CN101236209A - 基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白－靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法。该方法包括以下步骤：1)将若干组核酸捕获探针加入到含有靶标蛋白的生物样品体系中，形成靶标蛋白－核酸结合蛋白－核酸捕获探针复合物，所述核酸捕获探针含有至少一段能与核酸结合蛋白相结合的序列；2)通过能与靶标蛋白特异结合的分子把所述的靶标蛋白－核酸结合蛋白－核酸捕获探针复合物分离出来，然后回收核酸捕获探针；3)将步骤2)回收的核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；4)检测杂交结果，分析核酸结合蛋白是否与靶标蛋白存在相互作用。

Description

基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法

技术领域

本发明涉及蛋白-蛋白间是否存在相互作用的检测方法，特别是涉及一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白与靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法。

背景技术

核酸结合蛋白包括双链DNA结合蛋白、单链DNA结合蛋白和RNA结合蛋白等。

双链DNA结合蛋白是一类可以与一段特定序列的双链DNA特异结合的蛋白质分子或是蛋白质分子复合物。双链DNA结合蛋白主要包括原核生物中的阻遏子、操作子蛋白和真核生物中的转录因子等。

人类基因组计划(human genome project，HGP)的结束及几十种模式生物的测序完成，标志着生物学的研究重点由基因组时代逐渐的向功能基因组时代转变。基因表达调控是功能基因组研究的重要领域之一。一般来说，基因表达调控分为转录前调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控五个部分。在转录调控研究中，深入分析转录因子、转录因子-蛋白相互作用，转录因子-核酸相互作用有利于全面了解转录调控的网络机制。

核酸结合蛋白-蛋白间的相互作用属于蛋白-蛋白相互作用的研究范畴。目前，用于蛋白质相互作用的研究方法主要包括生物物理学方法和分子生物学方法。其中，生物物理学方法主要包括蛋白质亲和色谱(protein affinity chromatography)、免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)、表面等离子体共振技术(surface plasmonresonance，SPR)等；分子生物学方法主要是噬菌体展示技术(phage display)和酵母双杂交技术。

免疫共沉淀技术是以抗原、抗体间的免疫反应为基础的研究蛋白间相互作用的经典方法，其优点是相互作用的蛋白质都处在经过翻译后修饰的天然状态，是最接近生理状态的体内研究方法。免疫共沉淀技术中应该注意以下几点：1)确保共沉淀的蛋白是由于加入的特异性抗体得到的，而并非非特异结合的蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；2)阴性对照的设定。在同一份生物样品中，为了保证实验结果的特异性，要并行处理一份不加抗体的阴性对照；3)若证明两个蛋白直接或间接的相互作用，应该进行相互的IP实验以确保结果的可靠性。但是，免疫共沉淀毕竟只是一种低通量的手段，现在通常将其作为蛋白相互作用的验证方法，而高通量的检测手段还是要考虑芯片技术。

酵母双杂交系统是由Fields和Song于1989年提出的，作用原理是基于真核细胞转录因子的结构特性。这些转录因子通常由两个或两个以上相互独立的结构域组成，分别为DNA结合结构域(binding domain，BD)和转录激活结构域(activatingdomain，AD)，只有当两个结构域共同作用时才能使转录正常进行，来自不同转录激活因子的两种结构域也能使转录正常进行。利用此特性，可以使BD和AD分别与“诱饵”蛋白(×)和“猎物”蛋白(Y)形成融合蛋白，并在真核细胞中同时表达。如果两种蛋白可以发生相互作用，就能使BD和AD在空间上充分接近，从而激活报告基因的转录。但是，并不是所有的蛋白间相互作用都可以通过酵母双杂交系统检测。有些蛋白本身具有转录启动功能，仅其单独存在就能“自激活”报告基因的表达，尤其是转录因子，造成所谓的“假阳性”。由于酵母核内其它因素的介导，有时也会把原本没有直接相互作用的两个蛋白拉到一起并使BD和AD结构域相互靠近，从而激活报告基因转录，造成“假阳性”。而且，由于双杂交系统中构建的都是融合蛋白，有可能会影响某些蛋白的高级结构或功能，影响反应生理条件下的真实作用。双杂交技术通常以酵母为宿主细胞，有些异源蛋白也可能在酵母细胞中不能正确折叠或修饰而影响其正常功能。此外，由于常用的双杂交系统需要把融合蛋白定位在酵母细胞核内，这显然不利于核外蛋白的研究。如果两个蛋白的相互作用是发生在细胞核外的，就不能通过激活核内的报告基因表现出来，从而导致所谓的“假阴性”。这些都是酵母双杂交系统中存在的致命问题。

迄今为止，尚没有高通量检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测通量高、灵敏特异的基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法，包括以下步骤：

1)将若干组核酸捕获探针及核酸结合蛋白加入到含有靶标蛋白的生物样品体系中，形成靶标蛋白-核酸结合蛋白-核酸捕获探针复合物，所述核酸捕获探针含有至少一段能与核酸结合蛋白相结合的序列；

2)通过能与靶标蛋白特异结合的分子把所述的靶标蛋白-核酸结合蛋白-核酸捕获探针复合物分离出来，然后回收核酸捕获探针；

3)将步骤2)所回收的核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；

4)检测杂交结果，分析核酸结合蛋白是否与靶标蛋白存在相互作用。

在上述检测方法中，所述步骤1)中的靶标蛋白的选择是广泛的，可以是细胞自身表达的内源蛋白，即细胞本身固有的蛋白分子，可以是通过转染细胞和发酵等操作表达的外源蛋白等，如把某一蛋白的编码序列克隆到载体中形成表达质粒，然后转到细胞中进行表达。在所述构建的重组表达质粒中，为了方便表达蛋白的检测或纯化，一般都含有可以与目标蛋白形成融合蛋白的标签(如His、Myc、Flag、HA或ProteinA等)。靶标蛋白可以是核酸结合蛋白也可以是非核酸结合蛋白，如可以是任何能与转录因子相互作用的蛋白分子，在转录起始过程中起到重要作用的辅助因子(cofactors)，其虽然没有DNA结合活性，但可以通过蛋白-蛋白间相互作用严格控制转录过程；靶标蛋白本身也可以是核酸结合蛋白，如转录因子，研究转录因子-转录因子之间的相互作用也是生物学领域功能基因组时代的重要课题。

所述核酸结合蛋白的选择也是广泛的，可为双链DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、单链DNA结合蛋白或通过体外进化方法筛选出来的非天然的可以结合蛋白分子的核酸配体等，优选为双链DNA结合蛋白，更优选为转录因子，如AP1、NFkB、OCT、SP1或STAT1等。

步骤2)中所述的与靶标蛋白特异结合的分子可以是靶标蛋白的特异抗体，也可以是可与靶标蛋白共表达的蛋白标签的抗体或特异配体，例如，如果采用Protein A作为标签，则直接可以利用其特异配体IgG进行实验，采用类似免疫共沉淀(IP)的方法，把靶标蛋白-核酸结合蛋白-核酸捕获探针三分子的复合物纯化出来。同时，如果靶标蛋白是核酸结合蛋白，如转录因子，则可通过转录因子的结合序列(核酸序列)作为能与其特异结合的分子。除此之外，任何其它的天然的或人工的能与靶标蛋白特异结合的生物分子和化学分子都可以应用于本发明之中。

所述核酸捕获探针的核酸序列含有一段能与目标核酸结合蛋白相结合的序列。通过不同形式的探针设计，本发明可以采用直接末端标记法、单引物扩增法(singleprimer amplification，SPA)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增法或体外转录(in vitro transcription，IVT)扩增法进行探针的扩增或标记。

在直接末端标记法中，所述每组核酸捕获探针的一条核酸链的一端均带有一段突出端序列，为了能提高核酸捕获探针与固定化探针的杂交能力，所述固定化探针与其对应的所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链完全互补。

为方便进行杂交信号检测，所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链的一端还带有标记分子，其中，优选为生物素、地高辛、荧光分子、量子点、金颗粒或纳米颗粒。

为提高检测灵敏度，在本发明所述检测方法中步骤3)的杂交前还可以引入扩增的步骤。

在SPA方法中，每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端均带有一段3’突出端序列，进行步骤3)所述杂交前，还利用一条引物对所述回收的核酸捕获探针进行扩增，所述引物能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列的核酸链杂交，其中，优选的情况是：每组所述核酸捕获探针的一条带有3’突出端序列的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述引物序列与所述3’突出端序列完全互补。在PCR方法中，每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端和5’端还均分别带有一段3’突出端序列和一段5’突出端序列；进行步骤3)所述杂交前，还利用两条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述两条引物中的一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物的序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。其中，优选的情况是：所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述5’突出端序列均相同，所述两条引物中的一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。

在SPA和PCR方法中，为方便进行杂交信号检测，可以在扩增产物中加入标记分子，可以先使引物分子末端带有标记分子再进行扩增，也可以在进行扩增时在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸，其中，标记分子优选为生物素、地高辛、荧光分子、量子点、金颗粒或纳米颗粒。

此外，本发明还可以采用IVT扩增法，在该方法中，每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端还均带有一段3’突出端序列，进行步骤2)所述回收核酸捕获探针后，还利用一条引物对所述回收核酸捕获探针进行延伸形成完整双链，所述引物能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列的核酸链杂交；进行步骤3)所述杂交前，还针对所述的完整双链进行体外转录，其中3’突出端优选为能与T7序列杂交的序列。

本发明提供了一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法。该方法是通过检测核酸结合蛋白，特别是转录因子的特异结合序列来识别与靶标蛋白相互作用的核酸结合蛋白(特别是转录因子)的种类，具有通量高、灵敏度高和特异性强等特点，可广泛应用于生物学基础研究、药物开发等领域，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的操作流程示意图

图2A为以纯品转录因子NFkB为检测样品的检测结果的杂交结果图，其中实验样品标记红色Cy5荧光，对照样品标记绿色Cy3荧光，白色方框内的探针为对应于NFkB的特异探针

图2B为以纯品转录因子NFkB为检测样品的检测结果的散点图，其中实验样品标记红色Cy5荧光，对照样品标记绿色Cy3荧光，红色方框内的探针为对应于NFkB的特异探针

图2C为以纯品转录因子NFkB为检测样品的检测结果的杂交结果图，其中实验样品标记绿色Cy3荧光，对照样品标记红色Cy5荧光，白色方框内的探针为对应于NFkB的特异探针

图2D为以纯品转录因子NFkB为检测样品的检测结果的散点图，其中实验样品标记绿色Cy3荧光，对照样品标记红色Cy5荧光，红色方框内的探针为对应于NFkB的特异探针

图3A为应用IFNγ刺激小鼠3T3L1细胞系的模型，用本发明方法检测与STAT1相互作用的转录因子的杂交结果图，其中实验样品标记绿色Cy3荧光，对照样品标记红色Cy5荧光，箭头所指的探针为STAT1以及与其相互作用的转录因子对应的探针

图3B为应用IFNγ刺激小鼠3T3L1细胞系的模型，用本发明方法检测与STAT1相互作用的转录因子的杂交结果图，其中实验样品标记红色Cy5荧光，对照样品标记绿色Cy3荧光，箭头所指的探针为STAT1以及与其相互作用的转录因子对应的探针

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：

《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物、探针如无特别说明均由上海博亚公司合成。所有百分比浓度如无特别说明均为体积/体积(V/V)或质量/体积(W/V)百分比浓度。

实验材料：转录因子NFkB(p50)(#E3770)购自Promega公司(Madison，WI)，Protein A包被的磁珠购自Dynal Biotech公司(Norway)，NFkB和STAT1的抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)，核蛋白提取试剂盒购自PierceBiotechnology(Rockford，IL)。转录因子与其结合序列的通用结合缓冲液的成分为：100mM Hepes(pH7.6)，5mM EDTA(pH8.0)，50mM(NH₄)₂SO₄，1mM DTT，1％Tween20，150mM KCl，1.25mM MgCl₂。免疫沉淀缓冲液的成分为：20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1％Triton X-100及1×蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor cocktail，Roche)。

本发明的操作流程如图1所示，将核酸捕获探针的混合物加入到蛋白抽提物中，然后通过靶标蛋白(图中为菱形)的抗体，将靶标蛋白和与其相互作用的核酸结合蛋白(图中为圆形和三角形，)分离出来，通过检测结合在核酸结合蛋白上的核酸序列，就可以鉴定和靶标蛋白相互作用的核酸结合蛋白的种类。

实施例1、检测本发明基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法的特异性

以转录因子NFkB为靶标蛋白，利用NFkB纯品，检测本发明基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法的特异性，由于本实施例是检测该方法的特异性，其中蛋白种类只有NFkB一种，所以没有与之相互作用的核酸结合蛋白。具体检测方法包括以下步骤：

A.DNA探针的制备：每组中的DNA芯片固定探针都先用水溶解，配置在50％二甲亚砜(DMSO)的溶液中，探针的终浓度为10μM。核酸结合蛋白捕获探针都用水溶解，再把相对应的探针退火形成双链，把所有核酸结合蛋白(转录因子)的捕获探针混合在一起，使每条探针的终浓度为2nM。其中，突出端序列为：CCCTATAGTGAGTCGTATTACCCC。芯片中针对NFkB的固定探针共4条，序列分别为：GCA GGG AAT TTC CGA TCG GGA ATT TCC GAC，GGA GGG ACT TTCCAA GAG GGA CTT TCC AAG，GAA GGT CCT GGG GAC TTT CCG GTC GTACTA，CGT ACT AGG AGG GGA AAT TCC CTC TCG GAG。捕获探针除了突出端序列外，双链部分序列包含固定探针序列及其互补序列。

B.DNA芯片的制作：使用博奥生物有限公司生产的SmartArray^TM48机械手自动点样装置将步骤A所述的DNA芯片固定探针按照固定的点阵模式点制到光学醛基修饰的玻片(购自博奥生物有限公司)上，点间距为200微米。点样完毕后进行芯片固定，方法为：将玻片在37℃湿盒中固定12小时以上，然后用0.2％SDS溶液清洗芯片，置于摇床上500rpm清洗10分钟。将芯片浸泡在0.2％的NaBH₄(购自Sigma公司)中封闭5分钟后用蒸馏水清洗，2000rpm离心甩干。

C.核酸结合蛋白与核酸捕获探针的结合：将NFkB纯品蛋白，与核酸捕获探针混合物加入到通用结合缓冲液中形成75微升的反应体系，使NFkB的终浓度为5nM。反应体系在室温结合30分钟后，再冰浴结合30分钟。

D.靶标蛋白-转录因子-核酸捕获探针复合物的分离：在步骤C所述的反应体系中加入200微升免疫共沉淀缓冲液，同时加入NFkB的抗体至终浓度为20微克/毫升，并行做一个不加抗体的对照，在4℃、500rpm下反应2小时，然后加入20微升ProteinA包被的磁珠，在4℃、500rpm下反应1小时。反应结束后，用PBS清洗3遍后，每遍10min，用常规方法回收经富集的核酸捕获探针。

E.探针的扩增和标记：以步骤D回收的核酸捕获探针为模板，在荧光标记(采用生物芯片检测中常用的Cy3(绿色荧光)和Cy5(红色荧光)荧光染料，分两组标记，其中一组实验样品标记红色Cy5荧光，对照样品标记绿色Cy3荧光；另一组对照样品标记红色Cy5荧光，实验样品标记绿色Cy3荧光)的下游引物的引导下进行单引物扩增(SPA)，其中，扩增体系为：10×PCR缓冲液，2微升；2.5mM dNTPs，1.6微升；荧光标记引物，1微升；模板，10微升；Taq酶，0.5微升；无菌水，4.9微升，总计20微升。扩增条件为：95℃，3分钟；(95℃，30秒；53℃，30秒；72℃，30秒)×30个循环；72℃，10分钟。

F.芯片的杂交分析：将步骤E得到的扩增产物配制成15微升体系的杂交液，其中含有3×SSC和0.2％的SDS、25％甲酰胺和5×Denhardt’s，溶剂为重蒸水。然后将杂交液加到DNA芯片上(点样)，在42℃下杂交12小时后，使用含0.2％SDS的2×SSC清洗液在室温下清洗玻片4分钟，再用0.2×SSC清洗液清洗玻片，1600rpm甩干玻片。最后，使用博奥生物有限公司的Lu×Scan^TM10K激光扫描仪进行图像扫描，对扫描图像使用SpotData^TM软件进行分析处理。

检测结果如图2A-图2D所示，其中，图2A(实验样品标记红色Cy5荧光，对照样品标记绿色Cy3荧光)和图2C(实验样品标记绿色Cy3荧光，对照样品标记红色Cy5荧光)是杂交图片，方框内为转录因子NFkB特异结合探针杂交结果，两张图片为荧光交换的杂交结果。图中黄色的样品点(除了框内部分的亮点)为在实验样品和对照样品中相同的部分，红色和绿色代表富集的部分(框内的部分)。图2B(实验样品标记红色Cy5荧光，对照样品标记绿色Cy3荧光)和图2D(实验样品标记绿色Cy3荧光，对照样品标记红色Cy5荧光)为上述杂交结果的散点图，方框内为转录因子NFkB的特异结合探针，图中集中在坐标轴对角线附近的样品点为实验样品和对照样品中相同的部分，游离出来的样品点为富集部分，两个不同标记组的检测结果一致。上述实验结果表明本发明基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的检测方法具有较高的特异性。

实施例2、用本发明方法检测与蛋白STAT1相互作用的核酸结合蛋白

用本发明基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白(本实施例为转录因子STAT1，GenBank号：NM_007315)之间是否存在相互作用的方法检测IFNγ刺激小鼠3T3L1细胞系后提取的核蛋白中与STAT1相互作用的核酸结合蛋白，将核酸捕获探针的混合物加入到蛋白抽提物(本实施例为IFNγ刺激小鼠3T3L1细胞系后提取的核蛋白)中，然后通过靶标蛋白的抗体(本实施例为STAT1的抗体)将靶标蛋白和与其相互作用的核酸结合蛋白分离出来，通过检测结合在核酸结合蛋白(转录因子)上的核酸序列，就可以鉴定和靶标蛋白相互作用的核酸结合蛋白的种类。具体检测方法包括以下步骤：

A.DNA探针的制备：每组中的DNA芯片固定探针都先用水溶解，配置在50％二甲亚砜的溶液中，探针的终浓度为10μM。核酸结合蛋白(转录因子)捕获探针都用水溶解，再把相对应的探针退火形成双链，其中每组探针的终浓度均为60nM，把所有核酸结合蛋白(转录因子)的捕获探针混合在一起，使每条探针的终浓度为2nM。其中，突出端序列为：CCCTATAGTGAGTCGTATTACCCC。芯片中针对STAT1的固定探针共2条，序列分别为：GTA CGG GCA TTT CCG GGA AGT GCG TAT TTC，CAG GAT CGA ATT CCA GGA AAT CGT ACC GAG。捕获探针除了突出端序列外，双链部分序列包含固定探针序列及其互补序列。

B.DNA芯片的制作：使用博奥生物有限公司生产的SmartArray^TM48机械手自动点样装置将步骤A所述的DNA芯片固定探针按照固定的点阵模式点制到光学醛基修饰的玻片上，点间距为200微米。点样完毕后进行芯片固定，方法为：将玻片在37℃湿盒中固定12小时以上，然后用0.2％SDS溶液清洗芯片，置于摇床上500rpm清洗10分钟。将芯片浸泡在0.2％的NaBH4(购自Sigma公司)中封闭5分钟后用蒸馏水清洗，2000rpm离心甩干。

C.核酸结合蛋白与核酸捕获探针的结合：用终浓度为50U/毫升的IFNγ刺激小鼠3T3L1细胞系(购自美国ATCC)20分钟后，按照Pierce试剂盒的说明书进行核蛋白的提取。将50微克核蛋白、与4微升核酸捕获探针(探针浓度为2nM)混合物加入到通用结合缓冲液中形成75微升的反应体系。反应体系在室温结合30分钟后，在冰浴结合30分钟。

D.靶标蛋白-转录因子-核酸捕获探针复合物的分离：在步骤C所述的反应体系中加入200微升免疫共沉淀缓冲液，同时加入STAT1的抗体至终浓度为20微克/毫升，并行做一个不加抗体的对照，在4℃、500rpm下反应2小时，然后加入20微升ProteinA包被的磁珠，在4℃、500rpm下反应1小时。反应结束后，用PBS清洗3遍，每遍10分钟，然后用常规方法回收经富集的核酸捕获探针。

E.探针的扩增和标记：以步骤D回收的核酸捕获探针为模板，在荧光标记(分两组标记，其中一组实验样品标记红色Cy5荧光，对照样品标记绿色Cy3荧光；另一组对照样品标记红色Cy5荧光，实验样品标记绿色Cy3荧光)的下游引物的引导下进行单引物扩增(SPA)，其中，扩增体系为：10×PCR缓冲液，2微升；2.5mM dNTPs，1.6微升；荧光标记引物，1微升；模板，10微升；Taq酶，0.5微升；无菌水，4.9微升，总计20微升。扩增条件为：95℃，3分钟；(95℃，30秒；53℃，30秒；72℃，30秒)×30个循环；72℃，10分钟。

F.芯片的杂交分析：将步骤E得到的扩增产物配制成15微升体系的杂交液，其中含有3×SSC和0.2％的SDS、25％甲酰胺和5×Denhardt’s，溶剂为重蒸水。然后将杂交液加到DNA芯片上(点样)，在42℃下杂交12小时后，使用含0.2％SDS的2×SSC清洗液在室温下清洗玻片4分钟，再用0.2×SSC清洗液清洗玻片，1600rpm甩干玻片。最后，使用Lu×Scan^TM10K激光扫描仪进行图像扫描，对扫描图像使用SpotData^TM软件进行分析处理。

杂交结果如图3A(实验样品标记绿色Cy3荧光，对照样品标记红色Cy5荧光)和图3B(实验样品标记红色Cy5荧光，对照样品标记绿色Cy3荧光)所示，其中，箭头所指为在该实施例中富集出的结合探针，两张图片为荧光交换的杂交结果。图中黄色的样品点(除了红色和绿色的)为在实验样品和对照样品中相同的部分，红色和绿色代表富集的部分，两个不同标记组的检测结果一致，为STAT1自身和与之相互作用的核酸结合蛋白USF1。

上述实验结果表明本发明基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的检测方法具有较好的检测效果。

Claims (29)

1、一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白-靶标蛋白之间是否存在相互作用的方法，包括以下步骤：

1)将若干组核酸捕获探针及核酸结合蛋白加入到含有靶标蛋白的生物样品体系中，形成靶标蛋白-核酸结合蛋白-核酸捕获探针复合物，所述核酸捕获探针含有至少一段能与核酸结合蛋白相结合的序列；

2)通过能与靶标蛋白特异结合的分子把所述的靶标蛋白-核酸结合蛋白-核酸捕获探针复合物分离出来，然后回收核酸捕获探针；

3)将步骤2)所回收的核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；

4)检测杂交结果，分析核酸结合蛋白是否与靶标蛋白存在相互作用。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述靶标蛋白为细胞自身表达的内源蛋白，或是通过基因工程方法表达的外源蛋白。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述靶标蛋白为核酸结合蛋白或非核酸结合蛋白。

4、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述核酸结合蛋白为双链DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、单链DNA结合蛋白或通过体外进化方法筛选出来的非天然的可以结合蛋白分子的核酸配体。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述双链DNA结合蛋白为转录因子。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中能与靶标蛋白特异结合的分子为靶标蛋白的特异性抗体。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中能与靶标蛋白特异结合的分子为与靶标蛋白共表达的蛋白标签的抗体或其它配体。

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中能与靶标蛋白特异结合的分子为核酸。

9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸捕获探针的一条核酸链的一端均带有一段突出端序列。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述芯片上的固定化探针与其对应的所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链完全互补。

11、根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链还带有标记分子。

12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素、地高辛、荧光分子、量子点、金颗粒或纳米颗粒。

13、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述每组核酸捕获探针的一条核酸链的3’端均带有一段3’突出端序列，在进行步骤3)所述的杂交前，利用一条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述引物能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列的核酸链杂交。

14、根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述每组核酸捕获探针的一条带有3’突出端序列的核酸链中的3’突出端序列均相同。

15、根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述利用一条引物进行扩增时，在扩增产物中同时掺入标记分子。

16、根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述引物分子的5’端带有标记分子。

17、根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素、地高辛、荧光分子、量子点、金颗粒或纳米颗粒。

18、根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述利用一条引物进行扩增时在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸。

19、根据权利要求18所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素、地高辛、荧光分子、量子点、金颗粒或纳米颗粒。

20、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述每组核酸捕获探针的一条核酸链的3’端和5’端还均分别带有一段3’突出端序列和一段5’突出端序列；在进行步骤3)所述杂交前，利用两条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述两条引物中的一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端杂交。

21、根据权利要求20所述的方法，其特征在于：所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的3’突出端序列均相同，所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的5’突出端序列均相同，所述两条引物一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端杂交。

22、根据权利要求20所述的方法，其特征在于：所述利用两条引物进行扩增时，在扩增产物中同时掺入标记分子。

23、根据权利要求22所述的方法，其特征在于：所述引物分子的5’端带有标记分子。

24、根据权利要求23所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素、地高辛、荧光分子、量子点、金颗粒或纳米颗粒。

25、根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述利用两条引物进行扩增时在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸。

26、根据权利要求25所述的方法，其特征在于：所述标记分子为生物素、地高辛、荧光分子、量子点、金颗粒或纳米颗粒。

27、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述每组核酸捕获探针的一条核酸链的3’端均带有一段3’突出端序列，在进行步骤2)所述回收核酸捕获探针后，利用一条引物对所述回收核酸捕获探针进行延伸形成完整双链，所述引物能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列的核酸链杂交；在进行步骤3)所述杂交前，针对所述的完整双链进行体外转录。

28、根据权利要求27所述的方法，其特征在于：所述每组核酸捕获探针的一条带有3’突出端序列的核酸链中的3’突出端序列均相同。

29、根据权利要求27或28所述的方法，其特征在于：所述的3’突出端序列可与T7序列杂交。

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