JP2022523099A - Ｇｔｐ類似体を用いてｇタンパク質共役受容体の活性化の変化を測定する方法 - Google Patents

Ｇｔｐ類似体を用いてｇタンパク質共役受容体の活性化の変化を測定する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＧＴＰ類似体を用いてＧタンパク質共役受容体の活性化の変化を測定する方法の提供。【解決手段】本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる分子の能力を測定する方法であって、（ａ）第１容器に、・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを有する膜標本、・ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ源、・上記ＲＥＴパートナー対の第２メンバーで標識した、Ｇタンパク質のαサブユニット（Ｇαタンパク質）のリガンドであって、上記ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質に結合できるリガンド、および・必要に応じてＧＰＣＲアゴニストを導入する工程；（ｂ）上記第１容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程；（ｃ）（ｉ）第２容器に工程（ａ）と同じ試薬および試験対象分子を導入するか、または（ｉｉ）上記第１容器に試験対象分子を導入する工程；（ｄ）工程（ｃ）で得られた第２容器または第１容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程；（ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）で得られた各シグナルを比較する工程であって、工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが変化している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲの活性化を変化させられることを示している工程を有する方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化の変化を測定する新規な方法、例えば、ＧＰＣＲの活性化を変化させる分子の能力を決定する方法に関する。本発明に係る方法によれば、特に、ＧＰＣＲ標本においてＧＴＰ類似体に結合した完全なＧタンパク質の出現または消失を検出できる。
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、哺乳類および動物界全体における膜受容体ファミリーである。Ｇタンパク質は、ＧＰＣＲにより活性化されるヘテロ三量体タンパク質（α、β、およびγの３つのサブユニット）である。ＧＰＣＲを介して、Ｇタンパク質は、細胞外からのシグナルを細胞内に伝達する役割（すなわち、外的刺激に対する細胞応答）を果たす。一般的に述べられるその作用機序を図１に示し、以下に概要を示す。
・休止している不活性状態では、Ｇタンパク質のαサブユニットはヌクレオチドＧＤＰに結合している（ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質）。
・ＧＰＣＲの活性化後、ＧＰＣＲはＧタンパク質のαサブユニットに結合し、以下の２段階で構成されるＧタンパク質活性化プロセスを誘発する。
１）Ｇタンパク質からＧＤＰが放出されて空のＧタンパク質となり、不活性なＧＰＣＲ／空のＧタンパク質複合体が形成される。
２）ＧＴＰが固定されてＧＴＰ型の活性Ｇタンパク質（ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質）が形成される。
第一段階では、受容体に結合したＧタンパク質は「空（から）型」と呼ばれる形態である。文献では、この状態は一過性とされている。というのは、ヌクレオチドＧＴＰが、Ｇタンパク質のαサブユニットへすぐに結合するといわれているからである。また、活性化Ｇタンパク質のβ／γサブユニットがαサブユニットから解離する。
・次いで、ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質のαサブユニットは、エフェクターに結合してエフェクターを活性化する。すると、エフェクターはシグナル伝達経路を活性化し、その結果、細胞応答が起こる。
・次いで、ＧＴＰはＧタンパク質のαサブユニットにより加水分解されてＧＤＰとなり、αサブユニットはβ／γサブユニットと再結合して、ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質を再形成する（不活性状態）。
異なるエフェクターに対して異なる選択性プロファイルを示し、それによって優先的シグナル伝達経路の活性化を誘導するＧαタンパク質サブタイプがいくつか存在する。
ＧＰＣＲは多くの重要な生理学的機能に関与しており、多くの病態に対する好ましい治療標的の１つと見なされている。したがって、ＧＰＣＲを変化させられる分子を同定するために多くのインビトロスクリーニング試験が開発されている。開発された試験は、それぞれ異なるＧタンパク質活性化機構を利用し、様々な技術を採用したものである（非特許文献１）。
特に、放射性標識リガンドを用いてＧＰＣＲに対するリガンドの親和性を測定する親和性試験、ＧＰＣＲに固定したシンチグラフィービーズを用いる近接性シンチグラフィー試験、あるいはＧＴＰγＳなどの低加水分解性もしくは非加水分解性ＧＴＰを用いる機能性試験が挙げられる。しかしながら、これらの試験は実施が難しく、膜ろ過工程を必要とする場合もあるため、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）試験として用いることが制限され得る。
ＧＰＣＲ活性化を検出する他の試験も開発されている。これらの試験は、特に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（非特許文献２）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）（非特許文献３）などのエネルギー移動技術（共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ））に基づいている。これら２つの技術には、エネルギーを供与できる分子（供与体）またはエネルギーを受容できる分子（受容体）という概念が利用される（非特許文献４）。例えば、ＧＰＣＲに融合した供与体とＧタンパク質に融合した受容体とを用いて（特許文献１および特許文献２）、またはＧタンパク質のαサブユニットに融合した受容体とＧタンパク質のβおよび／またはγサブユニットに融合した供与体とを用いて（非特許文献５）、ＧＰＣＲとＧタンパク質との相互作用を検出するエネルギー移動技術が挙げられる。しかしながら、これらの技術は融合タンパク質の調製を必要とし、細胞により内因的に発現された（すなわち、未修飾および非過剰発現の）ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の研究が可能でないため、限定的である。また、受容体により活性化されるＧαタンパク質の各種サブタイプを識別するために、これらの技術は複数の膜試料の調製（Ｇαタンパク質のサブタイプごとの特定の調製）を必要とする。
また、エネルギー移動技術は、Ｇタンパク質の（活性）ＧＴＰ型またはＧタンパク質の（不活性）ＧＤＰ型の変化を視覚化することを目的とした試験の開発にも使用されている。まず、ストレプトアビジンタンパク質に結合した供与体に結合するビオチン標識に融合したＧタンパク質、および非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ類似体に結合した受容体を用いたフォーマットの使用が挙げられる（特許文献３）。また、別のフォーマットでは、ＧＴＰ型とＧＤＰ型とを識別し、供与体に結合したストレプトアビジンタンパク質によって供与体と結合するビオチン化ＢｉｏＫｅｙ（登録商標）ペプチド（ＫａｒｏＢｉｏ）を使用している。受容体は、抗６ＨＩＳ抗体を用いて、６ＨＩＳ標識と融合したＧＰＣＲに結合している（特許文献４）。これらの手法もまた、融合タンパク質の調製を必要とし、細胞により内因的に発現されたＧＰＣＲおよびＧタンパク質の研究が可能でないため、限定的である。同様に、受容体により活性化されるＧαタンパク質の各種サブタイプを識別するために、これらの技術は複数の膜試料の調製を必要とする。
従って、ＧＰＣＲの活性化の変化を容易に決定できる、例えば、ＧＰＣＲの活性化を変化させる分子の能力を容易に決定でき、かつ／またはＧＰＣＲによってＧタンパク質のどのサブタイプが活性化されるかを決定できる高感度で信頼できる方法に対するニーズが実在する。
国際公開第２００６／０８６８８３号 国際公開第２００３／００８４３５号 国際公開第２００６／０３５２０８号 国際公開第２００４／０３５６１４号
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＧＰＣＲ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２０１２，３３，３７２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，４１，１３９１ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９９，９６（１），１５１ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，２００７，９，５８４７ Ｂｕｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００３，２６，１６０７７－１６０８２
本発明は、ＧＰＣＲを変化させられる分子をインビトロスクリーニングする新規な方法の提供を目的とする。この新規な方法は、特に、（ｉ）ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全型のＧαタンパク質と空型のＧタンパク質とを識別する能力、または（ｉｉ）ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全型のＧαタンパク質とＧＤＰに結合した完全型のＧαタンパク質とを識別する能力に基づいている。
特に、本発明の利点としては、（１）蛍光に基づいた検出方法を採用しているため、放射性でない点、（２）洗浄工程を必要としないため、特に化合物をハイスループットスクリーニングする作業において適用が簡便である点、（３）特に未修飾Ｇタンパク質およびＧＰＣＲに作用できる点、および（４）Ｇαタンパク質の各種サブタイプを含む同一の膜標本において、ＧＰＣＲで活性化されたこれらの各種サブタイプを識別できる点（Ｇαタンパク質のサブタイプを識別する検出リガンドを用いて識別できる点）が挙げられる。
第１の態様によれば、本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる分子の能力を測定する方法であって、
（ａ）第１容器に、
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを有する膜標本、
・ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ源、
・上記ＲＥＴパートナー対の第２メンバーで標識した、Ｇタンパク質のαサブユニット（Ｇαタンパク質）のリガンドであって、上記ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質に結合できるリガンド、
・必要に応じてＧＰＣＲアゴニスト
を導入する工程；
（ｂ）上記第１容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程；
（ｃ）（ｉ）第２容器に工程（ａ）と同じ試薬および試験対象分子を導入するか、または（ｉｉ）上記第１容器に試験対象分子を導入する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた上記第２容器または上記第１容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程；
（ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）で得られた各シグナルを比較する工程であって、工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが変化している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲの活性化を変化させられることを示している工程
を有する方法に関する。
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の活性化の作用機序を表す。 本発明に係るアッセイフォーマットを表す。 本発明に係るアッセイフォーマットを表す。 本発明に係るアッセイフォーマットを表す。 本発明に係るアッセイフォーマットを表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－Ｃ３＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対する結合アッセイを表す。 検出ペアＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ａに係る結合アッセイを表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ａに係る活性化試験に対して、膜濃度およびＧＴＰ－供与体濃度が与える影響を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたドーパミンＤ２ ＧＰＣＲに対するフォーマット１Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたドーパミンＤ２ ＧＰＣＲに対するフォーマット１Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）＋ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ｂに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）＋ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ｂに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－Ｌ１８－フルオレセイン＋ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット１Ｂに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５＋ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット２Ｂに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８＋ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット２Ｂに係る活性化試験を表す。 検出ペアＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲに対するフォーマット２Ａに係る活性化試験を表す。
（定義）
本発明の意味において、「Ｇタンパク質」という語は、Ｇαタンパク質、Ｇβタンパク質、およびＧγタンパク質と呼ばれる３つのサブユニットで構成されたヘテロ三量体タンパク質を意味する。
本発明の意味において、「αＧタンパク質」または「Ｇα」という語は、Ｇタンパク質のαサブユニットを意味する。Ｇαタンパク質はＧＴＰアーゼ領域およびアルファヘリックス領域という２つの領域を有する。少なくとも２０種の異なるＧαタンパク質が存在しており、以下の主要なタンパク質ファミリー：Ｇαｓ（アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰの合成を増大させることが知られている）、Ｇαｉ（アデニル酸シクラーゼを阻害することが知られている）、Ｇαｏｌｆ（嗅覚受容体に関与する）、Ｇαｔ（ロドプシンと協調して網膜で視覚信号を伝達することが知られている）、Ｇαｑ（ホスホリパーゼＣを刺激することが知られている）、またはＧα１２／１３（細胞骨格、細胞結合、およびその他の細胞運動に関連するプロセスを制御することが知られている）ファミリーに分類できる。本発明の好ましい実施形態において、上記Ｇαタンパク質は、タンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ１、Ｇαｏ２、Ｇαｑ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｓ、Ｇαｚ、Ｇαｔ１、Ｇαｔ２、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６、およびＧαｇｕｓから選択され、タンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３から選択されることが好ましい。
本発明の意味において、「完全なＧαタンパク質」という語は、ＧＴＰ、非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ（本発明に従って標識したもの、または未標識のもの）、またはＧＤＰに結合したＧαタンパク質を意味する。そして、「ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質」、「非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質」、または「ＧＤＰに結合した完全なＧαタンパク質」と呼ばれる。（ＧＤＰまたはＧＴＰに結合した）完全なＧαタンパク質を図１に表す。本発明の文脈においては、ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識され、Ｇαタンパク質に結合できる非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰを用いているため、ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質を得ることができる。
「ＧＤＰ」という語はグアノシン二リン酸を意味する。
「ＧＴＰ」という語はグアノシン三リン酸を意味する。
「非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ」という語は、ＧＤＰへ加水分解されないまたはほとんど加水分解されないＧＴＰ類似体を意味する。例えば、ＧＴＰγＳ（ＣＡＳ Ｎｏ．３７５８９－８０－３）、ＧｐｐＮＨｐ（ＣＡＳ Ｎｏ．１４８８９２－９１－５）、またはＧｐｐＣｐ（ＣＡＳ Ｎｏ．１０４７０－５７－２）が挙げられる。
「ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ」、「標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ」、または「標識したＧＴＰ類似体」という語は、ＲＥＴパートナー対の供与体メンバーで標識した非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ（「ＧＴＰ－供与体」）またはＲＥＴパートナー対の受容体メンバーで標識した非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ（「ＧＴＰ－受容体」）を意味する。
本発明の意味において、「空のＧαタンパク質」という語は、ＧＴＰ、ＧＤＰ、または非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ（本発明に従って修飾したもの、または未修飾のもの）に結合していないＧαタンパク質、とりわけＲＥＴパートナー対のメンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合していないＧαタンパク質を意味する。文献によれば、空のＧαタンパク質は、ＧＤＰに結合した完全型と、ＧＴＰまたは非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全型との間にある一過性の状態とされている。空のＧαタンパク質を図１に表す。
本発明の意味において、「膜標本」という語は、１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを有する（または表面に発現する）細胞膜、細胞膜の断片、または細胞膜を模倣した人工系を含む標本を意味する。従って、「膜標本」という語は、１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを有する（または表面に発現する）全細胞、透過処理した全細胞、溶解細胞、精製細胞膜、およびナノディスク（「ナノスケールリン脂質二重層」ともいう）または界面活性剤の混合物で精製および再構成したＧＰＣＲ／Ｇαタンパク質複合体を包含する。
「抗体」または「免疫グロブリン」ともいう語は、それぞれ約５０～７０ｋＤａである２本の重鎖（Ｈ鎖という）と、それぞれ約２５ｋＤａである２本の軽鎖（Ｌ鎖という）とで構成され、鎖内および鎖間ジスルフィド架橋で互いに結合しているヘテロ四量体を意味する。各鎖は、Ｎ末端位の可変領域もしくはドメイン（軽鎖の場合はＶＬ、重鎖の場合はＶＨという）と、Ｃ末端位の定常領域（軽鎖の場合は単一ドメイン（ＣＬという）、重鎖の場合は３～４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４という）で構成されている）とで構成されている。各可変領域は一般に、４つの「ヒンジ領域」（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４という）と、抗原への結合に直接的に関与する「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３という）とを有する。
本発明に係る「抗体」は、哺乳類（ヒト、マウス、またはラクダ科等）に由来する抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体であってもよい。当業者によく知られた手法に従って遺伝子組換えされた細胞によって組換え産生されたモノクローナル抗体が好ましい。上記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ等の任意のアイソタイプであってもよく、ＩｇＧが好ましい。
「キメラ抗体」は、軽鎖および重鎖の可変領域の配列が属する種が、軽鎖および重鎖の定常領域の配列の種と異なる抗体を意味する。本発明の目的においては、重鎖および軽鎖の可変領域の配列はマウス由来であり、重鎖および軽鎖の定常領域の配列は非マウス種に属することが好ましい。この点について、定常領域の場合、非マウス哺乳類の種であればいずれも使用可能であり、特にヒト、サル、イノシシ科、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、またはトリが挙げられるが、本リストは網羅的なものではない。本発明に係るキメラ抗体は、ヒトに由来する重鎖および軽鎖の定常領域の配列と、マウスに由来する重鎖および軽鎖の可変領域の配列とを有することが好ましい。
「ヒト化抗体」は、抗原認識に関与する領域（超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ））の配列の一部または全部および場合によってはフレームワーク領域（ＦＲ領域）の所定のアミノ酸が非ヒト由来であり、抗原認識に関与しない定常領域および可変領域の配列がヒト由来である抗体を意味する。
「ヒト抗体」は、軽鎖の可変領域および定常領域、並びに重鎖の可変領域および定常領域の両方について、ヒト配列のみを有する抗体を意味する。
「抗体断片」は、酵素消化または生物生産によって得られた免疫グロブリンの一部であって、少なくとも１つのジスルフィド架橋を有し、全抗体によって認識された抗原に結合できるものを意味し、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性抗体、線状抗体（「単一ドメイン抗体」もしくはｓｄＡｂ、またはナノボディともいう）、単鎖を有する抗体（ｓｃＦｖ等）が挙げられる。ペプシンによる免疫グロブリンの酵素消化によってＦ（ａｂ’）２断片が生成され、Ｆｃ断片がいくつかのペプチドへ分割される。Ｆ（ａｂ’）２は、鎖間ジスルフィド架橋で結合された２つのＦａｂ’断片で形成される。Ｆａｂ部分は、可変領域とＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインとで構成される。Ｆａｂ’断片はＦａｂ領域とヒンジ領域とで構成される。Ｆａｂ’－ＳＨは、ヒンジ領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片を指す。
「親和性」という語は、抗体または抗体断片等の分子と、認識される抗原（例えばＧαタンパク質等の抗原）との非共有相互作用全ての強度を指す。親和性は一般に解離定数（Ｋｄ）で表される。解離定数（Ｋｄ）は、ＦＲＥＴまたはＳＰＲ等のよく知られた方法で測定できる。
本発明の意味において、「同一性」または「相同性」は、比較ウインドウにアラインメントさせた２つの配列を比較して算出する。配列のアラインメントによって、比較ウインドウ中の２つの配列で共通する位置（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を決定できる。従って、共通する位置の数を比較ウインドウ中の全位置数で割り、１００を掛けることで、同一性（％）が得られる。配列同一性（％）の決定は、手動でまたはよく知られたソフトウェアを用いて実施できる。
本発明の具体的な実施形態において、同一性または相同性は、アミノ酸残基の置換が少なくとも１つ、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個であることに相当し、保存的に実施されたアミノ酸残基の置換が少なくとも１つであることが好ましい。「保存的に実施されたアミノ酸残基の置換」は、あるアミノ酸残基を、類似した性質の側鎖を有する別のアミノ酸残基と置き換えることからなる。類似した性質の側鎖を有するアミノ酸のファミリーはよく知られており、例えば、塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジン等）、酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸等）、極性無電荷側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン等）、無極性側鎖（グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等）、β分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシン等）、および芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン等）が挙げられる。
従って、相同な抗体または抗体断片、あるいは「抗体または抗体断片の変異体」（すなわち、同じ機能を有する抗体または抗体断片）は、抗原結合能を失うことなく、定常領域および／または可変領域のレベルで他のアミノ酸と置換可能な特定のアミノ酸を有する。この置換は、抗体または抗体断片をコードするＤＮＡ配列内で実施すること、すなわち、置換は保存的な性質であることが好ましい。当業者は、自身の一般的な知識を用いて、実施可能な置換数とその位置とを決定して、抗体または抗体断片の機能を保存できる。抗体または抗体断片の１つ以上の変異体が抗原に特異的に結合する能力を決定するために、当業者がよく知っており背景技術に記載されているいくつかの好適な方法を採用できる。従って、抗体または抗体断片は、ＥＬＩＳＡ法、アフィニティクロマトグラフィーによる方法等の結合方法でアッセイできる。抗体または抗体断片の変異体は、例えば「ファージディスプレイ」法によって生成でき、これによってファージライブラリを作製できる。「ファージディスプレイ」ライブラリを作製する方法や、必要な機能特性を有する抗体または抗体断片の変異体を標的化する方法として多くの方法が知られている。
本発明の文脈で使用される抗体または抗体断片は、タンパク質Ｇαｉ、Ｇαｏ、および／またはＧαｚに結合すること、例えば、タンパク質Ｇαｉ１、タンパク質Ｇαｉ２、および／またはタンパク質Ｇαｉ３に結合することが有利である。ヒト由来のＧαｉ１タンパク質は、アイソフォーム１の場合は識別子ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６３０９６－１を、アイソフォーム２の場合は識別子ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６３０９６－２を有する。ヒト由来のＧαｉ１タンパク質をコードする遺伝子は、「ＧＮＡＩ１」（遺伝子ＩＤ：２７７０、ＮＣＢＩ）という名称で知られている。
本発明の意味において、「ＧＰＣＲの活性化を変化させられる分子」という語は、ＧＰＣＲを活性化または阻害でき、それによって、ＧＰＣＲを介した細胞外部から細胞内部へのシグナル伝達を誘導したり阻止したりできる分子を意味する。アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、ポジティブアロステリックモジュレーター、またはネガティブアロステリックモジュレーターであってもよい。
本発明の意味において、「試験対象分子」という語は、ＧＰＣＲの活性化を変化させそうな分子である。
本明細書において、「分子」という語は、更に特定されない限り、「ＧＰＣＲの活性化を変化させられる分子」および「試験対象分子」という語の両方を意味する。
「ＲＥＴ（共鳴エネルギー移動、英語でＲｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」という語は、エネルギー移動技術を意味する。
「ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動、英語でＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」という語は、２つの蛍光分子間のエネルギー移動を意味する。ＦＲＥＴは、エネルギー供与体とエネルギー受容体との双極子間相互作用による非放射性エネルギー移動と定義される。この物理現象は当該分子間のエネルギー互換性を必要とする。これは、供与体の発光スペクトルが受容体の吸収スペクトルと少なくとも部分的に重なっていなければならないことを示している。フェルスターの理論によると、ＦＲＥＴは、２つの分子、すなわち供与体および受容体を隔てる距離に依存するプロセスであり、これらの分子が互いに近接していると、ＦＲＥＴシグナルが放出される。
「ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」という語は、生物発光分子と蛍光分子との間のエネルギー移動を意味する。
本発明の意味において、「リガンド」という語は、標的分子に結合できる分子を意味する。本発明の文脈において、標的分子は、ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質である。本発明の文脈において、リガンドは、ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質に結合できる必要がある。しかしながら、リガンドは、ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質に必ずしも特異的ではない。従って、本発明の文脈において使用するリガンドは、ＧＤＰに結合したＧαタンパク質、ＧＴＰに結合したＧαタンパク質、未標識の非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合したＧαタンパク質、又は空のＧαタンパク質に結合できるものであってもよい。リガンドは、タンパク質性（タンパク質またはペプチド等）であってもヌクレオチド性（ＤＮＡまたはＲＮＡ等）であってもよい。本発明の文脈において、リガンドは、抗体、抗体断片、ペプチド、またはアプタマーから、好ましくは抗体または抗体断片から選択されることが有利である。本発明の文脈において、リガンドは、以下で記載するものなどの当業者によく知られた方法で直接的に標識しても間接的に標識してもよいが、ＲＥＴパートナー対のメンバーへの共有結合によってリガンドを直接標識することが好ましい。
「ＲＥＴパートナー対」という語は、エネルギー供与体化合物（以下、「供与体化合物」）とエネルギー受容体化合物（以下、「受容体化合物」）とで構成されるペアを意味する。これらが互いに近接しており、かつ供与体化合物の励起波長で励起される場合、これらの化合物はＲＥＴシグナルを放出する。ＲＥＴパートナーとなる２つの化合物について、供与体化合物の発光スペクトルが受容体化合物の励起スペクトルと部分的に重なっていなければならないことが知られている。例えば、蛍光供与体化合物と受容体化合物とを用いた場合は「ＦＲＥＴパートナー対」と言い、生物発光供与体化合物と受容体化合物とを用いた場合は「ＢＲＥＴパートナー対」と言う。
「ＲＥＴシグナル」という語は、供与体化合物と受容体化合物との間のＲＥＴを表す測定可能なシグナルを意味する。従って、例えば、ＦＲＥＴシグナルは、蛍光供与体化合物または受容体化合物（後者が蛍光性である場合）の発光強度または発光寿命の変化であってもよい。
「容器」という語は、プレートのウェルや試験管等、本発明に係る方法を実施するのに必要な試薬を膜標本と混合するのに好適な容器を意味する。
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる分子の能力を測定する方法であって、
（ａ）第１容器に、
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを有する膜標本、
・ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ源、
・上記ＲＥＴパートナー対の第２メンバーで標識した、Ｇタンパク質のαサブユニット（Ｇαタンパク質）のリガンドであって、上記ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質に結合できるリガンド、
・必要に応じてＧＰＣＲアゴニスト
を導入する工程；
（ｂ）上記第１容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程；
（ｃ）（ｉ）第２容器に工程（ａ）と同じ試薬および試験対象分子を導入するか、または（ｉｉ）上記第１容器に試験対象分子を導入する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた上記第２容器または上記第１容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程；および
（ｅ）工程（ｂ）および工程（ｄ）で得られた各シグナルを比較する工程であって、工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが変化している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲの活性化を変化させられることを示している工程
を有する方法に関する。
本発明に係る方法を実施する場合、標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ以外のＧＴＰ源を加える必要はない。また、本発明に係る方法を実施する場合、標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ以外のＧＴＰ源を加えないことが有利である。
また、本発明に係る方法を実施する場合、ＧＤＰ源を加える必要もない。しかしながら、本発明に係る方法を実施する場合、例えば工程（ａ）において、少量のＧＤＰであれば許容できる。フォーマット１Ａおよび１Ｂ（図２Ａおよび２Ｂ）において、本発明に係る方法を実施する場合、ＧＤＰ源を加えないことが有利である。フォーマット２Ａおよび２Ｂ（図２Ｃおよび２Ｄ）において、ＧＤＰを加えると、アゴニストを含まない条件とアゴニストを含む条件との間でシグナルをより良好に識別できる。
（工程（ａ））
工程（ａ）は、第１容器に、以下の３種または４種の成分：
・１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを有する膜標本、
・ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ源、
・ＲＥＴパートナー対の第２メンバーで標識した、Ｇタンパク質のαサブユニット（Ｇαタンパク質）のリガンドであって、ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質に結合できるリガンド、および
・必要に応じてＧＰＣＲアゴニスト
を導入する工程で構成される。
非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、ＧＴＰガンマＳ（ＧＴＰγＳまたはＧＴＰｇＳ）、ＧｐｐＮＨｐ、およびＧｐｐＣｐから選択されることが有利である。ＧＴＰガンマＳは、第３リン酸（γリン酸）以外の位置で標識する必要がある。３種または４種の成分は、任意の順序で順次容器へ導入してもよいし、同時または略同時に導入してもよい。３種の成分を混合することで、ＲＥＴを実施するのに好適な反応溶液が得られる。その他の成分を容器に加えることで、ＲＥＴの実施に適合した溶液としてもよい。例えば、セレンテラジンｈ（ベンジル－セレンテラジン）、ビスデオキシセレンテラジン（ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ（商標））、ジデヒドロセレンテラジン（セレンテラジン－４００ａ）、またはＤ－ルシフェリンを加えてもよい。
第１の具体的な実施形態において、Ｇαタンパク質のリガンドは、Ｇαタンパク質のＳｗｉｔｃｈＩＩ領域、特にＧαタンパク質のペプチド２１５～２９４に特異的に結合する。例えば、Ｇαタンパク質はＧαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３から選択され、Ｇαタンパク質のリガンドは配列Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｔｒｐ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ（配列番号１）のペプチドＫＢ１７５３である。
第２の具体的な実施形態において、Ｇαタンパク質はＧαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３から選択され、Ｇαタンパク質のリガンドはペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）と競合して当該Ｇαタンパク質に結合する。ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）と競合して当該Ｇαタンパク質に結合するリガンドの能力は、競合法で試験できる。
「競合法」は、ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）とＧαタンパク質との結合を阻止する能力、またはペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）と競合してＧαタンパク質に結合する能力について、Ｇαタンパク質のリガンドを試験する工程で構成される。言い換えれば、ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）と競合してＧαタンパク質に結合するＧαタンパク質のリガンドは、ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）と同じエピトープに結合するか、あるいはペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）により認識されるエピトープに十分に近接していることで、立体障害を理由としてＧαタンパク質のリガンドの結合を阻止できるエピトープに結合する。Ｇαタンパク質のリガンドがペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）と競合するか否かを決定するのには多くの種類の競合法が使用でき、例えばＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。例えば、ＥＬＩＳＡ競合法では、固体表面または細胞に結合した精製Ｇαタンパク質、Ｇαタンパク質に結合する試験対象のＧαタンパク質のリガンド、および標識したペプチドＫＢ１７５３を使用する。通常、参照ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）を（Ｇαタンパク質に対する解離定数Ｋｄに関連して）不飽和濃度で使用し、試験対象のＧαタンパク質のリガンドの濃度を上昇させながらまたは非存在下でシグナルを測定する。対象のＧαタンパク質のリガンドが過剰に存在する場合、ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）とＧαタンパク質との特異的な結合を少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、または７５％以上阻止できる。いくつかの場合、結合は少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、または９７％以上阻止される。
競合法の別の例では、ＴＲ－ＦＲＥＴを採用できる。例えば、ＴＲ－ＦＲＥＴでは、タグ付けおよび精製したＧαタンパク質、Ｇαタンパク質のタグで結合できるＴＲ－ＦＲＥＴパートナー対の第１メンバー（有利には供与体）で標識した抗Ｔａｇリガンド（有利には抗体）、ＴＲ－ＦＲＥＴパートナー対の第２メンバー（有利には、ペプチド上のビオチンおよびストレプトアビジン－受容体により間接的に標識する方法による受容体）で標識したペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）、および試験対象のＧαタンパク質のリガンドを使用する。通常、ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）を（Ｇαタンパク質に対する解離定数Ｋｄに関連して）不飽和濃度で使用し、試験対象のＧαタンパク質のリガンドの濃度を上昇させながらまたは非存在下でＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを測定する。対象のＧαタンパク質のリガンドを試験する場合、ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）とＧαタンパク質との特異的な結合を少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、または７５％以上阻止できる。いくつかの場合、結合は少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、または９７％以上阻止される。試験するＧαタンパク質のリガンドがペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）の結合を阻害する場合、（アロステリック阻害と対照的に）阻害のオルソステリック特性はシルドプロット実験で確認でき、Ｇαタンパク質のリガンドの濃度を上昇させながらまたは非存在下で、標識したペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）のＧαタンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を測定する工程で構成される。Ｇαタンパク質のリガンドの濃度を上昇させるとＫｄが線形で不飽和的に変化する場合、阻害はオルソステリックである（すなわち、ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）とＧαタンパク質のリガンドとがＧαタンパク質の同じエピトープで結合する）。Ｇαタンパク質のリガンドの濃度を上昇させるとＫｄが非線形で飽和的に変化する場合、阻害はアロステリックである（すなわち、ペプチドＫＢ１７５３（配列番号１）とリガンドとがＧαタンパク質の同じエピトープでは結合しない）。
Ｇαタンパク質のリガンドは、抗体または抗体断片であってもよい。
従って、第３の具体的な実施形態において、Ｇαタンパク質のリガンドは、Ｇαタンパク質に結合できる抗体または抗体断片であって、
・配列番号２のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有する重鎖の可変領域、ならびに
・配列番号５のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、ＤＴＳのアミノ酸配列（すなわち、３つのアミノ酸「Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ」、あるいはアスパラギン酸、スレオニン、セリンという３つのアミノ酸）であるＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有する軽鎖の可変領域
を含む抗体または抗体断片である。
Ｇαタンパク質に結合できる抗体または抗体断片の重鎖の可変領域は、
・配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するＦＲ１、
・配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するＦＲ２、
・配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するＦＲ３、および／または
・配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するＦＲ４
を有していてもよい。
Ｇαタンパク質に結合できる抗体または抗体断片の軽鎖の可変領域は、
・配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するＦＲ１、
・配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するＦＲ２、
・配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するＦＲ３、および／または
・配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するＦＲ４
を有していてもよい。
Ｇαタンパク質に結合できる抗体または抗体断片の具体的な実施形態において、
●重鎖の可変領域は、
・配列番号７のアミノ酸配列であるＦＲ１（すなわち、配列番号７のアミノ酸配列と１００％の相同性）、
・配列番号８のアミノ酸配列であるＦＲ２、
・配列番号９のアミノ酸配列であるＦＲ３、および
・配列番号１０のアミノ酸配列であるＦＲ４
を有しており、かつ
●軽鎖の可変領域は、
・配列番号１１のアミノ酸配列であるＦＲ１、
・配列番号１２のアミノ酸配列であるＦＲ２、
・配列番号１３のアミノ酸配列であるＦＲ３、および
・配列番号１４のアミノ酸配列であるＦＲ４
を有している。
Ｇαタンパク質に結合できる抗体または抗体断片の具体的な実施形態において、重鎖の可変領域は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有していてもよく、軽鎖の可変領域は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有していてもよい。
従って、Ｇαタンパク質のリガンドは、
・重鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有しており、
・軽鎖の可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有しており、かつ
・重鎖の可変領域のＣＤＲ１が配列番号２のアミノ酸配列で構成され、重鎖の可変領域のＣＤＲ２が配列番号３のアミノ酸配列で構成され、重鎖の可変領域のＣＤＲ３が配列番号４のアミノ酸配列で構成され、軽鎖の可変領域のＣＤＲ１が配列番号５のアミノ酸配列で構成され、軽鎖の可変領域のＣＤＲ２がＤＴＳのアミノ酸配列で構成され、軽鎖の可変領域のＣＤＲ３が配列番号６のアミノ酸配列で構成されている
抗体または抗体断片であってもよい。
Ｇαタンパク質のリガンドは、重鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列で構成され（すなわち、重鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列と１００％の相同性を有し）、軽鎖の可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列で構成されている抗体または抗体断片であることが有利である。
実施例においてＤＳＶ３６Ｓという番号で記載した抗体（要望に応じてＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手できるＤＶＳ抗体）は、配列番号１５のアミノ酸配列で構成されている重鎖の可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列で構成されている軽鎖の可変領域を有する。
上記した第３の具体的な実施形態に係る、Ｇαタンパク質に結合できる抗体または抗体断片は、以下、第４の具体的な実施形態において「参照抗体または抗体断片」という。
第４の具体的な実施形態において、Ｇαタンパク質のリガンドは、参照抗体または抗体断片と競合してＧαタンパク質に結合する抗体または抗体断片（以下、「競合抗体または抗体断片」）である。
参照抗体または抗体断片と競合してＧαタンパク質に結合する抗体または抗体断片の能力は、競合法で試験できる。「競合法」は、参照抗体または抗体断片と抗原との結合を阻止する能力、あるいは参照抗体または抗体断片と競合して抗原に結合する能力について、抗体（または抗体断片）を試験する工程で構成される。言い換えれば、参照抗体または抗体断片と競合する抗体は、参照抗体または抗体断片と同じエピトープに結合するか、あるいは参照抗体または抗体断片により認識されるエピトープに十分に近接していることで、立体障害を理由として参照抗体または抗体断片の結合を阻止できるエピトープに結合する。
抗体または抗体断片が参照抗体または抗体断片と競合するか否かを決定するのには非常に多くの競合法が使用でき、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイ、直接または間接サンドイッチ法、直接または間接固相放射免疫測定法（ＲＩＡ）、直接または間接固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等が挙げられる。例えば、競合ＥＬＩＳＡ法では、固体表面または細胞に結合した精製抗原、未標識抗原に結合する試験対象抗体、および標識した参照抗体または抗体断片を使用する。通常、参照抗体または抗体断片は、（Ｇαタンパク質に対する解離定数Ｋｄに関連して）不飽和濃度で存在し、試験する抗体または抗体断片の濃度を上昇させながらシグナルを測定する。抗体が過剰に存在する場合、参照抗体または抗体断片と抗原との特異的な結合を少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、または７５％以上阻止または阻害（例えば低減）できる。いくつかの場合、結合は少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、または９７％以上阻害される。
本発明に係る方法で使用される競合抗体または抗体断片は、例えば、参照抗体または抗体断片を用いて実施例２６に記載のプロトコルを実施することで得られる。実施例においてＤＳＶ３８Ｓという番号で記載した抗体（要望に応じてＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手できるＤＶＳ抗体）は、本発明に係る方法で使用できる競合抗体である。
上で定義した参照抗体または抗体断片および競合抗体または抗体断片は、以下、まとめて「本発明に係る方法で使用される抗体または抗体断片」という。
本発明に係る方法で使用される抗体または抗体断片は、単離された形態および／または膜環境に存在する状態のＧαタンパク質に結合でき、例えば、１種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを有する膜由来の標本に存在するＧαタンパク質に結合できる。本発明に係る抗体をＧαタンパク質に結合できるようにするために、Ｇαタンパク質をＧＰＣＲと錯体化させる必要はない。
本発明に係る方法で使用される抗体または抗体断片は、ＦＲＥＴで測定した解離定数（Ｋｄ）が２０ｎＭ以下でＧαタンパク質と結合できる。ＲＥＴを適切に実行するためには、解離定数が２０ｎＭ未満であることが好ましい。本発明に係る方法で使用される抗体または抗体断片は、ＦＲＥＴで測定した解離定数（Ｋｄ）が２０ｎＭ以下、例えば、親和定数が１０ｎＭ以下、もしくは５ｎＭ以下、例えば、０～２０ｎＭ（０を除く）、０～１０ｎＭ（０を除く）、０～５ｎＭ（０を除く）でＧαタンパク質と結合できるのが有利である。本発明に係る抗体または抗体断片のＫｄをＦＲＥＴで測定する方法を実施例２７に記載する。
本発明に係る方法で使用される抗体または抗体断片は、本発明に係る方法を実施する際に特に有利である。
例えば、本発明に係る方法で使用される抗体または抗体断片は、実施例２６に記載したプロトコルを実施して得られる。
本発明者らはまた、本発明に係る方法で使用される抗体または抗体断片がＧαタンパク質のＳｗｉｔｃｈＩＩ領域、より具体的にはＧαタンパク質のペプチド２１５～２９４に結合することを示した。
第１容器はＧＰＣＲアゴニストを含んでいてもよい。ＧＰＣＲアゴニストは文献（例えば、国際公開第２０１１／０１８５８６号の表１）に広範に記載されている。
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は、第１容器、すなわち工程（ａ）で得られた容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程で構成される。測定したシグナルは、試験対象分子の非存在下、容器で得られたシグナルに相当する。測定は当業者によく知られた従来の方法で実施でき、特に問題は生じない。一般に、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）等のＲＥＴシグナルを検出および測定できる装置をＴＲ－ＦＲＥＴまたは生物発光読取りモードで使用する。
（工程（ｃ））
一実施形態において、工程（ｃ）は、第２容器に、工程（ａ）と同じ試薬および試験対象分子を導入する工程で構成される。第２容器は第１容器と同様な方法で準備するが、第２容器には試験対象分子が存在することが唯一の違いであることが有利である。本実施形態は、第１容器および第２容器で放出されたＲＥＴシグナルを同時に測定できる点で有利である。また、本実施形態によれば、１つ以上の第２容器で放出されたＲＥＴシグナルを同時に測定できる。従って、本実施形態は、いくつかの異なる分子を並行して試験できる点で特に有利である。
別の実施形態において、工程（ｃ）は、第１容器に試験対象分子を入れる工程で構成される。本実施形態は、本発明に係る方法を実施するために容器を１つしか使用しないという利点を有する。
（工程（ｄ））
工程（ｄ）は、工程（ｃ）で得られた第２容器または第１容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程で構成される。測定したシグナルは、試験対象分子の存在下、容器で得られたシグナルに相当する。工程（ｂ）と同様に、測定は当業者によく知られた従来の方法で実施でき、特に問題は生じない。一般に、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）等のＲＥＴシグナルを検出および測定できる装置をＴＲ－ＦＲＥＴまたは生物発光読取りモードで使用する。
（工程（ｅ））
工程（ｅ）は、工程（ｂ）および（ｄ）で得られた各シグナルを比較する工程であって、工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが変化している場合、試験対象分子はＧＰＣＲの活性化を変化させられることを示している工程で構成される。シグナルの変化は、シグナルの増加であってもシグナルの低下であってもよい。
当業者であれば、工程（ｂ）および（ｄ）の各シグナルを容易に比較でき、例えばシグナル間の差が５％超、１０％超、１５％超、２０％超、または２５％超であるなど、変化を規定できる閾値を定義できる。例えば、工程（ｂ）および（ｄ）のシグナル比を算出してもよい。一般に、所定のＲＥＴパートナー対についてシグナル間の差が大きいほど、シグナル比が大きくなり、ＧＰＣＲの活性化の変化（例えば、活性化または阻害）が大きくなる。しかしながら、シグナル間の差は、本発明に係る方法を実施するのに使用したＲＥＴパートナー対に応じて変化しやすい。ＧＰＣＲの活性化の変化レベルによって、おおよそアゴニスト、アンタゴニスト、ポジティブアロステリックモジュレーターインバースアゴニスト、またはネガティブアロステリックモジュレーターインバースアゴニストである分子を同定できる。
第１の具体的な実施形態において、第１容器がＧＰＣＲアゴニストを含んでおらず、工程（ｅ）において、工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが低下している場合、試験対象分子がＧＰＣＲアゴニストであることを示している。
第２の具体的な実施形態において、第１容器がＧＰＣＲアゴニストを含み、工程（ｅ）において：
・工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが増大している場合、試験対象分子がＧＰＣＲのアンタゴニストまたはネガティブアロステリックモジュレーターであることを示しており、
・工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが低下している場合、試験対象分子がＧＰＣＲのアゴニストまたはポジティブアロステリックモジュレーターであることを示している。
第３の具体的な実施形態において、第１容器がＧＰＣＲアゴニストを含んでおらず、工程（ｅ）において、工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが増大している場合、試験対象分子がＧＰＣＲアゴニストであることを示している。
第４の具体的な実施形態において、第１容器がＧＰＣＲアゴニストを含み、工程（ｅ）において：
・工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが低下している場合、試験対象分子がＧＰＣＲのアンタゴニストまたはネガティブアロステリックモジュレーターであることを示しており、
・工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが増大している場合、試験対象分子がＧＰＣＲのアゴニストまたはポジティブアロステリックモジュレーターであることを示している。
（ＲＥＴパートナー対のメンバーによるリガンドの標識）
リガンドは、直接標識しても間接的に標識してもよい。
ＲＥＴパートナー対のメンバー（例えば、ＦＲＥＴを実施する場合は蛍光化合物）によるリガンドの直接標識は、リガンド上にある反応性基の存在に基づいた、当業者に知られている従来の方法で実施できる。例えば、リガンドが抗体または抗体断片である場合、以下の反応性基：末端アミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボン酸基、リジンのアミン基、アルギニンのグアニジン基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基、トリプトファンのインドール環、メチオニンのチオエーテル基、ヒスチジンのイミダゾール基を使用できる。
反応性基は、リガンドが有する反応性基と共有結合を形成できる。リガンドが有する好適な反応性基は当業者によく知られており、例えば、マレイミド基で官能化した供与体化合物または受容体化合物は、例えば、抗体または抗体断片等のタンパク質またはペプチドが有するシステインのチオール基に共有結合できる。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを有する供与体／受容体化合物は、タンパク質またはペプチドに存在するアミンに共有結合できる。
リガンドはまた、例えば、それ自体が受容体／供与体化合物に共有結合している抗体または抗体断片（この第２の抗体または抗体断片はリガンドを特異的に認識する）を測定媒体に導入することによって、蛍光または生物発光化合物で間接的に標識してもよい。
別の極めて一般的な間接標識手段は、標識対象のリガンドにビオチンを固定化してから、受容体／供与体化合物で標識したストレプトアビジンの存在下、このビオチン化リガンドをインキュベートする工程で構成される。好適なビオチン化リガンドは、当業者によく知られた手法で調製できる。例えばＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社は、フルオロフォアで標識したストレプトアビジンを「ｄ２」（番号６１０ＳＡＤＬＡ）という商品名で市販している。
本発明の文脈において、リガンドは、（ｉ）蛍光供与体化合物もしくは発光供与体化合物、または（ｉｉ）蛍光受容体化合物もしくは非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識される。リガンドは、蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識されることが好ましい。
（ＲＥＴパートナー対のメンバーによる非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰの標識）
非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、直接標識しても間接的に標識してもよい。非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、直接標識することが好ましい。
ＲＥＴパートナー対のメンバー（例えば、ＦＲＥＴを実施する場合は蛍光化合物）による非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰの直接標識は、非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ上にある反応性基の存在に基づいた方法で実施できる。
反応性基は、ＲＥＴパートナー対のメンバーが有する反応性基と共有結合を形成できる。ＲＥＴパートナー対のメンバーが有する好適な反応性基は当業者によく知られており、例えば、マレイミド基で官能化した供与体化合物または受容体化合物は、例えば、チオール基に共有結合できる。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを有する供与体／受容体化合物はアミンに共有結合できる。
本発明の文脈において、非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、（ｉ）蛍光供与体化合物、または（ｉｉ）蛍光受容体化合物もしくは非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識される。非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、蛍光供与体化合物で標識されることが好ましい。
具体的な実施形態において、非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは蛍光供与体化合物で標識され、Ｇαタンパク質のリガンドは蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識される。別の具体的な実施形態において、非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識され、Ｇαタンパク質のリガンドは蛍光供与体化合物または発光供与体化合物で標識される。
（ＦＲＥＴを実施するための標識）
具体的な実施形態において、リガンドおよび非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰはそれぞれ、ＦＲＥＴパートナー対のメンバー、すなわち蛍光エネルギー供与化合物または蛍光エネルギー受容化合物で標識される。
ＦＲＥＴシグナルを得るためのＦＲＥＴパートナー対の選択は、当業者の能力の範囲内である。例えば、ＦＲＥＴ現象を研究するのに使用可能な供与体／受容体ペアは、特にＪｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚによる研究（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ３３８）に記載されており、当業者はこれを参照できる。
（蛍光供与体化合物）
長続きする（＞０．１ｍｓ、好ましくは０．５～６ｍｓの範囲）蛍光エネルギー供与化合物、特にランタニド錯体、すなわち希土類のキレート、大環状分子、またはクリプテートは、時間分解測定の実施、すなわち、ＴＲ－ＦＲＥＴ（時間分解ＦＲＥＴ）シグナルの測定が可能であるため、測定媒体が放出するバックグラウンドノイズの大部分を排除できる点で有利である。このような理由で、また一般的に、これらの化合物は本発明に係る方法を実施するのに好ましい。これらの化合物はランタニド錯体であることが有利である。これらの錯体（キレートまたはクリプテート等）は、エネルギー供与ＦＲＥＴ対のメンバーとして特に好適である。
ユウロピウム（Ｅｕ３＋）、テルビウム（Ｔｂ３＋）、ジスプロシウム（Ｄｙ３＋）、サマリウム（Ｓｍ３＋）、ネオジム（Ｎｄ３＋）、イッテルビウム（Ｙｂ３＋）、またはエルビウム（Ｅｒ３＋）の錯体も本発明の目的に好適な希土類錯体であり、ユウロピウム（Ｅｕ３＋）およびテルビウム（Ｔｂ３＋）の錯体が特に好ましい。
多くの希土類錯体が記載されており、いくつかはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社から現在市販されている。
本発明の目的に好適な希土類のキレートまたはクリプテートの例としては、以下のものが挙げられる。
・ピリジン単位を１つ以上有するランタニド類のクリプテート。このような希土類のクリプテートは、例えば、欧州特許第０ １８０ ４９２号明細書、欧州特許第０ ３２１ ３５３号明細書、および欧州特許第０ ６０１ １１３号明細書や、国際公開第０１／９６８７７号に記載されている。テルビウム（Ｔｂ３＋）およびユウロピウム（Ｅｕ３＋）のクリプテートは、本発明の目的に特に好適である。ランタニド類のクリプテートはＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社が市販している。特に限定されないが、下記式で表されるユウロピウムのクリプテート（反応性基、例えばここではＮＨ２基を介して標識する化合物に結合させてもよい）が挙げられる。
Figure 2022523099000001
Figure 2022523099000002
Figure 2022523099000003
Figure 2022523099000004
・特に米国特許第４ ７６１ ４８１号明細書、米国特許第５ ０３２ ６７７号明細書、米国特許第５ ０５５ ５７８号明細書、米国特許第５ １０６ ９５７号明細書、米国特許第５ １１６ ９８９号明細書、米国特許第４ ７６１ ４８１号明細書、米国特許第４ ８０１ ７２２号明細書、米国特許第４ ７９４ １９１号明細書、米国特許第４ ６３７ ９８８号明細書、米国特許第４ ６７０ ５７２号明細書、米国特許第４ ８３７ １６９号明細書、米国特許第４ ８５９ ７７７号明細書に記載されたランタニド類のキレート。欧州特許第０ ４０３ ５９３号明細書、米国特許第５ ３２４ ８２５号明細書、米国特許第５ ２０２ ４２３号明細書、米国特許第５ ３１６ ９０９号明細書には、ターピリジン等の９座配位子で構成されるキレートが記載されている。ランタニド類のキレートはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社が市販している。
・Ｐｏｏｌｅ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｅｍｉｓｓｉｖｅ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ”，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００５，３，１０１３－１０２４に記載されたもの等、芳香環を有する発色団で置換されたテトラアザシクロドデカン等のキレート剤で構成されるランタニド錯体も使用できる。国際公開第２００９／１０５８０号に記載の錯体も使用できる。
・欧州特許第１ １５４ ９９１号明細書および欧州特許第１ １５４ ９９０号明細書に記載されたランタニドクリプテートも使用できる。
・下記式：
Figure 2022523099000005
のテルビウムクリプテート（反応性基、例えばここではＮＨ２基を介して標識する化合物に結合させてもよい）およびその合成が国際公開第２００８／０６３７２１号（化合物６ａ、８９頁）に記載されている。
・Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社が市販しているＬｕｍｉｐｈｏｒｅ社のテルビウムクリプテートＬｕｍｉ４－Ｔｂ
・下記式で表されるＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社の量子染料（反応性基、例えばここではＮＣＳ基を介して標識する化合物に結合させてもよい）：
Figure 2022523099000006
・ルテニウムキレート、特に、ルテニウム（ＩＩ）トリス（２，２’－ビピリジン）等のルテニウムイオンといくつかのビピリジンとで構成される錯体
・Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が市販している下記式のテルビウムキレートＤＴＰＡ－ｃｓ１２４Ｔｂ（反応性基Ｒを介して標識する化合物に結合させてもよい）およびその合成が米国特許第５ ６２２ ８２１号明細書に記載されている。
Figure 2022523099000007
・Ｌａｔｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ １９９７，７５（２）：１４９－１６９）に記載された下記式のテルビウムキレート
Figure 2022523099000008
蛍光供与体化合物は、ユウロピウムクリプテート、ユウロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン類、ローダミン類、シアニン類、スクアライン類、クマリン類、プロフラビン類、アクリジン類、フルオレセイン類、ホウ素ジピロメテンの誘導体、およびニトロベンゾオキサジアゾールから選択されるＦＲＥＴパートナーであることが有利である。
蛍光供与体化合物は、ユウロピウムクリプテート、ユウロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、および量子ドットから選択されるＦＲＥＴパートナーであることが特に有利であり、ユウロピウムおよびテルビウムのキレートおよびクリプテートが特に好ましい。
本発明のＦＲＥＴ法で使用できる蛍光供与体化合物で標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、下記一般式（１）および（２ａ、２ｂ、２ｃ）で表される。
Figure 2022523099000009
ＧＴＰ類似体の標識は、ＧＴＰの各種位置：
・リン酸のガンマ位（Ｏ、ＮＨ、ＣＨ２）、または
・リボースの２’位および３’位
で実施できる。
具体的な実施形態において、本発明のＦＲＥＴ法で使用できる蛍光供与体化合物で標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、下記一般式（Ｉ）：
Figure 2022523099000010
 （式中、
Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり；
Ｙ＝Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり；
Ｌは２価のリンカーであり；
Ｌｎ３＋は反応性基Ｇ３を有していてもよいランタニド錯体である）
で表される。
「ランタニド錯体」は、ランタニドファミリーの原子を錯体化できるキレート、大環状分子、クリプテート、または任意の有機種を意味しており、ランタニド（Ｌｎ）はＥｕ、Ｓｍ、Ｔｂ、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｎｄ、Ｅｒから選択される。ランタニドはＴｂ、Ｓｍ、またはＥｕであることが好ましく、ＥｕまたはＴｂが更により好ましい。
Ｙ＝Ｏである化合物はＧＴＰ－ガンマ－Ｏ類似体といわれる。Ｙ＝ＮＨである化合物はＧＴＰ－ガンマ－Ｎ類似体といわれる。Ｙ＝ＣＨ２である化合物はＧＴＰ－ガンマ－Ｃ類似体といわれる。
２価のリンカーＬは、
・直接結合；
・１つ以上の二重または三重結合を含んでいてもよい直鎖状または分岐鎖状の炭素数１～２０、好ましくは炭素数１～８のアルキレン基；
・炭素数５～８のシクロアルキレン基；または
・炭素数６～１４のアリーレン基
から選択され、
上記アルキレン基、シクロアルキレン基、またはアリーレン基は、酸素、窒素、硫黄、リン等のヘテロ原子を１個以上、またはカルバモイル基もしくはカルボキサミド基を１個以上含んでいてもよく、上記アルキレン基、シクロアルキレン基、またはアリーレン基は、１～５個、好ましくは１～３個の炭素数１～８のアルキル基、炭素数６～１４のアリール基、スルホネート基、またはオキソ基で置換されていてもよいことが有利である。
２価のリンカーＬは、以下の基：
Figure 2022523099000011
（式中、ｎ、ｍ、ｐ、ｑは１～１６、好ましくは１～５の整数であり、ｅは１～６、好ましくは１～４の範囲の整数である）から選択されることが更により有利である。
２価のリンカーＬは、直接結合、直鎖状または分岐鎖状の炭素数１～８のアルキレン基、または下記式の基から選択されることが非常に有利である。
Figure 2022523099000012
２価のリンカーＬは、
Figure 2022523099000013
 から選択されることが好ましく、－（ＣＨ２）ｎ－基が極めて特に好ましい。
Ｌ基は、式：
Figure 2022523099000014
 （式中、ｍ、ｎ、およびｐは１～１６、好ましくは１～５の整数である）の基であってもよく、有利である。
反応性基Ｇ３は、以下の基：アクリルアミド、活性化されていてもよいアミン（例えば、カダベリンまたはエチレンジアミン）、活性化エステル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、アジド、アジリジン、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン等のハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、チオール、ケトン、酸ハロゲン化物、スクシンイミジルエステル、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド、グリオキサール、トリアジン、アセチレン基のうちの１つから選択され、特に、式：
Figure 2022523099000015
 （式中、ｗは０～８まで変化し、ｖは０または１に等しく、Ａｒは１～３個のヘテロ原子を含む飽和または不飽和の５または６員複素環であり、ハロゲン原子で置換されていてもよい）の基から選択される基である。
反応性基Ｇ３は、アミン（－ＮＨＢｏｃの形態で保護されていてもよい）、スクシンイミジルエステル、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、ハロトリアジン、イソチオシアネート、マレイミド基、またはカルボン酸（－ＣＯ２Ｍｅ、－ＣＯ２ｔＢｕ基の形態で保護されていてもよい）から選択されることが好ましい。後者の場合、酸を求核種と反応できるようにエステル形態で活性化する必要がある。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、以下に示す錯体のうちの１つから選択されることが有利である。
Figure 2022523099000016
Figure 2022523099000017
Figure 2022523099000018
Figure 2022523099000019
Figure 2022523099000020
Figure 2022523099000021
Figure 2022523099000022
Figure 2022523099000023
Figure 2022523099000024
Figure 2022523099000025
Figure 2022523099000026
Figure 2022523099000027
Figure 2022523099000028
Figure 2022523099000029
Figure 2022523099000030
Figure 2022523099000031
Figure 2022523099000032
Figure 2022523099000033
Figure 2022523099000034
Figure 2022523099000035
Figure 2022523099000036
Figure 2022523099000037
ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ１７、Ｃ２４～Ｃ３２、およびＣ３６～Ｃ４４のうちの１つから選択されることが有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ１７およびＣ３６～Ｃ４４のうちの１つから選択されることがより有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ１７の１つから選択されることが更により有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ４およびＣ１１～Ｃ１７のうちの１つから選択されることが更により有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ１～Ｃ４およびＣ１１のうちの１つから選択されることが更により有利である。ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、錯体Ｃ２または錯体Ｃ３であることが非常に有利である。
上記ＧＴＰ類似体の調製は、文献または２０１９年１月３０日に出願された仏国特許出願公開第１９ ００８５６号明細書に記載されている。
蛍光供与体化合物で標識したＧＴＰ類似体は、以下に示すＧＴＰｇＮ－Ｃ２（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－Ｃ２）、ＧＴＰｇＮ－Ｃ３（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－Ｃ３）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ２）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ１１）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ３）、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２（ＧＴＰ－ガンマ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ２）、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３（ＧＴＰ－ガンマ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ３）、またはＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２）から選択でき、有利である。
Figure 2022523099000038
Figure 2022523099000039
Figure 2022523099000040
Figure 2022523099000041
特に好ましい実施形態において、蛍光供与体化合物で標識したＧＴＰ類似体は、ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２である。
（蛍光受容体化合物）
蛍光受容体化合物は、以下の群：アロフィコシアニン類、特に商品名ＸＬ６６５で知られているもの；ローダミン類、シアニン類（Ｃｙ５等）、スクアライン類、クマリン類、プロフラビン類、アクリジン類、フルオレセイン類、ホウ素ジピロメテンの誘導体（「Ｂｏｄｉｐｙ」という名称で市販）、「Ａｔｔｏ」という名称で知られているフルオロフォア、「ＤＹ」という名称で知られているフルオロフォア、「Ａｌｅｘａ」という名称で知られている化合物、ニトロベンゾオキサジアゾール等の発光有機分子から選択できる。蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン類、ローダミン類、シアニン類、スクアライン類、クマリン類、プロフラビン類、アクリジン類、フルオレセイン類、ホウ素ジピロメテンの誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾールから選択するのが有利である。
「シアニン類」および「ローダミン類」という表現は、それぞれ「シアニン誘導体」および「ローダミン誘導体」として理解されるべきものである。当業者であれは、これらの各種フルオロフォア市販品をよく知っている。
「Ａｌｅｘａ」化合物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が市販している。「Ａｔｔｏ」化合物はＡｔｔｏｔｅｃ社が市販している。「ＤＹ」化合物はＤｙｏｍｉｃｓ社が市販している。「Ｃｙ」化合物はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社が市販している。他の化合物は、Ｓｉｇｍａ社、Ａｌｄｒｉｃｈ社、またはＡｃｒｏｓ社等の様々な化学試薬供給会社が市販している。
以下の蛍光タンパク質も蛍光受容体化合物として使用できる：シアン蛍光タンパク質（ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ）、橙色および赤色蛍光タンパク質（Ｏｒａｎｇｅ ｋｕｓｉｂａｒｉ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｔｄｔｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｉｍ、ＡＱ１４３）、遠赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｔｄＫａｔｕｓｈｋａ２）。
Ｇαタンパク質のリガンドの場合、蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン類、ローダミン類、シアニン類、スクアライン類、クマリン類、プロフラビン類、アクリジン類、フルオレセイン類、ホウ素ジピロメテンの誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、および量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＦＲＥＴパートナーであることが有利である。
標識したＧＴＰ類似体の場合、蛍光受容体化合物は、ローダミン類、シアニン類、スクアライン類、クマリン類、プロフラビン類、アクリジン類、フルオレセイン類、ホウ素ジピロメテンの誘導体、およびニトロベンゾオキサジアゾールから選択されるＦＲＥＴパートナーであることが有利である。
本発明のＦＲＥＴ法で使用できる蛍光受容体化合物で標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、下記一般式（３）および（４ａ、４ｂ、４ｃ）で表される。
Figure 2022523099000042
ＧＴＰ類似体の標識は、ＧＴＰの各種位置：
・リン酸のガンマ位（Ｏ、ＮＨ、ＣＨ２）、または
・リボースの２’位および３’位
で実施できる。
具体的な実施形態において、本発明の方法で使用できる蛍光受容体化合物で標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）（ＧＴＰ－ｇＯ－ヘキシル－Ｃｙ５ ｄｉＳＯ３－）（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ－ＮＵ－８３４－ＣＹ５）、ＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）（ＧＴＰ－ｇＳ－ＥＤＡ－Ｃｙ５）（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ－ＮＵ－１６１０－ＣＹ５）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８（ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８）（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）、ＧＴＰｇＮ－Ｌ１８－フルオレセイン（ＧＴＰ－ｇＮ－ＥＤＡ－ペンチル－フルオレセイン）（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）、およびＧＴＰｇＮ－オクチル－ＣＹ５（ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－Ｃｙ５）（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）から選択でき、下記式で表される。
Figure 2022523099000043
（ＢＲＥＴを実施するための標識）
具体的な実施形態において、リガンドは、ＢＲＥＴパートナー対のメンバー、すなわち、エネルギー供与発光化合物またはエネルギー受容蛍光化合物で標識される。
タンパク質型の発光供与体化合物または蛍光受容体化合物（ＢＲＥＴパートナー対のメンバー）によるリガンドの直接標識は、当業者に知られている従来の方法、特にＴａｒｉｋ ＩｓｓａｄおよびＲａｌｆ Ｊｏｃｋｅｒｓによる論文（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｐｐ １９５－２０９，Ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＴＭ ｂｏｏｋ ｓｅｒｉｅｓ ＭＩＭＢ，ｖｏｌｕｍｅ ３３２）に記載された方法で実施でき、当業者はこれを参照できる。
有機分子型の蛍光受容体化合物（ＢＲＥＴパートナー対のメンバー）によるリガンドまたは非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰの直接標識は、上記の通り、リガンド上にある反応性基の存在に基づいた、当業者に知られている従来の方法で実施できる。
反応性基は、ＢＲＥＴパートナー対のメンバーが有する反応性基と共有結合を形成できる。ＢＲＥＴパートナー対のメンバーが有する好適な反応性基は当業者によく知られており、例えば、マレイミド基で官能化した受容体化合物は、例えば、抗体または抗体断片等のタンパク質またはペプチドが有するシステインのチオール基に共有結合できる。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを有する受容体化合物は、タンパク質またはペプチドに存在するアミンに共有結合できる。
ＢＲＥＴシグナルを得るためのＢＲＥＴパートナー対の選択は、当業者の能力の範囲内である。例えば、ＢＲＥＴ現象を研究するのに使用可能な供与体／受容体ペアは、特にＤａｓｉｅｌ Ｏ．Ｂｏｒｒｏｔｏ－Ｅｓｃｕｅｌａによる論文（ＢＩＯＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ ＥＮＥＲＧＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ（ＢＲＥＴ） ＭＥＴＨＯＤＳ ＴＯ ＳＴＵＤＹ Ｇ ＰＲＯＴＥＩＮ－ＣＯＵＰＬＥＤ ＲＥＣＥＰＴＯＲ－ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＴＹＲＯＳＩＮＥ ＫＩＮＡＳＥ ＨＥＴＥＲＯＲＥＣＥＰＴＯＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；１１７：１４１－１６４）に記載されており、当業者はこれを参照できる。
（発光供与体化合物）
具体的な実施形態において、発光供与体化合物は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼの変異体（Ｒｌｕｃ８）、およびホタルルシフェラーゼから選択されるＢＲＥＴパートナーである。
（蛍光受容体化合物）
具体的な実施形態において、蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン類、ローダミン類、シアニン類、スクアライン類、クマリン類、プロフラビン類、アクリジン類、フルオレセイン類、ホウ素ジピロメテンの誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ変異体（ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、ｅＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＹＦＰ変異体（ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＢＲＥＴパートナーである。
（材料）
・調査中の受容体およびＧαｉタンパク質を発現する細胞膜標本をＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒまたはＥｕｒｏｓｃｒｅｅｎから購入した。以下の表に、使用した各種試料のベース細胞および参照番号をまとめる。
Figure 2022523099000044
・ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓ抗体は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓが作製したものであり、要望に応じてＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手できる（それぞれ番号ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓ）。ＤＳＶ３６Ｓ抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列で構成されている重鎖の可変領域と、配列番号１５のアミノ酸配列で構成されている軽鎖の可変領域とを有する。抗体はＴＲ－ＦＲＥＴ検出に適合した蛍光プローブ（赤色受容体ｄ２または供与体Ｌｕｍｉ４Ｔｂ）で標識した。２つの抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓは、Ｇαｉタンパク質のＳｗｉｔｃｈＩＩ領域のレベルで結合する。
・ヌクレオチドＧＴＰ、ＧＤＰ、およびＧＴＰγＳはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（それぞれカタログ番号Ｇ８８７７、Ｇ７１２７、およびＧ８６３４）。
・ＧＰＣＲアゴニストであるデルタオピオイド（ＳＮＣ１６２）およびドーパミンＤ２Ｓ（ＰＰＨＴ）、並びにＧＰＣＲアンタゴニストであるデルタオピオイド（ナルトリンドール）はＴｏｃｒｉｓから購入した（それぞれカタログ番号１５２９および０７４０）。
・白色底の３８４ウェル低容量白色プレートはＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅから購入した（カタログ番号７８４０７５）。
・供与体または受容体フルオロフォアで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体（ＧＴＰｇＮ－Ｃ２；ＧＴＰｇＮ－Ｃ３；ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２；ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１；ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３；ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２；ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３；ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２；ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５；ＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８）は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓで合成したものである。
・受容体フルオロフォアで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）およびＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）は、それぞれ番号ＮＵ－８３４－ＣＹ５およびＮＵ－１６１０－ＣＹ５でＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
（方法）
（試薬の調製）
試薬はいずれも５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭ、または５００ｍＭ ＮａＣｌ（濃度は各図の凡例に規定）、０、０．５、または１μＭ ＧＤＰ（濃度は各図の凡例に規定）で希釈した。膜は４Ｘで調製して、１ウェルあたり１または１０μｇ分配した（量は各図の凡例に規定）。ヌクレオチドＧＴＰｇＳ（非特異的シグナル条件）は６．６７Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を１００μＭとした。試験化合物（アゴニストまたはアンタゴニスト）は１０Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を図に記載したものとした。検出に使用した抗Ｇαｉ抗体は４Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を下記の通りとした：ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２抗体（１０ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ抗体（０．５または１ｎＭ）；ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２抗体（１０ｎＭ）。供与体または受容体蛍光プローブで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体は４Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を各図の凡例に記載したものとした。
（３８４ウェルプレートにおける試薬の分配）
・ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を発現する膜：５μＬ
・バッファまたはＧＴＰｇＳヌクレオチド（非特異的シグナル条件）：３μＬ
・非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体－供与体または受容体：５μＬ
・抗Ｇαｉ－供与体または受容体リガンド：５μＬ
・バッファまたは試験化合物（アゴニストおよび／またはアンタゴニスト）：２μＬ
過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）を含むウェルで非特異的シグナル（蛍光バックグラウンドノイズ）を測定した。
（ＨＴＲＦシグナルの読取り）
（図で他に規定されていない限り）プレートを２１℃で２０ｈインキュベートした後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて以下の構成でＨＴＲＦシグナルを測定した。
・モジュール：ＨＴＲＦ（励起３３７ｎｍ、発光６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ）
・励起：レーザー４０フラッシュまたはランプ１００フラッシュ
・読取りウインドウ：遅延６０μｓ、積分４００μｓ
（シグナル処理）
６６５ｎｍ（赤色受容体Ｃｙ５の場合）または５２０ｎｍ（緑色受容体ＡＦ４８８またはフルオレセインの場合）および６２０ｎｍでの生シグナルから、以下の式によりＨＴＲＦ比を算出した。
ＨＴＲＦ比＝６６５ｎｍでのシグナルまたは５２０ｎｍでのシグナル／６２０ｎｍでのシグナル×１０，０００
（試験フォーマット）
図２Ａは、ＲＥＴ供与体パートナーで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体とＲＥＴ受容体パートナーで標識した抗Ｇタンパク質リガンドとを用いた試験原理を表し、アゴニスト化合物でＧＰＣＲを活性化することで、供与体ＧＴＰ類似体とＧタンパク質との結合が減少し、その結果、ＲＥＴシグナルが低下する（フォーマット１Ａ）。
図２Ｂは、ＲＥＴ受容体パートナーで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体とＲＥＴ供与体パートナーで標識した抗Ｇタンパク質リガンドとを用いた試験原理を表し、アゴニスト化合物でＧＰＣＲを活性化することで、受容体ＧＴＰ類似体とＧタンパク質との結合が減少し、その結果、ＲＥＴシグナルが低下する（フォーマット１Ｂ）。
図２Ｃは、ＲＥＴ供与体パートナーで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体とＲＥＴ受容体パートナーで標識した抗Ｇタンパク質リガンドとを用いた試験原理を表し、アゴニスト化合物でＧＰＣＲを活性化することで、供与体ＧＴＰ類似体とＧタンパク質との結合が増加し、その結果、ＲＥＴシグナルが増大する（フォーマット２Ａ）。
図２Ｄは、ＲＥＴ受容体パートナーで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体とＲＥＴ供与体パートナーで標識した抗Ｇタンパク質リガンドとを用いた試験原理を表し、アゴニスト化合物でＧＰＣＲを活性化することで、受容体ＧＴＰ類似体とＧタンパク質との結合が増加し、その結果、ＲＥＴシグナルが増大する（フォーマット２Ｂ）。
（実施例１～７：デルタオピオイドＧＰＣＲ（ＤＯＲ）に対するフォーマット１Ａに係る活性化試験（アゴニスト刺激下、ＧＴＰ－供与体および抗Ｇαｉタンパク質抗体－受容体間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが低下））
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３またはＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を用いて、ＧＴＰ－供与体／抗Ｇαｉ抗体－受容体ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を検出した。以下の実験条件を用いた。
・実施例１／図３Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
・実施例２／図４Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
・実施例３／図５Ａ：ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
・実施例４／図６Ａ：ＧＴＰｇＮ－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
・実施例５／図７Ａ：ＧＴＰｇＮ－Ｃ３（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＨＥＫ－ＤＯＲ膜１μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
・実施例６／図８：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＨＥＫ－ＤＯＲ膜１μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
・実施例７／図９：ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＨＥＫ－ＤＯＲ膜１μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比）から、類似体ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２、ＧＴＰｇＮ－Ｃ３、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図３Ａ～図９）。
次に、上記と同じ膜および実験条件を用いて、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質の比率を変化させるＧＰＣＲアゴニストの能力を試験した。アゴニストの刺激により生成されるＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）が低下する場合、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質形態の比率が低下する（すなわち、空のＧαタンパク質形態が増加する）ことを示す。従って、そのアゴニストで活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、Ｇタンパク質からＧＴＰ－供与体が離れて、空型に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが低下する。これらの結果を図３Ｂ（実施例１）、４Ｂ（実施例２）、５Ｂ（実施例３）、６Ｂ（実施例４）、および７Ｂ（実施例５）に表す。このようなアゴニストによるシグナルの変化は、類似体ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３（実施例６）およびＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３（実施例７）では試験しなかった。
（実施例８：膜の濃度およびＧＴＰ－供与体の濃度がデルタオピオイドＧＰＣＲ（ＤＯＲ）に対するフォーマット１Ａに係る活性化試験（アゴニスト刺激下、ＧＴＰ－供与体および抗Ｇαｉタンパク質抗体－受容体間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが低下）に与える影響）
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本（１または１０μｇ／ウェル）を用いて、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２／抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を検出した。ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２は、ウェル中最終２または６ｎＭで使用した。大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比）から、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２類似体はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１０Ａ）。また、左側パネルから、膜量を１ウェルあたり１μｇから１０μｇに増加させると、シグナル振幅（Ｓ／Ｂ＝全シグナル／非特異的シグナル）が増大することが分かる。右側パネルから、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２濃度を２ｎＭから６ｎＭに増加させると、シグナル振幅（Ｓ／Ｂ）が増大することが分かる。
次に、上記と同じ膜および実験条件を用いて、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質の比率を変化させるＧＰＣＲアゴニストの能力を試験した。アゴニストの刺激により生成されるＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）が低下する場合、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質形態の比率が低下する（すなわち、空のＧαタンパク質形態が増加する）ことを示す。従って、そのアゴニストで活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、Ｇタンパク質からＧＴＰ－供与体が離れて、空型に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが低下する。これらの結果を図１０Ｂに表す。また、左側パネルから、膜量を１ウェルあたり１μｇから１０μｇに増加させると、シグナル振幅（Ｓ／Ｂ＝アゴニストなしのビヒクルのシグナル／アゴニストシグナル）が増大することが分かる。右側パネルから、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２濃度を２ｎＭから６ｎＭに増加させると、シグナル振幅（Ｓ／Ｂ）が増大することが分かる。
（実施例９および１０：ドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲ（Ｄ２Ｓ）に対するフォーマット１Ａに係る活性化試験（アゴニスト刺激下、ＧＴＰ－供与体および抗Ｇαｉタンパク質抗体－受容体間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが低下））
まず、ドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を用いて、ＧＴＰ－供与体／抗Ｇαｉ抗体－受容体ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を検出した。以下の実験条件を用いた。
・実施例９／図１１Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－Ｄ２Ｓ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
・実施例１０／図１２Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－Ｄ２Ｓ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比）から、類似体ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２およびＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１１Ａ～図１２Ａ）。
次に、上記と同じ膜および実験条件を用いて、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質の比率を変化させるＧＰＣＲアゴニストの能力を試験した。アゴニストの刺激により生成されるＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）が低下する場合、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質形態の比率が低下する（すなわち、空のＧαタンパク質形態が増加する）ことを示す。従って、そのアゴニストで活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、Ｇタンパク質からＧＴＰ－供与体が離れて、空型に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが低下する。これらの結果を図１１Ｂ（実施例９）および１２Ｂ（実施例１０）に表す。
（実施例１１～１３：デルタオピオイドＧＰＣＲ（ＤＯＲ）に対するフォーマット１Ｂに係る活性化試験（アゴニスト刺激下、ＧＴＰ－受容体および抗Ｇαｉタンパク質抗体－供与体間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが低下））
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞膜標本を用いて、ＧＴＰ－受容体／抗Ｇαｉ抗体－供与体ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を検出した。以下の実験条件を用いた。
・実施例１１／図１３Ａ：ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）（ウェル中最終２５０ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（ウェル中最終０．２５ｎＭ）；ＨＥＫ－ＤＯＲ膜１μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ；２１℃で３ｈインキュベート後に読取り
・実施例１２／図１４Ａ：ＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）（ウェル中最終２５０ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（ウェル中最終０．２５ｎＭ）；ＨＥＫ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ；２１℃で１ｈインキュベート後に読取り
・実施例１３／図１５Ａ：ＧＴＰｇＮ－Ｌ１８－フルオレセイン（ウェル中最終３１ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（ウェル中最終０．２５ｎＭ）；ＨＥＫ－ＤＯＲ膜１μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比）から、類似体ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）、ＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）、およびＧＴＰｇＮ－Ｌ１８－フルオレセインはＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－供与体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１３Ａ～図１５Ａ）。
次に、上記と同じ膜および実験条件を用いて、ＧＴＰ－受容体に結合したＧαタンパク質の比率を変化させるＧＰＣＲアゴニストの能力を試験した。アゴニストの刺激により生成されるＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）が低下する場合、ＧＴＰ－受容体に結合したＧαタンパク質形態の比率が低下する（すなわち、空のＧαタンパク質形態が増加する）ことを示す。従って、そのアゴニストで活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、Ｇタンパク質からＧＴＰ－受容体が離れて、空型に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが低下する。これらの結果を図１３Ｂ（実施例１１）、１４Ｂ（実施例１２）、１５Ｂ（実施例１３）に表す。このようなアゴニストによるシグナルの変化は、類似体ＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）では極わずかである（実施例１２）。
（実施例１４～１９：デルタオピオイドＧＰＣＲ（ＤＯＲ）に対するフォーマット２Ａに係る活性化試験（アゴニスト刺激下、ＧＴＰ－供与体および抗Ｇαｉタンパク質抗体－受容体間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが増大））
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を用いて、ＧＴＰ－供与体／抗Ｇαｉ抗体－受容体ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を検出した。以下の実験条件を用いた。
・実施例１４／図１６Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；５００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
・実施例１５／図１７Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；３００ｍＭ ＮａＣｌ；０．５μＭ ＧＤＰ；０．１％ＢＳＡ
・実施例１６／図１８Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；３００ｍＭ ＮａＣｌ；０．５μＭ ＧＤＰ；０．１％ＢＳＡ
・実施例１７／図１９Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；３００ｍＭ ＮａＣｌ；０．５μＭ ＧＤＰ；０．１％ＢＳＡ
・実施例１８／図２０Ａ：ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；３００ｍＭ ＮａＣｌ；０．５μＭ ＧＤＰ；０．１％ＢＳＡ
・実施例１９／図２１Ａ：ＧＴＰｇＮ－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；３００ｍＭ ＮａＣｌ；０．５μＭ ＧＤＰ；０．１％ＢＳＡ
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比）から、類似体ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図１６Ａ～図２１Ａ）。
次に、上記と同じ膜および実験条件を用いて、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質の比率を変化させるＧＰＣＲアゴニストの能力を試験した。アゴニストの刺激により生成されるＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）が増大する場合、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質形態の比率が増加する（すなわち、空のＧαタンパク質形態が減少する）ことを示す。従って、そのアゴニストで活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰ－供与体がＧタンパク質に結合して、ＧＴＰ－供与体型に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが増大する。これらの結果を図１６Ｂ（実施例１４）、１７Ｂ（実施例１５）、１８Ｂ（実施例１６）、１９Ｂ（実施例１７）、２０Ｂ（実施例１８）、および２１Ｂ（実施例１９）に表す。また、図１７Ｂ（実施例１５）は第２条件を表しており、固定濃度のＧＰＣＲアゴニストＳＮＣ１６２（２００ｎＭ）による活性化が、ＧＰＣＲアンタゴニスト（ナルトリンドール）の濃度を上昇させると阻害された。このような活性化の阻害は、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の低下により観察される。
（実施例２０～２２：ドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲ（Ｄ２Ｓ）に対するフォーマット２Ａに係る活性化試験（アゴニスト刺激下、ＧＴＰ－供与体および抗Ｇαｉタンパク質抗体－受容体間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが増大））
まず、ドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を用いて、ＧＴＰ－供与体／抗Ｇαｉ抗体－受容体ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を検出した。以下の実験条件を用いた。
・実施例２０／図２２Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－Ｄ２Ｓ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌ；１μＭ ＧＤＰ；０．１％ＢＳＡ
・実施例２１／図２３Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－Ｄ２Ｓ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
・実施例２２／図２４Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル中最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－Ｄ２Ｓ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１μＭ ＧＤＰ；０．１％ＢＳＡ
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比）から、類似体ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図２２Ａ～図２４Ａ）。
次に、上記と同じ膜および実験条件を用いて、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質の比率を変化させるＧＰＣＲアゴニストの能力を試験した。アゴニストの刺激により生成されるＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）が増大する場合、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質形態の比率が増加する（すなわち、空のＧαタンパク質形態が減少する）ことを示す。従って、そのアゴニストで活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰ－供与体がＧタンパク質に結合して、ＧＴＰ－供与体型に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが増大する。これらの結果を図２２Ｂ（実施例２０）、２３Ｂ（実施例２１）、および２４Ｂ（実施例２２）に表す。
（実施例２３および２４：デルタオピオイドＧＰＣＲ（ＤＯＲ）に対するフォーマット２Ｂに係る活性化試験（アゴニスト刺激下、ＧＴＰ－受容体および抗Ｇαｉタンパク質抗体－供与体間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが増大））
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を用いて、ＧＴＰ－受容体／抗Ｇαｉ抗体－供与体ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を検出した。以下の実験条件を用いた。
・実施例２３／図２５Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５（ウェル中最終５０ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（ウェル中最終１ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；３００ｍＭ ＮａＣｌ；０．５μＭ ＧＤＰ；０．１％ＢＳＡ；２１℃で３ｈインキュベート後に読取り
・実施例２４／図２６Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８（ウェル中最終５０ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（ウェル中最終１ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；３００ｍＭ ＮａＣｌ；０．５μＭ ＧＤＰ；０．１％ＢＳＡ；２１℃で３ｈインキュベート後に読取り
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比）から、類似体ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５およびＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－供与体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図２５Ａ～２６Ａ）。
次に、上記と同じ膜および実験条件を用いて、ＧＴＰ－受容体に結合したＧαタンパク質の比率を変化させるＧＰＣＲアゴニストの能力を試験した。アゴニストの刺激により生成されるＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）が増大する場合、ＧＴＰ－受容体に結合したＧαタンパク質形態の比率が増加する（すなわち、空のＧαタンパク質形態が減少する）ことを示す。従って、そのアゴニストで活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰ－受容体がＧタンパク質に結合して、ＧＴＰ－受容体型に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが増大する。これらの結果を図２５Ｂ（実施例２３）および２６Ｂ（実施例２４）に表す。
（実施例２５：デルタオピオイドＧＰＣＲ（ＤＯＲ）に対するフォーマット２Ａに係る活性化試験（アゴニスト刺激下、ＧＴＰ－供与体および抗Ｇαｉタンパク質抗体－受容体間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが増大））
まず、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧαｉタンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を用いて、ＧＴＰ－供与体／抗Ｇαｉ抗体－受容体ペアのＧタンパク質への結合による特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル生成能を検出した。以下の実験条件を用いた。
・実施例２５／図２７Ａ：ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２（ウェル中最終７．５ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル中最終１０ｎＭ）；ＣＨＯ－ＤＯＲ膜１０μｇ／ウェル；バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；６０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＢＳＡ
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら２つの条件間で見られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの差（ＨＴＲＦ比）から、類似体ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２はＧαｉタンパク質に結合でき、抗Ｇαｉ抗体－受容体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成できることが分かる（図２７Ａ）。
次に、上記と同じ膜および実験条件を用いて、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質の比率を変化させるＧＰＣＲアゴニストの能力を試験した。アゴニストの刺激により生成されるＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）が増大する場合、ＧＴＰ－供与体に結合したＧαタンパク質形態の比率が増加する（すなわち、空のＧαタンパク質形態が減少する）ことを示す。従って、そのアゴニストで活性化されたＧＰＣＲ受容体によって、ＧＴＰ－供与体がＧタンパク質に結合して、ＧＴＰ－供与体型に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルが増大する。これらの結果を図２７Ｂ（実施例２５）に表す。
（実施例２６：本発明に係る方法で使用される抗Ｇαｉ１タンパク質抗体を得るためのプロトコル）
（マウスの免疫化）
ＴＳＴ－Ｇαｉ１組換えタンパク質（配列ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６３０９６－１のＧαｉ１タンパク質、Ｎ末端においてＴＥＶリンカーを介してＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇ（ＴＳＴ）（ＩＢＡ）でタグ化）をＳｆ９昆虫細胞（当該タンパク質をコードするバキュロウイルスに感染）において産生させてから、ＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇ（ＴＳＴ）（Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｒｅｓｉｎ（ＩＢＡ、カタログ：２－１２０８－００２））を介してアフィニティーカラムで精製した。
ＧＴＰｇＳ含有バッファ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１１ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１００μＭ ＧＴＰｇＳ）で事前に希釈したＴＳＴ－Ｇαｉ１タンパク質を注射して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。初回注射後、１ヶ月間隔でブースターを３回打った。
各注射から１５日後、マウスに血液穿刺を行うことで、免疫応答の存在を確認した。
そのため、ＥＬＩＳＡ型のアッセイをセットアップした。ＧＴＰｇＳ含有バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、１μＭ ＧＴＰｇＳ）で事前に２０μｇ／ｍＬに希釈したＴＳＴ－Ｇαｉ１タンパク質を、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴ（ＩＢＡ、カタログ：２－４１０１－００１）を含む９６ウェルプレートにＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇを介して吸着させた。そのため、タンパク質１００μｌを各ウェルに加えてから、３７℃で２時間インキュベートした後、ＰＢＳバッファ１Ｘ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。
その後、１０～１億倍に段階希釈した穿刺血を１００μＬ／ウェルの濃度で加え、３７℃で２時間インキュベートした。タンパク質に固定化されなかった抗体を、ＰＢＳバッファ１Ｘ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄して除去した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、Ｓｉｇｍａ＃Ａ０１６８、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで１／１００００に希釈）に結合した抗マウスＦｃ二次抗体を用いて、固定化した抗体を検出した。３７℃で１時間インキュベートしてから、ＰＢＳバッファ１Ｘ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＨＲＰの発色を、その基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ＃Ｔ０４４０）を撹拌下、室温で２０分間インキュベートしてから４５０ｎｍで比色分析を実施することで行った。
ＥＬＩＳＡアッセイで検出した抗体が、ＴｗｉｎＳｔｒｅｐＴａｇではなく、実際にＧαｉ１タンパク質に対するものであることを確認するために、同じ穿刺血を、ＴｗｉｎＳｔｒｅｐＴａｇ（ＳＮＡＰＴａｇ－ＴｗｉｎＳｔｒｅｐＴａｇ）でタグ化した過剰量の別の直交性タンパク質とプレインキュベートしてからＥＬＩＳＡアッセイで試験した。すると、抗ｔａｇ抗体は、タグ化直交性タンパク質に結合し、その結果、ウェル底部に付着したＧαｉ１タンパク質には結合しない。この場合、ＨＲＰシグナルは検出されないか、あるいはＨＲＰシグナルの低下が検出される。
最も抗体価がよく、且つ抗タグ対照例においてシグナルの低下が最も小さいマウスを選択し、次の工程のリンパ球ハイブリダイゼーション（融合ともいう）で使用した。マウスの脾臓を回収し、該脾臓から得たリンパ球と形質細胞との混合物を、ポリエチレングリコール系細胞融合触媒の存在下、インビトロで骨髄腫細胞株と融合した。ＨＧＰＲＴ酵素（ヒポキサンチングアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を欠いた変異骨髄腫細胞株を用いてハイブリッド細胞（ハイブリドーマという）を選択した。ヒポキサンチン、アミノプテリン（メトトレキサート）、およびチアミンを含む培地（ＨＡＴ培地）でこれらの細胞を培養して、融合しなかった骨髄腫細胞を除去することで、対象のハイブリドーマを選択した。融合しなかった脾臓細胞はインビトロでは増殖できないため死滅する。従って、ハイブリドーマのみが生存した。
次に、これらのハイブリドーマを培養プレートで培養した。その後、これらのハイブリドーマの上清を試験して、これらの抗Ｇαｉ１タンパク質抗体産生能を評価した。そのため、上記したＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
各種形態のＧαｉ１タンパク質（ＧＤＰに結合した完全型ｖｓＧＴＰｇＳに結合した完全型ｖｓ空型）における抗体の選択性を評価するために、１μＭ ＧＤＰまたは１μＭ ＧＴＰｇＳを含むか、あるいはヌクレオチドを含まないバッファでＴＳＴ－Ｇαｉ１タンパク質をプレインキュベートした条件で並行してアッセイを実施した。その後、最良のハイブリドーマを限界希釈工程でクローニングして、ハイブリドーマクローンを得た。
その後、対象のハイブリドーマクローンをマウスに注射（腹腔内注射）して、腹水中に多量の抗体を産生させた。
その後、タンパク質Ａを有する樹脂を含むカラムにおいてアフィニティクロマトグラフィーによって抗体を精製した。
（上述の通り精製した抗体のＧαタンパク質への結合に対するＤＳＶ３６Ｓ抗体との競合能）
試薬はいずれも５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌで希釈した。Ｇαｉ１タンパク質は２Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を２．５ｎＭとした。ヌクレオチドＧＴＰｇＳは２Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を１０μＭとした。これら２つの試薬は同一の溶液で調製し、室温で３０分間プレインキュベートしてから、ウェル中に分配した。上述の通り精製した抗体は４Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を０．０１～１μＭとした。ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２抗体は４Ｘで調製して、最終濃度を１０ｎＭとした。抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ抗体は４Ｘで調製して、ウェル中の最終濃度を０．５ｎＭとした。
試薬は、以下の通り、３８４ウェルプレートに分配する。
１．プレインキュベートしたＧαｉ１タンパク質＋ＧＴＰｇＳ混合物１０μｌを各ウェルに入れる。
２．精製した抗体５μｌを各ウェルに加える。
３．プレートを室温で３０分間インキュベートする。
４．抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ抗体とＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２抗体との混合物５μｌを各ウェルに加える。
プレートを室温で１ｈインキュベートしてから、ＨＴＲＦシグナルを読み取る。
本発明に係る抗体は、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２抗体で得られたＨＴＲＦシグナルを阻害できる。それに対して、本発明に係るものではない抗体は、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２により生成されるシグナルを阻害できない。
配列表
表３
Figure 2022523099000045

Claims (21)

  1. Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を変化させる分子の能力を測定する方法であって、
    （ａ）第１容器に、
    １種以上のＧＰＣＲと１種以上のＧαタンパク質とを有する膜標本、
    ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰ源、
    上記ＲＥＴパートナー対の第２メンバーで標識した、Ｇタンパク質のαサブユニット（Ｇαタンパク質）のリガンドであって、上記ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰに結合した完全なＧαタンパク質に結合できるリガンド、
    必要に応じてＧＰＣＲアゴニスト
    を導入する工程；
    （ｂ）上記第１容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程；
    （ｃ）（ｉ）第２容器に工程（ａ）と同じ試薬および試験対象分子を導入するか、または（ｉｉ）上記第１容器に試験対象分子を導入する工程；
    （ｄ）工程（ｃ）で得られた上記第２容器または上記第１容器で放出されたＲＥＴシグナルを測定する工程；
    （ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）で得られた各シグナルを比較する工程であって、工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが変化している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲの活性化を変化させられることを示している工程
    を有する方法。
  2. 上記第１容器はＧＰＣＲアゴニストを含んでおらず、工程（ｅ）において、工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが低下している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲアゴニストであることを示している、請求項１に記載の方法。
  3. 上記第１容器はＧＰＣＲアゴニストを含み、工程（ｅ）において、
    工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが増大している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲのアンタゴニストまたはネガティブアロステリックモジュレーターであることを示しており、
    工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが低下している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲのアゴニストまたはポジティブアロステリックモジュレーターであることを示している、
    請求項１に記載の方法。
  4. 上記第１容器はＧＰＣＲアゴニストを含んでおらず、工程（ｅ）において、工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが増大している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲアゴニストであることを示している、請求項１に記載の方法。
  5. 上記第１容器はＧＰＣＲアゴニストを含み、工程（ｅ）において、
    工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが低下している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲのアンタゴニストまたはネガティブアロステリックモジュレーターであることを示しており、
    工程（ｂ）で得られたシグナルに対して工程（ｄ）で得られたシグナルが増大している場合、上記試験対象分子はＧＰＣＲのアゴニストまたはポジティブアロステリックモジュレーターであることを示している、
    請求項１に記載の方法。
  6. 上記Ｇαタンパク質は、タンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ１、Ｇαｏ２、Ｇαｑ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｓ、Ｇαｚ、Ｇαｔ１、Ｇαｔ２、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６、およびＧαｇｕｓから選択され、好ましくはタンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 上記リガンドは、抗体、抗体断片、ペプチド、またはアプタマー、好ましくは抗体または抗体断片から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 上記非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、ＧＴＰガンマＳ（ＧＴＰγＳまたはＧＴＰｇＳ）、ＧｐｐＮＨｐ、およびＧｐｐＣｐから選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 上記ＲＥＴパートナー対の一方のメンバーが蛍光供与体化合物または発光供与体化合物であり、上記ＲＥＴパートナー対の他方のメンバーが蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 上記非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰを蛍光供与体化合物で標識し、上記Ｇαタンパク質のリガンドを蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 上記非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰを蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識し、上記Ｇαタンパク質のリガンドを蛍光供与体化合物または発光供与体化合物で標識する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  12. 上記蛍光供与体化合物は、ユウロピウムクリプテート、ユウロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン類、ローダミン類、シアニン類、スクアライン類、クマリン類、プロフラビン類、アクリジン類、フルオレセイン類、ホウ素ジピロメテンの誘導体、およびニトロベンゾオキサジアゾールから選択されるＦＲＥＴパートナーである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 上記蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン類、ローダミン類、シアニン類、スクアライン類、クマリン類、プロフラビン類、アクリジン類、フルオレセイン類、ホウ素ジピロメテンの誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＦＲＥＴパートナーである、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 上記発光供与体化合物は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼの変異体（Ｒｌｕｃ８）、およびホタルルシフェラーゼから選択されるＢＲＥＴパートナーである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  15. 上記蛍光受容体化合物は、アロフィコシアニン類、ローダミン類、シアニン類、スクアライン類、クマリン類、プロフラビン類、アクリジン類、フルオレセイン類、ホウ素ジピロメテンの誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＢＲＥＴパートナーである、請求項９～１１および１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 上記ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、一般式（Ｉ）：
    Figure 2022523099000046
     （Ｉ）
    （式中、
    Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２；
    Ｙ＝Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２；
    Ｌは２価のリンカー；
    Ｌｎ３＋は反応性基Ｇ３を有していてもよいランタニド錯体である）の蛍光供与体化合物である、請求項１～１０および１２～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 上記ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５、ＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８、ＧＴＰｇＮ－Ｌ１５－フルオレセイン、ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）、またはＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）から選択される、請求項１～９および１１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  18. 上記ＲＥＴパートナー対の第１メンバーで標識した非加水分解性または徐加水分解性ＧＴＰは、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－Ｃ２）、ＧＴＰｇＮ－Ｃ３（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－Ｃ３）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ２）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ１１）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－Ｃ３）、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２（ＧＴＰ－ガンマ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ２）、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３（ＧＴＰ－ガンマ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ３）、またはＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２（ＧＴＰ－ガンマ－Ｎ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２）、好ましくはＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２から選択される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 上記Ｇαタンパク質のリガンドは、Ｇαｉタンパク質のＳｗｉｔｃｈＩＩ領域、好ましくはＧαｉタンパク質のペプチド２１５～２９４に特異的に結合する抗体または抗体断片である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 上記Ｇαタンパク質はＧαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３から選択され、上記Ｇαタンパク質のリガンドは、配列Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｔｒｐ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ（配列番号１）のペプチドと競合して上記Ｇαタンパク質に結合する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 上記Ｇαタンパク質のリガンドは、
    （ｉ）上記Ｇαタンパク質に結合できる抗体もしくは抗体断片であって、
    配列番号２のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有する重鎖の可変領域、並びに
    配列番号５のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、ＤＴＳのアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列で構成されている軽鎖の可変領域のＣＤＲ３を有する軽鎖の可変領域
    を含む抗体もしくは抗体断片、または
    （ｉｉ）（ｉ）に係る抗体もしくは抗体断片と競合して上記Ｇαタンパク質に結合する抗体もしくは抗体断片
    から選択される抗体である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

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