CN102864214B - 非对称发夹探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“非对称发夹探针及其应用”，属于生物检测领域。非对称发夹探针由靶核酸特异序列和一回文序列组成，在无靶序列存在的情况下，处于亚稳定的发夹结构，而一旦加入待测靶序列，即触发无需酶参与的链式聚合反应，非对称发夹探针的靶核酸特异序列部分与对应靶核酸位点结合，其余探针则两两复性成两端均为回文序列的部分双链探针，在分子识别杂交的同时大幅度地增强检测信号，从而实现了待测靶序列的快速检测。本发明的非对称发夹探针链反应技术，巧妙地结合了分子杂交的高特异性和链式聚合的高效性，通过DNA聚合释放的自由能驱动分子级联放大，其反应体系简单，检测效率高，且有效地避免了PCR等传统技术存在的实验室污染问题。

Description

非对称发夹探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物反应技术，特别是涉及一种非对称发夹探针链反应技术。

背景技术

核酸分子固相杂交法、DNA测序法、毛细管电泳分析、基因芯片技术等检测方法的先后建立，将细菌分子检测方法提高到一个崭新的阶段，但是这些检测方法大多需要特殊的大型仪器，技术难度大，难以在临床中普及应用。此外，大多需要预先对样本进行PCR扩增，严重干扰了致病菌的定量检测，同时PCR技术存在的实验室污染问题也极大地影响了这些检测方法的准确性。

DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢键将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNA-RNA）的双链杂交分子。将未配对结合的探针洗去稀后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。由于DNA分子碱基互补的精确性，单连DNA探针仅与样品中变性处理的DNA单链出现配对杂交，由此决定了探针的特异性；用放射性同位素（如32P）或生物素标记探针，使杂交试验同时具有高度的敏感性。

Applied Gene Technologies公司的专利名称为“发夹形核酸探针技术”（Nucleic Acid Hairpin Probes），专利号为6380377涉及到一种茎环形DNA探针技术，与标准的单链核酸探针相比结构更稳定，酶反应更高效，对错配更加敏感，产生了更少的非特异性靶位结合。这些优点都提高了基因分析的特异性。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明设计了非对称发夹探针，并发明了一种非对称发夹探针链反应技术，巧妙地结合了分子杂交的高特异性和链式聚合的高效性，通过DNA聚合释放的自由能驱动分子级联放大，其反应体系简单，检测效率高，且有效地避免了PCR等传统技术存在的实验室污染问题。

非对称发夹探针1，其特征在于：包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列为无关序列，所述茎臂与其连接的粘性末端具有靶序列的互补核酸序列。

所述粘性末端位于非对称发夹探针1的5’端。

非对称发夹探针2，其特征在于：包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列与其相连的一条茎臂具有靶序列，所述另一茎臂上相连的粘性末端具有和上述无关序列的互补核酸序列。

所述粘性末端位于非对称发夹探针2的3’端。

所述粘性末端为6-8个碱基。

非对称发夹探针在快速检测待测靶序列中的应用。

所述应用为液相杂交链反应体系，所述反应体系中同时加入有非对称发夹探针1和非对称发夹探针2以及待测靶序列，其中所述非对称发夹探针1的粘性末端位于非对称发夹探针1的5’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端位于非对称发夹探针1的3’端；或者所述非对称发夹探针1的粘性末端位于非对称发夹探针1的3’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端位于非对称发夹探针1的5’端。

所述待测靶序列为细菌的16S rDNA序列。

所述细菌为金黄色葡萄球菌，所述非对称发夹探针1、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为：

SA-H1:TTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGCAAAGTCCGTCCGCCGCTAACATC，

SA-H2:CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAAGATGTTAGCGGCGGACGGACTTTG，

Tsa：CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAA。

所述细菌为铜绿假单胞菌，所述非对称发夹探针1、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为：

PA-H1:CGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC，

PA-H2:ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGT，

Tpa：ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。

所述细菌为肺炎克雷伯菌，所述非对称发夹探针1、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为：

KP-H1：

GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC，

KP-H2：

AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG，

Tkp：AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。

本发明的基本原理是：两条特异性自组装探针由靶核酸特异序列和一回文序列组成，在无靶序列存在的情况下，处于亚稳定的发夹结构，而一旦加入待测靶序列，即触发无需酶参与的链式聚合反应，此时特异性自组装探针的靶核酸特异序列部分与对应靶核酸位点结合，其余探针则两两复性成两端均为回文序列的部分双链探针，在分子识别杂交的同时大幅度地增强检测信号，从而实现了待测靶序列的快速检测。其原理如图1所示。其反应过程如下：(A)待测靶序列I从探针H1的粘性末端开始发生严格碱基配对的链置换反应从而打开探针的发夹结构，产生新的粘性末端；(B)H1的粘性末端与H2的粘性末端发生反应继续打开探针的发夹结构，继而探针H1和H2之间发生交替杂交反应，形成链式聚合体大幅度放大信号。

与传统的PCR、固相核酸杂交等技术相比，该技术具有更为突出的优点：（1）液相杂交反应。更加接近分子反应的自然状态，克服了固相杂交存在的空间位阻大的问题，提高了杂交反应的效率。（2）检测效率高，检测速度快。传统核酸检测技术通常需要几小时甚至十几小时，而该技术同时进行分子识别和级联信号放大，可在10分钟内完成核酸检测。（3）反应体系简单，成本低廉。无需酶及其他复杂的分子生物学试剂，反应体系更为简单，试剂可制备成干粉运输及保存。（4）单管反应，操作简便。所有检测在单一闭管中进行，操作步骤简单，并且有效地避免了PCR等传统技术存在的实验室污染问题。（5）适合与其他检测方法整合。针对细菌的特异性核酸靶序列，设计多重特异性非对称发夹探针，结合一种高效、灵敏的信号检测方法，就可实现快速并行检测细菌的目的。

附图说明

图1.非对称发夹探针链反应技术原理图

图中H1、H2、I：发夹探针1、发夹探针2、待测靶序列；A和a、B和b、C和c为互补核酸序列。

图2金黄色葡萄球菌非对称发夹探针链反应电泳结果，

图3铜绿假单胞菌非对称发夹探针链反应电泳结果，

图4肺炎克雷伯菌非对称发夹探针链反应电泳结果（粘性末端12个碱基），

图5肺炎克雷伯菌非对称发夹探针链反应电泳结果（粘性末端6-8个碱基），

图6肺炎克雷伯菌非对称发夹探针链反应电泳结果（粘性末端4个碱基），

图中第一泳道MM：DL 2，000DNA maker。

具体实施方式

本发明的具体实施例主要针对于三种病原菌，本领域技术人员可以按照本发明的原理，将其应用于任何微生体的检测，只要找到合适的特异性的待测靶序列。

实施例1

1、1技术方法及实验结果

1、检测靶序列的选择及非对称发夹探针的设计

（1）根据16S rDNA的分子生物学特点选择检测的靶序列。

16S rRNA是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标，其含量大(约占细菌RNA总量的80%)，具有多个拷贝，在细菌中高度保守，有“细菌化石”之称。基于上述16S rDNA分子生物学特征，通过文献或Genbank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查获致病菌16SrDNA序列，采用Vector NTI Suite9软件对致病菌的16SrDNA序列进行同源性比较，确定检测靶序列。

（2）特异性非对称HCR发夹探针的设计

采用Array Designer 4.0和Primer Premier 5.0软件设计非对称发夹式探针，用Omiga 2.0软件进行探针间、探针与靶序列的互补性分析，设计的备选探针序

列提交Genbank数据库进行特异性分析。

表1：三种病原菌探针及靶序列设计：

2、12μl体系杂交链反应

12μl HCR反应体系包括：40uM的探针H10.3μl；40uM的探针H20.3μl；3×HBN buffer 4μl；无菌水3.4μl；不同浓度的靶序列I 4μl。反应条件如下：99℃，8min；50℃，1h；4℃保存。HCR反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，每孔5.0μl上样。

实验结果如图2、3、4、5、6所示。

电泳结果显示可见所设计的HCR特异性探针均可成功启动杂交链反应，使得发夹探针结构打开，在无需酶作用的链式反应，因而形成长度不一的聚合DNA片段，在电泳图中显示为较离散的电泳条带，从而可以检测出0.05uM的靶序列。

从图4、5、6可以看出，粘性末端6-8个碱基，其条带更清楚，分辨率更高。

Claims (1)

1.非对称发夹探针1或2在非诊断或治疗为目的快速检测待测靶序列中的应用，所述非对称发夹探针1，包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列为无关序列，所述茎臂与其连接的粘性末端具有靶序列的互补核酸序列；所述非对称发夹探针2，包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列与其相连的一条茎臂具有靶序列，所述另一茎臂上相连的粘性末端具有和非对称发夹探针1中所述的无关序列的互补核酸序列，所述应用包括液相杂交链反应体系，所述反应体系中同时加入有非对称发夹探针1和非对称发夹探针2以及待测靶序列，其中所述非对称发夹探针1的粘性末端位于非对称发夹探针1的5’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端位于非对称发夹探针1的3’端；或者所述非对称发夹探针1的粘性末端位于非对称发夹探针1的3’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端位于非对称发夹探针1的5’端，所述待测靶序列为细菌的16S rDNA序列；

所述细菌为铜绿假单胞菌，所述非对称发夹探针1、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为：

PA-H1：CGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC，

PA-H2：ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGT，

Tpa：ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。