｇαタンパク質の空の形態に比べてＧαタンパク質の完全な形態に対して良好な親和性（すなわち、低いＫｄ）を有するリガンド対。選択性係数（空の形態のＫｄに対する完全な形態のＫｄの比）は、例えば少なくとも２倍である。
また、Ｇαタンパク質の一方の形態に比べてＧαタンパク質の他の形態でより高いＲＥＴシグナルを生成することができるリガンド対であってもよい。ＲＥＴシグナル比（他の形態のＲＥＴシグナルに対する優先的に認識される形態のＲＥＴシグナルの比）は、例えば少なくとも１．３倍である。
本発明において、用語「ＧＰＣＲ活性化を変化させることができる分子」は、ＧＰＣＲを活性化あるいは阻害することができ、したがって、ＧＰＣＲを介した細胞外から細胞内へのシグナルの伝達を誘導あるいは防止することができる分子を指す。上記分子は、作動薬、拮抗薬、逆作動薬、正のアロステリックモジュレーター、または負のアロステリックモジュレーターであってもよい。
本発明において、用語「試験分子」は、ＧＰＣＲ活性化を変化させることができる分子である。
本明細書では、用語「分子」は、さらなる説明がなければ、「ＧＰＣＲ活性化を変化させることができる分子」および「試験分子」の両方を指す。
用語「ＲＥＴ」は、共鳴エネルギー移動を指す。
用語「ＦＲＥＴ」は、蛍光共鳴エネルギー移動を指す。ＦＲＥＴは、エネルギー供与体と受容体との双極子−双極子相互作用から得られる非放射性エネルギー移動として定義される。この物理的現象は、これら分子間のエネルギー互換性を必要とする。これは、供与体の発光スペクトルが受容体の吸収スペクトルと少なくとも部分的に重なっていなければならないことを意味する。フェルスターの理論によると、ＦＲＥＴは、２つの分子、すなわち供与体および受容体の間の距離に依存するプロセスであり、これらの分子が互いに近接していると、ＦＲＥＴシグナルが放出される。
用語「ＢＲＥＴ」は、生物発光共鳴エネルギー移動を指す。
本発明において、用語「リガンド」は、標的分子に特異的かつ可逆的に結合することができる分子を指す。本発明の文脈で、標的分子は空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質である。リガンドは、タンパク質の性質を持つもの（例えば、タンパク質またはペプチド）、またはヌクレオチドの性質を持つもの（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であってもよい。本発明の文脈で、各リガンドは、抗体、抗体断片、ペプチド、またはアプタマーから選択されることが有利である。
本発明において、リガンドは、ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識されている。リガンドは、以下に記載するものなど、当業者によく知られている方法で直接的または間接的に標識されていてもよいが、好ましくは、リガンドは、ＲＥＴパートナー対のメンバーで共有結合により直接的に標識されている。
用語「ＲＥＴパートナー対」は、エネルギー供与体化合物（以降、「供与体化合物」と言う）とエネルギー受容体化合物（以降、「受容体化合物」と言う）とからなる対を指し、これらが互いに近接して供与体化合物の励起波長で励起すると、これら化合物はＲＥＴシグナルを放出する。２つの化合物がＲＥＴパートナーであるためには、供与体化合物の発光スペクトルが受容体化合物の励起スペクトルと部分的に重なっていなければならないことが知られている。例えば、蛍光供与体化合物および受容体化合物を用いる場合は「ＦＲＥＴパートナー対」が用いられ、生物発光供与体化合物および受容体化合物を用いる場合は「ＢＲＥＴパートナー対」が用いられる。
用語「ＲＥＴシグナル」は、供与体化合物と受容体化合物とのＲＥＴを表す任意の測定可能なシグナルを指す。したがって、例えば、ＦＲＥＴシグナルは、蛍光供与体化合物、あるいは受容体化合物が蛍光性である場合は受容体化合物の発光強度または寿命の変分であってもよい。
用語「容器」は、本発明による方法を実施するのに必要な試薬と膜標本とを混合するためのプレートのウェル、試験管などの好適な容器を指す。
方法
第一の態様によれば、本発明は、分子がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる能力を決定する方法に関し、上記方法は、
ａ）
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
・ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、およびＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド
を第一の容器に導入する工程と；
ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｃ）（ｉ）工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に、あるいは（ｉｉ）試験分子を第一の容器に導入する工程と；
ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中または第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示す、工程と
を含む。
第二の態様によれば、本発明は、分子がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる能力を決定する方法に関し、上記方法は、
ａ）
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
・ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、およびＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド、
・ＧＰＣＲ作動薬
を第一の容器に導入する工程と；
ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｃ）工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に導入する工程と；
ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示す、工程と
を含む。
本明細書はまた、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を測定する方法に関し、上記方法は、
ａ）
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
・ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、およびＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド
を第一の容器に導入する工程と；
ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｃ）（ｉ）工程ａ）と同じ試薬、およびＧＰＣＲ活性化を変化させることができる分子を第二の容器に、あるいは（ｉｉ）ＧＰＣＲ活性化を変化させることができる分子を第一の容器に導入する工程と；
ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中または第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、工程ｂ）で得られたシグナルと比較した工程ｄ）で得られたシグナルの増加または減少はＧＰＣＲ活性化の変化を示す、工程と
を含む。
本明細書はまた、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の標本において空のＧタンパク質または完全なＧタンパク質の出現または消失を検出する方法に関し、上記方法は、
ａ）
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを担持する膜標本、
・ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、およびＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド
を第一の容器に導入する工程と；
ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｃ）（ｉ）工程ａ）と同じ試薬、およびＧＰＣＲ活性化を変化させることができる分子を第二の容器に、あるいは（ｉｉ）ＧＰＣＲ活性化を変化させることができる分子を第一の容器に導入する工程と；
ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中または第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、工程ｂ）で得られたシグナルと比較した工程ｄ）で得られたシグナルの増加または減少は、空のＧタンパク質または完全なＧタンパク質の出現または消失を示す、工程と
を含む。
本明細書はまた、分子がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる能力を決定する方法に関し、上記方法は、
ａ）
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
・ＧＤＰ源およびＧＴＰ源、
・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、およびＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド
を第一の容器に導入する工程と；
ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｃ）（ｉ）工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に、あるいは（ｉｉ）試験分子を第一の容器に導入する工程と；
ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中または第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示す、工程と
を含む。
本明細書はまた、分子がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる能力を決定する方法に関し、上記方法は、
ａ）
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
・ＧＤＰ源およびＧＴＰ源、
・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、およびＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド、
・ＧＰＣＲ作動薬
を第一の容器に導入する工程と；
ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｃ）工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に導入する工程と；
ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示す、工程と
を含む。
工程ａ）
本発明の第一の態様によれば、工程ａ）は、以下の３つの要素を第一の容器に導入することからなる。
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
・ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、およびＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド。
第一の態様の一実施形態では、工程ａ）において、第一の容器は試験分子を含まない。この容器は、ＲＥＴシグナルおよび／またはＲＥＴシグナルのバックグラウンドノイズの基底レベルを測定するのに用いられる。
本発明の第二の態様によれば、工程ａ）は、以下の４つの要素を第一の容器に導入することからなる。
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
・ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、およびＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド、
・ＧＰＣＲ作動薬。
好ましい一実施形態では、ＧＴＰ源は、非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰ源であり、好ましくはＧＴＰガンマＳ（ＧＴＰγＳ）、ＧｐｐＮＨｐ、およびＧｐｐＣｐから選択され、好ましくはＧＴＰガンマＳ（ＧＴＰγＳ）である。
好ましい一実施形態では、ＧＤＰ源はＧＤＰである。
本発明による方法は、ＧＴＰ源およびＧＤＰ源の両方を導入するものではないことを理解しなければならない。
各要素を任意の順番で順次、同時、またはほとんど同時に容器に導入してもよい。要素を混合することで、ＲＥＴの実施に適合した反応液を得ることができる。他の要素を容器に加えて、溶液をＲＥＴの実施に適合させてもよい。例えば、セレンテラジンｈ（ベンジルセレンテラジン）、ビスデオキシセレンテラジン（ＤｅｅｐＢｌｕｅＣＴＭ）、ジヒドロセレンテラジン（セレンテラジン−４００ａ）、またはＤ−ルシフェリンを加えてもよい。
各リガンドは、個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる。第一の実施形態では、上記２つのリガンドのそれぞれが個別に空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合してもよい。すなわち、一方のリガンドは、他方のリガンドの存在下および非存在下で空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合してもよい。第二の特定の実施形態では、上記２つのリガンドは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合してもよい。すなわち、上記２つのリガンドの少なくとも一方は、他方のリガンドの存在下でのみ空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合してもよい。
特定の実施形態では、ＧＤＰ源と、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質に特異的に結合することができる各リガンドとが用いられる。この実施形態により、空のＧαタンパク質とＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質とを識別することができる。
他の特定の実施形態では、ＧＤＰ源と、それぞれ個別にまたは組み合わせて完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる各リガンドとが用いられる。この実施形態により、ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質と空のＧαタンパク質とを識別することができる。
他の特定の実施形態では、ＧＴＰ源と、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質に特異的に結合することができる各リガンドとが用いられる。この実施形態により、空のＧαタンパク質とＧＴＰおよび／または非加水分解性／低加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質とを識別することができる。
他の特定の実施形態では、ＧＴＰ源と、それぞれ個別にまたは組み合わせて完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる各リガンドとが用いられる。この実施形態により、ＧＴＰおよび／または非加水分解性／低加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質と空のＧαタンパクとを識別することができる。
Ｇαタンパク質は、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ１、Ｇαｏ２、Ｇαｑ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｓ、Ｇαｚ、Ｇαｔ１、Ｇαｔ２、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６、およびＧαｇｕｓタンパク質から選択されるのが有利であり、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３タンパク質から選択されるのが好ましい。
特定の実施形態では、第一のリガンドはペプチドであり、第二のリガンドは抗体または抗体断片である。例えば、第一のリガンドは、配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号１）を有するペプチド（ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質を特異的に認識するペプチドＫＢ１７５３）であり、第二のリガンドは抗Ｇαｉ抗体である。例えば、抗Ｇαｉ抗体は、供給業者Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの製品＃ＳＣ１３５３３の抗体（空の形態および完全な形態のＧタンパク質を認識するクローンＲ４）である。
他の特定の実施形態では、第一のリガンドおよび第二のリガンドは抗体または抗体断片である。
特定の実施形態では、本発明による方法の実施に用いられる抗体は、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、ＤＳＶ３９Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ（注文に応じてＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手できるＤＳＶ抗体）、および＃ＳＣ１３５３３から選択される。
他の特定の実施形態では、第一のリガンドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９から選択される配列のｓｄＡｂであり、第二のリガンドは抗Ｇαｉ抗体、例えば抗体＃ＳＣ１３５３３またはＤＳＶ３６Ｓ抗体である。
もちろん、第一のリガンドおよび第二のリガンドがＧαタンパク質に結合する場合、これらは競合してはならない。例えば、第一のリガンドおよび第二のリガンドは、Ｇαタンパク質の同じエピトープに結合しない。
当業者であれば、選択した作動薬、試験分子、および／または所望の特性などに応じてＧＰＣＲ作動薬の濃度および試験分子の濃度を適合させるのは困難ではない。
工程ｂ）
本発明の３つの態様によれば、工程ｂ）は、第一の容器中、すなわち工程ａ）で得られた容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定することからなる。測定されたシグナルは、試験分子の非存在下、容器中で得られたシグナルに相当する。この測定は、当業者に広く知られている従来の方法によって行うことができ、特に問題はない。通常、ＴＲ−ＦＲＥＴまたは生物発光読取りモードを備えたＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）など、ＲＥＴシグナルを検出および測定する装置が用いられる。
工程ｃ）
本発明の第一の態様によれば、
・一実施形態では、工程ｃ）は、工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に導入することからなる。有利には、第二の容器は第一の容器と同様に準備されるが、第二の容器には試験分子が存在することのみが異なっている。この実施形態は、第一の容器中および第二の容器中で放出されたＲＥＴシグナルの測定を同時に行うことができるので有利である。この実施形態はまた、１つ以上の第二の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを同時に測定することができる。したがって、この実施形態は、いくつかの異なる分子を並行して試験することができるので特に有利である。
・他の態様では、工程ｃ）は、試験分子を第一の容器に導入することからなる。この実施形態は、本発明による方法を実施するために容器を１つだけしか用いないという利点がある。
特定の実施形態では、シグナルの増減の振幅を変化させるように濃度を高めて試験分子を導入する。
本発明の第二の態様によれば、工程ｃ）は、工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に導入することからなる。有利には、第二の容器は、第一の容器と同様に準備されるが、第二の容器には試験分子が存在することのみが異なっている。したがって、第一の容器および第二の容器中で放出されたＲＥＴシグナルの測定が同時に行われる。これにより、１つ以上の第二の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを同時に測定することもできる。これにより、いくつかの異なる分子を並行して試験することができる。
特定の実施形態では、シグナルの増減の振幅を変化させるように濃度を高めて試験分子またはＧＰＣＲ作動薬を導入する。
工程ｄ）
本発明の３つの態様によれば、工程ｄ）は、工程ｃ）で得られた第二の容器中または第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定することからなる。測定されたシグナルは、試験分子（第二の態様では、±作動薬）の存在下、容器中で得られたシグナルに相当する。工程ｂ）のように、この測定は、当業者に広く知られている従来の方法によって行うことができ、特に問題はない。通常、ＴＲ−ＦＲＥＴまたは生物発光読取りモードを備えたＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）など、ＲＥＴシグナルを検出および測定する装置が用いられる。
工程ｅ）
本発明の３つの態様によれば、工程ｅ）は、工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較することからなる。
当業者であれば、工程ｂ）およびｄ）のシグナルを容易に比較し、増減の定量を可能にする閾値（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％より大きいシグナルの差）を規定することができる。例えば、工程ｂ）およびｄ）のシグナルの比を算出してもよい。一般に、所与のリガンド対について、シグナルの差が大きいほど、シグナルの比が大きく、ＧＰＣＲ活性化の変化（例えば活性化または阻害）も大きい。しかしながら、シグナルの差は、本発明による方法の実施に用いられるリガンド対に応じて変化し得る。ＧＰＣＲ活性化の変化の度合いによって、おおよその作動薬分子、拮抗薬分子、逆作動薬分子、正のアロステリックモジュレーター分子、または負のアロステリックモジュレーター分子を同定することができる。
第一の態様によれば、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示す。
第二の態様によれば、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
・ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示す。
ＲＥＴパートナー対のメンバーによるリガンドの標識
リガンドは、直接的または間接的に標識することができる。
当業者に知られている従来の方法によって、リガンド上の反応性基の存在に基づいて、ＲＥＴパートナー対のメンバー（例えばＦＲＥＴを用いる場合には蛍光化合物など）でリガンドを直接標識することができる。例えば、リガンドが抗体または抗体断片である場合、以下の反応性基を用いてもよい：末端アミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシラート基、リシンのアミノ基、アルギニンのグアニジン基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基、トリプトファンのインドール環、メチオニンのチオエーテル基、ヒスチジンのイミダゾール基。
反応性基は、ＲＥＴパートナー対のメンバーに担持された反応性基と共有結合を形成することができる。ＲＥＴパートナー対のメンバーに担持される適切な反応性基は、当業者によく知られており、例えば、マレイミド基で官能化された供与体化合物または受容体化合物は、例えば、タンパク質またはペプチド（例えば抗体または抗体断片）に担持されたシステインに担持されたチオール基と共有結合することができる。同様に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを担持する供与体／受容体化合物は、タンパク質またはペプチドを含むアミンと共有結合することができる。
また、それ自体は受容体／供与体化合物と共有結合している抗体または抗体断片を測定培地に導入することなどによって、リガンドを蛍光または生物発光化合物で間接的に標識してもよい。この第二の抗体または抗体断片はリガンドを特異的に認識するものである。
他の非常に伝統的な間接標識法は、標識対象のリガンドにビオチンを結合させて、受容体／供与体化合物で標識されたストレプトアビジンの存在下、このビオチン化リガンドをインキュベートすることからなる。適切なビオチン化リガンドは、当業者によく知られている技術により調製することができる。例えば、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓは、商品名「ｄ２」（品番６１０ＳＡＤＬＡ）でフルオロフォア標識ストレプトアビジンを市販している。
本発明の文脈で、第一のリガンドおよび第二のリガンドは、それぞれＲＥＴパートナー対のメンバーで標識されており、上記対のメンバーの一方は蛍光供与体または発光供与体化合物であり、上記対の他方のメンバーは蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）である。
ＦＲＥＴを実施するための標識
特定の実施形態では、第一のリガンドおよび第二のリガンドはそれぞれ、ＦＲＥＴパートナー対のメンバー、すなわち蛍光供与体化合物または蛍光エネルギー受容化合物で標識されている。
ＦＲＥＴシグナルを得るためのＦＲＥＴパートナー対の選択は、当業者の知るところである。例えば、ＦＲＥＴ現象を研究するのに用いることができる供与体／受容体の対は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ３３８）の著作に記載されており、当業者は参照することができる。
蛍光供与体化合物
寿命の長いエネルギー供与蛍光化合物（＞０．１ミリ秒、好ましくは０．５〜６ミリ秒の範囲）、特に希土類キレートまたはクリプテートは、測定培地から放出されたバックグラウンドノイズの大部分を処理する必要がなく、時間分解ＦＲＥＴを行うことができるため、有利である。このため、これらは本発明による方法の実施に一般に好ましい。これら化合物はランタニド錯体であることが有利である。これら錯体（例えば、キレートまたはクリプテート）はエネルギー供与ＦＲＥＴ対のメンバーとして特に好適である。
ユウロピウム（Ｅｕ３＋）、テルビウム（Ｔｂ３＋）、ジスプロシウム（Ｄｙ３＋）、サマリウム（Ｓｍ３＋）、ネオジム（Ｎｄ３＋）、イッテルビウム（Ｙｂ３＋）、またはエルビウム（Ｅｒ３＋）の錯体も、本発明に好適な希土類錯体であり、ユウロピウム（Ｅｕ３＋）およびテルビウム（Ｔｂ３＋）錯体が特に好ましい。
多くの希土類錯体が開示されており、いくつかは現在、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓによって商品化されている。
本発明の目的に好適な希土類キレートまたはクリプテートの例は以下の通りである。
・１つ以上のピリジン単位を含むランタニドクリプテート。そのような希土類クリプテートは、例えば、欧州特許第０１８０４９２号、欧州特許第０３２１３５３号、欧州特許第０６０１１１３号、および国際公開第０１／９６８７７号に記載されている。テルビウム（Ｔｂ３＋）およびユウロピウム（Ｅｕ３＋）のクリプテートは本発明の目的に特に好適である。ランタニドクリプテートは、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓにより市販されている。この例としては、下記式のユウロピウムクリプテート（反応性基（ここでは例えばＮＨ２基）を介して標識対象の化合物に結合させることができる）が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2020528278
Figure 2020528278
Figure 2020528278
Figure 2020528278
・特に米国特許第４，７６１，４８１号、５，０３２，６７７号、５，０５５，５７８号、５，１０６，９５７号、５，１１６，９８９号、４，７６１，４８１号、４，８０１，７２２号、４，７９４，１９１号、４，６３７，９８８号、４，６７０，５７２号、４，８３７，１６９号、４，８５９，７７７号に記載されたランタニドキレート。欧州特許第０４０３５９３号、米国特許第５，３２４，８２５号、米国特許第５，２０２，４２３号、米国特許第５，３１６，９０９号には、テルピリジンなどの九座リガンドからなるキレートが記載されている。ランタニドキレートはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒにより市販されている。
・Ｐｏｏｌｅ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００５，３，１０１３−１０２４“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｅｍｉｓｓｉｖｅ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ”に記載されたものなど、芳香環を有する発色団により置換されたキレート剤（テトラアザシクロドデカンなど）からなるランタニド錯体もまた用いることができる。国際公開第２００９／１０５８０号に記載された錯体もまた用いることができる。
・欧州特許第１１５４９９１号および１１５４９９０号に記載されたランタニドクリプテートもまた利用可能である。
・下記式のテルビウムクリプテート（反応性基（ここでは例えばＮＨ２基）を介して標識対象の化合物に結合させることができる）。その合成は、国際公開第２００８／０６３７２１（８９ページの化合物６ａ）に記載されている。
Figure 2020528278
・Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから市販されているＬｕｍｉｐｈｏｒｅ製テルビウムクリプテートＬｕｍｉ４−Ｔｂ。
・Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ製の下記式の量子色素（反応性基（ここではＮＣＳ）を介して標識対象の化合物に結合させることができる）。
Figure 2020528278
・ルテニウムキレート、特にルテニウムイオンといくつかのビピリジンとからなる錯体（例えばルテニウム（ＩＩ）トリス（２，２’−ビピリジン））。
・Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている下記式のテルビウムキレートＤＴＰＡ−ｃｓ１２４Ｔｂ（反応性基Ｒを介して標識対象の化合物に結合させることができる）。その合成は、米国特許第５，６２２，８２１号に記載されている。
Figure 2020528278
・Ｌａｔｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ １９９７，７５（２）：１４９−１６９）に記載された下記式のテルビウムキレート。
Figure 2020528278
蛍光供与体化合物は、ユウロピウムクリプテート、ユウロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体、およびニトロベンゾオキサジアゾールから選択されるＦＲＥＴパートナーであるのが有利である。
蛍光供与体化合物は、ユウロピウムクリプテート；ユウロピウムキレート；テルビウムキレート；テルビウムクリプテート；ルテニウムキレート；および量子ドットから選択されるＦＲＥＴパートナーであるのが特に有利であり、ユウロピウムおよびテルビウムのキレートおよびクリプテートが特に好ましい。
蛍光受容体化合物
蛍光受容体化合物は、以下の群から選択されてもよい：アロフィコシアニン、特に商品名ＸＬ６６５で知られているもの；発光有機分子、例えば、ローダミン、シアニン（Ｃｙ５など）、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体（「Ｂｏｄｉｐｙ」として市販）、「Ａｔｔｏ」として知られているフルオロフォア、「ＤＹ」として知られているフルオロフォア、「Ａｌｅｘａ」として知られている化合物、ニトロベンゾオキサジアゾール。蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾールから選択されることが有利である。
用語「シアニン」および「ローダミン」はそれぞれ、「シアニン誘導体」および「ローダミン誘導体」として理解されるべきである。当業者は、市場で入手可能なこれらの様々なフルオロフォアを熟知している。
「Ａｌｅｘａ」化合物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより市販されている。「Ａｔｔｏ」化合物はＡｔｔｏｔｅｃにより市販されている。「ＤＹ」化合物はＤｙｏｍｉｃｓにより市販されている。「Ｃｙ」化合物はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより市販されている。他の化合物はＳｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ、またはＡｃｒｏｓなどの様々な化学試薬供給業者により市販されている。
以下の蛍光タンパク質もまた、蛍光受容体化合物として用いることができる：シアン蛍光タンパク質（ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ）、橙色および赤色蛍光タンパク質（Ｏｒａｎｇｅ ｋｕｓｉｂａｒｉ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｔｄｔｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｉｍ、ＡＱ１４３）、近赤外蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｔｄＫａｔｕｓｈｋａ２）。
蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、および量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＦＲＥＴパートナーであることが有利である。
ＢＲＥＴを実施するための標識
特定の実施形態では、第一のリガンドおよび第二のリガンドはそれぞれ、ＢＲＥＴパートナー対のメンバー、すなわち発光供与体化合物または蛍光エネルギー受容化合物で標識されている。
リガンドは、直接的または間接的に標識することができる。
ＢＲＥＴパートナー対のメンバーである発光供与体化合物またはタンパク質型蛍光受容体化合物によりリガンドを直接標識することは、当業者に知られている伝統的な方法により行うことができ、特にＴａｒｉｋ Ｉｓｓａｄ ａｎｄ Ｒａｌｆ Ｊｏｃｋｅｒｓの論文（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｐｐ １９５−２０９，Ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＴＭ ｂｏｏｋ ｓｅｒｉｅｓ ＭＩＭＢ，ｖｏｌｕｍｅ ３３２）に記載されており、当業者は参照することができる。
ＢＲＥＴパートナー対のメンバーである有機分子型蛍光受容体化合物によりリガンドを直接標識することは、当業者に知られている伝統的な方法によって、上述したようにリガンド上の反応性基の存在に基づいて行うことができる。例えば、リガンドが抗体または抗体断片である場合、以下の反応性基を用いてもよい：末端アミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシラート基、リシンのアミノ基、アルギニンのグアニジン基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基、トリプトファンのインドール環、メチオニンのチオエーテル基、ヒスチジンのイミダゾール基。
反応性基は、ＢＲＥＴパートナー対のメンバーに担持された反応性基と共有結合を形成することができる。ＢＲＥＴパートナー対のメンバーに担持された適切な反応性基は、当業者によく知られており、例えば、マレイミド基で官能化された受容体化合物は、タンパク質またはペプチド（例えば抗体または抗体断片）に担持されたシステインに担持されたチオール基と共有結合することができる。同様に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを担持する受容体化合物は、タンパク質またはペプチドを含むアミンと共有結合することができる。
また、それ自体は受容体／供与体化合物に共有結合している抗体または抗体断片を測定培地に導入することなどによって、リガンドを生物発光または蛍光化合物で間接的に標識してもよい。この第二の抗体または抗体断片はリガンドを特異的に認識するものである。
他の非常に伝統的な間接標識法は、標識対象のリガンドにビオチンを結合させて、受容体／供与体化合物で標識されたストレプトアビジンの存在下、このビオチン化リガンドをインキュベートすることからなる。適切なビオチン化リガンドは、当業者によく知られている技術により調製することができる。例えば、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓは、商品名「ｄ２」（品番６１０ＳＡＤＬＡ）でフルオロフォア標識ストレプトアビジンを市販している。
ＢＲＥＴシグナルを得るためのＢＲＥＴパートナー対の選択は、当業者の知るところである。例えば、ＢＲＥＴ現象を研究するのに用いることができる供与体／受容体対は、特にＤａｓｉｅｌ Ｏ．Ｂｏｒｒｏｔｏ−Ｅｓｃｕｅｌａの論文（ＢＩＯＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ ＥＮＥＲＧＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ（ＢＲＥＴ）ＭＥＴＨＯＤＳ ＴＯ ＳＴＵＤＹ Ｇ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＣＯＵＰＬＥＤ ＲＥＣＥＰＴＯＲ−ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＴＹＲＯＳＩＮＥ ＫＩＮＡＳＥ ＨＥＴＥＲＯＲＥＣＥＰＴＯＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；１１７：１４１−１６４）に記載されており、当業者は参照することができる。
発光供与体化合物
特定の実施形態では、発光供与体化合物は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体（Ｒｌｕｃ８）、およびホタルルシフェラーゼから選択されるＢＲＥＴパートナーである。
蛍光受容体化合物
特定の実施形態では、蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ変異体（ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、ｅＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＹＦＰ変異体（ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＢＲＥＴパートナーである。
キット
本発明はまた、本発明による方法を実施するためのキットに関し、上記キットは、
・ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、およびＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド、ならびに
・一連の指示
を含む。
特定の実施形態では、上記キットはＧＤＰ源またはＧＴＰ源をさらに含む。
特定の実施形態では、上記キットは、Ｇαタンパク質、および／または１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本をさらに含む。
上記キットはまた、上記試薬用の希釈緩衝液を含んでいてもよい。
抗Ｇαｉ１タンパク質抗体を得るためのプロトコル
組換えＴＳＴ−Ｇαｉ１タンパク質（ＴＥＶリンカーを介してＮ末端がＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇ（ＴＳＴ）タグ（ＩＢＡ）で標識されたＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｐ６３０９６−１のＧαｉ１タンパク質）をＳｆ９昆虫細胞（上記タンパク質をコードするバキュロウイルスに感染）内で産生してから、ＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇ（ＴＳＴ）タグを介した親和性カラム（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ高容量樹脂（ＩＢＡ、カタログ：２−１２０８−００２））で精製した。
ＧＴＰｇＳを含む緩衝液（ＨＥＰＥＳ：２０ｍＭ、ｐＨ８、ＮａＣｌ：１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２：３ｍＭ、ＣＨＡＰＳ：１１ｍＭ、ＧＴＰｇＳ：１００μＭ）で予め希釈したＴＳＴ−Ｇαｉ１タンパク質の注射によりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。１回目の注射の後、１ヶ月間隔で３回追加免疫した。
各注射後の１５日間、マウスの血管穿刺を行って免疫応答の有無を確認した。
この目的のため、ＥＬＩＳＡ試験を設定した。ＧＴＰｇＳを含む緩衝液（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ：２０ｍＭ、ｐＨ８．５、ＮａＣｌ：１４０ｍＭ、ＥＤＴＡ：２ｍＭ、ＭｇＣｌ２：１０ｍＭ、ＢＳＡ：０．１％、ＧＴＰｇＳ：１μＭ）で予め２０μｇ／ｍＬに希釈したＴＳＴ−Ｇαｉ１タンパク質を、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（Ｒ）ＸＴを含む９６ウェルプレート（ＩＢＡ、カタログ：２−４１０１−００１）にＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇタグを介して吸着させた。この目的のため、１００μｌのタンパク質を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした後、緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。
次に、血管穿刺の１０〜１００万倍の連続希釈液を１００μＬ／ウェル加え、３７℃で２時間インキュベートした。タンパク質に結合していない抗体を緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄工程を行って除去してから、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）に結合した二次マウス抗Ｆｃ抗体（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで１／１０，０００に希釈したＳｉｇｍａ＃Ａ０１６８）を用いて、結合した抗体の検出を行った。３７℃で１時間インキュベートしてから緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、ＨＲＰのＴＭＢ基質（３，３’，５，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ＃Ｔ０４４０）を撹拌下、室温で２０分間インキュベートしてから、４５０ｎｍの比色アッセイによりＨＲＰを測定した。
ＥＬＩＳＡ試験により検出される抗体がＴｗｉｎＳｔｒｅｐＴａｇではなくＧαｉ１タンパク質に対するものであることを確実にするために、ＴｗｉｎＳｔｒｅｐＴａｇで標識した他の直交性タンパク質（ＳＮＡＰＴａｇ−ＴｗｉｎＳｔｒｐｅＴａｇ）の過剰量とプレインキュベートした後に同じ血管穿刺をＥＬＩＳＡ試験で試験した。したがって、抗タグ抗体は直交性標識タンパク質に結合するので、ウェル底部に結合したＧαｉ１タンパク質には結合しない。この場合、ＨＲＰシグナルは検出されないか、あるいはＨＲＰシグナルの減少が検出される。
抗タグ対照群において抗体価が最も良好でシグナル減少が最も少ないマウスを、次のリンパ球ハイブリダイゼーション工程（融合とも言う）に選んだ。マウスの脾臓を回収し、この脾臓に由来するリンパ球と形質細胞の混合物をポリエチレングリコール型細胞融合触媒の存在下で骨髄腫細胞株とインビトロで融合させた。ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）酵素を欠損している変異骨髄腫細胞株を用いて、ハイブリドーマと呼ばれるハイブリッド細胞の選択を行うことができた。これらの細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリン（メトトレキサート）、およびチミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培養することで、融合していない骨髄腫細胞を排除して、目的のハイブリドーマを選択することができた。融合していない脾臓細胞は、インビトロでは増殖することができないので死滅する。したがって、ハイブリドーマのみが生き残った。
次に、これらのハイブリドーマを培養プレートで成長させた。次いで、これらハイブリドーマの上澄みを試験して、抗Ｇαｉ１タンパク質抗体を産生する能力を評価した。この目的のため、上述したＥＬＩＳＡ試験を行った。
Ｇαｉ１タンパク質の各種形態（ＧＤＰに結合した完全な形態か、ＧＴＰｇＳに結合した完全な形態か、空の形態か）間で抗体の選択性を評価するために、１μＭのＧＤＰまたは１μＭのＧＴＰｇＳを含むか、あるいはヌクレオチドを含まない緩衝液中でＴＳＴ−Ｇαｉ１タンパク質をプレインキュベートする条件のもと並行して試験を行った。そして、最も良好なハイブリドーマを限界希釈工程でクローニングして、ハイブリドーマクローンを得た。
次いで、目的のハイブリドーマクローンをマウスに注射（腹腔内注射）して、腹水中に多量の抗体を産生させることができた。
次いで、親和性クロマトグラフィーによってタンパク質Ａを含む樹脂を備えたカラム上で抗体を精製した。
本発明の方法に用いるために、このようにして得られたモノクローナル抗体を上述の方法などによって蛍光プローブで標識した。
材料
●研究した受容体およびＧαｉタンパク質を発現する細胞膜は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入した。下記表に、用いた各種試料の細胞株および品番を示す。
Figure 2020528278
●抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した（カタログ番号ＳＣ１３５３３）。この抗体は、Ｇαタンパク質の３つの形態（空のＧαタンパク質、ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質、およびＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質）に非特異的に結合する。
●ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、ＤＳＶ３９Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ抗体は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓにより生成されたものであり、注文に応じてＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手可能である（それぞれ製品番号ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、ＤＳＶ３９Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ）。これらの抗体を適合したＴＲ−ＦＲＥＴ検出用蛍光プローブ（ｒｅｄ−ｄ２受容体またはＬｕｍｉ４Ｔｂ供与体）で標識した。ビオチン化ペプチドＫＢ１７５３は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓにより生成された。
・ＤＳＶ３６Ｓ抗体は、空のＧαタンパク質およびＧＤＰの形態に比べて、Ｇαタンパク質ＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰの形態に特異的に結合する。
・ＤＳＶ３Ｓ抗体は、ＧＤＰおよびＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰの形態に比べて、空のＧαタンパク質の形態に特異的に結合する。
・ＤＳＶ２６Ｓ抗体は、ＧＤＰおよびＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰの形態に比べて、空のＧαタンパク質の形態に特異的に結合する。
・ＤＳＶ３９Ｓ抗体は、Ｇαタンパク質の３つの形態（空のＧαタンパク質、ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質、およびＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質）に非特異的に結合する。
・ペプチドＫＢ１７５３は、空のＧαタンパク質およびＧＤＰの形態に比べて、Ｇαタンパク質ＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰの形態に特異的に結合する。
・リガンド対のペプチドＫＢ１７５３／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３は、空のＧαタンパク質およびＧＤＰの形態に比べて、Ｇαタンパク質ＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰの形態に特異的に結合する。
・リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３は、空のＧαタンパク質およびＧＤＰの形態に比べて、Ｇαタンパク質ＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰの形態に特異的に結合する。
・リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３は、空のＧαタンパク質およびＧＤＰの形態に比べて、Ｇαタンパク質ＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰの形態に特異的に結合する。
・リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３Ｓ／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓは、空のＧαタンパク質およびＧＤＰの形態に比べて、Ｇαタンパク質ＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰの形態に特異的に結合する。
・リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ２６Ｓは、Ｇαタンパク質ＧＤＰおよびＧＴＰまたは非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰの形態に比べて、空のＧαタンパク質の形態に特異的に結合する。
●赤色受容体ＸＬ６６５で標識したストレプトアビジンは、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓにより生成された（カタログ番号６１０ＳＡＸＬＢ）。
●ＧＴＰ、ＧＤＰ、およびＧＴＰγＳヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（それぞれカタログ番号Ｇ８８７７、Ｇ７１２７、およびＧ８６３４）。
●デルタオピオイドＧＰＣＲ作動薬ＳＮＣ１６２およびデルタオピオイドＧＰＣＲ拮抗薬ナルトリンドールは、Ｔｏｃｒｉｓから購入した（それぞれカタログ番号１５２９および０７４０）。
●３８４ウェル低容量白色プレート（背面白色）は、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅから購入した（カタログ番号７８４０７５）。
方法
●試薬の調製：
すべての試薬を緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ）で希釈した。膜を４倍調製して１μｇ／ウェルで分配した（他の仕様は除く）。ＧＤＰ、ＧＴＰ、またはＧＴＰγＳヌクレオチドおよび試験化合物（作動薬または拮抗薬）を予め混合し、４倍調製して、グラフに記載したウェル中の最終濃度を得た。検出に用いたすべての抗Ｇαｉ試薬を４倍調製して、以下のウェル中の最終濃度にした：ｓｄＡｂｓ−ｄ２（５０ｎＭ）；抗体ＳＣ１３５３３−ｄ２（０．１ｎＭ）；抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（０．２５ｎＭ）；抗体ＤＳＶ３６Ｓ−ｄ２（０．１ｎＭ）；抗体ＤＳＶ３６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（０．２５ｎＭ）；抗体ＤＳＶ３Ｓ−ｄ２（１０ｎＭ）；抗体ＤＳＶ３９Ｓ−ｄ２（１０ｎＭ）；抗体ＤＳＶ２６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（０．２５ｎＭ）；ペプチドＫＢ１７５３−ビオチン（５０ｎＭ）と組み合わせたストレプトアビジン−ＸＬ６６５（ＳＡ−ＸＬ）（２５ｎＭ）（プレートに分配する前に室温で３０分間プレインキュベート）。
●３８４ウェルプレートでの試薬の分配：
・ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を発現する膜：５μＬ
・ヌクレオチド（ＧＤＰ、ＧＴＰ、またはＧＴＰγＳ）±試験化合物（作動薬および／または拮抗薬）：５μＬ
・抗Ｇαｉリガンド−受容体（ｄ２またはＸＬ６６５）：５μＬ
・抗Ｇαｉリガンド−供与体（Ｌｕｍｉ４Ｔｂ）：５μＬ
非特異的シグナル（バックグラウンド蛍光ノイズ）は、２種の検出試薬（供与体および受容体で標識）のみを含み、他の成分は希釈緩衝液で置き換えたウェルで測定した。
●ＨＴＲＦシグナルの読取り：
プレートを２１℃で３時間または２０時間インキュベートし、次いでＨＴＲＦシグナルを以下の構成を有するＰＨＥＲＡｓｔａｒリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で測定した。
・モジュール：ＨＴＲＦ（励起：３３７ｎｍ、発光：６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ）
・励起：レーザー、４０フラッシュ
・読取りウィンドウ：遅延：６０μｓ−積算：４００μｓ
●シグナル処理：
６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの生シグナルから、ＨＴＲＦ比を下記式により算出した。
ＨＴＲＦ比＝（６６５ｎｍでのシグナル／６２０ｎｍでのシグナル）×１０，０００
試験フォーマット
図３Ａは、空のＧαタンパク質形態と、ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質形態との識別（フォーマット１Ａ）を示す。ＧＰＣＲ作動薬によってＧＰＣＲおよびＧαタンパク質が活性化された後、ＲＥＴパートナーで標識された２種のリガンドを用いて、空のＧαタンパク質形態の割合の増加が特異的に検出される。ＧＰＣＲの活性化によりＲＥＴシグナルが増加する。
図３Ｂは、ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質形態と、空のＧαタンパク質形態との識別（フォーマット１Ｂ）を示す。ＧＰＣＲ作動薬によってＧＰＣＲおよびＧαタンパク質が活性化された後、ＲＥＴパートナーで標識された２種のリガンドを用いて、ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質形態の割合の減少（空のＧαタンパク質の割合の増加によるもの）が特異的に検出される。ＧＰＣＲの活性化によりＲＥＴシグナルが減少する。
図３Ｃは、空のＧαタンパク質形態と、ＧＴＰまたはＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態との識別（フォーマット２Ａ）を示す。ＧＰＣＲ作動薬によってＧＰＣＲおよびＧαタンパク質が活性化された後、ＲＥＴパートナーで標識された２種のリガンドを用いて、空のＧαタンパク質形態の割合の増加が特異的に検出される。ＧＰＣＲの活性化によりＲＥＴシグナルが増加する。
図３Ｄは、ＧＴＰまたはＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態と、空のＧαタンパク質形態との識別（フォーマット２Ｂ）を示す。ＧＰＣＲ作動薬によってＧＰＣＲおよびＧαタンパク質が活性化された後、ＲＥＴパートナーで標識された２種のリガンドを用いて、ＧＴＰまたはＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態の割合の減少（空のＧαタンパク質形態の割合の増加によるもの）が特異的に検出される。ＧＰＣＲの活性化によりＲＥＴシグナルが減少する。
実施例１〜４ フォーマット２Ｂによる活性化試験：ＴＲ−ＦＲＥＴパートナーで標識した検出リガンド対を用いたＧＴＰまたはＧＴＰγＳ形態と空の形態との識別
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜を用いて、検出リガンド対が、空のＧαタンパク質に対してＧＴＰまたはＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質を特異的に検出する能力を確認した。膜を過剰のＧＴＰγＳ（１０μＭ）とともにインキュベートして、Ｇタンパク質にヌクレオチドを積載させるか（ＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態）、あるいは緩衝液のみでインキュベートした（空のＧαタンパク質形態）。これらの２つの条件で観察されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の差から、用いた４つの検出リガンド対（ペプチドＫＢ１７５３−ビオチン／ＳＡ−ＸＬ／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（実施例１／図４Ａ）；抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（実施例２／図５Ａ）；抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（実施例３／図６Ａ）；抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３Ｓ−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（実施例４／図７Ａ））によって、ＧＴＰγＳに結合したＧαタンパク質形態と空のＧαタンパク質形態とを識別することができることが示された。
第二の工程では、同じ膜および検出リガンド対を用いて、ＧＰＣＲ作動薬が空の形態のＧαタンパク質の割合を変化させる能力を試験した。デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜をＧＴＰγＳ（１０ｎＭ）およびＧＰＣＲ作動薬（ＳＮＣ１６２、濃度を高めていく）とともにインキュベートした。作動薬による刺激によって生成されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の減少は、空のＧαタンパク質形態の割合が増加したことを意味する。したがって、作動薬により活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰｇＳがＧタンパク質から放出されて、Ｇタンパク質が空の形態となり、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルが減少する。第二の条件では、所定濃度のＧＰＣＲ作動薬ＳＮＣ１６２（１０ｎＭ）での活性化は、ＧＰＣＲ拮抗薬（ナルトリンドール）の濃度が高くなると阻害された。この活性化の阻害は、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加により観察される。これらの結果を図４Ｂ（実施例１）、図５Ｂ（実施例２）、図６Ｂ（実施例３）、および図７Ｂ（実施例４、ここでは第二の条件は実施しなかった）に示す。
実施例５ フォーマット１Ａによる活性化試験：ＴＲ−ＦＲＥＴパートナーで標識した検出リガンド対を用いた空のＧαタンパク質形態とＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質形態との識別
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜を用いて、検出リガンド対が、ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質形態に対して空のＧαタンパク質形態を特異的に検出する能力を確認した。膜を過剰のＧＤＰ（１０μＭ）とともにインキュベートして、Ｇタンパク質にヌクレオチドを積載させるか（ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質形態）、あるいは緩衝液のみでインキュベートした（空のＧαタンパク質形態）。これらの２つの条件で観察されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の差から、用いた検出リガンド対（抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ２６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図８Ａ））によって、空のＧαタンパク質形態とＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質形態とを識別することができることが示された。
第二の工程では、同じ膜および同じ検出リガンド対を用いて、ＧＰＣＲ作動薬が空の形態のＧタンパク質の割合を変化させる能力を試験した。デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜をＧＤＰ（１０μＭ）およびＧＰＣＲ作動薬（ＳＮＣ１６２、濃度を高めていく）とともにインキュベートした。作動薬による刺激によって生成されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加は、空のＧαタンパク質形態の割合が増加したことを意味する。したがって、作動薬により活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＤＰがＧタンパク質から放出されて、Ｇタンパク質が空の形態となり、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルが増加する。第二の条件では、所定濃度のＧＰＣＲ作動薬ＳＮＣ１６２（１０ｎＭ）での活性化は、ＧＰＣＲ拮抗薬（ナルトリンドール）の濃度が高くなると阻害された。この活性化の阻害は、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の減少により観察される。これらの結果を図８Ｂに示す。
実施例６ フォーマット２Ａによる活性化試験：ＴＲ−ＦＲＥＴパートナーで標識した検出リガンド対を用いた空の形態とＧＴＰまたはＧＴＰγＳ形態との識別
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜を用いて、検出リガンド対が、ＧＴＰまたはＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態に対して空のＧαタンパク質形態を特異的に検出する能力を確認した。膜を過剰のＧＴＰγＳ（１０μＭ）とともにインキュベートして、Ｇタンパク質にヌクレオチドを積載させるか（ＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態）、あるいは緩衝液のみでインキュベートした（空のＧαタンパク質形態）。これらの２つの条件で観察されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の差から、用いた検出リガンド対（抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ２６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図９Ａ））によって、空のＧαタンパク質形態とＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態とを識別することができることが示された。
第二の工程では、同じ膜および同じ検出リガンド対を用いて、ＧＰＣＲ作動薬が空の形態のＧタンパク質の割合を変化させる能力を試験した。デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜をＧＴＰγＳ（１０ｎＭ）およびＧＰＣＲ作動薬（ＳＮＣ１６２、濃度を高めていく）とともにインキュベートした。作動薬による刺激によって生成されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加は、空のＧαタンパク質形態の割合が増加したことを意味する。したがって、作動薬により活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰｇＳがＧタンパク質から放出されて、Ｇタンパク質が空の形態となり、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルが増加する。第二の条件では、所定濃度の作動薬ＳＮＣ１６２（１０ｎＭ）での活性化は、ＧＰＣＲ拮抗薬（ナルトリンドール）の濃度が高くなると阻害される。この活性化の阻害は、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の減少により観察される。これらの結果を図９Ｂに示す。
実施例７ 各種ＧＰＣＲおよび細胞株での活性化試験の検証（フォーマット２Ｂの場合：ＴＲ−ＦＲＥＴパートナーで標識した検出リガンド対のペプチドＫＢ１７５３−ビオチン／ＳＡ−ＸＬ／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたＧＴＰまたはＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態と空のＧαタンパク質形態との識別）
４つの異なるＧＰＣＲ（デルタオピオイド、ガラニンＲ１、ＮＯＰ、５ＨＴ１Ａ）および２つの異なる細胞株（ＨＥＫ２９３およびＣＨＯ−Ｋ１）に対して活性化の検出の原理を検証した。
一方においては、デルタオピオイド、ＧＡＬＲ１（ガラニン受容体）、ＮＯＰ（ノシセプチン受容体）、または５ＨＴ１Ａ ＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜（１０μｇ／ウェル）を、ＧＴＰγＳ（１００ｎＭ）のみで、あるいはそれを所定の飽和濃度（１μＭ）の受容体作動薬（それぞれＳＮＣ１６２、ガラニン、ノシセプチン、およびセロトニン）と組み合わせたものとともにインキュベートした。これら４種のＧＰＣＲについて、受容体作動薬による刺激によって生成されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の減少は、空のＧαタンパク質形態の割合が増加したことを意味する。したがって、作動薬により活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰｇＳがＧタンパク質から放出されて、Ｇタンパク質が空の形態となり、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルが減少する。膜をＧＴＰγＳのみでインキュベートする条件のもとでの一方の受容体と他方の受容体とのシグナルの差は、各種膜標本でのＧαｉタンパク質の発現量の差によって説明される。同様に、各種ＧＰＣＲで観察されたシグナル変化の振幅の差は、Ｇαｉタンパク質またはＧＰＣＲの発現量の差によるものであり得る。
他方においては、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３またはＣＨＯ−Ｋ１細胞の膜（１０μｇ／ウェル）を、ＧＴＰγＳ（１００ｎＭ）のみで、あるいはそれを所定の飽和濃度（１μＭ）の受容体作動薬（ＳＮＣ１６２）と組み合わせたものとともにインキュベートした。いずれの細胞株でも、作動薬による刺激によって生成されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の減少は、空のＧタンパク質形態の割合が増加したことを意味する。したがって、作動薬により活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、今度はＧタンパク質が活性化されて、Ｇタンパク質が空の形態になり、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルが低下する。
これらの結果を図１０に示す。
実施例８ 検出リガンド対の抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３９Ｓ−ｄ２＋抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ２６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたフォーマット２Ａによる活性化試験（空のＧαタンパク質形態とＧＴＰまたはＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態との識別）でのＧＴＰγＳとＧＴＰとの比較
デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜（１μｇ／ウェル）を、ＧＴＰγＳまたはＧＴＰ（５０、１０００、または２００００ｎＭ）のみで、あるいはそれを所定の飽和濃度（１μＭ）のＧＰＣＲ作動薬（ＳＮＣ１６２）と組み合わせたものとともにインキュベートした。ヌクレオチドＧＴＰγＳおよびＧＴＰのいずれでも、作動薬による刺激によって生成されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加は、空のＧタンパク質形態の割合が増加したことを意味する。したがって、作動薬により活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰまたはＧＴＰｇＳがＧタンパク質から放出されて、Ｇタンパク質が空の形態となり、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルが増加する。いずれの条件（ＧＴＰγＳおよびＧＴＰ）も作動薬によるＧＰＣＲの活性化の検出に有効である場合、ＧＴＰγＳで観察されるシグナル変化の振幅は、ＧＴＰの場合よりも著しく良好である。このシグナル変化の振幅の差は、ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質形態の不安定さ（すなわち、ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解）により説明される。
これらの結果を図１１に示す。
実施例９ フォーマット２Ｂによる活性化試験：ＴＲ−ＦＲＥＴパートナーで標識した抗体対（抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ）を用いた完全なＧαｉ形態（ＧＴＰまたはＧＴＰγＳ）と空のＧαｉ形態との識別
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜を用いて、検出リガンド対が、空のＧαタンパク質に対してＧＴＰまたはＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質を特異的に検出する能力を確認した。膜を過剰のＧＴＰγＳ（１０μＭ）とともにインキュベートして、Ｇαタンパク質にヌクレオチドを積載させるか（ＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態）、あるいは緩衝液のみでインキュベートした（空のＧαタンパク質形態）。これらの２つの条件で観察されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の差から、用いた検出リガンド対（抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−ｄ２）によって、ＧＴＰγＳに結合したＧαタンパク質形態と空のＧαタンパク質形態とを識別することができることが示された（図１２Ａ）。
第二の工程では、同じ膜および検出リガンド対を用いて、ＧＰＣＲ作動薬が空の形態のＧαタンパク質の割合を変化させる能力を試験した。
第一の条件では、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜をＧＴＰγＳ（１０ｎＭ）およびＧＰＣＲ作動薬（ＳＮＣ１６２、濃度を高めていく）とともにインキュベートした。作動薬による刺激によって生成されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の減少は、空のＧαタンパク質形態の割合が増加したことを意味する。したがって、作動薬により活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰｇＳがＧタンパク質から放出されて、Ｇタンパク質が空の形態となり、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルが減少する。
第二の条件では、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜をＧＴＰγＳ（１０ｎＭ）、所定濃度のＧＰＣＲ作動薬ＳＮＣ１６２（１０ｎＭ）、およびＧＰＣＲ拮抗薬（ナルトリンドール、濃度を高めていく）とともにインキュベートした。したがって、作動薬による活性化は、拮抗薬の濃度が高くなると阻害される。この活性化の阻害は、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加により観察された。
結果を図１２Ｂに示す。
実施例１０ フォーマット２Ｂによる活性化試験：ＴＲ−ＦＲＥＴパートナーで標識したリガンド対を用いた完全なＧαｉ形態（ＧＴＰまたはＧＴＰγＳ）と空のＧαｉ形態との識別
以下の８つのリガンド対を用いた。
・抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｆ１１（配列番号２）／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３；
・抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｆ４（配列番号３）／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３；
・抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｇ６（配列番号４）／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３；
・抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｂ１１（配列番号５）／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３；
・抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｆ９（配列番号６）／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３；
・抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｇ７（配列番号７）／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３；
・抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ａ１０（配列番号８）／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ；
・抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｅ２（配列番号９）／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３。
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜を用いて、リガンド対が、空のＧαｉタンパク質に対してＧＴＰまたはＧＴＰγＳに結合した完全なＧαｉタンパク質を特異的に検出する能力を確認した。膜を過剰のＧＴＰγＳ（１０μＭ）とともにインキュベートして、Ｇαタンパク質にヌクレオチドを積載させるか（ＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態）、あるいは緩衝液のみでインキュベートした（空のＧαタンパク質形態）。これらの２つの条件で観察されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の差から、用いた８つの検出リガンド対によって、ＧＴＰγＳに結合した完全なＧαタンパク質形態と空のＧαタンパク質形態とを識別することができることが示された（抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｆ１１−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図１３Ａ）；抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｆ４−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図１４Ａ）；抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｇ６−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図１５Ａ）；抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｂ１１−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図１６Ａ）；抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｆ９−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図１７Ａ）；抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｇ７−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図１８Ａ）；抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ａ１０−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図１９Ａ）；抗Ｇαｉ ｓｄＡｂ Ｅ２−ｄ２／抗Ｇαｉ抗体ＳＣ１３５３３−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（図２０Ａ））。
第二の工程では、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜および上記８つのリガンド対を用いて、空の形態のＧαタンパク質の割合を測定することにより、ＧＰＣＲ作動薬がＧＰＣＲの活性化を変化させる能力を試験した。
第一の条件では、膜をＧＴＰγＳ（１０ｎＭ）およびＧＰＣＲ作動薬（ＳＮＣ１６２、濃度を高めていく）とともにインキュベートした。作動薬による刺激によって生成されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の減少は、空のＧαタンパク質形態の割合が増加したことを意味する。作動薬により活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰｇＳがＧαタンパク質から放出されて、Ｇαタンパク質が空の形態となり、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルが減少する。
第二の条件では、膜をＧＴＰγＳ（１０ｎＭ）、所定濃度のＧＰＣＲ作動薬ＳＮＣ１６２（１０ｎＭ）、およびＧＰＣＲ拮抗薬（ナルトリンドール、濃度を高めていく）とともにインキュベートした。したがって、作動薬による活性化は、拮抗薬の濃度が高くなると阻害される。この活性化の阻害は、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加により観察された。
結果を図１３Ｂ、図１４Ｂ、図１５Ｂ、図１６Ｂ、図１７Ｂ、図１８Ｂ、および図１９Ｂ（図１９Ｂでは、第二の条件は実施しなかった）に示す。

Claims (15)

  1. 分子がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる能力を決定する方法であって、
    ａ）１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
    ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
    ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、および上記ＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド
    を第一の容器に導入する工程と；
    ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
    ｃ）（ｉ）工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に、あるいは（ｉｉ）試験分子を第一の容器に導入する工程と；
    ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中または第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
    ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、
    ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
    ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
    ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
    ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
    ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
    ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示し、
    ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲ作動薬であることを示し、
    ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲ逆作動薬であることを示す、工程と
    を含む方法。
  2. 分子がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる能力を決定する方法であって、
    ａ）１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧタンパク質とを担持する膜標本、
    ＧＤＰ源またはＧＴＰ源、
    ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、および上記ＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド、
    ＧＰＣＲ作動薬
    を第一の容器に導入する工程と；
    ｂ）第一の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
    ｃ）工程ａ）と同じ試薬および試験分子を第二の容器に導入する工程と；
    ｄ）工程ｃ）で得られた第二の容器中で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程と；
    ｅ）工程ｂ）およびｄ）で得られたシグナルを比較する工程であって、
    ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
    ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
    ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
    ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの作動薬または正のアロステリックモジュレーターであることを示し、
    ＧＤＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
    ＧＤＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
    ＧＴＰ源と、空のＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの減少は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示し、
    ＧＴＰ源と、完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができるリガンドとを用いた場合のシグナルの増加は、上記分子がＧＰＣＲの拮抗薬または負のアロステリックモジュレーターであることを示す、工程と
    を含む方法。
  3. 上記Ｇαタンパク質は、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ１、Ｇαｏ２、Ｇαｑ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｓ、Ｇαｚ、Ｇαｔ１、Ｇαｔ２、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６、およびＧαｇｕｓタンパク質から、好ましくはＧαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３から選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 第一のリガンドおよび第二のリガンドは、抗体、抗体断片、ペプチド、またはアプタマーから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 第一のリガンドはペプチドであり、第二のリガンドは抗体または抗体断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 第一のリガンドおよび第二のリガンドは抗体または抗体断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 第一のリガンドは配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号１）のペプチド（ペプチドＫＢ１７５３）であり、第二のリガンドは抗Ｇαｉ抗体である、請求項５に記載の方法。
  8. 第一のリガンドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９から選択される配列のｓｄＡｂであり、第二のリガンドは抗Ｇαｉ抗体である、請求項６に記載の方法。
  9. 上記ＧＴＰ源は非加水分解性もしくは低加水分解性ＧＴＰであり、好ましくはＧＴＰガンマＳ（ＧＴＰγＳ）、ＧｐｐＮＨｐ、およびＧｐｐＣｐから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 第一のリガンドおよび第二のリガンドはそれぞれ、ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識され、上記対のメンバーの一方は発光供与体化合物または蛍光供与体化合物であり、上記対の他方のメンバーは蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 上記蛍光供与体化合物は、ユウロピウムクリプテート、ユウロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体、およびニトロベンゾオキサジアゾールから選択されるＦＲＥＴパートナーである、請求項１０に記載の方法。
  12. 上記蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＦＲＥＴパートナーである、請求項１０または１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 上記発光供与体化合物は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体（Ｒｌｕｃ８）、およびホタルルシフェラーゼから選択されるＢＲＥＴパートナーである、請求項１０に記載の方法。
  14. 上記蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＢＲＥＴパートナーである、請求項１０または１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    ＲＥＴパートナー対の第一のメンバーで標識されたＧタンパク質αサブユニット（Ｇαタンパク質）の第一のリガンド、および上記ＲＥＴパートナー対の第二のメンバーで標識されたＧαタンパク質の第二のリガンドであって、それぞれ個別にまたは組み合わせて空のＧαタンパク質または完全なＧαタンパク質に特異的に結合することができる第一および第二のリガンド；
    一連の指示；
    任意で上記試薬用の１種以上の希釈緩衝液；
    任意でＧＤＰ源またはＧＴＰ源；
    任意で１種以上のＧＰＣＲおよび／または１種以上のタンパク質を担持する膜標本；ならびに
    任意でＧαタンパク質
    を含むキット。
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