CN103472236B

CN103472236B - Dna结合蛋白的检测方法

Info

Publication number: CN103472236B
Application number: CN201310413728.2A
Authority: CN
Inventors: 张春阳; 张艳
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Baiyin Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2033-09-11
Also published as: CN103472236A

Abstract

本发明公开了一种DNA结合蛋白的检测方法，包括如下步骤：提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液，在ExoIII存在的条件下进行消化反应，反应完全后得到消化液；将消化液加入到扩增体系中，在聚合酶、内切酶和扩增模板存在的情况下，进行等温扩增反应后得到扩增液；将纳米金颗粒溶液与含有第一检测探针和第二检测探针的溶液混合后进行孵育后得到纳米金检测探针溶液；将扩增液和纳米金检测探针溶液混合后对混合液进行检测，完成DNA结合蛋白的检测。这种DNA结合蛋白的检测方法，通过第一检测探针和第二检测探针与扩增产物中靶DNA的结合，使得结合了检测探针的纳米金颗粒发生聚集，导致混合液的颜色发生变化，现象直观，灵敏度较高。

Description

DNA结合蛋白的检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种DNA结合蛋白的检测方法。

背景技术

简单灵敏的检测人体细胞中转录因子对于临床诊断以及药物的筛选有着重要的意义。目前的检测方法都是基于电泳迁移，免疫化学或者是荧光检测的方法，这些方法都是通过非扩增而直接进行检测，因此灵敏度较低。而且这些方法存在着放射性污染或者需要特异性抗体和荧光标记的探针，大大增加了实验成本和实验的复杂性。

DNA结合蛋白在基因组复制，基因转录，细胞分裂和DNA修复过程中起着至关重要的作用。而大部分的DNA结合蛋白都扮演着转录因子的角色，调节着细胞的发育，分化和增殖，由此转录因子也已经成为临床诊断和药物筛选中的靶点。目前为止绝大部分都是采用非扩增的直接检测的方法来定量转录因子，其中包括电泳迁移法(EMSA)，DNA酶足迹法；酶联免疫吸附法(ELISA),免疫印迹法(western blotting)和基于荧光能量共振转移(FRET)的方法。其中电泳迁移法(EMSA)和DNA酶足迹法属于传统检测方法，都是利用同位素标记DNA探针和凝胶电泳分离来检测DNA-蛋白复合物。酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹法(western blotting)是通过抗原和抗体的特异性反应，然后经酶标抗体的底物显色反应来检测DNA结合蛋白。基于荧光能量共振转移(FRET)的方法则是利用DNA与蛋白的相互作用，使标记有荧光的两段DNA探针相互靠近而发生FRET;或者是标记有荧光的DNA探针与蛋白的相互作用后对DNA序列起到保护作用，外切酶Exo III不能进行切割DNA探针从而发生FRET，以此来检测DNA结合蛋白。然而，传统的DNA结合蛋白的检测方法灵敏度都偏低。

发明内容

基于此，有必要提供一种灵敏度较高的DNA结合蛋白的检测方法。

一种DNA结合蛋白的检测方法，包括如下步骤：

提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液，在Exo III存在的条件下进行消化反应，反应完全后得到消化液，其中，未被Exo III切割的DNA的反义链作为引物被保留在所述消化液中；

将所述消化液加入到扩增体系中，在聚合酶、内切酶和扩增模板存在的情况下，进行等温扩增反应，反应完全后得到扩增液，其中，所述扩增模板包括n段重复序列以及n-1段依次连接所述重复序列的连接序列，所述引物与所述重复序列特异性结合，所述连接序列包括所述内切酶的酶切位点，n为不小于2的整数，所述引物扩增后得到所述扩增模版的互补序列，所述扩增模版的互补序列被所述内切酶切割形成n段包含所述重复序列的靶DNA；

提供纳米金颗粒溶液，并将所述纳米金颗粒溶液与含有第一检测探针和第二检测探针的溶液混合后进行孵育，孵育完成后得到纳米金检测探针溶液，其中，所述第一检测探针与所述靶DNA特异性互补，所述第二检测探针与所述靶DNA特异性互补；

将所述扩增液和所述纳米金检测探针溶液混合，反应完全后对混合液进行检测，完成所述DNA结合蛋白的检测。

在一个实施例中，所述提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液的操作为：

将HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，置于加湿处理的含有5%二氧化碳的37℃培养箱中，加入20纳克每毫升TNF-α进行刺激，30分钟后用细胞核提取物试剂盒裂解细胞，收集细胞提取物即为所述待检测的DNA结合蛋白的样品溶液。

在一个实施例中，所述DNA结合蛋白为NF-κB p50蛋白。

在一个实施例中，所述聚合酶为KF聚合酶，所述内切酶为Nb.BbvCI内切酶。

在一个实施例中，n=2。

在一个实施例中，所述纳米金颗粒溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备得到。

在一个实施例中，对所述混合液进行检测的操作可以为：肉眼直接观察，混合液中的纳米金检测探针发生聚集，颜色由红色变为紫色。

在一个实施例中，对所述混合液进行检测的操作可以为：采用分光光度计检测混合液，光谱采集范围为410nm～800nm，检测最大吸收峰。

在一个实施例中，所述作为引物的DNA的反义链的序列为SEQ ID No.1所示的序列。

在一个实施例中，所述扩增模板的序列为SEQ ID No.2所示的序列；

所述第一检测探针的序列为SEQ ID No.3所示的序列；

所述第二检测探针的序列为SEQ ID No.4所示的序列。

这种DNA结合蛋白的检测方法，通过特异性互补的检测探针与扩增产物中的靶DNA结合，使得结合了第一检测探针和第二检测探针的纳米金颗粒发生聚集，导致混合液的颜色发生变化。与传统的DNA结合蛋白的检测方法相比，这种DNA结合蛋白的检测方法由于结合了扩增方法与纳米金比色法，灵敏度较高，实验现象简单直观。

附图说明

图1为一实施方式的DNA结合蛋白的检测方法的流程图。

图2为DNA结合蛋白的检测方法的机理图。

图3为纳米金颗粒（AuNP）的透射电镜图。

图4为为非变性凝胶电泳分析等温指数扩增反应产物；泳道1表示存在8纳摩尔每升的NF-κB p50特异性探针和8纳摩尔每升的NF-κB p50；泳道2表示存在8纳摩尔每升的NF-κB p50特异性探针，不存在8纳摩尔每升的NF-κB p50；泳道3表示合成的长度为24个碱基的寡核苷酸；泳道4表示DNAmarker（分子质量参照）。

图5为NF-κB p50蛋白与非特异性探针的结合后纳米金吸收光谱的变化；曲线a表示存在2纳摩尔NF-κB p50蛋白和2纳摩尔特异性探针；曲线b表示存在2纳摩尔NF-κB p50蛋白和2纳摩尔非特异性探针；曲线c表示存在2纳摩尔特异性探针，不存在蛋白。

图6为A700/A525的吸收峰比值随NF-κB p50蛋白浓度变化的曲线。

图7为图6所示的曲线取对数后得到的A700/A525的吸收峰比值与NF-κBp50蛋白浓度的指数线性图，线性关系从5皮摩尔到2000皮摩尔。

图8为凝胶迁移实验（EMSA）验证HeLa细胞核提取物中NF-κB p50蛋白的活性；泳道1，存在10微克未经TNF-α诱导的细胞核提取物和4皮摩尔的NF-κB探针；泳道2，存在10微克经TNF-α诱导的细胞核提取物，不存在NF-κB探针；泳道3，存在10微克经TNF-α诱导的细胞核提取物和4皮摩尔的NF-κB探针。

图9为存在2纳摩尔每升的NF-κB探针和细胞核提取物时，纳米金的吸收光谱图；（a）TNF-α诱导过的细胞核提取物(25纳克每微升)；（b）TNF-α未诱导过的细胞核提取物(25纳克每微升)；（c）不存在细胞核提取物。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对DNA结合蛋白的检测方法做进一步的解释说明。

如图1所示的一实施方式的DNA结合蛋白的检测方法，包括如下步骤：

S10、提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液，在Exo III存在的条件下进行消化反应，反应完全后得到消化液。

提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液的操作为：

将HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，置于加湿处理的含有5%二氧化碳的37℃培养箱中，加入20纳克每毫升TNF-α进行刺激，30分钟后用细胞核提取物试剂盒裂解细胞，收集细胞提取物即为待检测的DNA结合蛋白的样品溶液。

结合图2，蛋白与DNA的结合位点在正义链的5’端，蛋白与DNA序列结合以后，Exo III对双链DNA分别从3’端到5’端进行酶切。由于蛋白的结合对DNA序列进行了保护作用，Exo III不能通过反义链的3’端进行切割，因此反义链被保留下来从而作为下面的等温扩增的引物。

也就是说，未被Exo III切割的DNA的反义链作为引物被保留在消化液中。

本实施方式中，DNA结合蛋白为NF-κB p50蛋白，作为引物的DNA的反义链的序列为SEQ ID No.1所示的序列。

SEQ ID No.1所示的序列中为：5′-TGT GGA ATT GCT CTC CCT ATA GTGAGT CGT AGTTCC AAG GAA AGT CCC ATC T-3′，加粗的部分为蛋白结合位点，Exo III肯定不能切割，斜体后面ATC T几个碱基不确定会不会切掉，因为存在酶的一个空间位阻问题，但是无论这几个碱基切割与否，都不影响下面的扩增反应。

S20、将消化液加入到扩增体系中，在聚合酶、内切酶和扩增模板存在的情况下，进行等温扩增反应，反应完全后得到扩增液。

扩增模板包括n段重复序列以及n-1段依次连接重复序列的连接序列，引物与重复序列特异性结合，连接序列包括内切酶的酶切位点，n为不小于2的整数，引物扩增后得到扩增模板的互补序列，扩增模板的互补序列被内切酶切割形成n段包含所述重复序列的靶DNA。

在一个特殊的方式中，n=2，聚合酶为KF聚合酶，内切酶为Nb.BbvCI内切酶。

本实施方式中，扩增模板的序列为SEQ ID No.2所示的序列，并且扩增模板的3′末端还带有一个起到修饰作用的磷酸基团。

S30、提供纳米金颗粒溶液，并将纳米金颗粒溶液与含有第一检测探针和第二检测探针的溶液混合后进行孵育，孵育完成后得到纳米金检测探针溶液。

纳米金颗粒溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备得到，具体如下：

将3.7mL质量浓度为1%的HAuCl₄水溶液加入到90mL水中加热至沸，然后迅速加入9mL质量浓度为1%的柠檬酸钠水溶液，并持续沸腾15分钟，溶液颜色迅速由浅黄色至无色、黑色，最后得到酒红色胶体溶液。

孵育完成后，第一检测探针与纳米金颗粒结合，第一检测探针以纳米金颗粒为核心，形成球状结构；同时，第二检测探针与纳米金颗粒结合，第二检测探针以纳米金颗粒为核心，形成球状结构。

结合图2，第一检测探针（probe1）与靶DNA特异性互补，第二检测探针（probe2）与靶DNA特异性互补，从而第一检测探针和第二检测探针可以与靶DNA进行特异性结合。

本实施方式中，第一检测探针的序列为SEQ ID No.3所示的序列，第二检测探针的序列为SEQ ID No.4所示的序列。

其中，第一检测探针的5′末端连接有起到修饰作用的巯基（-SH），第二检测探针的3′末端连接有起到修饰作用的巯基（-SH）。

S40、将扩增液和纳米金检测探针溶液混合，反应完全后对混合液进行检测，完成DNA结合蛋白的检测。

结合图2，第一检测探针（probe1）与靶DNA特异性互补，第二检测探针（probe2）与靶DNA特异性互补，从而第一检测探针和第二检测探针可以与靶DNA进行特异性结合，靶DNA起到搭桥作用，最终使得分别结合了第一检测探针和第二检测探针的纳米金颗粒发生聚集，从而导致混合液的颜色由红色变为紫色，通过分光光度计可以检测发现，混合液在紫光吸收区域达到最大吸收峰值。

对混合液进行检测的操作可以为：肉眼直接观察，混合液中的纳米金检测探针发生聚集，颜色由红色变为紫色。

或者，对混合液进行检测的操作可以为：采用分光光度计检测混合液，光谱采集范围为410nm～800nm，检测最大吸收峰。

以下为具体实施例。

实施例1

纳米金颗粒溶液的制备：利用柠檬酸钠还原氯金酸法制备纳米金颗粒溶液。将3.7mL质量浓度为1%的HAuCl₄水溶液加入到90mL水中加热至沸，然后迅速加入9mL质量浓度为1%的柠檬酸钠水溶液，并持续沸腾15分钟，溶液颜色迅速由浅黄色至无色、黑色，最后得到酒红色胶体溶液。

纳米金检测探针的制备：用两种不同的巯基修饰的寡核苷酸来修饰纳米金颗粒。5.2纳摩尔的探针1（序列为SEQ ID No.3所示的序列）和5.2纳摩尔的探针2（序列为SEQ ID No.4所示的序列）一起加在2.5毫升的纳米金溶液中，在室温静置16小时后，逐滴加入0.1摩尔每升的磷酸盐缓冲液(PH7.0)调节至终浓度为10毫摩尔每升，同时加入NaCl调节至浓度为0.1摩尔每升，室温静置40小时。然后在4℃，12000转每分钟离心25分钟,弃掉上清，用1毫升含有0.1摩尔每升NaCl的10毫摩尔每升的磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗三遍。最后纳米金检测探针1和纳米金检测探针2储存在0.3摩尔每升NaCl,10毫摩尔每升磷酸盐缓冲液(PH7.0)中，并放在4℃保存。

待检测的DNA结合蛋白的样品的制备：HeLa细胞（人宫颈癌细胞系）在含有10%胎牛血清的DMEM（一种培养液）中培养，置于加湿处理的含有5%二氧化碳的37℃培养箱中。HeLa细胞分为两组，一组加入20纳克每毫升TNF-α进行刺激，一组不加入TNF-α，30分钟后用细胞核提取物试剂盒裂解细胞（厂家ActiveMotif，货号:40010），收集细胞提取物并且用Bradford法定量蛋白浓度，细胞提取物最终冻存于负80℃冰箱中备用。

DNA结合蛋白的消化：不同浓度的纯化的重组NF-κB p50蛋白与2纳摩尔每升的双链DNA探针在7微升蛋白结合液中室温下反应30分钟。蛋白结合液中含有10毫摩尔每升pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液,100毫摩尔每升氯化钾，2毫摩尔每升氯化镁，0.1毫摩尔每升乙二胺四乙酸，0.1毫克每毫升的酵母tRNA，10%甘油，0.25毫摩尔每升二硫苏糖醇。细胞提取物与2纳摩尔每升的双链DNA探针在7微升蛋白结合液中室温下反应30分钟。蛋白结合液中含有10毫摩尔每升pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液,100毫摩尔每升氯化钾，2毫摩尔每升氯化镁，0.1毫摩尔每升乙二胺四乙酸，10%甘油，0.25毫摩尔每升二硫苏糖醇，2毫摩尔每升pH值为7.0的磷酸钠，20纳克每微升HaeIII-cut E.coli DNA,25纳克每微升的酵母tRNA。蛋白与DNA孵育后与消化液混合至总体积为10微升，其中含有20个单位DNA外切酶III，10毫摩尔每升Bis Tris Propane-HCl,10毫摩尔每升氯化镁，1毫摩尔每升二硫苏糖醇，37℃反应5分钟，70℃20分钟灭活，结束消化反应。由DNA外切酶III切割得到的作为引物的DNA的反义链的序列为SEQ ID No.1所示的序列。

靶DNA的扩增：扩增体系总共20微升体系，分为两部分，A液和B液。A液包括2微升的消化产物，0.05微摩尔每升模板（序列为SEQ ID No.2所示的序列），250微摩尔每升的脱氧核苷三磷酸混合液，1×NEB缓冲液2（10毫摩尔每升三氨基甲烷盐酸，50毫摩尔每升的氯化钠，10毫摩尔每升的氯化镁，1毫摩尔每升二硫苏糖醇，pH值为7.9）。B液包括0.25单位每微升Nb.BbvCI内切酶，0.05单位每微升的KF聚合酶。A液95℃，3分钟，在40℃孵育5分钟。然后A液和B液立刻混合，在40℃反应40分钟。

纳米金比色反应：10微升扩增产物与15微升纳米金检测探针1溶液和15微升纳米金检测探针2溶液一起孵育。然后用含有0.3摩尔每升的氯化钠和10毫摩尔每升pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释至150微升，最后用紫外分光光度计检测混合液。光谱采集范围在410-800纳米，最终发现混合溶液的最大吸收峰在525纳米处。

结合图2，对反应机理进行简单描述：

双链DNA探针包括两条反向的互补配对的寡核苷酸序列，蛋白与DNA的结合位点在正义链的5’端。DNA外切酶III具有从3’端到5’端持续切割DNA双链的能力。当DNA与蛋白结合时，DNA外切酶III不能通过结合位点而继续切割，因此反义寡核苷酸链得以保存下来作为扩增反应的引物。扩增反应的模板包括两部分序列相同的X,中间被序列A分开。X序列与保留下来的反义链的3’端互补配对，序列A是Nb.BbvCI对双链DNA序列的识别位点。当扩增反应的模板，DNA聚合酶，内切酶和脱氧核苷三磷酸都存在时，保留下来的反义寡核苷酸链作为引物起始扩增反应，通过切割酶的作用产生新的引物序列。这些新的引物可以与其他的DNA模板结合，开始新的一轮聚合，切割，链取代反应，最终产生更多的单链DNA。这些单链DNA作为连接体，可以与纳米金探针结合（探针1和探针2都是检测探针，它们都与扩增产物中DNA结合，形成三位置杂交的形式，扩增产物中靶DNA与两个探针的结合，靶DNA起到搭桥作用，才使得探针1和2修饰的纳米金颗粒靠拢发生聚集）引起纳米金的聚合，颜色由红色变为紫色。这种颜色变化可以由肉眼直接观察到，并且可以通过紫外吸收光谱的测定进行定量从而实现对蛋白的检测。当没有蛋白与DNA序列结合时，双链DNA序列被DNA外切酶III切割，不能进行等温扩增，没有连接序列产生，因此不能使纳米金聚合，没有颜色发生变化。

实施例2

1.纳米金和DNA修饰的纳米金的特征

为了得到均匀大小的纳米金颗粒，通过扫描透射电镜观察合成的纳米金颗粒的粒径大约都为14纳米，几乎都呈圆形，具有良好的分散性，结果如图3所示。

2.基于扩增的纳米金比色检测NF-κB p50可行性实验

为了确定基于扩增的纳米金比色是否可以检测DNA结合蛋白，我们选择NF-κB p50转录因子作为模型进行检测。NF-κB p50与DNA结合，经过DNA外切酶III切割和40℃等温扩增后，首先通过14%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证是否有24nt的寡核苷酸序列产生。结果如图4中显示，NF-κB p50存在时（电泳跑道1）可以产生24nt的寡核苷酸序列，NF-κB p50不存在时（电泳跑道2）没有目的条带产生。

3.DNA结合蛋白特异性检测

为了证明该检测方法的特异性，我们进行了对照实验。结果如图5，为NF-κBp50蛋白与非特异性探针的结合后纳米金吸收光谱的变化。曲线a表示存在2纳摩尔NF-κB p50蛋白和2纳摩尔特异性探针；曲线b表示存在2纳摩尔NF-κB p50蛋白和2纳摩尔非特异性探针；曲线c表示存在2纳摩尔特异性探针，不存在蛋白。由图5可以看出，曲线a相对于曲线b明显其光吸收值向紫外方向发生了偏移。

4.DNA结合蛋白灵敏度检测

为了证明本技术方案检测DNA结合蛋白的灵敏度，我们对不同浓度的NF-κB p50蛋白进行了检测分析。随着蛋白浓度的增加，纳米金颜色由红色变为紫色。同时，随着蛋白浓度的增加，525纳米处的吸收峰值逐渐降低，而700纳米处的吸收峰值逐渐增加。700纳米和525纳米处的吸收峰值的比值（A700/A525）用来分析纳米金颗粒的聚集程度，比值越高纳米金聚集程度越高呈现紫色，比值越低，纳米金呈分散状态，颜色为红色。图6和图7显示随着蛋白浓度的增加，A700/A525比值也增加，且浓度与A700/A525比值呈对数关系，即浓度的对数值与A700/A525呈线性关系，且线性关系覆盖3个数量级，由5皮摩尔每升到2纳摩尔每升。线性关系方程为A=-0.0316+0.2731log10C，其中A表示A700/A525比值，C表示蛋白浓度(皮摩尔每升)。用此方程分析空白值加上3倍偏差值得到检测限为3.8皮摩尔每升。这种方法的检测灵敏度比直接用纳米金检测和用能量共振转移检测高出4个数量级。

5.实际样品的检测

为了证明此方法的可行性，我们进行了实际样品的检测。用TNF-α诱导人宫颈癌细胞系HeLa，使其产生大量NF-κB p50。利用凝胶迁移实验（EMSA）证明细胞核提取物中的NF-κB p50是否具有活性，结果如图8所示。TNF-α诱导的细胞核提取物组（电泳跑道3）有一条明显的NF-κB p50与双链DNA结合的条带，相反没有经过TNF-α诱导的细胞核提取物组（电泳跑道1），NF-κB p50与双链DNA结合的条带非常弱。

图9显示的结果与EMSA实验一致，TNF-α诱导的细胞核提取物组,纳米金有明显的颜色变化，且最大吸收峰发生偏移（曲线a），未经过TNF-α诱导的细胞核提取物组，纳米金没有明显的颜色变化，且最大吸收峰发生很小的偏移（曲线b）与没有细胞提取物的对照组（曲线c）结果基本一致。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种DNA结合蛋白的检测方法，包括如下步骤：

将所述消化液加入到扩增体系中，在聚合酶、内切酶和扩增模板存在的情况下，进行等温扩增反应，反应完全后得到扩增液，其中，所述扩增模板包括n段重复序列以及n-1段依次连接所述重复序列的连接序列，所述引物与所述重复序列特异性结合，所述连接序列包括所述内切酶的酶切位点，n为不小于2的整数，所述引物扩增后得到所述扩增模板的互补序列，所述扩增模板的互补序列被所述内切酶切割形成n段包含所述重复序列的靶DNA；

2.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液的操作为：

将HeLa细胞在含有10％胎牛血清的DMEM中培养，置于加湿处理的含有5％二氧化碳的37℃培养箱中，加入20纳克每毫升TNF-α进行刺激，30分钟后用细胞核提取物试剂盒裂解细胞，收集细胞提取物即为所述待检测的DNA结合蛋白的样品溶液。

3.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述DNA结合蛋白为NF-κB p50蛋白。

4.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述聚合酶为KF聚合酶，所述内切酶为Nb.BbvCI内切酶。

5.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，n＝2。

6.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述纳米金颗粒溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备得到。

7.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，对所述混合液进行检测的操作为：肉眼直接观察，混合液中的纳米金检测探针发生聚集，颜色由红色变为紫色。

8.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，对所述混合液进行检测的操作为：采用分光光度计检测混合液，光谱采集范围为410nm～800nm，检测最大吸收峰。

9.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述作为引物的DNA的反义链的序列为SEQ ID No.1所示的序列。

10.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述扩增模板的序列为SEQ ID No.2所示的序列；

所述第一检测探针的序列为SEQ ID No.3所示的序列；

所述第二检测探针的序列为SEQ ID No.4所示的序列。