CN109970212A - 一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明b染料的方法 - Google Patents

一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明b染料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,本发明利用过氧化物模拟酶在一定浓度过氧化氢存在下可降解罗丹明B染料,本发明的过氧化物模拟酶是由一种分子内平行结构G4‑DNA与氯化血红素hemin孵育形成的,构建成本较低,方法稳定性和重复性良好,能快速降解环境监测等领域中的罗丹明B染料。

Description

一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法
技术领域
本发明属于分析化学和环境保护领域,具体涉及一种过氧化物模拟酶及其制备和应用。
技术背景
罗丹明B(Rhodamine B,简称RhB)又称玫瑰红B,或碱性玫瑰精,是一种水溶性强的人工合成的三苯甲烷类碱性染料,是致癌物质。罗丹明B常用作实验室中细胞荧光染色剂、激光材料、染料等行业。
国内外罗丹明B染料残留降解方法目前主要有物理方法如光照、超声波、微波等;化学方法如氧化分解、酸碱水解和光化学降解(主要是基于Fenton反应等产生OH自由基)等,近年来对罗丹明B染料降解已成为研究热点。
天然酶具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊蛋白质,但是天然酶具有稳定性差、易失活、不易制备等缺点,使其在应用过程中受限。
发明内容
研究表明重复的富含G碱基的结构单元的DNA片段能形成堆积的G-四链体结构(G4),G4结构PS2.M与hemin形成复合物后具有较高的过氧化物酶活性。本发明的一个目的在于针对目前罗丹明B 染料降解的物理、化学等方法缺点(如二次污染,操作繁琐,试剂消耗大,费时费力等),生物方法(如天然酶试剂昂贵、稳定性差、不易制备和保存等)不足,现提供一种廉价易得、操作简单、快速高效的罗丹明B降解方法,可应用于染料降解行业。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其创新点在于:所述过氧化物模拟酶降解罗丹明B染料步骤如下:
(1)罗丹明B染料溶液制备:取100mg/L罗丹明B染料溶液 10~20mL,用纯水将其稀释至100mL,得10~20mg/L罗丹明B染料溶液,2~6℃棕色保存备用;
(2)过氧化氢溶液配制:取质量分数为30%的过氧化氢溶液,用纯水将其稀释至物质的量浓度为0.1~2mmol/L备用;
(3)罗丹明B染料的降解反应:常温常压下吸取2~3mL罗丹明B染料溶液于具塞比色皿或试管或离心管或锥形瓶或碘量瓶中,依次加入300μL过氧化物模拟酶、30μL过氧化氢溶液,以手摇或涡旋或振荡的方式进行降解反应。
进一步的,所述基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料步骤(3)中的过氧化物模拟酶是由分子内平行结构G4-DNA与氯化血红素hemin通过π-π堆积作用自组装形成的。
进一步的,所述基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料步骤(3)中的过氧化物模拟酶结构图如图(5)所示。
进一步的,所述基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料步骤(3)中的过氧化物模拟酶的制备方法包括以下步骤:
(1)分子内平行结构G4-DNA溶液的配制:将G4-DNA用缓冲液溶解,并在90~100℃下加热5~15min,加热结束后迅速在冰上冷却至室温,2~6℃静置过夜,备用;
(2)氯化血红素hemin溶液的配制:取10mmol/L hemin储备液,用二甲基亚砜溶解得hemin工作液,于-15~-25℃保存,将hemin工作液用缓冲液稀释成氯化血红素hemin溶液备用;
(3)过氧化物模拟酶的建立:将步骤(1)中的G4-DNA溶液与步骤(2)中的氯化血红素hemin溶液等体积混合,室温孵育,得过氧化物模拟酶。
进一步的,所述过氧化物模拟酶的制备方法步骤(1)中制备的 G4-DNA溶液的最终物质的量浓度为1~10μmol/L,所述G4-DNA的序列包括5’-XnG3(XnG3)3Xn-3’,其核心结构为5’-G3(XnG3)3-3’,其中 X表示A、T、G、C任意核酸碱基,n为1~3的自然数。
进一步的,所述过氧化物模拟酶的制备方法步骤(2)中制备的氯化血红素hemin溶液物质的量浓度为2~20μmol/L。
进一步的,所述过氧化物模拟酶的制备方法步骤(1)和(2)中缓冲液每1L中各组分含量如下:
进一步的,所述步骤过氧化物模拟酶的制备方法(3)中所述孵育时间为1~2h,所述过氧化物模拟酶的物质的量浓度为1~10μmol/L。
进一步的,所述Tris/HCl的pH值为7~8。
所述过氧化物模拟酶降解罗丹明B染料步骤(3)中罗丹明B 染料的降解反应的反应时间为3~30min。
本发明的有益效果:
1.本发明构建一种分子内平行的G4-DNA与heminπ-π堆积作用形成的复合物具有强过氧化物模拟酶活性,能较好地降解罗丹明B 染料,且便于操作,方便易得,适合工业大规模生产。
2.本发明中制备过氧化物模拟酶的原料之一G4-DNA可通过大量化学合成获得,因而此方法操作简便可行,构建成本较低,方法稳定性和重复性良好。
3.本发明利用过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料方法在常温常压下即可进行,反应时间仅需3~30min,简单方便,可以快速降解环境监测等领域中的罗丹明B染料。
附图说明
图1为本发明EAD/hemin体系过氧化物模拟酶对罗丹明B染料降解前后光谱扫描图;
图2为本发明EAD/hemin体系过氧化物模拟酶对罗丹明B染料降解反应效率;
图3为本发明c-Myc/hemin体系过氧化物模拟酶对罗丹明B染料降解前后光谱扫描图;
图4为本发明c-Myc/hemin体系过氧化物模拟酶对罗丹明B染料降解反应效率;
图5为本发明中过氧化物模拟酶的结构式图。
具体实施方式
以下详细描述本发明的技术方案,本方法的实施例仅说明具体方法,该方法的规模不受实施例的限制。
实施例1
缓冲液:20mmol/L pH 7.5Tris/HCl,150mmol/L NaCl,20mmol/L KCl,0.05%Triton X-100。
分子内平行结构G4-DNA/hemin过氧化物模拟酶构建
(1)分子内平行G4-DNA溶液的配置:取EAD序列为5’-C (TG3)4C-3’的G4-DNA,用缓冲液溶解,并95℃加热10min,冰上迅速冷却至室温,4℃静置过夜。
(2)氯化血红素hemin溶液的配置:取10mmol/Lhemin储备液用二甲基亚砜(DMSO)溶解,得hemin工作液,-20℃保存备用。 Hemin工作液用缓冲液配好备用。
(3)过氧化物模拟酶构建:将步骤(1)中EAD溶液与步骤(2) 中hemin溶液等体积混合,确保EAD终浓度为10μmol/L与hemin 终浓度为20μmol/L,室温孵育1h,制备EAD/hemin过氧化物模拟酶;
罗丹明B染料的降解
(1)罗丹明B标准溶液的配置:取100mg/L罗丹明B储备液用纯水溶解,4℃棕色瓶保存备用。再用纯水稀释至合适浓度。
(2)罗丹明B标准曲线的绘制:用紫外-可见分光光度计采集步骤(1)中标准溶液系列(1、2、5、7.5、10mg/L)罗丹明B最大吸收波长555nm处的吸光度,绘制浓度与吸光度的响应曲线。线性回归方程为y=0.2373x+0.1575,相关系数r=0.9991。
(3)过氧化氢溶液的配置:用水稀释30%过氧化氢至合适浓度。
(4)罗丹明B降解反应监测:吸取2.67mL 20mg/L罗丹明B 于1cm比色皿中,按照顺序依次加入300μL 10μmol/L EAD/hemin 过氧化物模拟酶、30μL 100mmol/L过氧化氢,记录下这些过程中的光谱扫描(230~780nm)和最大吸收波长下吸光度;盖上比色皿盖子后,多次手摇比色皿,前5分钟每隔1min记录下最大吸收波长下吸光度,之后每隔5min记录下最大吸收波长下吸光度。将记录下的最大吸收波长下吸光度代入上述步骤(2)产生的线性回归方程,计算得未降解的罗丹明B浓度,进而计算出罗丹明B的降解率,并做只加EAD/hemin过氧化物模拟酶和只加过氧化氢的降解对照试验。
从图1可以看出在EAD/hemin体系下,一定浓度过氧化氢存在下,罗丹明B降解前后的吸收光谱图发生20~30nm的蓝移,且在260 nm和550nm处均下降,文献资料表明罗丹明B已发生显著降解,体系溶液的颜色有桃红色变为酒红色。如图2所示,在EAD/hemin 体系加入过氧化氢30min后,至少85%以上的罗丹明B染料已降解。
实施例2
分子内平行结构G4-DNA/hemin过氧化物模拟酶构建
(1)分子内平行G4-DNA溶液的配置:取c-Myc序列为 5’-TGAG3TG4AG3TG4A2-3’的G4-DNA,用缓冲液(同实施例1)溶解,并95℃加热5min,冰上迅速冷却至室温,4℃静置过夜。
(2)氯化血红素hemin溶液的配置:同实施例1。
(3)过氧化物模拟酶构建:将步骤(1)中c-Myc溶液与步骤(2) 中hemin等体积混合,确保c-Myc终浓度为10μmol/L与hemin终浓度为20μmol/L,并孵育2h,制备c-Myc/hemin过氧化物模拟酶;罗丹明B染料的降解
(1)罗丹明B标准溶液的配置:同实施例1。
(2)罗丹明B标准曲线的绘制:同实施例1。
(3)过氧化氢溶液的配置:同实施例1。
(4)罗丹明B降解反应监测:吸取2.67mL 20mg/L罗丹明B 于1cm比色皿中,按照顺序依次加入300μL 10μmol/L c-Myc/hemin 过氧化物模拟酶、30μL 100mmol/L过氧化氢,记录下这些过程中的最大吸收波长下吸光度;盖上比色皿盖子后,手摇比色皿,每隔4min 记录下最大吸收波长下吸光度。将记录下的最大吸收波长下吸光度代入上述步骤(2)产生的线性回归方程,计算得未降解的罗丹明B浓度,进而计算出罗丹明B的降解率,并做只加c-Myc/hemin过氧化物模拟酶和只加过氧化氢的降解对照试验。
从图3可以看出在c-Myc/hemin体系下,一定浓度过氧化氢存在下,试验现象与实施例1类似,罗丹明B降解前后的吸收光谱图发生20~30nm的蓝移,且在260nm和550nm处均下降,文献资料表明罗丹明B已发生显著降解,体系溶液的颜色有桃红色变为酒红色。如图4所示,在EAD/hemin体系加入过氧化氢30min后,至少90%以上的罗丹明B染料已降解。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述过氧化物模拟酶降解罗丹明B染料步骤如下:
(1)罗丹明B染料溶液制备:取100mg/L罗丹明B染料溶液10~20mL,用纯水将其稀释至100mL,得10~20mg/L罗丹明B染料溶液,2~6℃棕色保存备用;
(2)过氧化氢溶液配制:取质量分数为30%的过氧化氢溶液,用纯水将其稀释至物质的量浓度为0.1~2mmol/L备用;
(3)罗丹明B染料的降解反应:常温常压下吸取2~3mL罗丹明B染料溶液于具塞比色皿或试管或离心管或锥形瓶或碘量瓶中,依次加入300μL过氧化物模拟酶、30μL过氧化氢溶液,以手摇或涡旋或振荡的方式进行降解反应。
2.根据权利要求1所述的一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的过氧化物模拟酶是由分子内平行结构G4-DNA与氯化血红素hemin通过π-π堆积作用自组装形成的。
3.根据权利要求1所述的一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的过氧化物模拟酶的结构图如图(5)所示。
4.根据权利要求1所述的一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的过氧化物模拟酶的制备方法包括以下步骤:
(1)分子内平行结构G4-DNA溶液的配制:将G4-DNA用缓冲液溶解,并在90~100℃下加热5~15min,加热结束后在冰上迅速冷却至室温,2~6℃静置过夜,备用;
(2)氯化血红素hemin溶液的配制:取10mmol/L hemin储备液,用二甲基亚砜溶解得hemin工作液,于-15~-25℃保存,将hemin工作液用缓冲液稀释成氯化血红素hemin溶液备用;
(3)过氧化物模拟酶的建立:将步骤(1)中的G4-DNA溶液与步骤(2)中的氯化血红素hemin溶液等体积混合,室温孵育,得过氧化物模拟酶。
5.根据权利要求4所述的一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述步骤(1)中制备的G4-DNA溶液的最终物质的量浓度为1~10μmol/L,所述G4-DNA的序列包括5’-XnG3(XnG3)3Xn-3’,其核心结构为5’-G3(XnG3)3-3’,其中X表示A、T、G、C任意核酸碱基,n为1~3的自然数。
6.根据权利要求4所述的一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述步骤(2)中制备的氯化血红素hemin溶液物质的量浓度为2~20μmol/L。
7.根据权利要求4所述的一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述步骤(1)和(2)中缓冲液每1L中各组分含量如下:
8.根据权利要求4所述的一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述步骤(3)中所述孵育时间为1~2h,所述过氧化物模拟酶的物质的量浓度为1~10μmol/L。
9.根据权利要求7所述的一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述Tris/HCl的pH值为7~8。
10.根据权利要求1所述的一种基于过氧化物模拟酶活性降解罗丹明B染料的方法,其特征在于:所述步骤(3)中罗丹明B染料的降解反应的反应时间为3~30min。
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