JP2015092183A - 画期的新薬開発のためのターゲットタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する新薬候補物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
サイクリンTは、相同性が大きいタンパク質であり、特に、サイクリンボックスという共通部分が存在し、この部分がCDK9との結合を左右すると知られており、ヒトサイクリンT(GenBank #NM_001240)のサイクリンボックスは、266個のアミノ酸で形成されて、配列番号1の塩基配列として表した(図1)。
ヒトCDK9(GenBank#BC001968)は、配列番号2で表した。
CDK9を増幅するための鋳型として、ヒトcDNA mixtureを用い、ヒトサイクリンT1を増幅するための鋳型としては、HEK293細胞とHeLa細胞の1:1混合物を用いた。
配列番号3:GAATTCATGGCGAAGCAGTACGACTC(ヒトCDK9フォワードプライマー、EcoRI site含む)
配列番号4:CTCGAGGAAGACGCGCTCAAACTCC(ヒトCDK9リバースプライマー、XhoI site含む)
配列番号5:GAATTCATGGAGGGAGAGAGGAAGAACA(ヒトサイクリンT1フォワードプライマー、EcoRI site含む)
配列番号6:GTCGACAGCCTCGCATGCCCTCCAA(ヒトサイクリンT1リバースプライマー、SalI site含む)
ゾル−ゲルチップで、CDK9とヒトサイクリンT1の相互作用を確認するため、図5に示した方法でタンパク質間の結合をチップ上で確認した。
ヒトサイクリンT1及びCDK9を各々50ngずつゾル−ゲル物質組成1(25.0% TMOS、7.5% MTMS、5% GPTMOS)に混ぜてArrayerで96−ウェルプレートにスポッティングして固定化した。アフィニティーのない物質がチップに付着することを防止するため、スキムミルクが入っている結合バッファーでブロッキングした後、CDK9に結合する抗体のAnti−CDK9を1/500濃度で、常温で1時間反応させた。スキャナーでシグナルを確認するため、cy3で標識された二次抗体を1/1000濃度で、常温で1時間反応させた後、スキャンしてシグナルを確認した(図6)。
天然物ライブラリーを本格的にスクリーニングする前に4種類の天然物を選定してチップベースのアッセイシステムの条件を確立した。前記結果からCDK9のシグナルが弱かったため、チップに固定化するヒトサイクリンT1とCDK9の量を50ngの3倍の150ngに増やして、ゾル−ゲル物質組成2(25.0% TMOS、7.5% MTMS、15% GPTMOS)に混ぜて、96−ウェルプレートに固定化した。
タンパク質を固定化してアッセイするのに適切なゾル−ゲル物質を選定するため、実施例2で用いた組成1(25.0% TMOS、7.5% MTMS、5% GPTMOS)とポアサイズが組成2−9より大きかったため、大きいタンパク質分子をアッセイするのに良い組成である組成2(25.0% TMOS、7.5% MTMS、15% GPTMOS)の2種類ゾル材料に図9のように、CDK9(150ng/ゾル−ゲル物質11μL)とヒトサイクリンT1(180ng/ゾル−ゲル物質11μL)、陽性対照群及び陰性対照群を各々固定化した後、実施例2と同様な方法で、抗体を処理した後、スキャニングした。
実施例2及び3で確立されたタンパク質相互作用に対するチップベースのアッセイシステムを利用して、天然物ライブラリーをスクリーニングした。天然物ライブラリーは韓国生命工学研究院から放線菌培養抽出液21種、カビ培養抽出液40種及び植物抽出液19種を分譲して用いて、放線菌培養抽出液はアセトン:水=1:1溶媒に溶解し、植物抽出液は5mmg/mL濃度で水に溶解した。
ゾル−ゲルの処方(formulation)を変化させて、CDK9とサイクリンT1の相互作用が最もよく行われる組成を探すため、組成1で三つのシリケートモノマーとバッファーの組成を変化させて、組成1とは異なったポアサイズを有するように新しい組成を製造した。
実施例5で確認された組成を利用して、図14に示したように、天然物fullスクリーニング用タンパク質−タンパク質阻害分析システムを作製した。選ばれた三つの天然物を基に、再び低密度チップを作製した時、図15に示したように、Anti−CDK9と二次抗体だけ反応させた場合には、CDK9と天然物を固定したスポットだけでシグナルが見られ、CDK9、Anti−CDK9と二次抗体を反応させた場合にはCDK9と天然物、ヒトサイクリンT1と天然物を固定化したスポット全部からシグナルが見られたが、シグナルが弱く減少することも観察された。
本発明のチップベースのシステムがタンパク質相互作用に対する阻害剤開発に適用作用するかを検証するため、アプタマーを作製して、検証を行った。
鋳型:GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT−N40−AGATAGTAAGTGCAATCT
配列番号7:UUACAGAACAACCAACGUCGCUCCGGGUACUUCUUCAUCG
配列番号8:ACCATCGCGGAAGTCCAGTCTGCCATCAAAATCCGAAGTG
配列番号9:AATTCTCTCTCTTCATAATATTCCGGCGTCTACATCCACT
配列番号10:CACGCGTTCAACCCCCGGAATTTAGCAATAGCAGATTACG
この結果から、本発明に係るチップベースのタンパク質−タンパク質阻害剤スクリーニングシステムが作用することを確認することができた。
Claims (6)
- 以下の工程を含むタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法:
(a)ゾル−ゲル物質とタンパク質とが混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを作製する工程;
(b)前記タンパク質チップと、前記チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質とを、前記結合を阻害する候補物質の存在下において反応させる工程;及び
(c)前記チップに固定化されたタンパク質と、前記固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質との間の結合を測定して、前記候補物質がない場合のタンパク質−タンパク質相互作用に比べて、タンパク質−タンパク質相互作用が阻害される場合の候補物質をタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質として選定する工程。 - 前記候補物質は、天然物、化合物及びアプタマーからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記工程(c)におけるタンパク質間の結合は、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質に対する抗体を利用して確認することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記スポットは、96ウェルプレートに固定されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質チップに固定化されたタンパク質は、サイクリンT1で、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質はCDK9であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ゾル−ゲル物質は、TMOS 17.5重量部、MTMS 5〜15重量部及びGPTMOS 0〜15重量部を含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
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