CN101050475A - 一种非对称环发夹型dna探针的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种非对称环发夹型DNA探针的构建方法及应用。本发明所述的构建方法，包括以下步骤：(1)根据要检测的目标序列，构建与靶序列匹配的碱基序列A段；(2)构建与固定在芯片表面的Oligo DNA探针匹配的碱基序列B段；(3)构建C段碱基序列，其中C段碱基序列与B段碱基序列的茎臂部分的碱基序列互补；(4)将上述A、B、C段碱基序列组合。本发明绕开国内外学者为解决发夹型DNA探针在芯片表面的固定难题而在内环设计上突破，在保证了发夹型DNA探针与芯片结合时的特异性的同时，较好地解决了发夹型DNA探针在芯片表面的固定难题。使其非常高的特异性和灵敏度、液相杂交检测效率高、大规模自动化检测等独有技术优势在生物芯片领域得到充分发挥。

Description

一种非对称环发夹型DNA探针的构建方法及其应用

                          技术领域

本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种非对称环发夹型DNA探针的构建方法及其应用。

                          背景技术

探针技术是生物芯片技术的核心。发夹型DNA探针是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(fluores-cence resonance energy transfer，FRET)现象设计，空间结构上呈茎环结构。其中，环序列是与靶核酸互补的探针；茎臂是由与靶序列无关的互补序列构成；茎的两端分别连上一个荧光分子和一个淬灭分子。当有靶序列存在时，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收，可检测到荧光。与常规核酸探针相比，发夹型DNA探针的优势明显具有高特异性、高灵敏度、液相杂交检测效率高、可实现核酸的大规模自动化检测等优点。在用于核酸分子检测的基因芯片领域，目前使用最广泛的DNA探针主要是寡核苷酸探针Oligo、cDNA探针等。发夹型DNA探针具有上述诸多其他DNA探针难以具备的优势，但由于受分子结构的限制，目前发夹型DNA探针在芯片领域的运用几乎为空白，其非常高的特异性和灵敏度、液相杂交检测效率高等优势在芯片领域难以得到有效发挥。为此国内外许多学者重点研究怎样解决发夹型DNA探针在芯片表面的固定问题。但通常都是在发夹型DNA探针的茎结构修饰上作主研究方向，最常见的是修饰生物素-亲和素(biotin-avidin)。其中生物素(biotin)修饰到发夹型DNA探针的茎臂，亲和素(avidin)固定到芯片表面，通过生物素-亲和素(biotin-avidin)之间的结合力固定发夹型DNA探针，这种修饰生物素-亲和素的发夹型DNA探针有两个主要弱点：1、发夹型DNA探针茎结构的修饰技术有相当难度(国内目前还未见报道)2、茎臂修饰生物素(biotin)发夹型DNA探针与芯片表面亲和素(avidin)结合无特异性：对中、高密度芯片难以做到“点对点杂交”。发夹型DNA探针的优势在于“液-液相杂交”时的高特异性和高灵敏性：即发夹型DNA探针与靶序列先在试管里高特异/高灵敏杂交，复合体再与芯片表面的“探针”(亲和素avidin)结合；由于生物素-亲和素(biotin-avidin)结合方式无特异性，同样固定在芯片表面的亲和素(avidin)无特异性，从而导致多样本靶序列与特异性发夹型DNA探针杂交体在与芯片表面的亲和素(avitin)结合时无特异性，这种无特异性的芯片结合使得发夹型DNA探针对中、高密度芯片难以做到“点对点杂交”。芯片杂交时是整张芯片表面所有位点同时浸没在杂交液中，依靠探针与靶序列的特异性识别保证多样本检测的特异性“点对点杂交”。由于生物素-亲和素(biotin-avidin)结合方式无特异性，修饰在发夹探针茎臂上的生物素与固定在芯片表面的亲和素之间结合无特异性，这种无特异性的芯片结合导致所有靶序列样本都可与芯片表面所有位点结合，从而引起混乱无法区分使用。尽管可以先把特异性发夹探针分开点样固定在芯片表面，依靠特异碱基匹配与多样本靶序列特异性杂交，但这种杂交成为了“液-固相”杂交，其弊端：一是杂交效率非常低；二是不能充分发挥发夹探针的“液-液相杂交”高效率、高灵敏及特异的优势，从而极大地限制了发夹探针在芯片领域的运用。传统茎臂修饰发夹型DNA探针由于无法保证杂交特异性，在高密度芯片领域几乎无法实际使用。由于这两大技术缺陷的存在从而极大地限制了发夹型DNA探针在芯片领域的运用。

                          发明内容

为克服现有技术的上述缺陷，更充分发挥发夹型DNA探针的优势，本发明提供一种更容易固定在芯片表面的、对中、高密度芯片可以“点对点杂交”的非对称环发夹型DNA探针的构建方法及其应用。本发明的非对称环发夹型DNA探针的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据要检测的目标序列，构建非对称发夹型DNA探针的A段碱基序列，其中A段序列是与靶序列匹配碱基序列，A段碱基序列作为环序列的一部分；

(2)构建非对称发夹型DNA探针的B段碱基序列，其中B段碱基序列是与固定在芯片表面的Oligo DNA探针匹配的碱基序列，B段碱基序列一部分与A段碱基序列共同构成非对称发夹型DNA探针的整个环序列，B段碱基序列的另一部分作为茎臂与淬灭分子或者荧光分子相连；

(3)构建非对称发夹型DNA探针的C段碱基序列，其中C段碱基序列与B段碱基序列的茎臂部分的碱基序列互补，C段碱基序列一端与A段碱基序列相连，另一端与B段碱基序列相对应地与荧光分子或者淬灭分子相连；

(4)将上述A、B、C段碱基序列组合，再经软件验证不会形成除发夹结构外的其他二级结构，并经genbank比对后即完成非对称环发夹型DNA探针构建。

本发明的构建方法，在步骤(2)所述B段碱基序列一部分与A段碱基序列共同构成非对称发夹型DNA探针的整个环序列中，优选为：其中A段碱基序列的长度大于整个环序列长度的2/3并且小于整个环序列的长度。

因为本发明的方法所构建的发夹型DNA探针的环序列大部分(＞2/3)与靶序列匹配、小部分(＜1/3)与部分寡核苷酸探针匹配，故命名为非对称环发夹型DNA探针。(传统的发夹型DNA探针是整个环序列与靶序列完全匹配。)

本发明所述的非对称环发夹型DNA探针构建方法将A段碱基序列设计为与靶序列完全匹配的碱基序列，是为了在应用中利用该段与靶序列的杂交来检测靶序列是否存在。

本发明所述的非对称环发夹型DNA探针构建方法对B段碱基序列的设计是出于固定的需要。B段碱基序列设计成与固定在芯片表面的Oligo DNA探针匹配的碱基序列，通过B段碱基序列与固定在芯片表面的Oligo DNA探针的杂交，将非对称环发夹型DNA探针固定在芯片上。

在对多样本靶序列检测时，所述步骤(2)所述B段碱基序列可根据需要设计不同序列和不同长度。这种设计是为了使B段与固定在芯片表面的Oligo DNA探针进行特异性杂交，从而对中、高密度芯片也能做到“点对点杂交”。

本发明相比于现有的发夹型DNA探针技术，具有以下有益效果及优点：

(1)保持了发夹型DNA探针原有的茎环结构，不需做任何修饰或改动，技术难度低，容易操作；

(2)阳性——阴性荧光信号差异巨大，非常便于结果判断。液相中本发明的非对称环发夹型DNA探针与靶序列杂交后茎环结构打开，暴露出能与芯片表面寡核苷酸探针匹配的碱基序列，然后非对称环发夹型DNA探针——靶序列杂交体与芯片表面寡核苷酸探针杂交。由于只有打开茎环结构的非对称环发夹型DNA探针——靶序列杂交体(阳性产物)才能结合到芯片表面，未打开的非对称环发夹型DNA探针(阴性对照：无靶序列，茎环结构未打开)不能结合到芯片表面，冲洗掉游离的非对称环发夹型DNA探针，检测荧光信号时阴性对照荧光背景非常低甚至没有荧光背景，阳性——阴性荧光信号差异较之其他发夹型DNA探针芯片检测更为明显，更利于对阳性——阴性结果的判断。其他发夹型DNA探针的阴性对照尽管发夹茎环未打开，但由于结合在芯片表面发夹型DNA探针所带荧光分子的存在仍有荧光背景，干扰性很强。

(3)本发明的探针还保证发夹型DNA探针与芯片结合时的特异性，对中、高密度芯片可以做到“点对点杂交”。B段(即与芯片探针匹配的碱基序列)可根据需要(对多样本靶序列)设计为不同序列和不同长度，另外设计一段与芯片探针匹配碱基序列完全互补配对的寡核苷酸探针Oligo固定在芯片表面，如此，芯片探针匹配碱基序列与固定在芯片表面的寡核苷酸探针依据碱基互补配对原则进行特异性杂交，对中、高密度芯片也同样可以做到“点对点杂交”。

(4)本发明绕开国内外学者为解决发夹型DNA探针在芯片表面的固定难题而在探针茎臂修饰上作主研方向的思路，在内环设计上突破，在保证了发夹型DNA探针与芯片结合时的特异性(对中、高密度芯片可以做到“点对点杂交”)同时，较好地解决了发夹型DNA探针在芯片表面的固定难题。克服了长久以来发夹型DNA探针在芯片领域运用受到极大限制的痼疾，使其非常高的特异性和灵敏度、液相杂交检测效率高、大规模自动化检测等独有技术优势在生物芯片领域得到充分发挥。

                        附图说明

图1是茎臂修饰生物素的传统发夹型DNA探针的性能示意图。

图2是本发明方法构建的非对称环发夹型DNA探针结构示意图。

图3是本发明方法构建的非对称环发夹型DNA探针的性能示意图。

图4是应用该方法实际检测结核杆菌芯片实验结果示意图。

                      具体实施方式

以下结合本发明的一些具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1本发明方法所构建的探针

图2是本发明方法构建的非对称环发夹型DNA探针结构示意图，是针对如该图中所示的靶序列所构建，由图2可见，非对称环发夹型DNA探针的A段与靶序列匹配，B段与固定在芯片表面的Oligo DNA探针匹配。B段碱基序列一部分与A段碱基序列共同构成非对称发夹型DNA探针的整个环序列，B段碱基序列的另一部分作为茎臂与淬灭分子相连；其中C段碱基序列与B段碱基序列的茎臂部分的碱基序列互补，C段碱基序列一端与A段碱基序列相连，另一端荧光分子相连；

实施例2灵敏性试验

以不同浓度靶序列做灵敏性试验，先观察第一组：10mg/l、5mg/l、1mg/l；第二组：500ug/l、100ug/l、10ug/l、1ug/l；、第三组：500pg/l、100pg/l、10pg/l、1pg/l等不同浓度组别靶序列与预先设计好的非对称环发夹型DNA探针杂交后，在芯片扫描仪上观测荧光强度，确定检测的最低浓度组别单位(mg\ug\pg)，再往下作某一浓度组别单位的精确浓度灵敏性试验，如pg级：500pg/l、400pg/l、300pg/l、100pg/l、50pg/l、40pg/l、30pg/l、20pg/l、10pg/l…

试验结果：

在芯片扫描仪上观测荧光强度：最低浓度与阴性对照荧光具有明显区别。(一般以阳性荧光/阴性荧光≥1.5为判断标准)说明本发明的方法构建的探针具有高灵敏性。

实施例3特异性试验

预先设计好靶序列及对应非对称环发夹型DNA探针，另外设计合成10条与预先设计好的靶序列及非对称环发夹型DNA探针无关的干扰序列(经比对证明不能杂交结合)，在杂交条件固定情况下分别与特异性非对称环发夹型DNA探针杂交，在芯片扫描仪上观测荧光，比较特异性靶序列和无关干扰序列与特异探针杂交的荧光信号强弱。试验结果：特异性靶序列与特异性非对称环发夹型DNA探针杂交荧光信号强，而无关干扰序列与特异探针无杂交，带荧光分子的探针被冲洗掉，荧光背境信号非常弱。说明非对称环发夹型DNA探针较之其他探针具有非特异杂交干扰小，荧光背境低的独特优势。

图1是茎臂修饰生物素的传统发夹型DNA探针的性能示意图，由图1可以看出，茎臂修饰生物素的传统发夹型DNA探针与芯片表面亲和素(avidin)结合无特异性，因此对中、高密度芯片难以做到“点对点杂交”(即无法对多样本目标进行特异性识别)；图3是本发明方法设计的非对称环发夹型DNA探针的性能示意图，由图3可以看出，本发明方法设计的非对称环发夹型DNA探针由于对发夹型DNA探针设计了非对称环的模式，保证了发夹型DNA探针与芯片结合时的特异性(对中、高密度芯片可以做到“点对点杂交”)同时，较好地解决了发夹型DNA探针在芯片表面的固定问题。由二者对比可见，本发明方法设计的非对称环发夹型DNA探针，其性能明显优于茎臂修饰生物素的传统发夹型DNA探针的性能。

实施例4本发明的探针能进行大规模检测的试验

预先设计好针对某病原体(如乙型肝炎病毒HBV)特异片段的靶序列及对应非对称环发夹型DNA探针，收集临床相应某病原菌标本(如HBV)若干(＞200份)，标本处理后分别与对应探针杂交，观察杂交的荧光信号，设阴性对照，从而证明该探针能大规模进行临床检测。

芯片表面高密度点样，一份样本双份点样，统一设阴性对照，杂交冲洗后，荧光扫描仪下扫描，以阳性荧光/阴性荧光≥1.5为判断标准(以仪器软件分析)。

实施例5本发明的非对称环发夹型DNA探针设计方法及其在对结核杆菌基因检测上的应用

步骤一：针对结核杆菌保守序列IS986通过软件Primer 5.0设计靶序列

(1)下表中间为扩增目标产物为245bp(加粗)，两端为扩增引物(字下加线表示)：

Primer1：5’-CGTGAGGGATCGAGGTGGC-3’

Primer2：5’-GCGTAGGCTCGGTGACAAA-3’

(2)针对中间245bp扩增产物通过软件(Beacon Designer)设计靶序列：

上表774-797中斜体文字表示：

步骤二：设计A段碱基序列：即以上靶序列的对应互补序列：

5’-CTGGTGGTCCGAAGCGGcGCTGGA-3’

步骤三：设计B段碱基序列和另外一段与3’端部分B段碱基序列互补的茎臂碱基序列，及与B段碱基序列互补的Oligo，并经genebank和DNA star软件证实并保证特异性。

B段碱基序列：5’-ATGGACTCATCATGGC-3’

互补的茎臂碱基序列：5’-GCCATG-3’

Oligo：5’-GCCATGAGTCCAT-3’

步骤四：选择M-DABCYL为荧光-淬灭分子对，在DNA合成仪上(如ABI394高通量DNA合成仪)合成上述针对结核杆菌保守序列IS986非对称环发夹型DNA探针及Oligo(氨基修饰在5’端)。

结核杆菌保守序列IS986非对称环发夹型DNA探针：

FAM-5’-GCCATGCTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGAATGGACTCATCATGGC-3’-DABCYL

Oligo：氨基-5’-GCCATGAGTCCAT-3’

步骤五：然后按芯片实验的常规方法进行扩增、纯化、杂交、芯片冲洗扫描和进行荧光信号数据分析。

分析结果见图4，由图4可见阳性荧光信号较之阴性信号区别非常明显，说明该发明的非对称环发夹型DNA探针效果非常明显，完全能够投入芯片领域实际应用。

Claims (4)

1、一种非对称环发夹型DNA探针的构建方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)根据要检测的目标序列，构建非对称发夹型DNA探针的A段碱基序列，其中A段序列是与靶序列匹配碱基序列，A段碱基序列作为环序列的一部分；

(2)构建非对称发夹型DNA探针的B段碱基序列，其中B段碱基序列是与固定在芯片表面的Oligo DNA探针匹配的碱基序列，B段碱基序列一部分与A段碱基序列共同构成非对称发夹型DNA探针的整个环序列，B段碱基序列的另一部分作为茎臂与淬灭分子或者荧光分子相连；

(3)构建非对称发夹型DNA探针的C段碱基序列，其中C段碱基序列与B段碱基序列的茎臂部分的碱基序列互补，C段碱基序列一端与A段碱基序列相连，另一端与B段碱基序列相对应地与荧光分子或者淬灭分子相连；

(4)将上述A、B、C段碱基序列组合，再经软件验证不会形成除发夹结构外的其他二级结构，并经genbank比对后即完成非对称环发夹型DNA探针设计。

2、根据权利要求1所述的一种非对称环发夹型DNA探针的构建方法，其特征是，在对多样本靶序列检测时，所述步骤(2)所述B段碱基序列可根据需要设计不同序列和不同长度。

3、根据权利要求1所述的一种非对称环发夹型DNA探针的构建方法，其特征是，在步骤(3)组合后的发夹型DNA探针中，其中A段碱基序列的长度大于整个环序列长度的2/3并且小于整个环序列长度。

4、权利要求1所述的非对称环发夹型DNA探针的构建方法在基因检测方面的应用，其特征是，根据待检目标，运用所述方法构建对应的非对称环发夹型DNA探针，然后按常规的芯片实验方法对待检目标进行检测。

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