CA3127858A1 - Methode pour mesurer la modulation de l'activation d'un recepteur couple a une proteine g avec des analogues du gtp - Google Patents
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Abstract
Méthode pour mesurer la modulation de l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G avec des analogues du GTP L'invention concerne une méthode pour déterminer la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G (RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) introduction, dans un premier contenant : - d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - d'une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - d'un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, - éventuellement d'un agoniste du RCPG; b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant; c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'à l'étape a) et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à tester; d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c); e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG.
Description
Description Titre de l'invention : Méthode pour mesurer la modulation de l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G avec des analogues du GTP
Domaine Technique [0001] L'invention concerne un nouveau procédé pour mesurer la modulation de l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G (RCPG ou GPCR en anglais), par exemple un procédé pour déterminer la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un RCPG. Le procédé selon l'invention permet notamment de Io détecter l'apparition ou la disparition d'une protéine G pleine liée à
un analogue du GTP dans une préparation de RCPG.
Technique antérieure
Domaine Technique [0001] L'invention concerne un nouveau procédé pour mesurer la modulation de l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G (RCPG ou GPCR en anglais), par exemple un procédé pour déterminer la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un RCPG. Le procédé selon l'invention permet notamment de Io détecter l'apparition ou la disparition d'une protéine G pleine liée à
un analogue du GTP dans une préparation de RCPG.
Technique antérieure
[0002] Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR en anglais) sont une famille de récepteurs membranaires chez les mammifères et dans tout le règne animal. Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques (3 sous unités : alpha, bêta et gamma) qui sont activées par les RCPG. Au travers des RCPG, les protéines G ont un rôle de transduction d'un signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la cellule (i.e. réponse cellulaire à un stimulus externe).
Leur mécanisme d'action communément décrit est présenté dans la Figure 1 et résumé ci-après :
Leur mécanisme d'action communément décrit est présenté dans la Figure 1 et résumé ci-après :
[0003] - dans son état inactif, de repos, la sous unité alpha de la protéine G
est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP) ;
est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP) ;
[0004] - après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous unité alpha de la protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué
de deux étapes : 1) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G
vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et 2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G
liée au récepteur est sous une forme appelée forme vide . Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu'il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous unités bêta/gamma de la protéine G activée se dissocient de la sous unité alpha ;
de deux étapes : 1) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G
vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et 2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G
liée au récepteur est sous une forme appelée forme vide . Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu'il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous unités bêta/gamma de la protéine G activée se dissocient de la sous unité alpha ;
[0005] - la sous unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire ;
[0006] - le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous unité alpha de la protéine G et la sous unité alpha se réassocie aux sous unité bêta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif).
[0007] Il existe plusieurs sous types de protéines G alpha présentant des profils de sélectivité différents pour les différents effecteurs et induisant ainsi l'activation de voies de signalisation préférentielles.
Io [0008] Les RCPG sont associés à de nombreuses fonctions physiologiques importantes et sont considérés comme l'une des cibles thérapeutiques privilégiées pour un grand nombre de pathologies. Ainsi, de nombreux tests de criblage in vitro ont été développés pour identifier des molécules capables de moduler les RCPG. Les tests mis au point exploitent différents mécanismes d'activation des protéines G et mettent en oeuvre des technologies variées (Zhang et al.; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372).
[0009] On peut citer notamment les tests d'affinité qui utilisent des ligands radiomarqués pour mesurer l'affinité du ligand au RCPG, les tests de scintigraphie de proximité qui utilisent des billes de scintigraphie sur lesquelles des RCPG ont été fixés ou les tests fonctionnels utilisant du GTP faiblement ou non hydrolysable comme le GTPyS. Ces tests sont néanmoins difficiles à mettre en oeuvre et nécessitent parfois des étapes de filtration sur membrane qui peut limiter leur utilisation comme tests de criblage à haut débit (HTS).
[0010] D'autres tests ont été développés pour mettre en évidence l'activation des RCPG. Ces tests se basent notamment sur les techniques de transfert d'énergie (RET - acronyme anglais de Resonance Energy Transfer ), comme le FRET
(acronyme anglais de Fluorescence Resonance Energy Transfer ) (Clinical Chemistry, 1995, 41, 1391) ou le BRET (acronyme anglais de Bioluminescence Resonance Energy Transfer ) (Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(1), 151). Ces deux techniques font appel à des notions de molécules capables de donner de l'énergie (on parle de donneurs) ou d'accepter de l'énergie (on parle d'accepteurs) (Physical Chemistry Chemical Physics, 2007, 9, 5847). On peut citer par exemple les techniques de transfert d'énergie mettant en évidence l'interaction entre un RCPG et la protéine G en utilisant soit un donneur fusionné au RCPG et un accepteur fusionné à la protéine G (WO
2006/086883 et WO 2003/008435) soit un accepteur fusionné à la sous-unité
alpha de la protéine G et un donneur fusionné à la sous-unité bêta et / ou gamme de la protéine G (Bunemann et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 2003, 26, 16077-16082). Ces techniques sont néanmoins contraignantes puisqu'elles nécessitent la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d'étudier les RCPG et les protéines G exprimés de façon endogène par les cellules (i.e. non modifiés et non sur-exprimés). D'autre part, afin de discriminer les différents sous types de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d'échantillons membranaires multiples (une préparation spécifique pour chaque sous type de protéine G alpha).
[0011] Les techniques de transfert d'énergie ont également été utilisées pour la mise au point de tests visant à visualiser la modulation de la forme GTP (active) de la protéine G ou de la forme GDP (inactive) de la protéine G. On peut tout d'abord citer par exemple l'utilisation d'un format avec la protéine G fusionnée à une étiquette biotine ainsi liée à un donneur lui-même couplé à une protéine streptavidine et un accepteur lié à un analogue GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (WO 2006/035208). D'autre part, un autre format utilise des peptides BioKey biotinylé (KaroBio) discriminant la forme GTP de la forme GDP et qui sont liés à un donneur grâce à une protéine streptavidine couplée au donneur. L'accepteur est lié au RCPG, qui est fusionné avec une étiquette 6HIS, à l'aide d'un anticorps anti 6HIS (WO 2004/035614). Ces techniques sont également contraignantes puisqu'elles nécessitent aussi la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d'étudier les RCPG et les protéines G exprimés de façon endogène par les cellules. De même, afin de discriminer les différents sous type de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d'échantillons membranaires multiples.
[0012] Il existe donc un réel besoin de disposer d'une méthode sensible et fiable qui permet de déterminer facilement la modulation de l'activation d'un RCPG, par exemple pour déterminer facilement la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un RCPG, et / ou de déterminer quelle sous type de protéine G
est activé par le RCPG.
Résumé de l'invention [0013] La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode pour le criblage in vitro de molécules capables de moduler les RCPG. Cette nouvelle méthode est notamment basée sur la capacité à discriminer (i) une forme de protéine Galpha pleine liée à un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué
par un membre d'un couple de partenaires de RET et une forme vide de protéine Io G ou (ii) une forme de protéine Galpha pleine liée à un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaires de RET et une forme de protéine Galpha pleine liée au GDP.
[0014] En particulier la présente invention a comme avantages 1) d'utiliser une méthode de détection à base de fluorescence donc non radioactive ; 2) de ne nécessiter aucune étape de lavage et ainsi de simplifier sa mise en oeuvre notamment pour des activités de criblage de composés à haut débit ; 3) de permettre de travailler notamment sur des protéines G et RCPG non modifiés ;
4) de permettre la discrimination de différents sous-types de protéines Galpha activées par le RCPG dans une même préparation membranaire comportant ces différents sous types (la discrimination étant apportée par l'utilisation de ligands de détection discriminant les sous-types de protéines Galpha).
[0015] Selon un premier aspect, l'invention concerne une méthode pour déterminer la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G (RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) introduction, dans un premier contenant :
- d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - d'une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué
par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - d'un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, - éventuellement d'un agoniste du RCPG;
b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ;
c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'a l'étape a) 5 et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à
tester ;
d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ;
e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG.
Brève description des figures [0016] La figure 1 représente le mécanisme d'action d'activation d'un RCPG et de la protéine G.
[0017] Les figures 2A à 20 illustrent 4 formats d'essai selon l'invention.
[0018] Les figures 3A et 3B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-02 + DSV36S-d2.
[0019] Les figures 4A et 4B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0020] Les figures 5A et 5B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPg0-hexyl-C2 + DSV36S-d2.
[0021] Les figures 6A et 6B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
[0022] Les figures 7A et 7B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C3 + DSV36S-d2.
[0023] La figure 8 illustre un test de liaison sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C3 + DSV36S-d2.
[0024] La figure 9 illustre un test de liaison selon le format 1A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPg0-hexyl-C3 + DSV36S-d2.
[0025] Les figures 10A et 10B illustrent l'effet de la concentration en membrane et en GTP-donneur sur un test d'activation selon le format 1A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0026] Les figures 11A et 11B illustrent un test d'activation selon le format lA sur RCPG Dopamine D2 avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0027] Les figures 12A et 12B illustrent un test d'activation selon le format 1A sur RCPG Dopamine D2 avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0028] [Fig. 13A-13B] Les figures 13A et 13B illustrent un test d'activation selon le format 1B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPg0-Linker-Cy5(P) + DSV36S-Lumi4Tb.
[0029] Les figures 14A et 14B illustrent un test d'activation selon le format 1B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgS-Linker-Cy5(R) +
DSV36S-Lumi4Tb.
[0030] Les figures 15A et 15B illustrent un test d'activation selon le format 1B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-L18-Fluorescein +
DSV36S-Lumi4Tb.
[0031] Les figures 16A et 16B, illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0032] Les figures 17A et 17B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0033] Les figures 18A et 18B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV38S-d2.
[0034] Les figures 19A et 19B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0035] Les figures 20A et 20B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPg0-hexyl-C2 + DSV36S-d2.
[0036] Les figures 21A et 21B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
[0037] Les figures 22A, 22B illustrent un test d'activation selon le format 2A
sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0038] Les figures 23A et 23B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0039] Les figures 24A et 24B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0040] Les figures 25A et 25B illustrent un test d'activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-Cy5 + DSV36S-Lumi4Tb.
[0041] Les figures 26A et 26B illustrent un test d'activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-AF488 +
DSV36S-Lumi4Tb.
[0042] Les figures 27A et 27B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 + DSV36S-d2.
Description détaillée [0043] Définitions [0044] Au sens de l'invention, le terme protéine G désigne une protéine hétéro-trimérique composée de trois sous-unités appelées protéine Galpha, protéine Gbêta et protéine Ggamma.
[0045] Au sens de l'invention, le terme Protéine Galpha ou Galpha désigne la sous-unité alpha de la protéine G. La protéine Galpha possèdent deux domaines, le domaine GTPase, et le domaine hélice alpha. Il existe au moins 20 protéines Galpha différentes, qui peuvent se classer parmi les principales familles de protéines suivantes : Galphas (connu pour activer l'adénylate cyclase afin d'augmenter la synthèse de l'AMPc), Galphai (connu pour inhiber l'adénylate cyclase), Galphaolf (associé aux récepteurs olfactifs), Galphat (connu pour la
Io [0008] Les RCPG sont associés à de nombreuses fonctions physiologiques importantes et sont considérés comme l'une des cibles thérapeutiques privilégiées pour un grand nombre de pathologies. Ainsi, de nombreux tests de criblage in vitro ont été développés pour identifier des molécules capables de moduler les RCPG. Les tests mis au point exploitent différents mécanismes d'activation des protéines G et mettent en oeuvre des technologies variées (Zhang et al.; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372).
[0009] On peut citer notamment les tests d'affinité qui utilisent des ligands radiomarqués pour mesurer l'affinité du ligand au RCPG, les tests de scintigraphie de proximité qui utilisent des billes de scintigraphie sur lesquelles des RCPG ont été fixés ou les tests fonctionnels utilisant du GTP faiblement ou non hydrolysable comme le GTPyS. Ces tests sont néanmoins difficiles à mettre en oeuvre et nécessitent parfois des étapes de filtration sur membrane qui peut limiter leur utilisation comme tests de criblage à haut débit (HTS).
[0010] D'autres tests ont été développés pour mettre en évidence l'activation des RCPG. Ces tests se basent notamment sur les techniques de transfert d'énergie (RET - acronyme anglais de Resonance Energy Transfer ), comme le FRET
(acronyme anglais de Fluorescence Resonance Energy Transfer ) (Clinical Chemistry, 1995, 41, 1391) ou le BRET (acronyme anglais de Bioluminescence Resonance Energy Transfer ) (Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(1), 151). Ces deux techniques font appel à des notions de molécules capables de donner de l'énergie (on parle de donneurs) ou d'accepter de l'énergie (on parle d'accepteurs) (Physical Chemistry Chemical Physics, 2007, 9, 5847). On peut citer par exemple les techniques de transfert d'énergie mettant en évidence l'interaction entre un RCPG et la protéine G en utilisant soit un donneur fusionné au RCPG et un accepteur fusionné à la protéine G (WO
2006/086883 et WO 2003/008435) soit un accepteur fusionné à la sous-unité
alpha de la protéine G et un donneur fusionné à la sous-unité bêta et / ou gamme de la protéine G (Bunemann et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 2003, 26, 16077-16082). Ces techniques sont néanmoins contraignantes puisqu'elles nécessitent la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d'étudier les RCPG et les protéines G exprimés de façon endogène par les cellules (i.e. non modifiés et non sur-exprimés). D'autre part, afin de discriminer les différents sous types de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d'échantillons membranaires multiples (une préparation spécifique pour chaque sous type de protéine G alpha).
[0011] Les techniques de transfert d'énergie ont également été utilisées pour la mise au point de tests visant à visualiser la modulation de la forme GTP (active) de la protéine G ou de la forme GDP (inactive) de la protéine G. On peut tout d'abord citer par exemple l'utilisation d'un format avec la protéine G fusionnée à une étiquette biotine ainsi liée à un donneur lui-même couplé à une protéine streptavidine et un accepteur lié à un analogue GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (WO 2006/035208). D'autre part, un autre format utilise des peptides BioKey biotinylé (KaroBio) discriminant la forme GTP de la forme GDP et qui sont liés à un donneur grâce à une protéine streptavidine couplée au donneur. L'accepteur est lié au RCPG, qui est fusionné avec une étiquette 6HIS, à l'aide d'un anticorps anti 6HIS (WO 2004/035614). Ces techniques sont également contraignantes puisqu'elles nécessitent aussi la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d'étudier les RCPG et les protéines G exprimés de façon endogène par les cellules. De même, afin de discriminer les différents sous type de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d'échantillons membranaires multiples.
[0012] Il existe donc un réel besoin de disposer d'une méthode sensible et fiable qui permet de déterminer facilement la modulation de l'activation d'un RCPG, par exemple pour déterminer facilement la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un RCPG, et / ou de déterminer quelle sous type de protéine G
est activé par le RCPG.
Résumé de l'invention [0013] La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode pour le criblage in vitro de molécules capables de moduler les RCPG. Cette nouvelle méthode est notamment basée sur la capacité à discriminer (i) une forme de protéine Galpha pleine liée à un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué
par un membre d'un couple de partenaires de RET et une forme vide de protéine Io G ou (ii) une forme de protéine Galpha pleine liée à un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaires de RET et une forme de protéine Galpha pleine liée au GDP.
[0014] En particulier la présente invention a comme avantages 1) d'utiliser une méthode de détection à base de fluorescence donc non radioactive ; 2) de ne nécessiter aucune étape de lavage et ainsi de simplifier sa mise en oeuvre notamment pour des activités de criblage de composés à haut débit ; 3) de permettre de travailler notamment sur des protéines G et RCPG non modifiés ;
4) de permettre la discrimination de différents sous-types de protéines Galpha activées par le RCPG dans une même préparation membranaire comportant ces différents sous types (la discrimination étant apportée par l'utilisation de ligands de détection discriminant les sous-types de protéines Galpha).
[0015] Selon un premier aspect, l'invention concerne une méthode pour déterminer la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G (RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) introduction, dans un premier contenant :
- d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - d'une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué
par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - d'un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, - éventuellement d'un agoniste du RCPG;
b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ;
c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'a l'étape a) 5 et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à
tester ;
d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ;
e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG.
Brève description des figures [0016] La figure 1 représente le mécanisme d'action d'activation d'un RCPG et de la protéine G.
[0017] Les figures 2A à 20 illustrent 4 formats d'essai selon l'invention.
[0018] Les figures 3A et 3B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-02 + DSV36S-d2.
[0019] Les figures 4A et 4B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0020] Les figures 5A et 5B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPg0-hexyl-C2 + DSV36S-d2.
[0021] Les figures 6A et 6B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
[0022] Les figures 7A et 7B illustrent un test d'activation selon le format lA
sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C3 + DSV36S-d2.
[0023] La figure 8 illustre un test de liaison sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C3 + DSV36S-d2.
[0024] La figure 9 illustre un test de liaison selon le format 1A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPg0-hexyl-C3 + DSV36S-d2.
[0025] Les figures 10A et 10B illustrent l'effet de la concentration en membrane et en GTP-donneur sur un test d'activation selon le format 1A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0026] Les figures 11A et 11B illustrent un test d'activation selon le format lA sur RCPG Dopamine D2 avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0027] Les figures 12A et 12B illustrent un test d'activation selon le format 1A sur RCPG Dopamine D2 avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0028] [Fig. 13A-13B] Les figures 13A et 13B illustrent un test d'activation selon le format 1B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPg0-Linker-Cy5(P) + DSV36S-Lumi4Tb.
[0029] Les figures 14A et 14B illustrent un test d'activation selon le format 1B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgS-Linker-Cy5(R) +
DSV36S-Lumi4Tb.
[0030] Les figures 15A et 15B illustrent un test d'activation selon le format 1B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-L18-Fluorescein +
DSV36S-Lumi4Tb.
[0031] Les figures 16A et 16B, illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0032] Les figures 17A et 17B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0033] Les figures 18A et 18B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV38S-d2.
[0034] Les figures 19A et 19B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0035] Les figures 20A et 20B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPg0-hexyl-C2 + DSV36S-d2.
[0036] Les figures 21A et 21B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
[0037] Les figures 22A, 22B illustrent un test d'activation selon le format 2A
sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0038] Les figures 23A et 23B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0039] Les figures 24A et 24B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0040] Les figures 25A et 25B illustrent un test d'activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-Cy5 + DSV36S-Lumi4Tb.
[0041] Les figures 26A et 26B illustrent un test d'activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-AF488 +
DSV36S-Lumi4Tb.
[0042] Les figures 27A et 27B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 + DSV36S-d2.
Description détaillée [0043] Définitions [0044] Au sens de l'invention, le terme protéine G désigne une protéine hétéro-trimérique composée de trois sous-unités appelées protéine Galpha, protéine Gbêta et protéine Ggamma.
[0045] Au sens de l'invention, le terme Protéine Galpha ou Galpha désigne la sous-unité alpha de la protéine G. La protéine Galpha possèdent deux domaines, le domaine GTPase, et le domaine hélice alpha. Il existe au moins 20 protéines Galpha différentes, qui peuvent se classer parmi les principales familles de protéines suivantes : Galphas (connu pour activer l'adénylate cyclase afin d'augmenter la synthèse de l'AMPc), Galphai (connu pour inhiber l'adénylate cyclase), Galphaolf (associé aux récepteurs olfactifs), Galphat (connu pour la
8 transduction des signaux visuels dans la rétine en conjonction avec la rhodopsine), Galphaq (connu pour stimuler la phospholipase C) ou la famille Galpha12 / 13 (connue pour réguler le cytosquelette, les jonctions cellulaires, et d'autres processus liés au mouvement de la cellule). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la protéine Galpha est choisie parmi la protéine Galphai1, Galphai2, Galphai3, Galphao1, Galphao2, Galphaq, Galpha12, Galpha13, Galphas, Galphaz, Galphat1, Galphat2, Galpha11, Galpha14, Galpha15, Galpha16 et Galphagus, de préférence choisie parmi la protéine Galphai1, Galphai2 et Galphai3.
1.0 [0046] Au sens de l'invention, le terme Protéine Galpha pleine désigne une protéine Galpha liée au GTP ou au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (marqué selon l'invention ou non-marqué) ou au GDP. On parle alors de protéine G alpha pleine liée au GTP , de protéine G alpha pleine liée au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable ou de protéine Galpha pleine liée au GDP . La protéine Galpha pleine (liée au GDP ou au GTP) est représentée à la Figure 1. Dans le cadre de la présente invention, on utilise un GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET qui est capable de se liée à
la protéine Galpha, ce qui permet d'obtenir une protéine Galpha pleine liée au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET.
[0047] Le terme GDP désigne la guanosine diphosphate.
[0048] Le terme GTP désigne la guanosine triphosphate.
[0049] Le terme GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable désigne un analogue du GTP qui n'est pas hydrolysé ou peu hydrolysé en GDP. On peut citer par exemple le GTPgammaS (CAS no. 37589-80-3), le GppNHp (CAS no.
148892-91-5) ou le GppCp (CAS no. 10470-57-2).
[0050] Les termes GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaire de RET ou GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué ou analogue de GTP marqué désignent soit un GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaire de RET donneur ( GTP-donneur ), soit un GTP non
1.0 [0046] Au sens de l'invention, le terme Protéine Galpha pleine désigne une protéine Galpha liée au GTP ou au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (marqué selon l'invention ou non-marqué) ou au GDP. On parle alors de protéine G alpha pleine liée au GTP , de protéine G alpha pleine liée au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable ou de protéine Galpha pleine liée au GDP . La protéine Galpha pleine (liée au GDP ou au GTP) est représentée à la Figure 1. Dans le cadre de la présente invention, on utilise un GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET qui est capable de se liée à
la protéine Galpha, ce qui permet d'obtenir une protéine Galpha pleine liée au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET.
[0047] Le terme GDP désigne la guanosine diphosphate.
[0048] Le terme GTP désigne la guanosine triphosphate.
[0049] Le terme GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable désigne un analogue du GTP qui n'est pas hydrolysé ou peu hydrolysé en GDP. On peut citer par exemple le GTPgammaS (CAS no. 37589-80-3), le GppNHp (CAS no.
148892-91-5) ou le GppCp (CAS no. 10470-57-2).
[0050] Les termes GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaire de RET ou GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué ou analogue de GTP marqué désignent soit un GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaire de RET donneur ( GTP-donneur ), soit un GTP non
9 hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaire de RET accepteur ( GTP-accepteur ).
[0051] Au sens de l'invention, le terme Protéine Galpha vide désigne une protéine Galpha qui n'est pas liée au GTP ou au GDP ou au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (modifié selon l'invention ou non-modifié), en particulier une protéine Galpha qui n'est pas liée au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre de couple de partenaire de RET. La protéine Galpha vide est décrite dans la littérature comme un état transitoire entre la forme pleine liée au GDP et la forme pleine liée au Io GTP ou au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable. La protéine Galpha vide est représentée à la Figure 1.
[0052] Au sens de l'invention, le terme préparation membranaire désigne une préparation comprenant des membranes cellulaires ou des fragments de membranes cellulaires ou des systèmes artificiels mimant des membranes cellulaires qui portent (ou qui expriment à leur surface) un ou plusieurs RCPG
et une ou plusieurs protéine(s) Galpha. Ainsi, le terme préparation membranaire englobe les cellules entières, les cellules entières perméabilisées, les cellules lysées, les membranes cellulaires purifiées et les complexes RCPG / Protéine Galpha purifiés et reconstitués dans des nanodisques (aussi appelés << nanoscale phospholipid bilayers ) ou des mélanges de détergents qui portent (ou qui expriment à leur surface) un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha.
[0053] Le terme anticorps , également appelé immunoglobuline désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH
pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde. Chaque domaine variable comprend généralement 4 régions charnières (appelées FR1, FR2, FR3, FR4) et 3 régions directement responsables de la liaison avec l'antigène, dites CDR (appelées CDR1, CDR2, CDR3).
[0054] Un anticorps selon l'invention peut être d'origine mammifère (ex.
humain ou de souris ou de camélidé), humanisé, chimérique, recombinant. Il s'agit de 5 préférence d'un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement connues de l'homme de l'art. L'anticorps peut être de n'importe quel isotype, par exemple IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, de préférence IgG.
[0055] Par anticorps chimérique , on entend un anticorps dont les séquences des
[0051] Au sens de l'invention, le terme Protéine Galpha vide désigne une protéine Galpha qui n'est pas liée au GTP ou au GDP ou au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (modifié selon l'invention ou non-modifié), en particulier une protéine Galpha qui n'est pas liée au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre de couple de partenaire de RET. La protéine Galpha vide est décrite dans la littérature comme un état transitoire entre la forme pleine liée au GDP et la forme pleine liée au Io GTP ou au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable. La protéine Galpha vide est représentée à la Figure 1.
[0052] Au sens de l'invention, le terme préparation membranaire désigne une préparation comprenant des membranes cellulaires ou des fragments de membranes cellulaires ou des systèmes artificiels mimant des membranes cellulaires qui portent (ou qui expriment à leur surface) un ou plusieurs RCPG
et une ou plusieurs protéine(s) Galpha. Ainsi, le terme préparation membranaire englobe les cellules entières, les cellules entières perméabilisées, les cellules lysées, les membranes cellulaires purifiées et les complexes RCPG / Protéine Galpha purifiés et reconstitués dans des nanodisques (aussi appelés << nanoscale phospholipid bilayers ) ou des mélanges de détergents qui portent (ou qui expriment à leur surface) un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha.
[0053] Le terme anticorps , également appelé immunoglobuline désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH
pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde. Chaque domaine variable comprend généralement 4 régions charnières (appelées FR1, FR2, FR3, FR4) et 3 régions directement responsables de la liaison avec l'antigène, dites CDR (appelées CDR1, CDR2, CDR3).
[0054] Un anticorps selon l'invention peut être d'origine mammifère (ex.
humain ou de souris ou de camélidé), humanisé, chimérique, recombinant. Il s'agit de 5 préférence d'un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement connues de l'homme de l'art. L'anticorps peut être de n'importe quel isotype, par exemple IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, de préférence IgG.
[0055] Par anticorps chimérique , on entend un anticorps dont les séquences des
10 régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à
une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non-murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine.
[0056] Par anticorps humanisé , on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
[0057] Par anticorps humain , on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes.
une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non-murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine.
[0056] Par anticorps humanisé , on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
[0057] Par anticorps humain , on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes.
11 [0058] On entend par fragment d'anticorps , toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins un pont disulfure et qui est capable de se lier à l'antigène reconnu par l'anticorps entier, par exemple Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, les diabodies, les anticorps linéaires (aussi appelés Single Domain Antibodies ou sdAb, ou nanobodies), les anticorps avec une seule chaine (ex. les scFv). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à
un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre.
[0059] Le terme affinité fait référence à la force de l'ensemble des interactions non-covalentes entre une molécule, par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps et l'antigène reconnu, par exemple un antigène tel que la protéine G
alpha. L'affinité est généralement représentée par la constante de dissociation (Kd). La constante de dissociation (Kd) peut être mesurée par des méthodes bien connues, par exemple en FRET ou en SPR.
[0060] Au sens de la présente invention, l'identité ou l'homologie est calculée en comparant deux séquences alignées dans une fenêtre de comparaison.
L'alignement des séquences permet de déterminer le nombre de positions (nucléotides ou acides aminés) en commun pour les deux séquences dans la fenêtre de comparaison. Le nombre de positions en commun est donc divisé par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et multiplié par pour obtenir le pourcentage d'identité. La détermination du pourcentage d'identité
de séquence peut être effectuée manuellement ou grâce à des programmes informatiques bien connus.
[0061] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'identité ou l'homologie correspond à au moins une substitution, par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, substitutions, d'un résidu d'acide aminé, de préférence au moins une substitution d'un résidu d'acide aminé réalisée de façon conservative. La substitution d'un résidu d'acide aminé réalisée de façon conservative consiste à remplacer un
un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre.
[0059] Le terme affinité fait référence à la force de l'ensemble des interactions non-covalentes entre une molécule, par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps et l'antigène reconnu, par exemple un antigène tel que la protéine G
alpha. L'affinité est généralement représentée par la constante de dissociation (Kd). La constante de dissociation (Kd) peut être mesurée par des méthodes bien connues, par exemple en FRET ou en SPR.
[0060] Au sens de la présente invention, l'identité ou l'homologie est calculée en comparant deux séquences alignées dans une fenêtre de comparaison.
L'alignement des séquences permet de déterminer le nombre de positions (nucléotides ou acides aminés) en commun pour les deux séquences dans la fenêtre de comparaison. Le nombre de positions en commun est donc divisé par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et multiplié par pour obtenir le pourcentage d'identité. La détermination du pourcentage d'identité
de séquence peut être effectuée manuellement ou grâce à des programmes informatiques bien connus.
[0061] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'identité ou l'homologie correspond à au moins une substitution, par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, substitutions, d'un résidu d'acide aminé, de préférence au moins une substitution d'un résidu d'acide aminé réalisée de façon conservative. La substitution d'un résidu d'acide aminé réalisée de façon conservative consiste à remplacer un
12 résidu d'acide aminé par un autre résidu d'acide aminé, ayant une chaîne latérale possédant des propriétés similaires. Les familles d'acides aminés possédant des chaines latérales avec des propriétés similaires sont bien connues, on peut citer par exemple les chaines latérales basiques (e.g., lysine, arginine, histidine), les chaines latérales acides (e.g., aspartic acid, glutamic acid), les chaînes latérales polaires et non chargées (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), les chaînes latérales apolaires (e.g., glycine, cysteine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), les chaînes latérales beta-ramifiées (e.g., threonine, valine, isoleucine) et les chaînes latérales aromatiques (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
[0062] Les anticorps ou fragments d'anticorps homologues ou variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps (c'est-à-dire des anticorps ou fragments d'anticorps ayant la même fonction) possèdent donc certains acides aminés qui peuvent être substitués par d'autres acides aminés au niveau des régions constantes et/ou des régions variables, sans perdre la capacité de liaison à
l'antigène. Il est préférable que cette substitution soit réalisée au sein de la séquence d'ADN qui code pour l'anticorps ou le fragment d'anticorps, c'est-à-dire que la substitution soit conservative en nature. L'Homme du métier utilise ses connaissances générales pour déterminer le nombre de substitutions qui peuvent être réalisés et leur localisation afin de pouvoir conserver la fonction de l'anticorps ou du fragment d'anticorps. Afin de déterminer la capacité d'un ou plusieurs variants d'anticorps ou de fragment d'anticorps à se lier spécifiquement à un antigène, plusieurs méthodes appropriées, bien connues de l'homme du métier et décrites dans l'art antérieur, peuvent être utilisées. Les anticorps ou les fragments d'anticorps peuvent donc être testés par les méthodes de liaison, comme par exemple la méthode ELISA, la méthode par chromatographie d'affinité, etc. Les variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps peuvent être générés par exemple par la méthode de phage display permettant de générer une librairie de phage. Un grand nombre de méthodes sont connues afin de générer une librairie de phage display et cibler les variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps ayant les caractéristiques fonctionnelles recherchées.
[0062] Les anticorps ou fragments d'anticorps homologues ou variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps (c'est-à-dire des anticorps ou fragments d'anticorps ayant la même fonction) possèdent donc certains acides aminés qui peuvent être substitués par d'autres acides aminés au niveau des régions constantes et/ou des régions variables, sans perdre la capacité de liaison à
l'antigène. Il est préférable que cette substitution soit réalisée au sein de la séquence d'ADN qui code pour l'anticorps ou le fragment d'anticorps, c'est-à-dire que la substitution soit conservative en nature. L'Homme du métier utilise ses connaissances générales pour déterminer le nombre de substitutions qui peuvent être réalisés et leur localisation afin de pouvoir conserver la fonction de l'anticorps ou du fragment d'anticorps. Afin de déterminer la capacité d'un ou plusieurs variants d'anticorps ou de fragment d'anticorps à se lier spécifiquement à un antigène, plusieurs méthodes appropriées, bien connues de l'homme du métier et décrites dans l'art antérieur, peuvent être utilisées. Les anticorps ou les fragments d'anticorps peuvent donc être testés par les méthodes de liaison, comme par exemple la méthode ELISA, la méthode par chromatographie d'affinité, etc. Les variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps peuvent être générés par exemple par la méthode de phage display permettant de générer une librairie de phage. Un grand nombre de méthodes sont connues afin de générer une librairie de phage display et cibler les variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps ayant les caractéristiques fonctionnelles recherchées.
13 [0063] Avantageusement, l'anticorps ou le fragment d'anticorps utilisé dans le cadre de la présente invention se lie à la protéine G alphai, G alphao et/ou G
alphaz, par exemple il se lie à la protéine G alphai1, à la protéine G a1phai2 et/ou à
la protéine G a1phai3. La protéine G alphai1 d'origine humaine porte l'identifiant UniProt P63096-1 pour l'isoforme 1 et l'identifiant UniProt P63096-2 pour l'isoforme 2. Le gène codant pour la protéine G alphai1 d'origine humaine est connu sous le nom de GNAI1 (Gene ID : 2770, NCBI).
[0064] Au sens de l'invention, le terme molécule capable de moduler l'activation du RCPG désigne une molécule capable d'activer ou d'inhiber un RCPG, et donc d'induire la transduction ou d'empêcher la transduction d'un signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la cellule via le RCPG. Il peut s'agir d'un agoniste, d'un antagoniste, d'un agoniste inverse, d'un modulateur allostérique positif ou d'un modulateur allostérique négatif.
[0065] Au sens de l'invention, le terme molécule à tester est une molécule susceptible de moduler l'activation du RCPG.
[0066] Dans la présente description, le terme molécule , sans autre précision, désigne à la fois les termes molécule capable de moduler l'activation du GPCR et molécule à tester .
[0067] Le terme RET (de l'anglais Resonance Energy Transfer ) désigne les techniques de transfert d'énergie.
[0068] Le terme FRET (de l'anglais Fluorescence Resonance Energy Transfer ) désigne le transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes.
Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle¨dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à
proximité l'une de l'autre, un signal de FRET sera émis.
[0069] Le terme BRET (de l'anglais Bioluminescence Resonance Energy Transfer ) désigne le transfert d'énergie entre une molécule bioluminescente et une molécule fluorescente.
alphaz, par exemple il se lie à la protéine G alphai1, à la protéine G a1phai2 et/ou à
la protéine G a1phai3. La protéine G alphai1 d'origine humaine porte l'identifiant UniProt P63096-1 pour l'isoforme 1 et l'identifiant UniProt P63096-2 pour l'isoforme 2. Le gène codant pour la protéine G alphai1 d'origine humaine est connu sous le nom de GNAI1 (Gene ID : 2770, NCBI).
[0064] Au sens de l'invention, le terme molécule capable de moduler l'activation du RCPG désigne une molécule capable d'activer ou d'inhiber un RCPG, et donc d'induire la transduction ou d'empêcher la transduction d'un signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la cellule via le RCPG. Il peut s'agir d'un agoniste, d'un antagoniste, d'un agoniste inverse, d'un modulateur allostérique positif ou d'un modulateur allostérique négatif.
[0065] Au sens de l'invention, le terme molécule à tester est une molécule susceptible de moduler l'activation du RCPG.
[0066] Dans la présente description, le terme molécule , sans autre précision, désigne à la fois les termes molécule capable de moduler l'activation du GPCR et molécule à tester .
[0067] Le terme RET (de l'anglais Resonance Energy Transfer ) désigne les techniques de transfert d'énergie.
[0068] Le terme FRET (de l'anglais Fluorescence Resonance Energy Transfer ) désigne le transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes.
Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle¨dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à
proximité l'une de l'autre, un signal de FRET sera émis.
[0069] Le terme BRET (de l'anglais Bioluminescence Resonance Energy Transfer ) désigne le transfert d'énergie entre une molécule bioluminescente et une molécule fluorescente.
14 [0070] Au sens de l'invention, le terme ligand désigne une molécule capable de se lier à une molécule cible. Dans le cadre de l'invention, la molécule cible est la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET. Dans le cadre de la présente invention, il est nécessaire que le ligand soit capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET.
Néanmoins, le ligand n'est pas nécessairement spécifique de la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET. Ainsi, le ligand utilisé
dans le cadre de l'invention peut aussi être capable de se lier à la protéine Galpha liée au GDP, à la protéine Galpha liée au GTP, à la protéine Galpha liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable non-marqué, ou même à la protéine Galpha vide. Le ligand peut être de nature protéique (ex. une protéine ou un peptide) ou de nature nucléotidique (ex. un ADN ou un ARN). Dans le cadre de l'invention, le ligand est avantageusement choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, un peptide ou un aptamère, de préférence un anticorps ou un fragment d'anticorps. Dans le cadre de la présente invention, le ligand peut être marqué de manière directe ou indirecte selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple comme décrit ci-après, mais de manière préférée, le ligand est marqué de manière directe, par liaison covalente avec un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0071] Le terme couple de partenaires de RET désigne un couple constitué
d'un composé donneur d'énergie (ci-après composé donneur ) et d'un composé
accepteur d'énergie (ci-après composé accepteur ); lorsqu'ils sont à
proximité
l'un de l'autre et lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé donneur, ces composés émettent un signal de RET. Il est connu que pour que deux composés soient partenaires de RET, le spectre d'émission du composé donneur doit recouvrir partiellement le spectre d'excitation du composé
accepteur. Par exemple, on parle de couples de partenaires de FRET
lorsqu'on utilise un composé fluorescent donneur et un composé accepteur ou de couple de partenaires de BRET lorsqu'on utilise un composé bioluminescent donneur et un composé accepteur.
[0072] Le terme signal de RET désigne tout signal mesurable représentatif d'un RET entre un composé donneur et un composé accepteur. Par exemple, un signal de FRET peut donc être une variation de l'intensité ou de la durée de vie de luminescence du composé fluorescent donneur ou du composé accepteur 5 lorsque ce dernier est fluorescent.
[0073] Le terme contenant désigne un puits d'une plaque, un tube à essai ou de tout autre contenant approprié au mélange d'une préparation membranaire avec les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention.
[0074] L'invention concerne une méthode pour déterminer la capacité d'une 10 molécule à moduler l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G
(RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) introduction, dans un premier contenant :
- d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha,
Néanmoins, le ligand n'est pas nécessairement spécifique de la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET. Ainsi, le ligand utilisé
dans le cadre de l'invention peut aussi être capable de se lier à la protéine Galpha liée au GDP, à la protéine Galpha liée au GTP, à la protéine Galpha liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable non-marqué, ou même à la protéine Galpha vide. Le ligand peut être de nature protéique (ex. une protéine ou un peptide) ou de nature nucléotidique (ex. un ADN ou un ARN). Dans le cadre de l'invention, le ligand est avantageusement choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, un peptide ou un aptamère, de préférence un anticorps ou un fragment d'anticorps. Dans le cadre de la présente invention, le ligand peut être marqué de manière directe ou indirecte selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple comme décrit ci-après, mais de manière préférée, le ligand est marqué de manière directe, par liaison covalente avec un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0071] Le terme couple de partenaires de RET désigne un couple constitué
d'un composé donneur d'énergie (ci-après composé donneur ) et d'un composé
accepteur d'énergie (ci-après composé accepteur ); lorsqu'ils sont à
proximité
l'un de l'autre et lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé donneur, ces composés émettent un signal de RET. Il est connu que pour que deux composés soient partenaires de RET, le spectre d'émission du composé donneur doit recouvrir partiellement le spectre d'excitation du composé
accepteur. Par exemple, on parle de couples de partenaires de FRET
lorsqu'on utilise un composé fluorescent donneur et un composé accepteur ou de couple de partenaires de BRET lorsqu'on utilise un composé bioluminescent donneur et un composé accepteur.
[0072] Le terme signal de RET désigne tout signal mesurable représentatif d'un RET entre un composé donneur et un composé accepteur. Par exemple, un signal de FRET peut donc être une variation de l'intensité ou de la durée de vie de luminescence du composé fluorescent donneur ou du composé accepteur 5 lorsque ce dernier est fluorescent.
[0073] Le terme contenant désigne un puits d'une plaque, un tube à essai ou de tout autre contenant approprié au mélange d'une préparation membranaire avec les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention.
[0074] L'invention concerne une méthode pour déterminer la capacité d'une 10 molécule à moduler l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G
(RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) introduction, dans un premier contenant :
- d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha,
15 -d'une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué
par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - d'un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, - éventuellement d'un agoniste du RCPG;
b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ;
c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'à l'étape a) et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à
tester ;
d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ;
e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG.
[0075] Il n'est pas nécessaire d'ajouter une source de GTP, autre que le GTP
non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué, lors de la mise en oeuvre du
par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - d'un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, - éventuellement d'un agoniste du RCPG;
b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ;
c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'à l'étape a) et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à
tester ;
d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ;
e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG.
[0075] Il n'est pas nécessaire d'ajouter une source de GTP, autre que le GTP
non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué, lors de la mise en oeuvre du
16 procédé selon l'invention. D'ailleurs, avantageusement, aucune autre source de GTP que le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué n'est ajoutée lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
[0076] Il n'est pas non plus nécessaire d'ajouter une source de GDP lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Néanmoins, une faible quantité de GDP
peut être tolérée lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, par exemple à l'étape a). Dans les formats 1A et 1B (Figures 2A et 2B), avantageusement, aucune source de GDP n'est ajoutée lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Dans les formats 2A et 2B (Figures 2C et 2D), l'ajout de GDP peut permettre une meilleure discrimination du signal entre une condition ne contenant pas d'agoniste et une condition contenant un agoniste.
[0077] Etape a) [0078] L'étape a) consiste à introduire, dans un premier contenant les trois ou quatre éléments suivants :
- une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué
par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capables de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, et - éventuellement un agoniste du RCPG.
[0079] Avantageusement, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est choisi parmi le GTPgammaS (GTPyS ou GTPgS), le GppNHp et le GppCp. Le GTPgammaS devant être marqué sur une position autre que le troisième phosphate (phosphate gamma). Les trois ou quatre éléments peuvent être introduits dans le contenant de manière séquentielle dans n'importe quel ordre, ou de manière simultanée ou quasi-simultanée. Le mélange des 3 éléments permet d'obtenir une solution réactionnelle adaptée à la mise en oeuvre d'un RET. D'autres éléments peuvent être ajoutés dans le contenant afin d'adapter la
[0076] Il n'est pas non plus nécessaire d'ajouter une source de GDP lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Néanmoins, une faible quantité de GDP
peut être tolérée lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, par exemple à l'étape a). Dans les formats 1A et 1B (Figures 2A et 2B), avantageusement, aucune source de GDP n'est ajoutée lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Dans les formats 2A et 2B (Figures 2C et 2D), l'ajout de GDP peut permettre une meilleure discrimination du signal entre une condition ne contenant pas d'agoniste et une condition contenant un agoniste.
[0077] Etape a) [0078] L'étape a) consiste à introduire, dans un premier contenant les trois ou quatre éléments suivants :
- une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué
par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capables de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, et - éventuellement un agoniste du RCPG.
[0079] Avantageusement, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est choisi parmi le GTPgammaS (GTPyS ou GTPgS), le GppNHp et le GppCp. Le GTPgammaS devant être marqué sur une position autre que le troisième phosphate (phosphate gamma). Les trois ou quatre éléments peuvent être introduits dans le contenant de manière séquentielle dans n'importe quel ordre, ou de manière simultanée ou quasi-simultanée. Le mélange des 3 éléments permet d'obtenir une solution réactionnelle adaptée à la mise en oeuvre d'un RET. D'autres éléments peuvent être ajoutés dans le contenant afin d'adapter la
17 solution à la mise en oeuvre du RET. Par exemple, on peut ajouter la coelentérazine h (benzyl-coelentérazine) ou la bisdésoxycoelentérazine (DeepBlueCTM) ou didéshydrocoelenterazine (coelentérazine-400a) ou la D-luciférine.
[0080] Dans un premier mode de réalisation particulier, le ligand de la protéine Galpha se lie spécifiquement au domaine Switchll de la protéine Galpha, en particulier au peptide 215-294 de la protéine Galpha. Par exemple, la protéine Galpha est choisie parmi Galphai1, Galphai2 et Galphai3 et le ligand de la protéine Galpha est un peptide KB1753 de séquence Ser-Ser-Arg-Gly-Tyr-Tyr-lo His-Gly-Ile-Trp-Val-Gly-Glu-Glu-Gly-Arg-Leu-Ser-Arg (SEQ ID No : 1).
[0081] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, la protéine Galpha est choisie parmi Galphai1, Galphai2 et Galphai3 et le ligand de la protéine Galpha entre en compétition pour la liaison à ladite protéine Galpha avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1). La capacité du ligand à compéter pour la liaison à
ladite protéine Galpha avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) peut être testée par une méthode par compétition.
[0082] Une méthode par compétition consiste à tester un ligand de la protéine Galpha pour ses capacités à bloquer la liaison entre le peptide KB1753 (SEQ ID
No : 1) et la protéine Galpha, ou à entrer en compétition avec le peptide (SEQ ID No : 1) pour la liaison à la protéine Galpha. En d'autres termes, un ligand de la protéine Galpha qui entre en compétition avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) pour la liaison à la protéine Galpha se lie au même épitope que le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) ou à un épitope qui est suffisamment proches de l'épitope reconnu par le peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) pour empêcher la liaison du ligand de la protéine Galpha pour des raisons d'encombrements stériques. De nombreux types de méthodes par compétition peuvent être utilisés pour déterminer si un ligand de la protéine Galpha entre en compétition avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1), par exemple par test ELISA. Par exemple, la méthode par compétition par ELISA implique l'utilisation d'une protéine Galpha purifiée liée à une surface solide ou à des cellules, d'un ligand de la protéine Galpha à tester qui se lie à la protéine Galpha et le peptide KB1753 marqué.
Habituellement, le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) de référence est utilisé à
une concentration non saturante (par rapport à sa constante de dissociation Kd pour
[0080] Dans un premier mode de réalisation particulier, le ligand de la protéine Galpha se lie spécifiquement au domaine Switchll de la protéine Galpha, en particulier au peptide 215-294 de la protéine Galpha. Par exemple, la protéine Galpha est choisie parmi Galphai1, Galphai2 et Galphai3 et le ligand de la protéine Galpha est un peptide KB1753 de séquence Ser-Ser-Arg-Gly-Tyr-Tyr-lo His-Gly-Ile-Trp-Val-Gly-Glu-Glu-Gly-Arg-Leu-Ser-Arg (SEQ ID No : 1).
[0081] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, la protéine Galpha est choisie parmi Galphai1, Galphai2 et Galphai3 et le ligand de la protéine Galpha entre en compétition pour la liaison à ladite protéine Galpha avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1). La capacité du ligand à compéter pour la liaison à
ladite protéine Galpha avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) peut être testée par une méthode par compétition.
[0082] Une méthode par compétition consiste à tester un ligand de la protéine Galpha pour ses capacités à bloquer la liaison entre le peptide KB1753 (SEQ ID
No : 1) et la protéine Galpha, ou à entrer en compétition avec le peptide (SEQ ID No : 1) pour la liaison à la protéine Galpha. En d'autres termes, un ligand de la protéine Galpha qui entre en compétition avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) pour la liaison à la protéine Galpha se lie au même épitope que le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) ou à un épitope qui est suffisamment proches de l'épitope reconnu par le peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) pour empêcher la liaison du ligand de la protéine Galpha pour des raisons d'encombrements stériques. De nombreux types de méthodes par compétition peuvent être utilisés pour déterminer si un ligand de la protéine Galpha entre en compétition avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1), par exemple par test ELISA. Par exemple, la méthode par compétition par ELISA implique l'utilisation d'une protéine Galpha purifiée liée à une surface solide ou à des cellules, d'un ligand de la protéine Galpha à tester qui se lie à la protéine Galpha et le peptide KB1753 marqué.
Habituellement, le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) de référence est utilisé à
une concentration non saturante (par rapport à sa constante de dissociation Kd pour
18 la protéine Galpha) et on mesure le signal en absence ou en présence de concentrations croissantes du ligand de la protéine Galpha à tester. Lorsqu'un ligand de la protéine Galpha d'intérêt est présent en excès, il peut bloquer la liaison spécifique du peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) à la protéine Galpha d'au moins 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est bloquée d'au moins 80 à 85%, 85 à 90%, 90 à 95%, 95 à 97% ou 97% ou plus.
[0083] Un autre exemple de méthode par compétition peut utiliser le TR-FRET.
Par exemple, le TR-FRET implique l'utilisation d'une protéine Galpha purifiée et tagguée, d'un ligand anti-Tag (avantageusement un anticorps) marqué par le premier membre du couple de partenaire de TR-FRET (avantageusement le donneur) capable de se lier sur le tag de la protéine Galpha, du peptide (SEQ ID NO : 1) marqué par le deuxième membre du couple de partenaire de TR-FRET (avantageusement l'accepteur par une méthode de marquage indirecte avec une biotine sur le peptide et de la streptavidine-accepteur) et d'un ligand de la protéine Galpha à tester. Habituellement, le peptide KB1753 (SEQ ID NO : 1) est utilisé à une concentration non saturante (par rapport à sa constate de dissociation Kd pour la protéine Galpha) et on mesure le signal TR-FRET en absence ou en présence de concentrations croissantes du ligand de la protéine Galpha à tester. Lorsqu'un ligand de la protéine Galpha d'intérêt est testé, il peut bloquer la liaison spécifique du peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) à la protéine Galpha d'au moins 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%
ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est bloquée d'au moins 80 à 85%, 85 à 90%, 90 à 95%, 95 à 97% ou 97% ou plus. Si le ligand de la protéine Galpha testé inhibe la liaison du peptide KB1753 (SEQ ID No: 1), le caractère orthostérique de l'inhibition (en opposition à une inhibition allostérique) peut être confirmé par des expériences de Schild-Plot qui consiste à mesurer la constante de dissociation (Kd) du peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) marqué pour la protéine Galpha en absence ou en présence de concentrations croissantes du ligand de la protéine Galpha. Si le Kd évolue de manière linéaire et non saturable lorsque la concentration de ligand de la protéine Galpha augmente, l'inhibition est orthostérique (c'est-à-dire que le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) et le ligand de la protéine Galpha se lient sur le même épitope de la protéine Galpha). Si le Kd
[0083] Un autre exemple de méthode par compétition peut utiliser le TR-FRET.
Par exemple, le TR-FRET implique l'utilisation d'une protéine Galpha purifiée et tagguée, d'un ligand anti-Tag (avantageusement un anticorps) marqué par le premier membre du couple de partenaire de TR-FRET (avantageusement le donneur) capable de se lier sur le tag de la protéine Galpha, du peptide (SEQ ID NO : 1) marqué par le deuxième membre du couple de partenaire de TR-FRET (avantageusement l'accepteur par une méthode de marquage indirecte avec une biotine sur le peptide et de la streptavidine-accepteur) et d'un ligand de la protéine Galpha à tester. Habituellement, le peptide KB1753 (SEQ ID NO : 1) est utilisé à une concentration non saturante (par rapport à sa constate de dissociation Kd pour la protéine Galpha) et on mesure le signal TR-FRET en absence ou en présence de concentrations croissantes du ligand de la protéine Galpha à tester. Lorsqu'un ligand de la protéine Galpha d'intérêt est testé, il peut bloquer la liaison spécifique du peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) à la protéine Galpha d'au moins 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%
ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est bloquée d'au moins 80 à 85%, 85 à 90%, 90 à 95%, 95 à 97% ou 97% ou plus. Si le ligand de la protéine Galpha testé inhibe la liaison du peptide KB1753 (SEQ ID No: 1), le caractère orthostérique de l'inhibition (en opposition à une inhibition allostérique) peut être confirmé par des expériences de Schild-Plot qui consiste à mesurer la constante de dissociation (Kd) du peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) marqué pour la protéine Galpha en absence ou en présence de concentrations croissantes du ligand de la protéine Galpha. Si le Kd évolue de manière linéaire et non saturable lorsque la concentration de ligand de la protéine Galpha augmente, l'inhibition est orthostérique (c'est-à-dire que le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) et le ligand de la protéine Galpha se lient sur le même épitope de la protéine Galpha). Si le Kd
19 évolue de manière non-linéaire et saturable lorsque la concentration de ligand de la protéine Galpha augmente, l'inhibition est allostérique (c'est-à-dire que le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1) et le ligand ne se lient pas sur le même épitope de la protéine G alpha).
[0084] Le ligand de la protéine Galpha peut être un anticorps ou un fragment d'anticorps.
[0085] Ainsi, dans un troisième mode de réalisation particulier, le ligand de la protéine Galpha est un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à
la protéine G alpha , qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID
NO : 3, et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, et - un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5, un CDR2 de séquence d'acides aminés DTS
(soit les trois acides aminés Asp Thr Ser ou encore les trois acides aminés acide aspartique, thréonine, sérine), et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6.
[0086] Le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps ou du fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha peut comprendre :
- un FR1 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7, - un FR2 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8, - un FR3 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9, et/ou - un FR4 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 10.
[0087] Le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps ou du fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha peut comprendre :
5 - un FR1 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 11, - un FR2 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
10 d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 12, - un FR3 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 15 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 13, et/ou - un FR4 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la
[0084] Le ligand de la protéine Galpha peut être un anticorps ou un fragment d'anticorps.
[0085] Ainsi, dans un troisième mode de réalisation particulier, le ligand de la protéine Galpha est un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à
la protéine G alpha , qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID
NO : 3, et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, et - un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5, un CDR2 de séquence d'acides aminés DTS
(soit les trois acides aminés Asp Thr Ser ou encore les trois acides aminés acide aspartique, thréonine, sérine), et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6.
[0086] Le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps ou du fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha peut comprendre :
- un FR1 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7, - un FR2 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8, - un FR3 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9, et/ou - un FR4 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 10.
[0087] Le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps ou du fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha peut comprendre :
5 - un FR1 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 11, - un FR2 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
10 d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 12, - un FR3 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 15 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 13, et/ou - un FR4 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la
20 séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 14.
[0088] Dans un mode de réalisation particulier de l'anticorps ou du fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha:
= le domaine variable de la chaîne lourde comprend :
- un FR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7 (i.e. 100%
d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7), - un FR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8, - un FR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9, et - un FR4 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 10 ; et = le domaine variable de la chaîne légère comprend :
- un FR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 11, - un FR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 12, - un FR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 13, et - un FR4 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 14.
[0088] Dans un mode de réalisation particulier de l'anticorps ou du fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha:
= le domaine variable de la chaîne lourde comprend :
- un FR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7 (i.e. 100%
d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7), - un FR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8, - un FR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9, et - un FR4 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 10 ; et = le domaine variable de la chaîne légère comprend :
- un FR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 11, - un FR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 12, - un FR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 13, et - un FR4 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 14.
21 [0089] Dans un mode de réalisation particulier de l'anticorps ou du fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha, le domaine variable de la chaîne lourde peut présenter au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 15, et le domaine variable de la chaîne légère peut présenter d'homologie au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie avec la Io séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 16.
[0090] Ainsi, le ligand de la protéine Galpha peut être un anticorps ou fragment d'anticorps dans lequel :
- le domaine variable de la chaîne lourde présente au moins 80%
d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95%
d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO:
15;
- le domaine variable de la chaîne légère présente au moins 80%
d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95%
d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO:
16 ; et - le CDR1 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, le CDR2 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, le CDR3 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, le CDR1 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5, le CDR2 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés DTS, et le CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6.
[0091] Avantageusement, le ligand de la protéine Galpha est un anticorps un anticorps ou fragment d'anticorps dans lequel le domaine variable de la chaîne
[0090] Ainsi, le ligand de la protéine Galpha peut être un anticorps ou fragment d'anticorps dans lequel :
- le domaine variable de la chaîne lourde présente au moins 80%
d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95%
d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO:
15;
- le domaine variable de la chaîne légère présente au moins 80%
d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95%
d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO:
16 ; et - le CDR1 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, le CDR2 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, le CDR3 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, le CDR1 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5, le CDR2 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés DTS, et le CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6.
[0091] Avantageusement, le ligand de la protéine Galpha est un anticorps un anticorps ou fragment d'anticorps dans lequel le domaine variable de la chaîne
22 lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 15 (i.e. le domaine variable de la chaîne lourde présente 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 15) et le domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO : 16.
[0092] L'anticorps décrit dans les exemples sous la référence DSV36S
(anticorps DSV disponible auprès de Cisbio Bioassays sur demande) comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 15 et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO : 16.
[0093] L'anticorps ou fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G
alpha selon le troisième mode de réalisation particulier décrit ci-dessus est appelé
anticorps ou fragment d'anticorps de référence ci-après dans le quatrième mode de réalisation particulier.
[0094] Dans un quatrième mode de réalisation particulier, le ligand de la protéine Galpha est un anticorps ou d'un fragment d'anticorps qui entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence, ci-après anticorps ou fragment d'anticorps compétiteur .
[0095] La capacité d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps à entrer en compétition avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour la liaison à la protéine G alpha peut être testée par une méthode par compétition. Une méthode par compétition consiste à tester un anticorps (ou un fragment d'anticorps) pour ses capacités à bloquer la liaison entre un anticorps ou fragment d'anticorps de référence et un antigène ou à entrer en compétition avec un anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour la liaison à
l'antigène. En d'autres termes, un anticorps qui entre en compétition avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence se lie au même épitope que l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence ou à un épitope qui est suffisamment proches de l'épitope reconnu par l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour empêcher la liaison de l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour des raisons d'encombrements stériques.
[0096] De nombreux types de méthodes par compétition peuvent être utilisés pour déterminer si un anticorps ou un fragment d'anticorps entre en compétition avec
[0092] L'anticorps décrit dans les exemples sous la référence DSV36S
(anticorps DSV disponible auprès de Cisbio Bioassays sur demande) comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 15 et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO : 16.
[0093] L'anticorps ou fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G
alpha selon le troisième mode de réalisation particulier décrit ci-dessus est appelé
anticorps ou fragment d'anticorps de référence ci-après dans le quatrième mode de réalisation particulier.
[0094] Dans un quatrième mode de réalisation particulier, le ligand de la protéine Galpha est un anticorps ou d'un fragment d'anticorps qui entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence, ci-après anticorps ou fragment d'anticorps compétiteur .
[0095] La capacité d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps à entrer en compétition avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour la liaison à la protéine G alpha peut être testée par une méthode par compétition. Une méthode par compétition consiste à tester un anticorps (ou un fragment d'anticorps) pour ses capacités à bloquer la liaison entre un anticorps ou fragment d'anticorps de référence et un antigène ou à entrer en compétition avec un anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour la liaison à
l'antigène. En d'autres termes, un anticorps qui entre en compétition avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence se lie au même épitope que l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence ou à un épitope qui est suffisamment proches de l'épitope reconnu par l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour empêcher la liaison de l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour des raisons d'encombrements stériques.
[0096] De nombreux types de méthodes par compétition peuvent être utilisés pour déterminer si un anticorps ou un fragment d'anticorps entre en compétition avec
23 un anticorps ou fragment d'anticorps de référence, par exemple: par test ELISA
par compétition, par la méthode du sandwich direct ou indirect, par dosage radio-immunologique (RIA) direct ou indirect en phase solide, par dosage immuno-enzymatique en phase solide directe ou indirecte (EIA), etc. Par exemple, la méthode ELISA par compétition implique l'utilisation d'un antigène purifié lié
à
une surface solide ou à des cellules, l'anticorps à tester qui se lie à
l'antigène non marqué et un anticorps ou fragment d'anticorps de référence marqué.
Habituellement, l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence est présent en concentration non saturante (par rapport à sa constante de dissociation Kd pour la protéine Galpha) et on mesure le signal à des concentrations croissantes de l'anticorps ou du fragment d'anticorps à tester. Lorsqu'un anticorps est présent en excès, il peut bloquer ou inhiber (par exemple réduire) la liaison spécifique d'un anticorps ou fragment d'anticorps de référence à un antigène d'au moins 45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est inhibée d'au moins 80 à 85%, 85 à 90%, 90 à 95%, à 97% ou 97% ou plus.
[0097] Les anticorps ou fragments d'anticorps compétiteurs mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peuvent, par exemple, être obtenus avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence par la mise en oeuvre du protocole décrit dans l'Exemple 26. L'anticorps décrit dans les exemples sous la référence DSV38S
(anticorps DSV disponible auprès de Cisbio Bioassays sur demande) est un anticorps compétiteur qui peut être s en oeuvre dans le procédé selon l'invention.
[0098] Les anticorps ou fragments d'anticorps de référence et les anticorps ou fragments d'anticorps compétiteurs tels que définis ci-dessus sont appelés conjointement anticorps ou fragments d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention ci-après.
[0099] L'anticorps ou le fragment d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé
selon l'invention peut se lier a la protéine G alpha sous une forme isolée et/ou présente dans un environnement membranaire, par exemple il peut se lier a une protéine G alpha présente dans une préparation de membranes portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéines G alpha. Il n'est pas nécessaire que la protéine G alpha soit complexée avec le RCPG pour que l'anticorps selon l'invention puisse se lier à la protéine G alpha.
par compétition, par la méthode du sandwich direct ou indirect, par dosage radio-immunologique (RIA) direct ou indirect en phase solide, par dosage immuno-enzymatique en phase solide directe ou indirecte (EIA), etc. Par exemple, la méthode ELISA par compétition implique l'utilisation d'un antigène purifié lié
à
une surface solide ou à des cellules, l'anticorps à tester qui se lie à
l'antigène non marqué et un anticorps ou fragment d'anticorps de référence marqué.
Habituellement, l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence est présent en concentration non saturante (par rapport à sa constante de dissociation Kd pour la protéine Galpha) et on mesure le signal à des concentrations croissantes de l'anticorps ou du fragment d'anticorps à tester. Lorsqu'un anticorps est présent en excès, il peut bloquer ou inhiber (par exemple réduire) la liaison spécifique d'un anticorps ou fragment d'anticorps de référence à un antigène d'au moins 45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est inhibée d'au moins 80 à 85%, 85 à 90%, 90 à 95%, à 97% ou 97% ou plus.
[0097] Les anticorps ou fragments d'anticorps compétiteurs mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peuvent, par exemple, être obtenus avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence par la mise en oeuvre du protocole décrit dans l'Exemple 26. L'anticorps décrit dans les exemples sous la référence DSV38S
(anticorps DSV disponible auprès de Cisbio Bioassays sur demande) est un anticorps compétiteur qui peut être s en oeuvre dans le procédé selon l'invention.
[0098] Les anticorps ou fragments d'anticorps de référence et les anticorps ou fragments d'anticorps compétiteurs tels que définis ci-dessus sont appelés conjointement anticorps ou fragments d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention ci-après.
[0099] L'anticorps ou le fragment d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé
selon l'invention peut se lier a la protéine G alpha sous une forme isolée et/ou présente dans un environnement membranaire, par exemple il peut se lier a une protéine G alpha présente dans une préparation de membranes portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéines G alpha. Il n'est pas nécessaire que la protéine G alpha soit complexée avec le RCPG pour que l'anticorps selon l'invention puisse se lier à la protéine G alpha.
24 [0100] L'anticorps ou le fragment d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé
selon l'invention peut se lier à la protéine G alpha avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure ou égale à 20 nM. Une constante de dissociation inférieure à 20 nM est préférable pour la bonne mise en oeuvre d'un RET. Avantageusement, l'anticorps ou le fragment d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peut se lier à la protéine G alpha avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure ou égale à 20 nM, par exemple une constante d'affinité inférieure ou égale à 10 nM ou encore inférieure ou égale à 5 nM, par exemple allant de 0 à 20 nM (0 étant exclu), allant de 0 à 10 nM (0 étant exclu), allant de 0 à 5 nM (0 étant exclu). Un procédé
pour mesurer le Kd d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps selon l'invention en FRET est décrit à l'Exemple 27.
[0101] L'anticorps ou le fragment d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé
selon l'invention est particulièrement avantageux dans la mise en oeuvre du procédé
selon l'invention.
[0102] Par exemple, des anticorps ou fragments d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peuvent être obtenus par la mise en oeuvre du protocole décrit dans l'Exemple 26.
[0103] Les inventeurs ont également montrés que les anticorps ou fragments d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention se lient au domaine Switchll de la protéine G alpha, et plus particulièrement au peptide 215-294 de la protéine G alpha.
[0104] Le premier contenant peut éventuellement contenir un agoniste du RCPG.
Des agonistes de RCPG sont largement décrits dans la littérature, par exemple dans le Tableau 1 de la demande W02011/018586.
[0105] Etape b) [0106] L'étape b) consiste à mesurer le signal de RET émis dans le premier contenant, c'est-à-dire le contenant obtenu à l'étape a). Le signal mesuré
correspond au signal obtenu dans le contenant en absence de la molécule à
tester. La mesure peut se faire par des méthodes conventionnelles largement connues de l'homme du métier et ne pose pas de problème particulier. On utilise généralement un appareil qui permet de détecter et de mesurer le signal de RET, comme par exemple le lecteur de microplaques PHERAstar FS (BMG Labtech) avec le mode de lecture TR-FRET ou bioluminescence.
[0107] Etape c) [0108] Dans un mode de réalisation, l'étape c) consiste à introduire dans un second 5 contenant les mêmes réactifs qu'à l'étape a) et la molécule à tester.
Avantageusement, le second contenant est préparé de la même manière que le premier contenant, la seule différence étant la présence dans le deuxième contenant de la molécule à tester. Ce mode de réalisation est avantageux car il permet d'effectuer la mesure du signal de RET émis dans le premier contenant et 10 dans le deuxième contenant de manière simultanée. Ce mode de réalisation permet également d'effectuer la mesure simultanée du signal de RET émis dans un ou plusieurs seconds contenants. Ainsi, ce mode de réalisation est particulièrement avantageux puisqu'il permet de tester plusieurs molécules différentes en parallèle.
15 .. [0109] Dans un autre mode de réalisation, l'étape c) consiste à
introduire dans le premier contenant la molécule à tester. Ce mode de réalisation présente l'avantage de n'utiliser qu'un seul contenant pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention.
[0110] Etape d) 20 -- [0111] L'étape d) consiste à mesurer le signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c). Le signal mesuré
correspond au signal obtenu dans le contenant en présence de la molécule à
tester. Comme à l'étape b), la mesure peut se faire par des méthodes conventionnelles largement connues de l'homme du métier et ne pose pas de
selon l'invention peut se lier à la protéine G alpha avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure ou égale à 20 nM. Une constante de dissociation inférieure à 20 nM est préférable pour la bonne mise en oeuvre d'un RET. Avantageusement, l'anticorps ou le fragment d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peut se lier à la protéine G alpha avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure ou égale à 20 nM, par exemple une constante d'affinité inférieure ou égale à 10 nM ou encore inférieure ou égale à 5 nM, par exemple allant de 0 à 20 nM (0 étant exclu), allant de 0 à 10 nM (0 étant exclu), allant de 0 à 5 nM (0 étant exclu). Un procédé
pour mesurer le Kd d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps selon l'invention en FRET est décrit à l'Exemple 27.
[0101] L'anticorps ou le fragment d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé
selon l'invention est particulièrement avantageux dans la mise en oeuvre du procédé
selon l'invention.
[0102] Par exemple, des anticorps ou fragments d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peuvent être obtenus par la mise en oeuvre du protocole décrit dans l'Exemple 26.
[0103] Les inventeurs ont également montrés que les anticorps ou fragments d'anticorps mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention se lient au domaine Switchll de la protéine G alpha, et plus particulièrement au peptide 215-294 de la protéine G alpha.
[0104] Le premier contenant peut éventuellement contenir un agoniste du RCPG.
Des agonistes de RCPG sont largement décrits dans la littérature, par exemple dans le Tableau 1 de la demande W02011/018586.
[0105] Etape b) [0106] L'étape b) consiste à mesurer le signal de RET émis dans le premier contenant, c'est-à-dire le contenant obtenu à l'étape a). Le signal mesuré
correspond au signal obtenu dans le contenant en absence de la molécule à
tester. La mesure peut se faire par des méthodes conventionnelles largement connues de l'homme du métier et ne pose pas de problème particulier. On utilise généralement un appareil qui permet de détecter et de mesurer le signal de RET, comme par exemple le lecteur de microplaques PHERAstar FS (BMG Labtech) avec le mode de lecture TR-FRET ou bioluminescence.
[0107] Etape c) [0108] Dans un mode de réalisation, l'étape c) consiste à introduire dans un second 5 contenant les mêmes réactifs qu'à l'étape a) et la molécule à tester.
Avantageusement, le second contenant est préparé de la même manière que le premier contenant, la seule différence étant la présence dans le deuxième contenant de la molécule à tester. Ce mode de réalisation est avantageux car il permet d'effectuer la mesure du signal de RET émis dans le premier contenant et 10 dans le deuxième contenant de manière simultanée. Ce mode de réalisation permet également d'effectuer la mesure simultanée du signal de RET émis dans un ou plusieurs seconds contenants. Ainsi, ce mode de réalisation est particulièrement avantageux puisqu'il permet de tester plusieurs molécules différentes en parallèle.
15 .. [0109] Dans un autre mode de réalisation, l'étape c) consiste à
introduire dans le premier contenant la molécule à tester. Ce mode de réalisation présente l'avantage de n'utiliser qu'un seul contenant pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention.
[0110] Etape d) 20 -- [0111] L'étape d) consiste à mesurer le signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c). Le signal mesuré
correspond au signal obtenu dans le contenant en présence de la molécule à
tester. Comme à l'étape b), la mesure peut se faire par des méthodes conventionnelles largement connues de l'homme du métier et ne pose pas de
25 problème particulier. On utilise généralement un appareil qui permet de détecter et de mesurer le signal de RET, comme par exemple le lecteur de microplaques PHERAstar FS (BMG Labtech) avec le mode de lecture TR-FRET ou bioluminescence.
[0112] Etape e) -- [0113] L'étape e) consiste à comparer les signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG.
[0112] Etape e) -- [0113] L'étape e) consiste à comparer les signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG.
26 La modulation du signal peut être soit une augmentation du signal soit une diminution du signal.
[0114] L'homme du métier peut aisément comparer les signaux des étapes b) et d) et définir un seuil lui permettant de qualifier la modulation, par exemple un écart entre les signaux supérieur à 5%, supérieur à 10%, supérieur à 15%, supérieur à
20% ou supérieur à 25%. On peut par exemple calculer le ratio entre les signaux des étapes b) et d). De manière générale, pour un couple de partenaires de RET
donné, plus l'écart entre les signaux est important, plus le ratio entre les signaux sera important et plus la modulation de l'activation du RCPG (ex. activation ou 1.0 inhibition) est importante. L'écart entre les signaux est toutefois susceptible de varier en fonction du couple de partenaires de RET utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Le niveau de modulation de l'activation du RCPG
permet d'identifier des molécules plus ou moins agonistes, antagonistes, agonistes inverse modulateur allostérique positif ou modulateur allostérique négatif.
[0115] Dans un premier mode de réalisation particulier, le premier contenant ne contient pas un agoniste du RCPG et à l'étape e) une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste du RCPG.
[0116] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, le premier contenant comprend un agoniste du RCPG et à l'étape e) :
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ;
- une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG.
[0117] Dans un troisième mode de réalisation particulier, le premier contenant ne comprend pas un agoniste du RCPG et à l'étape e) une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste du RCPG.
[0118] Dans un quatrième mode de réalisation particulier, le premier contenant comprend un agoniste du RCPG et à l'étape e) :
[0114] L'homme du métier peut aisément comparer les signaux des étapes b) et d) et définir un seuil lui permettant de qualifier la modulation, par exemple un écart entre les signaux supérieur à 5%, supérieur à 10%, supérieur à 15%, supérieur à
20% ou supérieur à 25%. On peut par exemple calculer le ratio entre les signaux des étapes b) et d). De manière générale, pour un couple de partenaires de RET
donné, plus l'écart entre les signaux est important, plus le ratio entre les signaux sera important et plus la modulation de l'activation du RCPG (ex. activation ou 1.0 inhibition) est importante. L'écart entre les signaux est toutefois susceptible de varier en fonction du couple de partenaires de RET utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Le niveau de modulation de l'activation du RCPG
permet d'identifier des molécules plus ou moins agonistes, antagonistes, agonistes inverse modulateur allostérique positif ou modulateur allostérique négatif.
[0115] Dans un premier mode de réalisation particulier, le premier contenant ne contient pas un agoniste du RCPG et à l'étape e) une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste du RCPG.
[0116] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, le premier contenant comprend un agoniste du RCPG et à l'étape e) :
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ;
- une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG.
[0117] Dans un troisième mode de réalisation particulier, le premier contenant ne comprend pas un agoniste du RCPG et à l'étape e) une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste du RCPG.
[0118] Dans un quatrième mode de réalisation particulier, le premier contenant comprend un agoniste du RCPG et à l'étape e) :
27 - une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ;
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG.
[0119] Marquage du ligand par un membre d'un couple de partenaires de RET
[0120] Le ligand peut être marqué de manière directe ou indirecte.
[0121] Le marquage direct du ligand par un membre d'un couple de partenaires de RET, par exemple un composé fluorescent quand on met en oeuvre un FRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l'homme du métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur le ligand. Par exemple, lorsque le ligand est un anticorps ou un fragment d'anticorps, les groupes réactifs suivants peuvent être utilisés : le groupe amino terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
[0122] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par le ligand. Les groupes réactifs appropriés, portés par le ligand, sont bien connus de l'homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines portées par une protéine ou un peptide, par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps. De même, un composé donneur / accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à
une amine présente une protéine ou un peptide.
[0123] Le ligand peut également être marqué par un composé fluorescent ou bioluminescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu de mesure un anticorps ou un fragment d'anticorps, lui-même lié de manière covalente à un composé accepteur / donneur, ce deuxième anticorps ou fragment d'anticorps reconnaissant de manière spécifique le ligand.
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ;
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG.
[0119] Marquage du ligand par un membre d'un couple de partenaires de RET
[0120] Le ligand peut être marqué de manière directe ou indirecte.
[0121] Le marquage direct du ligand par un membre d'un couple de partenaires de RET, par exemple un composé fluorescent quand on met en oeuvre un FRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l'homme du métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur le ligand. Par exemple, lorsque le ligand est un anticorps ou un fragment d'anticorps, les groupes réactifs suivants peuvent être utilisés : le groupe amino terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
[0122] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par le ligand. Les groupes réactifs appropriés, portés par le ligand, sont bien connus de l'homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines portées par une protéine ou un peptide, par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps. De même, un composé donneur / accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à
une amine présente une protéine ou un peptide.
[0123] Le ligand peut également être marqué par un composé fluorescent ou bioluminescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu de mesure un anticorps ou un fragment d'anticorps, lui-même lié de manière covalente à un composé accepteur / donneur, ce deuxième anticorps ou fragment d'anticorps reconnaissant de manière spécifique le ligand.
28 [0124] Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la biotine sur le ligand à marquer, puis d'incuber ce ligand biotinylé en présence de streptavidine marquée par un composé accepteur / donneur. Des ligands biotinylés appropriés peuvent être préparés par des techniques bien connues de l'homme du métier ; la société Cisbio Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec un fluorophore dont la dénomination commerciale est d2 (réf. 610SADLA).
[0125] Dans le cadre de l'invention, le ligand est marqué par (i) un composé
fluorescent donneur ou luminescent donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). De préférence, le ligand est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé
accepteur non fluorescent (quencher).
[0126] Marquage du GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable par un membre d'un couple de partenaires de RET
[0127] Le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable peut être marqué de manière directe ou indirecte. De préférence, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué de manière directe.
[0128] Le marquage direct du GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable par un membre d'un couple de partenaires de RET, par exemple un composé
fluorescent quand on met en oeuvre un FRET, peut être effectué par les méthodes reposant sur la présence de groupes réactifs sur le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable.
[0129] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par un membre d'un couple de partenaires de RET. Les groupes réactifs appropriés, portés par le membre d'un couple de partenaires de RET, sont bien connus de l'homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols. De même, un composé donneur / accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine.
[0130] Dans le cadre de l'invention, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par (i) un composé fluorescent donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent
[0125] Dans le cadre de l'invention, le ligand est marqué par (i) un composé
fluorescent donneur ou luminescent donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). De préférence, le ligand est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé
accepteur non fluorescent (quencher).
[0126] Marquage du GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable par un membre d'un couple de partenaires de RET
[0127] Le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable peut être marqué de manière directe ou indirecte. De préférence, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué de manière directe.
[0128] Le marquage direct du GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable par un membre d'un couple de partenaires de RET, par exemple un composé
fluorescent quand on met en oeuvre un FRET, peut être effectué par les méthodes reposant sur la présence de groupes réactifs sur le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable.
[0129] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par un membre d'un couple de partenaires de RET. Les groupes réactifs appropriés, portés par le membre d'un couple de partenaires de RET, sont bien connus de l'homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols. De même, un composé donneur / accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine.
[0130] Dans le cadre de l'invention, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par (i) un composé fluorescent donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent
29 (quencher). De préférence, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent donneur.
[0131] Dans un mode de réalisation particulier, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent donneur et le ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). Dans un autre mode de réalisation particulier, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher) et ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur.
[0132] Marquage pour la mise en oeuvre d'un FRET
[0133] Dans un mode de réalisation particulier, le ligand et le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable sont chacun marqués par un membre d'un couple de partenaires de FRET, c'est à dire un composé fluorescent donneur ou un composé fluorescent accepteur d'énergie.
[0134] La sélection du couple de partenaires de FRET pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. Par exemple, des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition 338), auquel l'homme du métier pourra se référer.
[0135] Composés fluorescents donneurs [0136] Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (>0,1 ms, de préférence comprise dans la gamme allant de 0,5 à 6 ms), en particulier les complexes de lanthanide c'est-à-dire les chélates, les macrocycles ou cryptates de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET (en langue anglaise, Time Resolved FRET ) en s'affranchissant d'une grande partie du bruit de fond émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Avantageusement, ces composés sont des complexes de lanthanides. Ces complexes (tels que chélates ou cryptates) sont particulièrement appropriés en tant que membre du couple de FRET donneur d'énergie.
[0137] Les complexes d'europium (Eu3+), de terbium (Tb3+), de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodymium (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, les complexes d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) étant 5 particulièrement préférés.
[0138] De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés Perkin Elmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays.
[0139] Des exemples de chélates ou cryptates de terres rares appropriés aux fins 10 de l'invention sont :
[0140] - Les cryptates de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine.
De tels cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO
01/96 877. Les cryptates de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont 15 particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptates de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à
titre d'exemple non limitatif les cryptates d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
20 [0141]
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HOOC COOH
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H
A..,. 1 N
m r.:113+N -, -,e117.µk / c 00 H
HOOC (X)OH
PV ¨ Bi Pv - tetr a ac id e-- Eu [0145] - Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société
Perkin Elmer.
[0146] - Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO
2009/10580.
[0147] - Les cryptates de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP
1 154 990 sont également utilisables.
[0148] - Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupeNI-12) :
[0149]
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P'-o ,,,,,, , O'" , !
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\ i ,,. ,,...... , ., '',.... , , 20 s ... i -----[0150] et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO
2008/063721 (composé 6a page 89).
[0151] - Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé
par Cisbio Bioassays.
[0152] - Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) :
[0153]
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[0154] - Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(II) tris(2,2'-bipyridine).
[0155] - Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821.
[0156]
et r \
4\ ,k i i \ \weis rnt CO: 0 N ' , ( , \.¨ceill) '\It [0157] - Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal of Luminescence 1997, 75(2): 149-169) :
[0158]
NCS
N ¨N
N
N
e--\t, ;
0 ek 'ese_ <=\ t )=0 CP=C
HO
Tb-W14016 [0159] Avantageusement, le composé fluorescent donneur est un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d'europium, un chélate d'europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole.
[0160] De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dot ; les chélates et les cryptates d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
[0161] Des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqués par un composé fluorescent donneur susceptibles d'être utilisé dans la méthode FRET
de l'invention sont représentés par les formules générales (1) et (2a, 2b, 2c) ci-dessous :
[0162]
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HO OH HO OH
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o; 1 Xie 0. o, ve: xe. em O>Ye Oirt Xe ' t-e e.IMÉüe etkee <Weee [0163] Le marquage des analogues du GTP peut être effectué sur différentes positions du GTP :
- en position gamma du phosphate (0, NH, CH2), OU
5 - sur les positions 2' et 3' du ribose [0164] Dans un mode de réalisation particulier, des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqués par un composé fluorescent donneur susceptibles d'être utilisé dans la méthode FRET de l'invention sont représentés par la formule générale (I) :
Io [0165]
o eNi)(j\ii II II
Ln 3+ ¨L-Y¨P PõPs sCI) OH OH OH
HO OH
dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
15 L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3.
[0166] On entend par complexe de lanthanide un chélate, un macrocycle, un cryptate ou toute espèce organique capable de complexer un atome de la famille des lanthanides, le lanthanide (Ln) étant choisi parmi : Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, 20 Er, de préférence le lanthanide est Tb, Sm ou Eu et de manière encore plus préférée Eu ou Tb.
[0167] Les composés pour lesquels Y = 0 sont appelés analogues GTP-gamma-0.
Les composés pour lesquels Y = NH sont appelés analogues GTP-gamma-N.
Les composés pour lesquels Y = CH2 sont appelés analogues GTP-gamma-C.
[0168] Le groupe de liaison divalent L est avantageusement choisi parmi :
- une liaison directe;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8; ou _ un groupe arylène en C6-C14;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo.
[0169] Encore plus avantageusement, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi les groupes suivants :
[0170]
(C1-12)n¨O¨ (CH2)0¨ (CI-12) ;
H II II
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H
¨ (CNA¨NIL-0¨ (C1-12)n-7- N
S¨ (CI-12)p¨ =
H H I I
¨ (CH2)n¨N ¨ ; (CH2)n¨N¨ (CI-12)rr = (CI-12) ;
H ____________________________ H
¨ (CH2)n _______ (C1-12) ; N¨ (CH2)n-¨(CH2) ________ I N ¨LL (CH2) -e [0171] dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4.
[0172] De manière tout à fait avantageuse, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi une liaison directe, un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C8 ou un groupe de formule :
[0173]
H$ (C110-m .. ;
[0174] Le groupe de liaison divalent L est de préférence choisi parmi :
[0175]
¨(CH)¨ (C112)c--0¨i:CHA7-0¨(C1106---.
le groupe ¨(CH2)n- étant tout particulièrement préféré.
[0176] Le groupe L peut également avantageusement être un groupe de formule :
H H
______________ N (CH2)n N __ (CH2)m S _________________________________________ N
CH ____________________________________________________________ o dans laquelle m, n et p sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à
5.
[0177] Le groupe réactif G3 est choisi parmi l'un des groupes suivants : un acrylamide, une amine éventuellement activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules :
( 11 NH)¨(CH2) NCS ( 11 NH)¨(CH2)¨NCO
V w y w ( 11 NH)¨(CH2)¨NH2 ( 11 NH¨)¨(CH2)¨N3 y w y w ( 11 NH)¨(CH2)¨SH
( 11 NH)¨(CH2)¨S-S-Ar y w y w ( 11 NH¨)¨(CH2)¨NH-Ar ( 11 NH ) y w (CH2)¨
y >----( 11 NH)¨(CH2) 41 NCS ( 11 NH-)_y(CH) NCO
V w w .0 >/s03-( 11 NH¨)¨(CH2) 41 N3 ( 11 NH)¨v (CH2) w m o¨:
y w )------.----- 0 ( 11 NH NH w 11 0 N ( 11 NH)¨(CH2) =CH
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( 11 NH)¨(CH2)¨NH¨ \ N
y w N=( CI
dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.
De manière préférée, le groupe réactif G3 est choisi parmi une amine (éventuellement protégée sous forme ¨NHBoc), un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle un haloacétamide, une hydrazine, une halotriazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe ¨0O2Me, -0O2tBu). Dans ce dernier cas, l'acide devra être activé sous forme d'ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile.
Le complexe de lanthanide Ln3+ est avantageusement choisi parmi l'un des complexes ci-après :
[0178]
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C86b, Ln= Tb C87 C88 C89 C90 [0179] Avantageusement, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C17, C24 à C32 et C36 à C44. De manière plus avantageuse, le 5 complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à
C17 et C36 à C44. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C4 et Cl 1 à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de 10 lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C4 et C11. De manière tout à fait avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est le complexe C2 ou le complexe C3.
[0180] La préparation des analogues de GTP susmentionnés est décrite soit dans la littérature, soit dans la demande de brevet français déposée le 30 janvier 15 sous le numéro FR 19 00856.
[0181] Avantageusement, l'analogue de GTP marqué par un composé fluorescent donneur peut être choisi parmi GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl-C11 (GTP-gamma-N-octyl-C11), GTPgN-octyl-C3 (GTP-gamma-N-octyl-C3), GTPg0-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPg0-hexyl-C3 (GTP-gamma-0-hexyl-C3) ou GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-C2), présentés ci-dessous.
[0182]
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H il II il o -Eu3* GTP-gamma-N octyl-thiosuccinimidyl C2 0 [0183] Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'analogue de GTP
marqué par un composé fluorescent donneur est le GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
[0184] Composés fluorescents accepteurs [0185] Les composés fluorescents accepteurs peuvent être choisis dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination Bodipy ), les fluorophores connus sous la dénomination Atto , les fluorophores connus sous la dénomination DY , les composés connus sous la dénomination Alexa , le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les prof lavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
[0186] Les expressions les cyanines et les rhodamines doivent être respectivement comprises comme les dérivés de cyanine et les dérivés de rhodamine . L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
[0187] Les composés Alexa sont commercialisés par la société Invitrogen;
les composés Atto sont commercialisés par la société Attotec ; les composés << DY sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés Cy sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros.
[0188] Les protéines fluorescentes suivantes peuvent également être utilisées en tant que composé fluorescent accepteur : les protéines fluorescentes cyans (AmCyan1, Midori-lshi Cyan, mTFP1), les protéines fluorescentes vertes (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen), les protéines fluorescentes jaunes (EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana), les protéines fluorescentes oranges et rouges (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer, mTangerine, AsRed2, mRFP1, JRed, mCherry, mStrawberry, HcRed1, mRaspberry, HcRed-Tandem, mPlim, A0143), les protéines fluorescentes dans le rouge lointain (mKate, mKate2, tdKatushka2).
[0189] Avantageusement, pour le ligand de la protéine Galpha, le composé
fluorescent accepteur est un partenaire de FRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole et un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP
choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed.
[0190] Avantageusement, pour l'analogue de GTP marqué, le composé fluorescent accepteur est un partenaire de FRET choisi parmi : les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole.
[0191] Des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqués par un composé fluorescent accepteur susceptibles d'être utilisé dans la méthode FRET
de l'invention sont représentés par les formules générales (3) et (4a, 4b, 4c) ci-dessous :
[0192]
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Mkee eyeee 4g> ZY$ 0> Yez OK Xe% tHe [0193] Le marquage des analogues du GTP peut être effectué sur différentes positions du GTP :
- en position gamma du phosphate (0, NH, CH2) ; ou - sur les positions 2' et 3' du ribose.
[0194] Dans un mode de réalisation particuliers, des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un composé fluorescent accepteur susceptibles d'être utilisé dans la méthode de l'invention peuvent être choisi parmi les GTPg0-Linker-Cy5(P) (GTP-g0-hexyl-Cy5 diS03-) (Jena Bioscience -NU-834-CY5), GTPgS-Linker-Cy5(R) (GTP-gS-EDA-Cy5) (Jena Bioscience - NU-1610-CY5), GTPgN-octyl-AF488 (GTP-gN-octyl-AF488) (Cisbio Bioassays), GTPgN-L18-Fluorescein (GTP-gN-EDA-pentyl-Fluoresceine) (Cisbio Bioassays) et GTPgN-octyl-CY5 (GTP-gN-octyl-Cy5) (Cisbio Bioassays) et sont représentés par les formules suivantes :
[0195]
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,,... ..,, me.eeeyKe esebe weemysi [0196] Marquage pour la mise en oeuvre d'un BRET
[0197] Dans un mode de réalisation particulier, le ligand est marqué par un membre d'un couple de partenaires de BRET, c'est à dire un composé luminescent 5 donneur ou un composé fluorescent accepteur d'énergie.
[0198] Le marquage direct du ligand par un composé luminescent donneur ou un composé fluorescent accepteur de type protéine, membre d'un couple de partenaires de BRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l'homme du métier et notamment décrites dans l'article de Tank Issad et Ralf 10 Jockers (Bioluminescence Resonance Energy Transfer to Monitor Protein-Protein Interactions, Transmembrane Signaling Protocols pp 195-209, Part of the Methods in Molecular BiologyTM book series MIMB, volume 332) auquel l'homme du métier pourra se référer.
[0199] Le marquage direct du ligand ou du GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable par un composé fluorescent accepteur de type molécule organique, membre d'un couple de partenaires de BRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l'homme du métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur le ligand comme cité ci-dessus.
[0200] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par un membre d'un couple de partenaires de BRET. Les groupes réactifs appropriés, portés par le membre d'un couple de partenaires de BRET, sont bien connus de l'homme du métier, par exemple un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines portées par une protéine ou un peptide, par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps.
De même, un composé accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine présente une protéine ou un peptide.
[0201] La sélection du couple de partenaires de BRET pour obtenir un signal de BRET est à la portée de l'homme du métier. Par exemple, des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de BRET sont notamment décrits dans l'article de Dasiel O. Borroto-Escuela (BIOLUMINISCENCE
RESONANCE ENERGY TRANSFER (BRET) METHODS TO STUDY G
PROTEIN-COUPLED RECEPTOR-RECEPTOR TYROSINE KINASE
HETERORECEPTOR COMPLEXES, Methods Cell Biol. 2013; 117: 141-164), auquel l'homme du métier pourra se référer.
[0202] Composés luminescents donneurs [0203] Dans un mode de réalisation particulier, le composé luminescent donneur est un partenaire de BRET choisi parmi : la Luciférase (luc), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase.
[0204] Composés fluorescents accepteur [0205] Dans un mode de réalisation particulier, le composé fluorescent accepteur est un partenaire de BRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les prof lavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP (GFP10, GFP2, eGFP), la YFP, les variants YFP (eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus, YPet), le mOrange, le DsRed.
[0206]EXEMPLES
[0207] Matériel [0208] - les préparations membranaires de cellules exprimant les récepteurs étudiés et la protéine Galphai ont été achetées chez Perkin Elmer ou Euroscreen. Le tableau ci-dessous liste les fonds cellulaires et références des différents échantillons utilisés :
[0209] [Table 1]
Fournieseur Reference celfuleim 1 Delta Opioïde 1 HEK293 Perle amer 611 0549400UA
Delta Opioide CHO-K1 furceffla Service ---Dopamine D2S CHO-K1 famegem 1 Service [0210] - les anticorps DSV36S et DSV38S ont été générés par Cisbio Bioassays et sont disponibles auprès de Cisbio Bioassays sur demande (sous les références respectives DSV36S et DSV38S). L'anticorps DSV36S comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO: 15. Les anticorps ont été marqués avec les sondes fluorescentes compatibles pour une détection TR-FRET
(accepteur rouge ¨ d2 ou donneur Lumi4Tb). Les deux anticorps DSV36S et DSV38S se lient au niveau du domaine switch II de la protéine Galphai.
[0211] - les nucléotides GTP, GDP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G8877, G7127 et G8634).
[0212] - les agonistes des RCPG Delta Opioïde (SNC162) et Dopamine D25 (PPHT) et l'antagoniste du RCPG Delta Opioïde (Naltrindole) ont été achetés chez Tocris (références catalogues respectives 1529 et 0740).
[0213] - les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été
achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075).
[0214] - Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores donneurs ou accepteurs (GTPgN-C2 ; GTPgN-C3 ; GTPgN-octyl-C2 ; GTPgN-octyl-C11 ; GTPgN-octyl-C3 ; GTPg0-hexyl-C2 ;
GTPg0-hexyl-C3 ; GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 ; GTPgN-octyl-Cy5 ;
GTPgN-octyl-AF488) ont été synthétisés à Cisbio Bioassays.
[0215] - Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores accepteurs GTPg0-Linker-Cy5(P) et GTPgS-Linker-Cy5(R) ont été achetés chez Jena Bioscience sous les références respectives NU-834-CY5 et NU-1610-CY5.
Io [0216] Méthode [0217] Préparation des réactifs [0218] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCl2 10mM, BSA 0,1%, NaCI 10mM ou 100mM ou 300mM ou 500mM (concentration spécifiée dans la légende de chaque figure), 0 ou 0.5 ou 1 M GDP
(concentration spécifiée dans la légende de chaque figure). Les membranes ont été préparées 4X pour distribuer 1 ou 104/puits (quantité spécifiée dans la légende de chaque figure). Le nucléotide GTPgS (condition signal non spécifique) a été préparé 6.67X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 100 M. Les composés à tester (agonistes ou antagonistes) ont été
préparés 10X pour obtenir les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les graphiques. Les anticorps anti-Galphai utilisés pour la détection ont été
préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits suivantes :
anticorps DSV36S-d2 (10nM) ; anticorps DSV36S-Lumi4Tb (0.5 ou 1nM) ;
anticorps DSV38S-d2 (10nM). Les analogues GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables marqués avec des sondes fluorescentes donneur ou accepteur ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les légendes de chaque figure.
[0219] Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits [0220] = Membranes exprimant le RCPG et la protéine G : 5 L
= Tampon ou nucléotide GTPgS (pour la condition signal non spécifique) : 3 1_ = Analogue GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables ¨ donneur ou accepteur : 5 L
= Ligand anti Galphai-donneur ou accepteur : 5 L
= Tampon ou Composés à tester (agonistes et / ou antagonistes) : 2 L.
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits contenant un excès de GTPgS (100 M).
[0221] Lecture du signal HTRF
[0222] Les plaques ont été incubées à 21 C pendant 20h (hormis si autrement spécifié dans les figures) puis le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec la configuration suivante :
= Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm) = Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs = Fenêtre de lecture : délais : 60 5 ¨ Intégration : 400 5.
[0223] Traitement du signal [0224] A partir des signaux bruts à 665nm (pour accepteur rouge - Cy5) ou 520nm (pour accepteurs verts ¨ AF488 ou Fluorescéine) et 620nm, le Ratio HTRF a été
calculé selon la formule suivante :
Ratio HTRF = Signal à 665nm ou Signal à 520nm / Signal à 620nm * 10,000.
[0225] Formats d'essais [0226] La figure 2A illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET donneur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET accepteur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une diminution de la liaison de l'analogue GTP-donneur à la protéine G et donc une diminution du signal de RET (format 1A).
[0227] La figure 2B illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET accepteur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET donneur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une diminution de la liaison de l'analogue GTP-accepteur à la protéine G et donc une diminution du signal de RET (format 1 B).
[0228] La figure 2C illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET donneur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET accepteur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la liaison de l'analogue GTP-donneur à la protéine G et donc une augmentation du signal de RET (format 2A).
[0229] La figure 2D illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET accepteur 5 et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET donneur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la liaison de l'analogue GTP-accepteur à la protéine G et donc une augmentation du signal de RET (format 2B).
[0230] Exemples 1 à 7 - Test d'activation selon le format 1A sur RCPG Delta 10 Opioïde (DOR) : diminution du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
[0231] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de 15 cellules HEK293 ou CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 1 / Figure 3A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
20 - Exemple 2 / Figure 4A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 3 / Figure 5A : GTPg0-hexyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
25 Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 4 / Figure 6A : GTPgN-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 5 / Figure 7A : GTPgN-C3 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2
[0131] Dans un mode de réalisation particulier, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent donneur et le ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). Dans un autre mode de réalisation particulier, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher) et ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur.
[0132] Marquage pour la mise en oeuvre d'un FRET
[0133] Dans un mode de réalisation particulier, le ligand et le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable sont chacun marqués par un membre d'un couple de partenaires de FRET, c'est à dire un composé fluorescent donneur ou un composé fluorescent accepteur d'énergie.
[0134] La sélection du couple de partenaires de FRET pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. Par exemple, des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition 338), auquel l'homme du métier pourra se référer.
[0135] Composés fluorescents donneurs [0136] Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (>0,1 ms, de préférence comprise dans la gamme allant de 0,5 à 6 ms), en particulier les complexes de lanthanide c'est-à-dire les chélates, les macrocycles ou cryptates de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET (en langue anglaise, Time Resolved FRET ) en s'affranchissant d'une grande partie du bruit de fond émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Avantageusement, ces composés sont des complexes de lanthanides. Ces complexes (tels que chélates ou cryptates) sont particulièrement appropriés en tant que membre du couple de FRET donneur d'énergie.
[0137] Les complexes d'europium (Eu3+), de terbium (Tb3+), de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodymium (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, les complexes d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) étant 5 particulièrement préférés.
[0138] De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés Perkin Elmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays.
[0139] Des exemples de chélates ou cryptates de terres rares appropriés aux fins 10 de l'invention sont :
[0140] - Les cryptates de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine.
De tels cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO
01/96 877. Les cryptates de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont 15 particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptates de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à
titre d'exemple non limitatif les cryptates d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
20 [0141]
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h.......\ s> :.'e.
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HOOC COOH
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H
A..,. 1 N
m r.:113+N -, -,e117.µk / c 00 H
HOOC (X)OH
PV ¨ Bi Pv - tetr a ac id e-- Eu [0145] - Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société
Perkin Elmer.
[0146] - Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO
2009/10580.
[0147] - Les cryptates de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP
1 154 990 sont également utilisables.
[0148] - Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupeNI-12) :
[0149]
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P'-o ,,,,,, , O'" , !
HN NH
\ i ,,. ,,...... , ., '',.... , , 20 s ... i -----[0150] et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO
2008/063721 (composé 6a page 89).
[0151] - Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé
par Cisbio Bioassays.
[0152] - Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) :
[0153]
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\sõ, U
[0154] - Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(II) tris(2,2'-bipyridine).
[0155] - Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821.
[0156]
et r \
4\ ,k i i \ \weis rnt CO: 0 N ' , ( , \.¨ceill) '\It [0157] - Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal of Luminescence 1997, 75(2): 149-169) :
[0158]
NCS
N ¨N
N
N
e--\t, ;
0 ek 'ese_ <=\ t )=0 CP=C
HO
Tb-W14016 [0159] Avantageusement, le composé fluorescent donneur est un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d'europium, un chélate d'europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole.
[0160] De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dot ; les chélates et les cryptates d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
[0161] Des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqués par un composé fluorescent donneur susceptibles d'être utilisé dans la méthode FRET
de l'invention sont représentés par les formules générales (1) et (2a, 2b, 2c) ci-dessous :
[0162]
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HO OH HO OH
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o; 1 Xie 0. o, ve: xe. em O>Ye Oirt Xe ' t-e e.IMÉüe etkee <Weee [0163] Le marquage des analogues du GTP peut être effectué sur différentes positions du GTP :
- en position gamma du phosphate (0, NH, CH2), OU
5 - sur les positions 2' et 3' du ribose [0164] Dans un mode de réalisation particulier, des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqués par un composé fluorescent donneur susceptibles d'être utilisé dans la méthode FRET de l'invention sont représentés par la formule générale (I) :
Io [0165]
o eNi)(j\ii II II
Ln 3+ ¨L-Y¨P PõPs sCI) OH OH OH
HO OH
dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
15 L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3.
[0166] On entend par complexe de lanthanide un chélate, un macrocycle, un cryptate ou toute espèce organique capable de complexer un atome de la famille des lanthanides, le lanthanide (Ln) étant choisi parmi : Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, 20 Er, de préférence le lanthanide est Tb, Sm ou Eu et de manière encore plus préférée Eu ou Tb.
[0167] Les composés pour lesquels Y = 0 sont appelés analogues GTP-gamma-0.
Les composés pour lesquels Y = NH sont appelés analogues GTP-gamma-N.
Les composés pour lesquels Y = CH2 sont appelés analogues GTP-gamma-C.
[0168] Le groupe de liaison divalent L est avantageusement choisi parmi :
- une liaison directe;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8; ou _ un groupe arylène en C6-C14;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo.
[0169] Encore plus avantageusement, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi les groupes suivants :
[0170]
(C1-12)n¨O¨ (CH2)0¨ (CI-12) ;
H II II
¨ (CH2)n-0¨ (CH2),-,70¨ (CH2)-N (CI-12)q (CH2)rin¨ ;
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;
II H HIIS
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H
¨ (CNA¨NIL-0¨ (C1-12)n-7- N
S¨ (CI-12)p¨ =
H H I I
¨ (CH2)n¨N ¨ ; (CH2)n¨N¨ (CI-12)rr = (CI-12) ;
H ____________________________ H
¨ (CH2)n _______ (C1-12) ; N¨ (CH2)n-¨(CH2) ________ I N ¨LL (CH2) -e [0171] dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4.
[0172] De manière tout à fait avantageuse, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi une liaison directe, un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C8 ou un groupe de formule :
[0173]
H$ (C110-m .. ;
[0174] Le groupe de liaison divalent L est de préférence choisi parmi :
[0175]
¨(CH)¨ (C112)c--0¨i:CHA7-0¨(C1106---.
le groupe ¨(CH2)n- étant tout particulièrement préféré.
[0176] Le groupe L peut également avantageusement être un groupe de formule :
H H
______________ N (CH2)n N __ (CH2)m S _________________________________________ N
CH ____________________________________________________________ o dans laquelle m, n et p sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à
5.
[0177] Le groupe réactif G3 est choisi parmi l'un des groupes suivants : un acrylamide, une amine éventuellement activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules :
( 11 NH)¨(CH2) NCS ( 11 NH)¨(CH2)¨NCO
V w y w ( 11 NH)¨(CH2)¨NH2 ( 11 NH¨)¨(CH2)¨N3 y w y w ( 11 NH)¨(CH2)¨SH
( 11 NH)¨(CH2)¨S-S-Ar y w y w ( 11 NH¨)¨(CH2)¨NH-Ar ( 11 NH ) y w (CH2)¨
y >----( 11 NH)¨(CH2) 41 NCS ( 11 NH-)_y(CH) NCO
V w w .0 >/s03-( 11 NH¨)¨(CH2) 41 N3 ( 11 NH)¨v (CH2) w m o¨:
y w )------.----- 0 ( 11 NH NH w 11 0 N ( 11 NH)¨(CH2) =CH
)------- y w Cl N¨(\
( 11 NH)¨(CH2)¨NH¨ \ N
y w N=( CI
dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.
De manière préférée, le groupe réactif G3 est choisi parmi une amine (éventuellement protégée sous forme ¨NHBoc), un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle un haloacétamide, une hydrazine, une halotriazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe ¨0O2Me, -0O2tBu). Dans ce dernier cas, l'acide devra être activé sous forme d'ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile.
Le complexe de lanthanide Ln3+ est avantageusement choisi parmi l'un des complexes ci-après :
[0178]
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S03- C66b, Ln = Tb 03S
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C86b, Ln= Tb C87 C88 C89 C90 [0179] Avantageusement, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C17, C24 à C32 et C36 à C44. De manière plus avantageuse, le 5 complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à
C17 et C36 à C44. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C4 et Cl 1 à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de 10 lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C4 et C11. De manière tout à fait avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est le complexe C2 ou le complexe C3.
[0180] La préparation des analogues de GTP susmentionnés est décrite soit dans la littérature, soit dans la demande de brevet français déposée le 30 janvier 15 sous le numéro FR 19 00856.
[0181] Avantageusement, l'analogue de GTP marqué par un composé fluorescent donneur peut être choisi parmi GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl-C11 (GTP-gamma-N-octyl-C11), GTPgN-octyl-C3 (GTP-gamma-N-octyl-C3), GTPg0-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPg0-hexyl-C3 (GTP-gamma-0-hexyl-C3) ou GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-C2), présentés ci-dessous.
[0182]
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H il II il o -Eu3* GTP-gamma-N octyl-thiosuccinimidyl C2 0 [0183] Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'analogue de GTP
marqué par un composé fluorescent donneur est le GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
[0184] Composés fluorescents accepteurs [0185] Les composés fluorescents accepteurs peuvent être choisis dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination Bodipy ), les fluorophores connus sous la dénomination Atto , les fluorophores connus sous la dénomination DY , les composés connus sous la dénomination Alexa , le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les prof lavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
[0186] Les expressions les cyanines et les rhodamines doivent être respectivement comprises comme les dérivés de cyanine et les dérivés de rhodamine . L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
[0187] Les composés Alexa sont commercialisés par la société Invitrogen;
les composés Atto sont commercialisés par la société Attotec ; les composés << DY sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés Cy sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros.
[0188] Les protéines fluorescentes suivantes peuvent également être utilisées en tant que composé fluorescent accepteur : les protéines fluorescentes cyans (AmCyan1, Midori-lshi Cyan, mTFP1), les protéines fluorescentes vertes (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen), les protéines fluorescentes jaunes (EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana), les protéines fluorescentes oranges et rouges (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer, mTangerine, AsRed2, mRFP1, JRed, mCherry, mStrawberry, HcRed1, mRaspberry, HcRed-Tandem, mPlim, A0143), les protéines fluorescentes dans le rouge lointain (mKate, mKate2, tdKatushka2).
[0189] Avantageusement, pour le ligand de la protéine Galpha, le composé
fluorescent accepteur est un partenaire de FRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole et un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP
choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed.
[0190] Avantageusement, pour l'analogue de GTP marqué, le composé fluorescent accepteur est un partenaire de FRET choisi parmi : les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole.
[0191] Des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqués par un composé fluorescent accepteur susceptibles d'être utilisé dans la méthode FRET
de l'invention sont représentés par les formules générales (3) et (4a, 4b, 4c) ci-dessous :
[0192]
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- en position gamma du phosphate (0, NH, CH2) ; ou - sur les positions 2' et 3' du ribose.
[0194] Dans un mode de réalisation particuliers, des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un composé fluorescent accepteur susceptibles d'être utilisé dans la méthode de l'invention peuvent être choisi parmi les GTPg0-Linker-Cy5(P) (GTP-g0-hexyl-Cy5 diS03-) (Jena Bioscience -NU-834-CY5), GTPgS-Linker-Cy5(R) (GTP-gS-EDA-Cy5) (Jena Bioscience - NU-1610-CY5), GTPgN-octyl-AF488 (GTP-gN-octyl-AF488) (Cisbio Bioassays), GTPgN-L18-Fluorescein (GTP-gN-EDA-pentyl-Fluoresceine) (Cisbio Bioassays) et GTPgN-octyl-CY5 (GTP-gN-octyl-Cy5) (Cisbio Bioassays) et sont représentés par les formules suivantes :
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,,... ..,, me.eeeyKe esebe weemysi [0196] Marquage pour la mise en oeuvre d'un BRET
[0197] Dans un mode de réalisation particulier, le ligand est marqué par un membre d'un couple de partenaires de BRET, c'est à dire un composé luminescent 5 donneur ou un composé fluorescent accepteur d'énergie.
[0198] Le marquage direct du ligand par un composé luminescent donneur ou un composé fluorescent accepteur de type protéine, membre d'un couple de partenaires de BRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l'homme du métier et notamment décrites dans l'article de Tank Issad et Ralf 10 Jockers (Bioluminescence Resonance Energy Transfer to Monitor Protein-Protein Interactions, Transmembrane Signaling Protocols pp 195-209, Part of the Methods in Molecular BiologyTM book series MIMB, volume 332) auquel l'homme du métier pourra se référer.
[0199] Le marquage direct du ligand ou du GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable par un composé fluorescent accepteur de type molécule organique, membre d'un couple de partenaires de BRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l'homme du métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur le ligand comme cité ci-dessus.
[0200] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par un membre d'un couple de partenaires de BRET. Les groupes réactifs appropriés, portés par le membre d'un couple de partenaires de BRET, sont bien connus de l'homme du métier, par exemple un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines portées par une protéine ou un peptide, par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps.
De même, un composé accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine présente une protéine ou un peptide.
[0201] La sélection du couple de partenaires de BRET pour obtenir un signal de BRET est à la portée de l'homme du métier. Par exemple, des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de BRET sont notamment décrits dans l'article de Dasiel O. Borroto-Escuela (BIOLUMINISCENCE
RESONANCE ENERGY TRANSFER (BRET) METHODS TO STUDY G
PROTEIN-COUPLED RECEPTOR-RECEPTOR TYROSINE KINASE
HETERORECEPTOR COMPLEXES, Methods Cell Biol. 2013; 117: 141-164), auquel l'homme du métier pourra se référer.
[0202] Composés luminescents donneurs [0203] Dans un mode de réalisation particulier, le composé luminescent donneur est un partenaire de BRET choisi parmi : la Luciférase (luc), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase.
[0204] Composés fluorescents accepteur [0205] Dans un mode de réalisation particulier, le composé fluorescent accepteur est un partenaire de BRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les prof lavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP (GFP10, GFP2, eGFP), la YFP, les variants YFP (eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus, YPet), le mOrange, le DsRed.
[0206]EXEMPLES
[0207] Matériel [0208] - les préparations membranaires de cellules exprimant les récepteurs étudiés et la protéine Galphai ont été achetées chez Perkin Elmer ou Euroscreen. Le tableau ci-dessous liste les fonds cellulaires et références des différents échantillons utilisés :
[0209] [Table 1]
Fournieseur Reference celfuleim 1 Delta Opioïde 1 HEK293 Perle amer 611 0549400UA
Delta Opioide CHO-K1 furceffla Service ---Dopamine D2S CHO-K1 famegem 1 Service [0210] - les anticorps DSV36S et DSV38S ont été générés par Cisbio Bioassays et sont disponibles auprès de Cisbio Bioassays sur demande (sous les références respectives DSV36S et DSV38S). L'anticorps DSV36S comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO: 15. Les anticorps ont été marqués avec les sondes fluorescentes compatibles pour une détection TR-FRET
(accepteur rouge ¨ d2 ou donneur Lumi4Tb). Les deux anticorps DSV36S et DSV38S se lient au niveau du domaine switch II de la protéine Galphai.
[0211] - les nucléotides GTP, GDP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G8877, G7127 et G8634).
[0212] - les agonistes des RCPG Delta Opioïde (SNC162) et Dopamine D25 (PPHT) et l'antagoniste du RCPG Delta Opioïde (Naltrindole) ont été achetés chez Tocris (références catalogues respectives 1529 et 0740).
[0213] - les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été
achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075).
[0214] - Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores donneurs ou accepteurs (GTPgN-C2 ; GTPgN-C3 ; GTPgN-octyl-C2 ; GTPgN-octyl-C11 ; GTPgN-octyl-C3 ; GTPg0-hexyl-C2 ;
GTPg0-hexyl-C3 ; GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 ; GTPgN-octyl-Cy5 ;
GTPgN-octyl-AF488) ont été synthétisés à Cisbio Bioassays.
[0215] - Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores accepteurs GTPg0-Linker-Cy5(P) et GTPgS-Linker-Cy5(R) ont été achetés chez Jena Bioscience sous les références respectives NU-834-CY5 et NU-1610-CY5.
Io [0216] Méthode [0217] Préparation des réactifs [0218] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCl2 10mM, BSA 0,1%, NaCI 10mM ou 100mM ou 300mM ou 500mM (concentration spécifiée dans la légende de chaque figure), 0 ou 0.5 ou 1 M GDP
(concentration spécifiée dans la légende de chaque figure). Les membranes ont été préparées 4X pour distribuer 1 ou 104/puits (quantité spécifiée dans la légende de chaque figure). Le nucléotide GTPgS (condition signal non spécifique) a été préparé 6.67X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 100 M. Les composés à tester (agonistes ou antagonistes) ont été
préparés 10X pour obtenir les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les graphiques. Les anticorps anti-Galphai utilisés pour la détection ont été
préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits suivantes :
anticorps DSV36S-d2 (10nM) ; anticorps DSV36S-Lumi4Tb (0.5 ou 1nM) ;
anticorps DSV38S-d2 (10nM). Les analogues GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables marqués avec des sondes fluorescentes donneur ou accepteur ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les légendes de chaque figure.
[0219] Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits [0220] = Membranes exprimant le RCPG et la protéine G : 5 L
= Tampon ou nucléotide GTPgS (pour la condition signal non spécifique) : 3 1_ = Analogue GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables ¨ donneur ou accepteur : 5 L
= Ligand anti Galphai-donneur ou accepteur : 5 L
= Tampon ou Composés à tester (agonistes et / ou antagonistes) : 2 L.
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits contenant un excès de GTPgS (100 M).
[0221] Lecture du signal HTRF
[0222] Les plaques ont été incubées à 21 C pendant 20h (hormis si autrement spécifié dans les figures) puis le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec la configuration suivante :
= Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm) = Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs = Fenêtre de lecture : délais : 60 5 ¨ Intégration : 400 5.
[0223] Traitement du signal [0224] A partir des signaux bruts à 665nm (pour accepteur rouge - Cy5) ou 520nm (pour accepteurs verts ¨ AF488 ou Fluorescéine) et 620nm, le Ratio HTRF a été
calculé selon la formule suivante :
Ratio HTRF = Signal à 665nm ou Signal à 520nm / Signal à 620nm * 10,000.
[0225] Formats d'essais [0226] La figure 2A illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET donneur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET accepteur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une diminution de la liaison de l'analogue GTP-donneur à la protéine G et donc une diminution du signal de RET (format 1A).
[0227] La figure 2B illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET accepteur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET donneur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une diminution de la liaison de l'analogue GTP-accepteur à la protéine G et donc une diminution du signal de RET (format 1 B).
[0228] La figure 2C illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET donneur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET accepteur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la liaison de l'analogue GTP-donneur à la protéine G et donc une augmentation du signal de RET (format 2A).
[0229] La figure 2D illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET accepteur 5 et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET donneur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la liaison de l'analogue GTP-accepteur à la protéine G et donc une augmentation du signal de RET (format 2B).
[0230] Exemples 1 à 7 - Test d'activation selon le format 1A sur RCPG Delta 10 Opioïde (DOR) : diminution du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
[0231] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de 15 cellules HEK293 ou CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 1 / Figure 3A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
20 - Exemple 2 / Figure 4A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 3 / Figure 5A : GTPg0-hexyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
25 Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 4 / Figure 6A : GTPgN-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 5 / Figure 7A : GTPgN-C3 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2
30 (10nM final dans le puits) ; 1 g membranes HEK-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI
50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 6 / Figure 8 : GTPgN-octyl-C3 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 1 g membranes HEK-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 7 / Figure 9 : GTPg0-hexyl-C3 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 1 g membranes HEK-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
[0232] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2, GTPgN-octyl-C11, GTPg0-hexyl-C2, GTPgN-C2, GTPgN-C3, GTPgN-octyl-C3, GTPg0-hexyl-C3 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-IO FRET avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 3A à 9).
[0233] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la sortie du GTP-donneur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET.
Ces résultats sont représentés sur les figures 3B (Exemple 1), 4B (Exemple 2), 5B (Exemple 3), 6B (Exemple 4) et 7B (Exemple 5). Avec les analogues GTPgN-octyl-C3 (Exemple 6) et GTPg0-hexyl-C3 (Exemple 7), cette modulation du signal par un agoniste n'a pas été testée.
[0234]Exemple 8¨ Effet de la concentration en membrane et en GTP-donneur sur le test d'activation selon le format lA sur RCPG Delta Opioïde (DOR) :
diminution du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
[0235] Dans un premier temps, la capacité du couple GTPgN-octyl-C2 / Anticorps anti-Galphai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai (1 ou 10 g / puits). Le GTPgN-octyl-C2 a été utilisé à 2 ou 6nM final dans les puits.
Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai DSV36S-d2 (Figure 10A). Par ailleurs, le panel de gauche montre une augmentation de l'amplitude de signal (S/B = Signal Total / Signal Non Spécifique) en augmentant la quantité de membrane de 1 à 104 par puits. Le panel de droite montre une augmentation de l'amplitude du signal (S/B) en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-C2 de 2 à 6nM.
[0236] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la sortie du GTP-donneur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET.
Ces résultats sont représentés sur la figure 10B. Par ailleurs, le panel de gauche montre une augmentation de l'amplitude de signal (S/B = Signal Véhicule sans agoniste / Signal Agoniste) en augmentant la quantité de membrane de 1 à 104 par puits. Le panel de droite montre une augmentation de l'amplitude du signal (S/B) en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-C2 de 2 à 6nM.
[0237] Exemples 9 et 10 - Test d'activation selon le format 1A sur RCPG
Dopamine D2S (D2S) : diminution du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
[0238] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D25 et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 9 / Figure 11A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
D5V365-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D25 / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 10 / Figure 12A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D2S / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
[0239] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2 et GTPgN-octyl-C11 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 11A à 12A).
[0240] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la sortie du GTP-donneur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET.
Ces résultats sont représentés sur les figures 11B (Exemple 9) et 12B (Exemple 10).
[0241] Exemples 11 à 13- Test d'activation selon le format 1B sur RCPG Delta Opioïde (DOR) : diminution du siqnal TR-FRET entre GTP-accepteur et Anticorps anti-protéine Galphai-donneur sous stimulation d'un aqoniste.
[0242] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-accepteur /
Anticorps anti-Galphai donneur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 11 / Figure 13A : GTPg0-Linker-Cy5(P) (250nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final dans le puits) ; 1 g membranes HEK-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA
0,1%. Lecture après 3h d'incubation à 21 C.
- Exemple 12 / Figure 14A : GTPgS-Linler-Cy5(R) (250nM final dans le puits) ;
DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final dans le puits) ; 104 membranes HEK-DOR /
puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
Lecture après 1h d'incubation à 21 C.
- Exemple 13 / Figure 15A : GTPgN-L18-Fluorescein (31nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final dans le puits) ; 1 g membranes HEK-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA
010/ , 0.
[0243] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPg0-Linker-Cy5(P), GTPgS-Linler-Cy5(R) et GTPgN-L18-Fluorescein sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-donneur (Figure 13A à 15A).
[0244] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-accepteur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-accepteur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la sortie du GTP-accepteur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 13B (Exemple 11), 14B (Exemple 12), 15B (Exemple 13). Avec l'analogue GTPgS-Linler-Cy5(R) (Exemple 12), cette modulation du signal par un agoniste est très faible.
[0245] Exemples 14 à 19 - Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde (DOR) : auqmentation du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
[0246] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 14 / Figure 16A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 500mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 15 / Figure 17A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ;
BSA 0,1%.
- Exemple 16 / Figure 18A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
5 DSV38S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ;
BSA 0,1%.
- Exemple 17 / Figure 19A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
10 Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ;
BSA 0,1%.
- Exemple 18 / Figure 20A : GTPg0-hexyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ;
15 BSA 0,1 /o.
- Exemple 19 / Figure 21A : GTPgN-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ; BSA 0,1%.
[0247] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès 20 de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2, GTPgN-octyl-C11, GTPg0-hexyl-C2, GTPgN-C2 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figures 16A à 21A).
25 [0248] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.
L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-30 donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la liaison du GTP-donneur à
la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 16B (Exemple 14), 17B (Exemple 15), 18B (Exemple 16), 19B (Exemple 17), 20B
(Exemple 18) et 21B (Exemple 19). Par ailleurs, la figure 17B (Exemple 15) montre une deuxième condition où l'activation par une concentration fixe d'agoniste du RCPG SNC162 (200nM) a été inhibée par une concentration croissante d'antagoniste du RCPG (Naltrindole). Cette inhibition d'activation est observée par la diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF).
[0249] Exemples 20 à 22 - Test d'activation selon le format 2A sur RCPG
Dopamine D2S (D2S) : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un agoniste.
[0250] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 20 / Figure 22A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D2S / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; GDP 1p1M ; BSA
0,10/0.
- Exemple 21 / Figure 23A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D2S / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 100mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 22 / Figure 24A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D2S / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 100mM ; GDP 1p1M ; BSA
010/ , 0.
[0251] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 22A à 24A).
[0252] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.
L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la liaison du GTP-donneur à
la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 22B (Exemple 20), 23B (Exemple 21) et 24B (Exemple 22).
[0253]Exemples 23 et 24 - Test d'activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde (DOR) : auqmentation du sifflai TR-FRET entre GTP-accepteur et Anticorps anti-protéine Galphai-donneur sous stimulation d'un acioniste.
[0254] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-accepteur /
Anticorps anti-Galphai donneur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 23 / Figure 25A : GTPgN-octyl-Cy5 (50nM final dans le puits) ;
DSV36S-Lumi4Tb (1nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR /
puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP
0.5 M ; BSA 0,1%. Lecture après 3h d'incubation à 21 C.
- Exemple 24 / Figure 26A : GTPgN-octyl-AF488 (50nM final dans le puits) ;
DSV36S-Lumi4Tb (1nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR /
puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP
0.5 M ; BSA 0,1%. Lecture après 3h d'incubation à 21 C.
[0255] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-Cy5 et GTPgN-octyl-AF488 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-donneur (Figure 25A à 26A).
.. [0256] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-accepteur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.
L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-accepteur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la liaison du GTP-accepteur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-accepteur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 25B (Exemple 23) et 26B (Exemple 24).
[0257]Exemples 25 - Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde (DOR) : auqmentation du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 25 / Figure 27A : GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (7.5nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 60mM ; NaCI 150mM ; BSA
010/ , 0.
[0258] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 est capable de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET
avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 27A).
[0259] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.
L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la liaison du GTP-donneur à
la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur la figure 27B (Exemple 25).
[0260] Exemple 26 : Protocole pour obtenir des anticorps anti-protéine G
alphail utilisés dans le procédé selon l'invention [0261] Immunisation de souris [0262] La protéine TST-G alphai1 recombinantes (protéine G alphai1 de séquence UniProt P63096-1 tagguée en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV) a été produite dans des cellules d'insectes Sf9 (infection avec un baculovirus codant ladite protéine) puis purifiée sur une colonne d'affinité via le tag TwinStreptag (TST) (Strep-Tactin Superflow high capacity resin (IBA, Catalogue : 2-1208-002)).
[0263] Des souris BALB/c ont été immunisées par injection de la protéine TST-G
alphai1 préalablement diluée dans du tampon contenant du GTPgS (HEPES
20mM pH8, NaCI 100mM, MgCl2 3mM, CHAPS 11mM, GTPgS 100 M). La primo-injection a été suivie de trois rappels à intervalle d'un mois.
[0264] Quinze jours après chaque injection, des ponctions sanguines sur les souris ont permis de vérifier la présence d'une réponse immunitaire.
[0265] Pour cela, un test de type ELISA a été mis en place. La protéine TST-G
alphai1 préalablement diluée à 20 g/mL dans du tampon contenant du GTPgS
(Tris HCI 20mM pH8.5, NaCI 140mM, EDTA 2mM, MgCl2 10mM, BSA 0.1%, GTPgS lel) a été adsorbée via le tag TwinStreptag sur des plaques 96 puits contenant de la Strep-Tactin XT (IBA, Catalogue : 2-4101-001). Pour cela, 1000 de protéine ont été ajoutés dans chaque puits puis incubées pendant 2h à 37 C
suivi de trois lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20.
[0266] Les dilutions sérielles d'un facteur 10 à 100 millions des ponctions sanguines ont ensuite été ajoutées à hauteur de 100 L / puits et incubées pendant 2h à
37 C. Les anticorps non fixés à la protéine ont été éliminés par trois étapes de lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20 puis la détection des anticorps fixés a été réalisée à l'aide d'un anticorps secondaire anti-Fc de souris lié à la HRP
(horseradish peroxidase) (Sigma #A0168 dilué au 1/10 000 dans du PBS, BSA
0.1%). Après 1h d'incubation à 37 C puis trois lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20, la révélation de la HRP a été réalisé par dosage colorimétrique à 450nm suite à l'incubation de son substrat TMB (3,3',5,5'-Tétraméthylbenzidine, Sigma #T0440) pendant 20min à température ambiante sous agitation.
[0267] Afin de s'assurer que les anticorps détectés par le test ELISA étaient bien dirigés contre la protéine G alphai1 et non contre le tag TwinStrepTag, les 5 mêmes ponctions ont été testés sur le test ELISA après pré-incubation avec un excès d'une autre protéine orthogonale tagguée avec le TwinStrepTag (SNAPTag-TwinStrpeTag). Ainsi, les anticorps anti tag se fixent sur la protéine orthogonale taguée et donc pas sur la protéine G alphai1 attachée au fond des puits ; auquel cas aucun signal HRP ou une diminution du signal HRP est Io détecté.
[0268] Les souris présentant les meilleurs titres d'anticorps et le moins de baisse de signal dans le cas contrôle anti tag ont été sélectionnées pour l'étape suivante d'hybridation lymphocytaire, aussi appelée fusion. La rate des souris a été
récupérée et un mélange des lymphocytes et plasmocystes issus de cette rate a 15 été fusionné in vitro avec une lignée cellulaire de myélome en présence d'un catalyseur de la fusion cellulaire du type polyéthylène glycol. Une lignée cellulaire de myélome mutante, manquant l'enzyme HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) a été utilisée pour permettre une sélection des cellules hybrides, appelées hybridomes. Ces cellules ont été cultivées dans un 20 milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminopterine (methotrexate) et de la thyamine (milieu HAT) pour permettre l'élimination des cellules de myélome non fusionnées et ainsi sélectionner les hybridomes d'intérêt. Les cellules de rate non fusionnées quant à elle meurent puisqu'elles sont incapables de proliférer in vitro.
Ainsi, seuls les hybridomes ont survécu.
25 [0269] Ces hybridomes ont alors été cultivés dans des plaques de culture. Les surnageants de ces hybridomes ont ensuite été testés pour évaluer leur capacité
à produire des anticorps anti protéine G alphai1. Pour cela, un test ELISA
comme décrit ci-dessus a été réalisé.
[0270] Afin d'évaluer la sélectivité des anticorps entre les différentes formes de la 30 protéine Galpahi1 (forme pleine liée au GDP vs forme pleine liée au GTPgS vs forme vide), le test a été réalisé en parallèle sur des conditions de protéine TST-G alphai1 pré-incubée dans le tampon contenant soit du GDP à lel, soit du GTPgS à 1 M soit sans nucléotide. Les meilleurs hybridomes ont ensuite été
clonés avec une étape de dilution limite afin d'obtenir des clones d'hybridome.
[0271] Les clones d'hybridomes d'intérêt ont ensuite été injectés dans des souris (injection intra péritonéale) afin de permettre la production des anticorps en grande quantité dans le liquide d'ascite.
[0272] Les anticorps ont ensuite été purifiés par chromatographie d'affinité
sur des colonnes avec des résines présentant de la protéine A.
[0273] Capacité des anticorps purifiés ci-dessus à entrer en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps DSV36S
[0274] Tous les réactifs sont dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCl2 10mM, BSA 0,1%, NaCI 10mM. La protéine Gail est préparée 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS est préparé 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 10 .M. Ces réactifs sont préparés dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à
température ambiante avant d'être distribués dans les puits. Les anticorps purifiés ci-dessus sont préparés 4X pour viser des concentrations finales dans les puits comprises entre 0.01 et 1 M. L'anticorps DSV36S-d2 est préparé 4X
pour viser une concentration finale de 10nM. L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb est préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.5nM.
[0275] Les réactifs sont distribués dans les plaques 384 puits de la manière suivante :
1. 100 du mélange pré-incubé de protéine G ail + GTPgS sont placés dans chaque puit, 2. 50 de l'anticorps purifié sont rajoutés dans chaque puit 3. Les plaques sont incubées pendant 30 minutes à température ambiante 4. 50 du mélange anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et anticorps DSV36S-d2 sont rajoutés dans chaque puit.
[0276] Les plaques sont incubées 1H à température ambiante avant de lire le signal HTRF.
[0277] Les anticorps selon l'invention sont capables d'inhiber le signal HTRF
obtenu avec de l'anticorps DSV36S-d2. A l'inverse, les anticorps qui ne sont pas selon l'invention ne sont pas capables d'inhiber le signal généré par le DSV36S-d2.
Listage de séquences [0278] [Table 3]
Numéro de séquence Type de séquences Séquence en acides aminés SEQ ID NO: 1 Peptide KB1753 SSRGYYHGIWVGEEGRLSR
SEQ ID NO : 2 VH ¨ CDR1 GFNIKDYY
SEQ ID NO :3 VH ¨ CDR2 IDPENGNT
SEQ ID NO :4 VH ¨ CDR3 TRGGGYYSDWYFDV
SEQ ID NO :5 VL ¨ CDR1 SSVSY
SEQ ID NO :6 VL ¨ CDR3 QQWSSNPPIT
SEQ ID NO :7 VH ¨ FR1 EVQLQQSGAELVRPGALVKLSC
KAS
SEQ ID NO :8 VH ¨ FR2 MHWVKQRPEQGLEWIGW
SEQ ID NO :9 VH ¨ FR3 IYDPKFQGKASITADTSSNTAYL
QLSSLTSEDTAVYYC
SEQ ID NO: 10 VH ¨ FR4 WGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 11 VL ¨ FR1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC
SAS
SEQ ID NO: 12 VL ¨ FR2 MHWYQQKSGTSPKRWIY
SEQ ID NO: 13 VL ¨ FR3 KLASGVPARFSGSGSGTSYSLTI
SSMEAEDAATYYC
SEQ ID NO: 14 VL ¨ FR4 FGAGTKLELK
SEQ ID NO: 15 VH EVQLQQSGAELVRPGALVKLSC
KASGFNIKDYYMHWVKQRPEQ
GLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQ
GKASITADTSSNTAYLQLSSLTS
EDTAVYYCTRGGGYYSDWYFD
VWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 16 VL
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC
SASSSVSYMHWYQQKSGTSPK
RWIYDTSKLASGVPARFSGSGS
GTSYSLTISSMEAEDAATYYCQ
QWSSNPPITFGAGTKLELK
TrisHCI
50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 6 / Figure 8 : GTPgN-octyl-C3 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 1 g membranes HEK-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 7 / Figure 9 : GTPg0-hexyl-C3 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 1 g membranes HEK-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
[0232] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2, GTPgN-octyl-C11, GTPg0-hexyl-C2, GTPgN-C2, GTPgN-C3, GTPgN-octyl-C3, GTPg0-hexyl-C3 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-IO FRET avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 3A à 9).
[0233] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la sortie du GTP-donneur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET.
Ces résultats sont représentés sur les figures 3B (Exemple 1), 4B (Exemple 2), 5B (Exemple 3), 6B (Exemple 4) et 7B (Exemple 5). Avec les analogues GTPgN-octyl-C3 (Exemple 6) et GTPg0-hexyl-C3 (Exemple 7), cette modulation du signal par un agoniste n'a pas été testée.
[0234]Exemple 8¨ Effet de la concentration en membrane et en GTP-donneur sur le test d'activation selon le format lA sur RCPG Delta Opioïde (DOR) :
diminution du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
[0235] Dans un premier temps, la capacité du couple GTPgN-octyl-C2 / Anticorps anti-Galphai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai (1 ou 10 g / puits). Le GTPgN-octyl-C2 a été utilisé à 2 ou 6nM final dans les puits.
Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai DSV36S-d2 (Figure 10A). Par ailleurs, le panel de gauche montre une augmentation de l'amplitude de signal (S/B = Signal Total / Signal Non Spécifique) en augmentant la quantité de membrane de 1 à 104 par puits. Le panel de droite montre une augmentation de l'amplitude du signal (S/B) en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-C2 de 2 à 6nM.
[0236] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la sortie du GTP-donneur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET.
Ces résultats sont représentés sur la figure 10B. Par ailleurs, le panel de gauche montre une augmentation de l'amplitude de signal (S/B = Signal Véhicule sans agoniste / Signal Agoniste) en augmentant la quantité de membrane de 1 à 104 par puits. Le panel de droite montre une augmentation de l'amplitude du signal (S/B) en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-C2 de 2 à 6nM.
[0237] Exemples 9 et 10 - Test d'activation selon le format 1A sur RCPG
Dopamine D2S (D2S) : diminution du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
[0238] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D25 et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 9 / Figure 11A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
D5V365-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D25 / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 10 / Figure 12A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D2S / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
[0239] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2 et GTPgN-octyl-C11 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 11A à 12A).
[0240] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la sortie du GTP-donneur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET.
Ces résultats sont représentés sur les figures 11B (Exemple 9) et 12B (Exemple 10).
[0241] Exemples 11 à 13- Test d'activation selon le format 1B sur RCPG Delta Opioïde (DOR) : diminution du siqnal TR-FRET entre GTP-accepteur et Anticorps anti-protéine Galphai-donneur sous stimulation d'un aqoniste.
[0242] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-accepteur /
Anticorps anti-Galphai donneur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 11 / Figure 13A : GTPg0-Linker-Cy5(P) (250nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final dans le puits) ; 1 g membranes HEK-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA
0,1%. Lecture après 3h d'incubation à 21 C.
- Exemple 12 / Figure 14A : GTPgS-Linler-Cy5(R) (250nM final dans le puits) ;
DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final dans le puits) ; 104 membranes HEK-DOR /
puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%.
Lecture après 1h d'incubation à 21 C.
- Exemple 13 / Figure 15A : GTPgN-L18-Fluorescein (31nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final dans le puits) ; 1 g membranes HEK-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA
010/ , 0.
[0243] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPg0-Linker-Cy5(P), GTPgS-Linler-Cy5(R) et GTPgN-L18-Fluorescein sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-donneur (Figure 13A à 15A).
[0244] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-accepteur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-accepteur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la sortie du GTP-accepteur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 13B (Exemple 11), 14B (Exemple 12), 15B (Exemple 13). Avec l'analogue GTPgS-Linler-Cy5(R) (Exemple 12), cette modulation du signal par un agoniste est très faible.
[0245] Exemples 14 à 19 - Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde (DOR) : auqmentation du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
[0246] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 14 / Figure 16A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 500mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 15 / Figure 17A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ;
BSA 0,1%.
- Exemple 16 / Figure 18A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
5 DSV38S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ;
BSA 0,1%.
- Exemple 17 / Figure 19A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
10 Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ;
BSA 0,1%.
- Exemple 18 / Figure 20A : GTPg0-hexyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ;
15 BSA 0,1 /o.
- Exemple 19 / Figure 21A : GTPgN-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ; Tampon :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5 M ; BSA 0,1%.
[0247] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès 20 de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2, GTPgN-octyl-C11, GTPg0-hexyl-C2, GTPgN-C2 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figures 16A à 21A).
25 [0248] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.
L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-30 donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la liaison du GTP-donneur à
la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 16B (Exemple 14), 17B (Exemple 15), 18B (Exemple 16), 19B (Exemple 17), 20B
(Exemple 18) et 21B (Exemple 19). Par ailleurs, la figure 17B (Exemple 15) montre une deuxième condition où l'activation par une concentration fixe d'agoniste du RCPG SNC162 (200nM) a été inhibée par une concentration croissante d'antagoniste du RCPG (Naltrindole). Cette inhibition d'activation est observée par la diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF).
[0249] Exemples 20 à 22 - Test d'activation selon le format 2A sur RCPG
Dopamine D2S (D2S) : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un agoniste.
[0250] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 20 / Figure 22A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D2S / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 10mM ; GDP 1p1M ; BSA
0,10/0.
- Exemple 21 / Figure 23A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D2S / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 100mM ; BSA 0,1%.
- Exemple 22 / Figure 24A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ;
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-D2S / puits ;
Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 100mM ; GDP 1p1M ; BSA
010/ , 0.
[0251] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 22A à 24A).
[0252] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.
L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la liaison du GTP-donneur à
la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 22B (Exemple 20), 23B (Exemple 21) et 24B (Exemple 22).
[0253]Exemples 23 et 24 - Test d'activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde (DOR) : auqmentation du sifflai TR-FRET entre GTP-accepteur et Anticorps anti-protéine Galphai-donneur sous stimulation d'un acioniste.
[0254] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-accepteur /
Anticorps anti-Galphai donneur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 23 / Figure 25A : GTPgN-octyl-Cy5 (50nM final dans le puits) ;
DSV36S-Lumi4Tb (1nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR /
puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP
0.5 M ; BSA 0,1%. Lecture après 3h d'incubation à 21 C.
- Exemple 24 / Figure 26A : GTPgN-octyl-AF488 (50nM final dans le puits) ;
DSV36S-Lumi4Tb (1nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR /
puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP
0.5 M ; BSA 0,1%. Lecture après 3h d'incubation à 21 C.
[0255] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-Cy5 et GTPgN-octyl-AF488 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti Galphai-donneur (Figure 25A à 26A).
.. [0256] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-accepteur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.
L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-accepteur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la liaison du GTP-accepteur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-accepteur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 25B (Exemple 23) et 26B (Exemple 24).
[0257]Exemples 25 - Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde (DOR) : auqmentation du siqnal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d'un aqoniste.
Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Exemple 25 / Figure 27A : GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (7.5nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 104 membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCl2 60mM ; NaCI 150mM ; BSA
010/ , 0.
[0258] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 est capable de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET
avec l'anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 27A).
[0259] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.
L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue).
Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la liaison du GTP-donneur à
la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur la figure 27B (Exemple 25).
[0260] Exemple 26 : Protocole pour obtenir des anticorps anti-protéine G
alphail utilisés dans le procédé selon l'invention [0261] Immunisation de souris [0262] La protéine TST-G alphai1 recombinantes (protéine G alphai1 de séquence UniProt P63096-1 tagguée en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV) a été produite dans des cellules d'insectes Sf9 (infection avec un baculovirus codant ladite protéine) puis purifiée sur une colonne d'affinité via le tag TwinStreptag (TST) (Strep-Tactin Superflow high capacity resin (IBA, Catalogue : 2-1208-002)).
[0263] Des souris BALB/c ont été immunisées par injection de la protéine TST-G
alphai1 préalablement diluée dans du tampon contenant du GTPgS (HEPES
20mM pH8, NaCI 100mM, MgCl2 3mM, CHAPS 11mM, GTPgS 100 M). La primo-injection a été suivie de trois rappels à intervalle d'un mois.
[0264] Quinze jours après chaque injection, des ponctions sanguines sur les souris ont permis de vérifier la présence d'une réponse immunitaire.
[0265] Pour cela, un test de type ELISA a été mis en place. La protéine TST-G
alphai1 préalablement diluée à 20 g/mL dans du tampon contenant du GTPgS
(Tris HCI 20mM pH8.5, NaCI 140mM, EDTA 2mM, MgCl2 10mM, BSA 0.1%, GTPgS lel) a été adsorbée via le tag TwinStreptag sur des plaques 96 puits contenant de la Strep-Tactin XT (IBA, Catalogue : 2-4101-001). Pour cela, 1000 de protéine ont été ajoutés dans chaque puits puis incubées pendant 2h à 37 C
suivi de trois lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20.
[0266] Les dilutions sérielles d'un facteur 10 à 100 millions des ponctions sanguines ont ensuite été ajoutées à hauteur de 100 L / puits et incubées pendant 2h à
37 C. Les anticorps non fixés à la protéine ont été éliminés par trois étapes de lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20 puis la détection des anticorps fixés a été réalisée à l'aide d'un anticorps secondaire anti-Fc de souris lié à la HRP
(horseradish peroxidase) (Sigma #A0168 dilué au 1/10 000 dans du PBS, BSA
0.1%). Après 1h d'incubation à 37 C puis trois lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20, la révélation de la HRP a été réalisé par dosage colorimétrique à 450nm suite à l'incubation de son substrat TMB (3,3',5,5'-Tétraméthylbenzidine, Sigma #T0440) pendant 20min à température ambiante sous agitation.
[0267] Afin de s'assurer que les anticorps détectés par le test ELISA étaient bien dirigés contre la protéine G alphai1 et non contre le tag TwinStrepTag, les 5 mêmes ponctions ont été testés sur le test ELISA après pré-incubation avec un excès d'une autre protéine orthogonale tagguée avec le TwinStrepTag (SNAPTag-TwinStrpeTag). Ainsi, les anticorps anti tag se fixent sur la protéine orthogonale taguée et donc pas sur la protéine G alphai1 attachée au fond des puits ; auquel cas aucun signal HRP ou une diminution du signal HRP est Io détecté.
[0268] Les souris présentant les meilleurs titres d'anticorps et le moins de baisse de signal dans le cas contrôle anti tag ont été sélectionnées pour l'étape suivante d'hybridation lymphocytaire, aussi appelée fusion. La rate des souris a été
récupérée et un mélange des lymphocytes et plasmocystes issus de cette rate a 15 été fusionné in vitro avec une lignée cellulaire de myélome en présence d'un catalyseur de la fusion cellulaire du type polyéthylène glycol. Une lignée cellulaire de myélome mutante, manquant l'enzyme HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) a été utilisée pour permettre une sélection des cellules hybrides, appelées hybridomes. Ces cellules ont été cultivées dans un 20 milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminopterine (methotrexate) et de la thyamine (milieu HAT) pour permettre l'élimination des cellules de myélome non fusionnées et ainsi sélectionner les hybridomes d'intérêt. Les cellules de rate non fusionnées quant à elle meurent puisqu'elles sont incapables de proliférer in vitro.
Ainsi, seuls les hybridomes ont survécu.
25 [0269] Ces hybridomes ont alors été cultivés dans des plaques de culture. Les surnageants de ces hybridomes ont ensuite été testés pour évaluer leur capacité
à produire des anticorps anti protéine G alphai1. Pour cela, un test ELISA
comme décrit ci-dessus a été réalisé.
[0270] Afin d'évaluer la sélectivité des anticorps entre les différentes formes de la 30 protéine Galpahi1 (forme pleine liée au GDP vs forme pleine liée au GTPgS vs forme vide), le test a été réalisé en parallèle sur des conditions de protéine TST-G alphai1 pré-incubée dans le tampon contenant soit du GDP à lel, soit du GTPgS à 1 M soit sans nucléotide. Les meilleurs hybridomes ont ensuite été
clonés avec une étape de dilution limite afin d'obtenir des clones d'hybridome.
[0271] Les clones d'hybridomes d'intérêt ont ensuite été injectés dans des souris (injection intra péritonéale) afin de permettre la production des anticorps en grande quantité dans le liquide d'ascite.
[0272] Les anticorps ont ensuite été purifiés par chromatographie d'affinité
sur des colonnes avec des résines présentant de la protéine A.
[0273] Capacité des anticorps purifiés ci-dessus à entrer en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps DSV36S
[0274] Tous les réactifs sont dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCl2 10mM, BSA 0,1%, NaCI 10mM. La protéine Gail est préparée 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS est préparé 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 10 .M. Ces réactifs sont préparés dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à
température ambiante avant d'être distribués dans les puits. Les anticorps purifiés ci-dessus sont préparés 4X pour viser des concentrations finales dans les puits comprises entre 0.01 et 1 M. L'anticorps DSV36S-d2 est préparé 4X
pour viser une concentration finale de 10nM. L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb est préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.5nM.
[0275] Les réactifs sont distribués dans les plaques 384 puits de la manière suivante :
1. 100 du mélange pré-incubé de protéine G ail + GTPgS sont placés dans chaque puit, 2. 50 de l'anticorps purifié sont rajoutés dans chaque puit 3. Les plaques sont incubées pendant 30 minutes à température ambiante 4. 50 du mélange anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et anticorps DSV36S-d2 sont rajoutés dans chaque puit.
[0276] Les plaques sont incubées 1H à température ambiante avant de lire le signal HTRF.
[0277] Les anticorps selon l'invention sont capables d'inhiber le signal HTRF
obtenu avec de l'anticorps DSV36S-d2. A l'inverse, les anticorps qui ne sont pas selon l'invention ne sont pas capables d'inhiber le signal généré par le DSV36S-d2.
Listage de séquences [0278] [Table 3]
Numéro de séquence Type de séquences Séquence en acides aminés SEQ ID NO: 1 Peptide KB1753 SSRGYYHGIWVGEEGRLSR
SEQ ID NO : 2 VH ¨ CDR1 GFNIKDYY
SEQ ID NO :3 VH ¨ CDR2 IDPENGNT
SEQ ID NO :4 VH ¨ CDR3 TRGGGYYSDWYFDV
SEQ ID NO :5 VL ¨ CDR1 SSVSY
SEQ ID NO :6 VL ¨ CDR3 QQWSSNPPIT
SEQ ID NO :7 VH ¨ FR1 EVQLQQSGAELVRPGALVKLSC
KAS
SEQ ID NO :8 VH ¨ FR2 MHWVKQRPEQGLEWIGW
SEQ ID NO :9 VH ¨ FR3 IYDPKFQGKASITADTSSNTAYL
QLSSLTSEDTAVYYC
SEQ ID NO: 10 VH ¨ FR4 WGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 11 VL ¨ FR1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC
SAS
SEQ ID NO: 12 VL ¨ FR2 MHWYQQKSGTSPKRWIY
SEQ ID NO: 13 VL ¨ FR3 KLASGVPARFSGSGSGTSYSLTI
SSMEAEDAATYYC
SEQ ID NO: 14 VL ¨ FR4 FGAGTKLELK
SEQ ID NO: 15 VH EVQLQQSGAELVRPGALVKLSC
KASGFNIKDYYMHWVKQRPEQ
GLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQ
GKASITADTSSNTAYLQLSSLTS
EDTAVYYCTRGGGYYSDWYFD
VWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 16 VL
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC
SASSSVSYMHWYQQKSGTSPK
RWIYDTSKLASGVPARFSGSGS
GTSYSLTISSMEAEDAATYYCQ
QWSSNPPITFGAGTKLELK
Claims (21)
1. Méthode pour déterminer la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G (RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) introduction, dans un premier contenant :
- d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - d'une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - d'un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué
par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, - éventuellement d'un agoniste du RCPG ;
b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ;
c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'à l'étape a) et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à
tester ;
d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ;
e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG.
a) introduction, dans un premier contenant :
- d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - d'une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - d'un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué
par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, - éventuellement d'un agoniste du RCPG ;
b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ;
c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'à l'étape a) et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à
tester ;
d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ;
e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le premier contenant ne contient pas un agoniste du RCPG et à l'étape e) une diminution du signal obtenu à
l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à
tester est un agoniste du RCPG.
l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à
tester est un agoniste du RCPG.
3. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le premier contenant comprend un agoniste du RCPG et à l'étape e) :
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ;
- une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG.
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ;
- une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG.
4. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le premier contenant ne comprend pas un agoniste du RCPG et à l'étape e) une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste du RCPG.
5. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le premier contenant comprend un agoniste du RCPG et à l'étape e) :
- une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ;
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG.
- une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ;
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à
l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle la protéine Galpha est choisie parmi la protéine Galphail, Galphai2, Galphai3, Galphaol, Galphao2, Galphaq, Galpha12, Galpha13, Galphas, Galphaz, Galphatl, Galphat2, Galphall, Galpha14, Galpha15, Galpha16 et Galphagus, de préférence choisie parmi la protéine Galphail, Galphai2 et Galphai3.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le ligand est choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, un peptide ou un aptamère, de préférence un anticorps ou un fragment d'anticorps.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est choisi parmi le GTPgammaS (GTPyS ou GTPgS), le GppNHp et le GppCp.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'un des membres du couple de partenaires de RET est un composé
fluorescent donneur ou luminescent donneur et l'autre membre du couple de paitenaires de RET est un composé fluorescent accepteur ou un composé
accepteur non fluorescent (quencher).
fluorescent donneur ou luminescent donneur et l'autre membre du couple de paitenaires de RET est un composé fluorescent accepteur ou un composé
accepteur non fluorescent (quencher).
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé
fluorescent donneur et le ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé
fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher).
fluorescent donneur et le ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé
fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher).
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé
fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher) et ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur.
fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher) et ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur.
12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans laquelle le composé fluorescent donneur est un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d'europium, un chélate d'europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole.
13. Méthode selon l'une quelconque des revendication 9 à 12, dans laquelle le composé fluorescent accepteur est un partenaire de FRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP
citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed.
citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed.
14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans laquelle le composé luminescent donneur est un partenaire de BRET choisi parmi : la Luciférase (luc), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase.
15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 et 14, dans laquelle le composé fluorescent accepteur est un partenaire de BRET choisi parmi :
les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP
citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed.
les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP
citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed.
16. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-10 et 12-15, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET est un composé fluorescent donneur de formule générale (I) :
dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3.
dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3.
17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-9 et 11-15, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET est choisi parmi GTPgN-octyl-Cy5, GTPgN-octyl-AF488, GTPgN-L15-Fluorescein, GTPg0-Linker-Cy5(P) ou GTPgS-Linker-Cy5(R).
18. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET est choisi parmi GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl-C11 (GTP-gamma-N-octyl-C11), GTPgN-octyl-C3 (GTP-gamma-N-octyl-C3), GTPg0-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPg0-hexyl-C3 (GTP-gamma-0-hexyl-C3) ou GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-C2), de préférence GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
19. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le ligand de la protéine Galpha est un anticorps ou un fragment d'anticorps qui se lie spécifiquement au domaine SwitchII de la protéine Galphai, de préférence au peptide 215-294 dans la protéine Galphai.
20. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la protéine Galpha est choisie parmi Galphail, Galphai2 et Galphai3 et le ligand de la protéine Galpha entre en compétition pour la liaison à la protéine Galpha avec le peptide de séquence Ser-Ser-Arg-Gly-Tyr-Tyr-His-Gly-Ile-Trp-Val-Gly-Glu-Glu-Gly-Arg-Leu-Ser-Arg (SEQ ID No : 1).
21. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le ligand de la protéine Galpha est un anticorps choisi parmi :
(i) un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G
alpha, qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO
: 3, et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, et - un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5, un CDR2 de séquence d'acides aminés DTS, et un CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6 ; ou (ii) un anticorps ou un fragment d'anticorps qui entre en compétition pour la liaison à
la protéine G alpha avec l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon (i).
(i) un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G
alpha, qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO
: 3, et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, et - un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5, un CDR2 de séquence d'acides aminés DTS, et un CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6 ; ou (ii) un anticorps ou un fragment d'anticorps qui entre en compétition pour la liaison à
la protéine G alpha avec l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon (i).
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