CN103060282A - Dna过氧化物酶及其制备方法、用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶学领域，具体地说是一种DNA过氧化物酶，其分子结构如下述通式(Ⅰ)：
Description
技术领域
本发明涉及酶学领域，具体地说是一种二重复单元DNA G-四链体-血红素 DNA过氧化物酶及其制备方法、用途。
背景技术
众所周知，酶是具有催化功能的生物大分子，它的特点是具有高度的专一性和很高催化活性。过去人们以为酶只能由蛋白质组成，但1981年T.R. Cech等发现了核酸也具有催化反应的能力，提出了核酶的概念。1994年R.R. Breaker证明了DNA也具有酶的活性。1996年Dipankar Sen 课题组发现了DNA过氧化物酶，它不仅能够催化核酸链上的反应，还能像普通催化剂那样参与催化氧化反应。目前发现了各种各样的DNA过氧化酶具有不同的催化活性。DNA过氧化物酶能够氧化显色底物发生颜色的变化，在分析检测不同类型的靶分子中表现出十分优良的特性。首先，与蛋白质构成的酶相比，DNA过氧化物酶稳定性更高，而且DNA的合成与纯化过程远比蛋白质容易得多，最重要的是在操作过程中不容易失活；其次，DNA过氧化物酶的获得比较方便，只需将DNA片段在适当的条件下与Hemin（血红素）混匀即可。
随着对DNA过氧化物酶深入研究，人们发现能形成G-四链体的核酸序列就有可能存在DNA过氧化物酶活性。2009年Chengde Mao 课题组发现很多物种的端粒DNA序列与Hemin结合后可以具有DNA过氧化物酶的活性，其中也包括了能够形成 G-四链体的人类端粒DNA（TTAGGG）n 序列。首先DNA G-四链体-Hemin DNA过氧化物酶能够催化H2O2氧化ABTS2- 生成绿色ABTS·-，可作为一种新型的颜色反应标签应用于检测之中。其次DNA G-四链体-Hemin DNA过氧化物酶具有酶的活性，能够放大反应信号，从而提高检测的灵敏度。研究表明85%以上的肿瘤细胞中端粒酶表达呈阳性，而正常细胞中几乎检测不到端粒酶，这说明端粒酶与细胞的恶性转化及维持分裂增殖具有密切的关系。端粒DNA G-四链体结构的形成能够有效地抑制端粒酶的活性，因而靶向端粒DNA G-四链体并使其稳定的配体成为抗癌药物研究的新方向。在G-四链体稳定剂类抗癌药物的开发过程中，建立一种既简便又快速的药物大批量筛选方法是必不可少的。G-四链体可以与Hemin结合而显示出较强的酶活性，并且文献报道，Hemin主要作用于G-四链体末端的G-四分体上；G-四链体稳定剂也需要与G-四链体结合而对该结构起到稳定作用，若两者在G-四链体的结合位点相同或相接近，G-四链体稳定剂与G-四链体结合有可能有效的阻碍Hemin与G-四链体结合，导致体系中酶的催化活性降低，并且文献报道，G-四链体稳定剂也主要堆积在G-四链体末端的G-四分体上。利用体系中信号强度随时间的变化关系，比较不同药物与 G-四链体的作用能力，可实现G-四链体稳定剂类抗癌药物的大批量筛选。但过去研究的都是单体DNA G-四链体稳定剂，这些单体DNA G-四链体一般由21-26个碱基组成，然而3’末端单链人类端粒DNA实际上由100-200碱基组成，很多研究表明其能够形成连续的多重复单元DNA G-四链体。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有的技术不足，提供一种二重复单元DNA G-四链体-血红素 DNA过氧化物酶，具有更高的催化活性，从而在检测中可以扩大反应信号，提高检测灵敏度，降低最低检测下限的范围，可以实现多重复单元DNA G-四链体稳定剂类抗癌药物的大批量筛选及高灵敏度的分析检测不同类型的靶分子，利用二重复单元DNA G-四链体-Hemin DNA过氧化物酶比较出了不同配体与二重复单元DNA G-四链体的结合能力。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种DNA过氧化物酶，其特征是：其分子结构如下述通式(Ⅰ)：
(Ⅰ)
制备前述DNA过氧化物酶的方法，其特征是包括下列步骤：
（1）试剂和缓冲液
血红素溶解于二甲基亚砜中制备成血红素溶液，2～8℃保存；
用去离子水配制氯化钾溶液；
用去离子水配制PH值为7.0～8.0Tris-HCl缓冲液；
（2） T8 DNA的预处理
固体样品T8 DNA在4℃经离心机以12000 r·min-1高速离心5～10min，并在－20℃保存，使用前用去离子水配制成T8 DNA溶液，4℃保存，3天内使用；
（3）二重复单元DNA G-四链体的制备
取步骤（2）配制的T8 DNA溶液放入到5ml 离心管中，加入步骤（1）配制的氯化钾溶液、Tris-HCl缓冲溶液，使T8 DNA 处于含KCl浓度100mM、含Tris-HCl浓度25mM、pH值为7.0～8.0的溶液中，混均，在90℃水浴锅中加热5～10min，缓慢冷却至室温；
（4）DNA过氧化物酶的制备
在步骤（3）的离心管中加入步骤（1）配制的血红素溶液，轻轻摇晃使其混均，静置2～3h。
前述DNA过氧化物酶，作为大批量筛选多重复单元DNA G-四链体稳定剂类抗癌药物及高灵敏度的分析检测不同类型靶分子的应用。
本发明的有益效果是：二重复单元DNA G-四链体-血红素 DNA过氧化物酶具有更高的催化活性，从而在检测中可以扩大反应信号，提高检测灵敏度，降低最低检测下限的范围，可以实现多重复单元DNA G-四链体稳定剂类抗癌药物的大批量筛选及高灵敏度的分析检测不同类型的靶分子，利用二重复单元DNA G-四链体-血红素DNA过氧化物酶比较出了不同配体与二重复单元DNA G-四链体的结合能力。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为单体DNA G-四链体和二重复单元DNA G-四链体的CD光谱图。
图2为单体DNA G-四链体和二重复单元DNA G-四链体对血红素催化活性影响的紫外光谱图。
图3三种化合物分别对二重复单元DNA G-四链体-血红素 DNA过氧化物酶催化活性影响，即比较三种化合物与二重复单元DNA G-四链体的结合能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1：
本实施例二重复单元DNA G-四链体-血红素 DNA过氧化物酶的分子结构如下述通式(Ⅰ)：
(Ⅰ)
二重复单元DNA G-四链体-血红素 DNA过氧化物酶的制备，其具体过程和步骤如下：
（1）试剂和缓冲液
0.652mg血红素溶解于10ml二甲基亚砜中制备成浓度100uM的溶液，2～8℃保存，1个星期内使用。
0.745g氯化钾，用去离子水配制成浓度1M的氯化钾溶液。
0.3785g的Tris（三羟甲基氨基甲烷）溶解于20ml的双蒸水中，待充分溶解后，加入浓盐酸调节pH值至7.0～8.0，用去离子水定容至25ml配制成Tris-HCl浓度125mM的缓冲液。
（2）T8 DNA（5’-（TTAGGG）8 TT-3’）的预处理
固体样品T8 DNA在4℃经离心机以12000 r·min-1高速离心8min，以避免打开离心管时DNA飞出，影响DNA的浓度，向离心后的T8 DNA样品中加入去离子水配制成T8 DNA 浓度100uM的T8 DNA溶液并保存在4℃冷柜里，三天内使用。
（3）二重复单元DNA G-四链体的制备
在5 ml的离心管中分别加入0.6mL的浓度125 mM的Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.0～8.0），0.3mL浓度1M的氯化钾溶液及6uL浓度100uM的T8 DNA溶液，混均，在90 ℃水浴锅中加热5～10min，缓慢冷却至室温，在室温中培养12～18小时。
阳性对照：T4 DNA（5’-（TTAGGG）4TT-3’）形成的单体DNA G-四链体。
（4）二重复单元DNA G-四链体-血红素DNA过氧化物酶的制备
在步骤（3）中的EP管中加入12uL浓度100uM的血红素，轻轻摇晃混均（不可超声混均），放置3h。
阳性对照：单体DNA G-四链体- 血红素 DNA过氧化物酶。
该二重复单元DNA G-四链体- 血红素 DNA过氧化物酶对血红素催化活性的增强幅度大约是单体DNA G-四链体- 血红素 DNA过氧化物酶的二倍。
二重复单元DNA G-四链体-血红素 DNA过氧化物酶应用于药物传感器设计，比较四甲基代二氨基三苯甲基盐酸盐(MG)、槲皮素、木犀草素三种不同配体与二重复单元DNA G-四链体作用的能力大小，其操作方法如下：
（1）0.60mg槲皮素、0.57mg木犀草素溶于10ml甲醇中制备成200uM的溶液，3.6mg MG溶于100ml去子水中制备成100uM的溶液，4 ℃保存，并在1个月内使用。ABTS二铵盐，-20 ℃保存，使用前用去离子水配制成100mM的溶液。过氧化氢溶液，4℃保存，使用前用去离子水配制成1M的储存液。
（2）按实施例1中的步骤制备二重复单元DNA G-四链体-血红素DNA过氧化物酶。
（3）在4个装有等摩尔量的二重复单元DNA G-四链体-血红素 DNA过氧化物酶的离心管中分别加入4倍DNA浓度的配体溶液，放置3h，以使配体与DNA过氧化物酶充分反应，三种化合物分别对DNA过氧化物酶催化活性的影响如表1-1。
表1-1三种化合物分别对DNA过氧化物酶催化活性的影响
在室温下，用酶标仪检测每个离心管中二重复单元DNA G-四链体-血红素DNA过氧化物酶催化ABTS（2，2-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐）的活力。在每个样品测试前加入新鲜配制60uL浓度100mM的ABTS并混均，取6uL浓度1M的过氧化氢溶液滴在酶标仪样品板的中心，然后加入含有ABTS的溶液，波长设置在421nm，检测时间范围为0～30s。
分析图1的CD光谱图可见，T4 DNA在波长大约295nm处有一个正峰，265nm处有一个肩峰，240nm处有一个负峰，这显示了杂2型单体DNA G-四链体的特征。T8 DNA大约290nm处有一个正峰，250nm处有一个小的肩峰，268nm处有一个大的肩峰，240nm处有一个负峰，并且特征峰的强度与连续2个G-四链体单元的峰强度之和一致，这显示了混合型（杂1型和杂2型）二重复单元DNA G-四链体的特征。
分析图2的紫外光谱图可见，在Hemin（血红素）中加入单体DNA G-四链体，血红素的催化活性明显增强，而在血红素中加入二重复单元DNA G-四链体，血红素的催化活性增强幅度更加明显，对血红素催化活性的增强幅度大约是单体DNA G-四链体的2倍，证明了二重复单元DNA G-四链体-Hemin DNA过氧化物酶极高的催化活性。
分析图3可见，分别加入四甲基代二氨基三苯甲基盐酸盐（MG）、槲皮素、木犀草素三种化合物30秒后，二重复单元DNA G-四链体-Hemin(血红素)DNA过氧化物酶的催化活性均降低，其中活性降低幅度最大的是MG，其次是槲皮素，这说明MG与二重复单元DNA G-四链体结合能力最强，三种化合物与二重复单元DNA G-四链体结合能力的大小为MG＞ 槲皮素＞木犀草素。
Claims (3)
1.一种DNA过氧化物酶，其特征是：其分子结构如下述通式(Ⅰ)：
(Ⅰ)。
2. 一种制备权利要求1所述DNA过氧化物酶的方法，其特征是包括下列步骤：
（1）试剂和缓冲液
血红素溶解于二甲基亚砜中制备成血红素溶液，2～8℃保存；
用去离子水配制氯化钾溶液；
用去离子水配制PH值为7.0～8.0Tris-HCl缓冲液；
（2）T8 DNA的预处理
固体样品T8 DNA在4 ℃经离心机以12000 r·min-1高速离心5～10 min，并在－20℃保存，使用前用去离子水配制成T8 DNA溶液，4℃保存，3天内使用；
（3）二重复单元DNA G-四链体的制备
取步骤（2）配制的T8 DNA溶液放入到5ml 离心管中，加入步骤（1）配制的氯化钾溶液、Tris-HCl缓冲溶液，使T8 DNA 处于含KCl浓度100mM、含Tris-HCl浓度25mM 、pH值为7.0～8.0的溶液中，混均，在90℃水浴锅中加热5～10min，缓慢冷却至室温；
（4）二重复单元DNA G-四链体-血红素 DNA过氧化物酶的制备
在步骤（3）的离心管中加入步骤（1）配制的血红素溶液，轻轻摇晃使其混均，静置2～3h。
3.一种如权利要求1所述DNA过氧化物酶，其特征是：作为大批量筛选多重复单元DNA G-四链体稳定剂类抗癌药物及高灵敏度的分析检测不同类型靶分子的应用。
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