CN103804590A

CN103804590A - 一种dna水凝胶及其在过氧化物检测中的应用

Info

Publication number: CN103804590A
Application number: CN201310711003.1A
Authority: CN
Inventors: 刘明哲; 赵海旭; 张红利; 蒋钢锋; 张辉
Original assignee: SHENYANG PHARMACEUTICAL UNIVERSITY (BENXI) MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: SHENYANG PHARMACEUTICAL UNIVERSITY (BENXI) MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2033-12-19
Also published as: CN103804590B

Abstract

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种DNA水凝胶及其在过氧化氢检测中的应用，具体涉及高分子材料DNA水凝胶在肉眼检测过氧化物中的应用。该水凝胶是以具有过氧化酶活性的DNAzyme作为交联剂，聚丙烯酰胺为骨架的新型DNA水凝胶。其结构由下述含有DNA的聚丙烯酰胺高分子，T-DNAzyme-T，及血红素通过分子间作用力结合形成。本发明的凝胶呈现凝胶态，能够用于过氧化物肉眼检测。具有操作简便，可肉眼半定量检测，材料可重复利用等优点。

Description

一种DNA水凝胶及其在过氧化物检测中的应用

技术领域：

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种DNA水凝胶及其在过氧化氢检测中的应用，具体涉及高分子材料DNA水凝胶在肉眼检测过氧化物中的应用。

背景技术：

DNA水凝胶分为纯DNA水凝胶和DNA与人造高分子杂化的DNA水凝胶。本发明仅涉及后者。后者是一种将DNA嵌入到高分子水凝胶中并兼具水凝胶和DNA的特点的功能型的智能水凝胶。

DNA酶（以下简称DNAzyme）是一种具有催化活性的DNA分子，目前在药学，生物学和材料学领域受到广泛研究。本发明所涉及的是具有模拟过氧化酶活性的DNAzyme。这种DNAzyme的寡核苷酸链可自身折叠或分子间以四聚体形式结合形成G四链体的结构。形成G四链体的结构后通过结合血红素（hemin）分子，显示过氧化酶活性，从而催化过氧化酶底物。这种DNAzyme与过氧化蛋白酶相比具有价格低廉，热稳定性好，可重复利用，易于进行分子加工和修饰，可操作性强等优点。

目前检测过氧化物的方法主要有荧光法，化学发光法，高效液相色谱法，电子顺磁共振法和基于酶传感的电化学方法等。但是这些方法都需要借助相应的仪器设备实施，使用起来不便。市场上销售的过氧化氢检测试纸则具有无法重复使用的缺陷。

发明内容：

本发明所解决的技术问题是提供一种可应用于肉眼半定量检测过氧化物的DNA水凝胶。该水凝胶不仅具有可加工性，而且可重复使用。该水凝胶是以具有过氧化酶活性的DNAzyme作为交联剂，聚丙烯酰胺为骨架的新型DNA水凝胶。其结构由下述含有DNA的聚丙烯酰胺高分子(图1)，T-DNAzyme-T，及血红素通过分子间作用力(主要包括氢键, 静电引力,疏水性相互作用等)结合形成。其中T-DNAzyme-T的两端或一端的序列可与DNA的序列互补杂交形成氢键。T-DNAzyme-T内部的序列为已报道的可结合血红素分子的具有过氧化酶活性的DNAzyme序列。T-DNAzyme-T与血红素以1 : 1或2 : 1或4 ：1的比例结合。DNA: T-DNAzyme-T可以是2 : 1或1 : 1。水凝胶中丙烯酰胺单体的质量百分比为3 % ～ 20 %。m与n的比为2000 : 1至10 : 1。

本发明采用以下技术方案制备DNA水凝胶：

（一）Acrydite-DNA的合成：

6-氨基-1-己醇和三乙胺混合后冷却到0℃。甲基丙酰胺滴加到反应液中，混合物在0℃下搅拌2 ～ 4小时。反应完之后将溶剂蒸出。残留物溶于乙醇和15 %的氢氧化钠的混合溶液中。溶液反应2 ～ 4小时，得到6-羟己基甲基丙烯酰胺。将6-羟己基甲基丙烯酰胺溶于二氯甲烷（CH₂Cl₂）中，搅拌并缓慢加入N,N’-二异丙基乙胺（DIPEA），反应保持0℃。然后2-羟乙基-二异丙胺-氯代亚磷酰胺缓慢滴加到反应液中，保持0℃反应 3 ～ 6小时。然后将溶剂除去。残留物溶于乙酸乙酯中，并用饱和氯化钠萃取。除去溶剂后，产物用柱层析分离（乙酸乙酯：石油醚=5 : 1）得到无色油状液体，即3-氰乙基-二异丙基-6-甲基丙烯酰胺基亚磷酰胺（Acrydite）。通过DNA合成仪将Acrydite接入到DNA的5’端，得到Acrydite-DNA。

（二）以DNAzyme为交联剂的聚丙烯酰胺水凝胶的制备

首先，将T-DNAzyme-T加入到离心管中，加入缓冲液A（50mM 吗啉乙磺酸；100mM Tris-醋酸；40mM 醋酸钾；1% N,N-二甲基亚砜；0.05% 曲拉通X-100，PH 6.5），经变性退火形成G-四链体，加入血红素，并混匀，形成G-四链体-血红素复合物。该复合物具有过氧化酶活性，即DNAzyme。其次，将丙烯酰胺和Acrydite-DNA混合，加入过硫酸铵（APS）和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）聚合形成含有DNA序列的DNA聚丙烯酰胺链。最后 DNAzyme与该DNA聚丙烯酰胺链通过DNA互补序列分子杂交交联形成DNA水凝胶。

利用本发明制得的DNA水凝胶如图3所示。从图3照片可以看出，该方法得到的凝胶呈现凝胶态（图3a），与未添加DNAzyme的DNA聚丙烯酰胺链溶液（图3b）有明显区别。图3a中水凝胶的颜色来源于血红素。

所述的DNA序列为：　　

DNA: 5’-AAA AAA AAA AAA AAA A-3’

Acrydite-DNA: 5’-Acrydite- AAA AAA AAA AAA AAA A-3’

T-DNAzyme-T: 5’-TTT TTT TTT TTT TTT AGG TGG GGA GGA GCG GGG TGC TTT TTT TTT TTT TTT-3’

上述DNA和Acrydite-DNA及T-DNAzyme-T的序列的种类不限于5’-AAA AAA AAA AAA AAA A-3’，只要满足DNA和Acrydite-DNA中下划线部分的序列和T-DNAzyme-T中的下划线部分的序列全部或部分互补即可。互补的碱基数大于5小于80为宜。T-DNAzyme-T中加粗部分的序列（AGG TGG GGA GGA GCG GGG TGC）为具有过氧化酶活性的序列。T-DNAzyme-T中加粗部分的序列不限于上述含有AGG TGG GGA GGA GCG GGG TGC的序列，可以用含有下述或不限于下述的已报道的具有过氧化酶活性的序列代替。如：

PS2.M： 5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’

EAD： 5’-CTGGGTGGGTGGGTGGGA-3’

c-Myc： 5’- TGAGGGTGGGGAGGGTGGGG4AA-3’

本发明还提供了利用所制得的DNA水凝胶进行过氧化物肉眼检测的新方法。该方法具有操作简便，可肉眼半定量检测，材料可重复利用等优点。

本发明利用DNA水凝胶通过如下方法检测过氧化物：

过氧化氢的测定：

取40 μL 的缓冲液A（通常为含有醋酸钾，表面活性剂，二甲基亚砜成分的pH在6 ～ 7范围内的马林磺酸溶液，如：50mM 吗啉乙磺酸；100mM Tris-醋酸；40mM 醋酸钾；1% N,N-二甲基亚砜；0.05% 曲拉通X-100，PH 6.5）于离心管中，再依次加入约1 μL体积的 DNA水凝胶，150 μL的含有过氧化氢，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的缓冲液B（通常为含有磷酸氢二钠，氯化钾的pH在4 ～ 5范围内的柠檬酸缓冲液），混匀，开始反应。观察水凝胶颜色变化，并用数码相机拍摄照片。对照反应分别是具有相同浓度的过氧化氢的DNAzyme-血红素溶液和血红素溶液，随着时间的进行对比颜色变化。DNA水凝胶催化过氧化氢的同时氧化过氧化氢酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB），TMB被氧化后会显蓝绿色。

从图4a可以看出，离心管中的凝胶块儿呈明显的蓝绿色，而同浓度的过氧化氢的DNAzyme-血红素溶液和血红素溶液则没有颜色变化（图4b, 4c）。

过氧化苯甲酰的测定：

方法步骤及使用试剂与过氧化氢的测定方法相同。结果表明本发明同样适用于过氧化苯甲酰的测定。

过氧化叔丁醇的测定：

方法步骤及使用试剂与过氧化氢的测定方法相同。结果表明本发明同样适用于过氧化叔丁醇的测定。

本发明中的DNA水凝胶的可检测对象不限于过氧化氢，还包括过氧化苯甲酰，过氧化叔丁醇等更加广泛的过氧化物。

DNA水凝胶酶动力学测定：

取前述缓冲液A分别加入到五个的离心管中，再依次加入DNA水凝胶，不同浓度的过氧化氢溶液，相同浓度的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液(组成同缓冲液B)，混匀，反应开始分别取凝胶外的溶液来测UV/VIS 652nm处的波长，制得图5。根据图5计算得到以凝胶外析出的TMB氧化产物的浓度上升速率为催化速度的DNA水凝胶的表观酶动力学变量为K_m = 3.06mM，K_cat = 0.09s^-1，从而证明了DNA水凝胶具有模拟过氧化酶特性。

由上述技术方案可知，本发明所述的DNA水凝胶可用于肉眼检测过氧化氢。

本发明的技术效果在于：本发明的DNA水凝胶呈现固体凝胶状，本身具有过氧化酶的活性，可催化过氧化物，并具有很好的灵敏度。利用本方法可肉眼测定过氧化物的范围为0.01 ～ 100 mg/L。按实施例五中所述方法测得过氧化氢的肉眼检测范围为0.01mg/L ～ 50 mg/L；过氧化苯甲酰的肉眼检范围为0.1 mg/L ～ 100 mg/L；过氧化叔丁醇的肉眼检测范围为0.05 mg/L ～ 100 mg/L。检测使用DNA水凝胶体积小，检测简便，灵敏度高，可重复利用。

附图说明：

图1 为含有DNA的聚丙烯酰胺高分子及结构。

图2为3-氰乙基-二异丙基-6-甲基丙烯酰胺基亚磷酰胺（Acrydite）的合成路线图。

图3为本发明的DNA水凝胶照片：

图3a为DNA水凝胶；图3b为未添加DNAzyme的DNA聚丙烯酰胺链溶液。

图4为本发明的DNA水凝胶的催化活性比较：反应的溶液中TMB的浓度为1mM，过氧化氢的浓度为2 mg/L。

图4a为DNA水凝胶反应液，图4b为G四链体-血红素反应液，图4c为血红素反应液。

图5为本DNA水凝胶的酶动力学L-B图。

图中横轴表示过氧化氢浓度的倒数。纵轴表示TMB氧化速度的倒数。

具体实施方案：

实施例1：

Acrydite-DNA的合成步骤如下：

1）6-羟己基甲基丙烯酰胺的合成：

6-氨基-1-己醇（1g，8.53mmol）加入到20ml乙腈中，溶液冷却到0℃。将三乙胺（2.36mL，17mmol）滴加到反应液中，不断搅拌5min。甲基丙烯酰氯（2.67g，2.55mmol 2）缓慢的滴加到溶液中，混合物在0℃下反应2h。反应过程中通过点TLC确认反应进度（乙酸乙酯：石油醚=5 : 1），反应完毕后，将溶剂除去，剩余物质用饱和NaHCO₃和饱和NaCl洗涤，得到产物3，产率80%。萃取物溶解于10ml 乙醇和15%NaOH（4mL）。反应液搅拌1h，通过点TLC确认反应进度（乙酸乙酯：石油醚 = 5 : 1），反应完毕后将溶剂除掉，产物用饱和NaHCO₃和饱和NaCl溶液洗涤，并通过硅胶柱层析分离（乙酸乙酯：石油醚 = 5 : 1）得到产物，产率75%。1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ5.91（s, 1H）5.89 (s, 1H), 5.31 (s, 1H) , 3.64 (m, 2H), 3.63 (m, 2H), 1.95 (s, 3H), 1.68-1.52 (m, 4H) 1.47-1.30 (m, 4H) 。

2）Acrydite-DNA的合成：

将6-羟己基甲基丙烯酰胺（0.50g，2.70mmol）加入到无水CH₂Cl₂(10ml)中，反应液在Ar环境下，并降温到0℃，N,N’-二异丙基乙胺（DIPEA）（0.98g，7.5mmol）用注射器缓慢的添加到反应中，并在0℃搅拌5min。然后，2-氰己基二异丙基氯代亚磷酰胺（0.87ml，3.25mmol）缓慢滴加到溶液中，混合物在0℃下反应2h。通过点TLC板（rf=0.3，乙酸乙酯：石油醚：三乙胺=40:60:3）确认反应进度。反应完毕后，将溶剂除去，残留液用饱和NaCl洗涤，产物用柱层析（乙酸乙酯：石油醚：三乙胺=40:60:3）分离得到纯品，将产物在真空条件下干燥10h除去产品中的水和其他溶剂，得到无色油状物质，即，3-氰乙基-二异丙基-6-甲基丙烯酰胺基亚磷酰胺（Acrydite）（图2）。产率50%。1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 5.91 (s, 1H), 5.31 (s, 1H), 5.30 (s. 1H), 3.80-3.75 (m, 2H), 3.70-3.50 (m, 4H), 3.35-3.25 (m, 2H), 2.65 (t, 2H), 1.95 (m, 3H), 1.68-1.52 (m, 4H) 1.47-1.30 (m, 4H) 1.22-1.15 (m, 12H)。

通过DNA合成仪将Acrydite接入到DNA的5’端，得到富含脱氧腺苷(A)的Acrydite-DNA（序列：Acrydite-AAA AAA AAA AAA AAA A）。

实施例2

以DNA为交联剂的聚丙烯酰胺水凝胶的制备步骤如下：

1）配制含有DNA序列的聚丙烯酰胺链步骤

将3 μL 25%的丙烯酰胺和4.5 μL 4mM acrydite-DNA加入到100mM HEPES缓冲液，然后分别加入2% 过硫酸铵（APS）和2% N,N,N’,N’-四甲基联苯胺（TEMED），混匀后真空条件下反应15min，得到含有DNA的聚丙酰胺链。

2）DNAzyme的配制步骤：

取4mM T-DNAzyme-T 1.8μL放到200μL的离心管中，加入缓冲液A (50 mM 吗啉乙磺酸 (MES) pH 6.5; 100 mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸盐缓冲液pH 6.5; 40 mM 醋酸钾; 1%DMSO; 0.05%Triton X-100)。混合物在95℃ 5min，然后缓慢冷却到室温，约1h，使其形成DNA四链体结构。加入0.6 mM 血红素 1.5μL，将其混匀，形成DNAzyme。

3）DNA水凝胶的制备：

将已经形成DNAzyme的交联剂4.5 μL加入到10.5 μL含有DNA的聚丙烯酰胺链的溶液中，混匀并反应20min后得到DNA水凝胶。

测试结果见图3所示，从图3可以看到凝胶的形态是一种凝胶态（图3a），明显的区别于溶液态（图3b）。

实施例3：

利用DNA水凝胶检测过氧化物的步骤如下:

过氧化氢的测定：

取40 μL 的缓冲液A于离心管中，再依次加入约1 μL体积的 DNA水凝胶和150μL的含有过氧化氢， 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的缓冲溶液B（0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH 4.4），混匀，开始反应。观察水凝胶的颜色变化，并在50min后照相记录结果。作为对照试验，预先分别配置40 μL 的DNAzyme-血红素和血红素溶液（组成同缓冲液A），再加入150μL的含有过氧化氢（最终浓度为2 mg/L）， 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的缓冲溶液B，混匀，开始反应，观察溶液颜色变化。

测试结果见图4所示，从图4可以看到，DNA水凝胶催化过氧化氢氧化过氧化酶底物TMB的反应具有显色现象，而含有同浓度过氧化氢的DNA-血红素和血红素溶液则无颜色变化。

过氧化苯甲酰的测定：

方法步骤及使用试剂与过氧化氢的测定相同。所使用过氧化苯甲酰的最终浓度为8 mg/L。

过氧化叔丁醇的测定：

方法步骤及使用试剂与过氧化氢的测定相同。所使用过氧化叔丁醇的最终浓度为4 mg/L。

实施例4：

DNA水凝胶酶动力学测定步骤如下：

实施例4中测定DNA水凝胶的反应酶动力学，需要5组反应。配制TMB溶液，过氧化氢溶液，working solution过程和操作均与实施例3的方法相同，过氧化氢的最终浓度为0.08,0.16,0.4,0.8,1.8mM，反应为20min，间隔5min测定凝胶外溶液的紫外曲线在652nm处的吸光度值。

测试结果见图5所示。根据图5计算得到以凝胶外析出的TMB氧化产物的浓度上升速率为催化速度的DNA水凝胶的表观酶动力学变量为K_m = 3.06mM，K_cat = 0.09s^-1。

Claims

1.一种DNA水凝胶，其特征在于：由含有DNA的聚丙烯酰胺高分子，T-DNAzyme-T，及血红素通过分子间作用力结合形成

含有DNA的聚丙烯酰胺高分子。

2.根据权利要求1所述的DNA水凝胶，其特征在于：T-DNAzyme-T与血红素的比例为1 : 1或2 : 1或4 ：1，DNA: T-DNAzyme-T为2 : 1或1 : 1。

3.根据权利要求1所述的DNA水凝胶，其特征在于，含有DNA的聚丙烯酰胺高分子中，m与n的比为2000 : 1至10 : 1；水凝胶中丙烯酰胺单体的质量百分比为3 % ～ 20 。

4.如权利要求1所述的DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）Acrydite-DNA的合成；

6-氨基-1-己醇和三乙胺混合后冷却，甲基丙酰胺滴加到反应液中，混合物反应得到6-羟己基甲基丙烯酰胺；将6-羟己基甲基丙烯酰胺溶于二氯甲烷中，搅拌并缓慢加入N,N’-二异丙基乙胺，反应，然后2-羟乙基-二异丙胺-氯代亚磷酰胺缓慢滴加到反应液中，反应，然后将溶剂除去，残留物溶于乙酸乙酯中，并用饱和氯化钠萃取，除去溶剂后产物用柱层析分离得到无色油状液体Acrydite，通过DNA合成仪将Acrydite接入到DNA的5’端，得到Acrydite-DNA；

（2）以DNAzyme为交联剂的聚丙烯酰胺水凝胶的制备；

将T-DNAzyme-T经变性退火形成G-四链体，加入血红素，并混匀，形成G-四链体-血红素复合物；将丙烯酰胺和Acrydite-DNA混合，加入过硫酸铵（APS）和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）聚合形成含有DNA序列的DNA聚丙烯酰胺链；

最后 DNAzyme与该DNA聚丙烯酰胺链通过DNA互补序列分子杂交交联形成DNA水凝胶。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于， T-DNAzyme-T中的部分序列与前述DNA的序列互补配对，起到交联剂的作用。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的T-DNAzyme-T中的部分序列与血红素结合并显示过氧化酶活性。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，DNA和Acrydite-DNA的序列和T-DNAzyme-T中的序列之间互补的碱基数大于5小于80。

8.权利要求1所述的DNA水凝胶在过氧化物检测中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，取适量含有醋酸钾，表面活性剂，二甲基亚砜成分的的马林磺酸溶液，加入过氧化物样品，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺被氧化后显蓝绿色。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所使用的显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的衍生物或其他氧化后显色的物质，优选 2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)。