CN111298836A - 一种基于生物模拟酶信号放大的dna水凝胶及其应用 - Google Patents

一种基于生物模拟酶信号放大的dna水凝胶及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111298836A
CN111298836A CN202010151505.3A CN202010151505A CN111298836A CN 111298836 A CN111298836 A CN 111298836A CN 202010151505 A CN202010151505 A CN 202010151505A CN 111298836 A CN111298836 A CN 111298836A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
short
chain dna
chain
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010151505.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111298836B (zh
Inventor
高志贤
李双
白家磊
彭媛
宁保安
王江
韩殿鹏
任汉林
韩铁
伍翩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Original Assignee
Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences filed Critical Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Priority to CN202010151505.3A priority Critical patent/CN111298836B/zh
Publication of CN111298836A publication Critical patent/CN111298836A/zh
Priority to AU2020101877A priority patent/AU2020101877A4/en
Application granted granted Critical
Publication of CN111298836B publication Critical patent/CN111298836B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/02—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides
    • B01J31/06—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides containing polymers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶及其在微囊藻毒素‑LR中检测中的应用，运用DNA水凝胶包覆层包被具有过氧化物酶活性的生物模拟酶，在构建该水凝胶包覆层时，运用与微囊藻毒素‑LR的适配体作为交联桥。借此，当DNA水凝胶遇到微囊藻毒素‑LR时该DNA水凝胶结构中的交联桥结构发生改变，使DNA水凝胶崩解而将生物模拟酶释放出来，生物模拟酶可催化显色反应，再结合运用比色检测手段测出微囊藻毒素‑LR的浓度或含量。相比传统的高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法、液相色谱‑串联质谱法等检测方法，本发明具有成本低、检测快、配套检测设备便携性好等优点。

Description

一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶及其应用
技术领域
本发明属于水环境监测技术领域，具体涉及一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶及其在微囊藻毒素-LR中检测中的应用。
背景技术
水体富营养化导致世界各地的河流和湖泊蓝藻水华越来越频繁。由鱼腥藻、束丝藻、拟柱胞藻、节球藻等蓝藻产生并释放的微囊藻毒素(MCs)受到广泛关注。MCs是一类具有生物活性的环状七肽化合物，在环境中能稳定存在，其中又以微囊藻毒素-LR(缩写：MC-LR)的含量最为丰富(约占天然水体中MCs总浓度的99.8％)，毒性最强，已严重威胁水体生态安全和人类健康。大量研究表明，即使在长期低水平暴露的情况下，MC-LR暴露与肝癌的发生高度相关。MC-LR可抑制蛋白磷酸酶活性，影响miRNA表达的调节，损害肾脏、皮肤和生殖系统。此外，最近的研究发现MC-LR还有神经毒性，MC-LR的暴露可引起血脑屏障破坏、记忆缺陷和阿尔茨海默病样症状。MC-LR污染在世界各地均有报道。如1996年，巴西116名患者在接受血液透析治疗时，由于使用了MCs污染的水而中毒，导致52人死亡；我国黄河流域南，约有70％的湖泊沟塘频繁发生水华，其中约80％含有MCs，在太湖、巢湖、滇池等重要大型淡水湖泊均检测到MCs。世界卫生组织(WHO)推荐饮用水中MC-LR的限值为1.0μg/L。此外，MC-LR还能通过食物链作用在水产品中富集，给食品安全带来潜在危害。因此，开发一种简单、灵敏、快速、可靠的分析方法实现对MC-LR进行痕量监测，在环境安全、食品安全与人类健康领域具有重要的意义和必要性。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶及其在微囊藻毒素-LR中检测中的应用，运用DNA水凝胶包被生物模拟酶，在该DNA水凝胶遇到微囊藻毒素-LR时该DNA水凝胶结构中的交联桥结构发生改变，使DNA水凝胶崩解而将生物模拟酶释放出来，生物模拟酶可催化显色反应，再结合运用比色检测手段测出微囊藻毒素-LR的浓度或含量。相比传统的高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法、液相色谱-串联质谱法等检测方法，本发明具有成本低、检测快、配套仪器便携性好等优点。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一方面，本发明提供一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其包含：水凝胶包覆层和被包覆在该水凝胶包覆层内部的生物模拟酶；
所述生物模拟酶为由贵金属或过渡金属复合的具有过氧化物酶活性的生物模拟酶；
所述水凝胶包覆层包含直链聚合物骨架、第一短链DNA、第二短链DNA和MC-LR适配体；所述第一短链DNA、第二短链DNA分别为按照所述MC-LR适配体的碱基序列并依据碱基互补配对原则所设计，使其分别能够与所述MC-LR适配体的部分碱基产生互补配对；
其中，所述第一短链DNA接枝在所述直链聚合物骨架形成含DNA的第一骨架，所述第二短链DNA接枝在所述直链聚合物骨架形成含DNA的第二骨架；借助所述MC-LR适配体作为交联桥，使所述含DNA的第一骨架和所述含DNA的第二骨架产生交联，形成所述水凝胶包覆层。
根据本发明一个较佳实施例，其中：所述生物模拟酶为Au、Pt复合形成的Au/PtTNPs(过氧化物酶)，或者所述生物模拟酶为Cu与Au、Pt复合形成Cu/Au/Pt TNPs(过氧化物酶)。
这些生物模拟酶具有类似天然酶的酶活性，不仅具有类过氧化物酶活性，同时还具有稳定性好、催化性能不易受环境的影响、经济效益低等优点，其可以催化H2O2使TMB(四甲基联苯胺)发生颜色变化的反应。
此外，由贵金属(Au、Pt)或过渡金属(Cu)合成的复合生物模拟酶(Cu/Au/Pt TNPs)相比于单一的金属材料，前者的过氧化物酶(TNPs)的酶活性要明显增强，且稳定性高、成本效益高。
根据本发明一个较佳实施例，其中：所述直链聚合物骨架为直链聚丙烯酰胺骨架、羧甲基纤维素骨架、N-异丙基丙烯酰胺骨架或聚乙烯醇骨架。更优选地，所述直链聚合物骨架为直链聚丙烯酰胺骨架，直链聚丙烯酰胺骨架上含有丰富的活性氨基，易于与带有碱基的短链DNA反应，使短链DNA接枝在其线性骨架上。
根据本发明一个较佳实施例，其中：所述MC-LR适配体的序列为：5’-GGC GCC AAACAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；选择其高亲和区域设计与适配体部分互补的第一短链DNA和第二短链DNA，所述MC-LR适配体的高亲和区域序列为：5’-A TACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3’。
根据本发明一个较佳实施例，其中：所述第一短链DNA的序列为：5’-Acrydite-TTTTTT GGG CAT AAT GAG-3’；所述第二短链DNA的序列为：5’-Acrydite-TTT TTT GTA ATTGTC ATG-3’。
上述第一短链DNA和第二短链DNA的特点在于：既能和MC-LR适配体稳定杂交，又能够保证当MC-LR适配体遇到MC-LR时，MC-LR能够将所述第一短链DNA和第二短链DNA从MC-LR适配体上竞争下来；换句话说，MC-LR与适配体的结合力要优先于第一短链DNA和第二短链DNA，只有这样MC-LR才可以破坏所述DNA水凝胶的交联结构，使DNA水凝胶瓦解将其内部的生物模拟酶TNPs释放出来。
另一方面，本发明还提供一种用于检测微囊藻毒素-LR的试剂组合物，其包含上述任一方案所记载的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶、过氧化物氧化剂和还原性显色剂。
优选地，所述过氧化物氧化剂为H2O2、所述还原性显色剂为四甲基联苯胺(TMB)。优选地，所述试剂组合物还包括缓冲液和浓盐酸。
再一方面，本发明提供一种用于检测微囊藻毒素-LR的方法，所述方法包括步骤：
步骤1：取一定量的上述基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，加入待测的样品溶液，置于30-40℃下孵育0.5-2h；
步骤2：向混合体系中加入双氧水H2O2、显色剂TMB，用缓冲液调节pH至弱酸性，室温下反应后，加入浓盐酸终止反应；
步骤3：采用比色检测方法，进行定量测定。
其中，步骤3可采用紫外-可见分光光度计测特定波长下的吸光度值，依据已知浓度的标准溶液系列绘制标准曲线，进行定量测定。
此外，本发明还提供一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶的制备方法，所述方法包括步骤：
S1:制备具有过氧化物酶活性的生物模拟酶Cu/Au/Pt TNPs：
将可溶性铜盐与络合剂在水中混合，然后加入足量的还原剂，搅拌反应后，再加入适量金酸或金酸盐、以及铂酸或铂酸盐，再次搅拌反应，制得具有过氧化物酶活性的生物模拟酶Cu/Au/Pt TNPs；
S2:准备适配体和第一短链DNA、第二短链DNA：
所述MC-LR适配体的序列为：5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TACCCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；所述第一短链DNA的序列为：5’-Acrydite-TTT TTT GGG CAT AAT GAG-3’；所述第二短链DNA的序列为：5’-Acrydite-TTTTTT GTA ATT GTC ATG-3’；
S3:制备基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，本步骤包括：
S31:将第一短链DNA、第二短链DNA分别溶于缓冲液中，分别得到第一短链DNA的溶液和第二短链DNA的溶液；
S32:准备聚合物单体的溶液，所述聚合物单体能够聚合生成能供DNA接枝连接的直链聚合物；
将第一短链DNA的溶液与聚合物单体的溶液共混，在真空环境下，加入聚合引发剂和催化剂，得到接枝有第一短链DNA的直链聚合物；
将第二短链DNA的溶液与聚合物单体的溶液共混，在真空环境下，加入聚合引发剂和催化剂，得到接枝有第二短链DNA的直链聚合物；
S33:将接枝有第一短链DNA的直链聚合物与接枝有第二短链DNA的直链聚合物混合，加入步骤S1制备的生物模拟酶Cu/Au/Pt TNPs，再加入作为交联桥的适配体溶液，充分混合反应，冷却至室温，得到所述基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶。
优选地，步骤S1中，所述金酸为氯金酸，所述金酸盐为氯金酸盐；所述铂酸为四氯铂酸或六氯铂酸，所述铂酸盐为四氯铂酸盐或六氯铂酸盐。
优选地，步骤S32中，所述聚合物单体的溶液为丙烯酰胺溶液，所述聚合引发剂为过硫酸铵溶液，所述催化剂为N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)溶液。
优选地，步骤S33中，接枝有第一短链DNA的直链聚合物与接枝有第二短链DNA的直链聚合物按照摩尔比1：1混合，混合后加入PBS缓冲溶液，然后加入作为交联桥的适配体溶液，剧烈混合后，在65℃下反应，冷却至室温形成水凝胶。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
(1)、本发明提供的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，运用DNA水凝胶包被生物模拟酶，在该DNA水凝胶遇到MC-LR时，该DNA水凝胶结构中的交联桥(适配体)结合，使适配体二级结构发生改变，从而破坏适配体的交联作用，使DNA水凝胶崩解而将生物模拟酶释放出来，生物模拟酶可催化显色反应，产生肉眼可见的颜色变化。颜色深度与MC-LR的量直接相关，因此可根据溶液最后的颜色实现MC-LR的可视化检测，比如结合运用比色检测手段测出微囊藻毒素-LR的浓度或含量。相比传统的高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法、液相色谱-串联质谱法等检测方法，本发明具有检测成本低、检测快、检测仪器便宜且便携性好等优点。其中比色检测手段可为比色传感器或紫外-可见分光光度计可对MC-LR进行定量检测。
(2)、本发明的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其中包埋的生物模拟酶，具有天然酶活性的生物模拟酶，不仅具有类过氧化物酶活性，同时还具有稳定性好、催化性能不易受环境的影响、经济效益低等优点。生物模拟酶由贵金属(Au、Pt)或过渡金属(Cu)合成的复合生物模拟酶(Cu/Au/Pt TNPs)相比于单一的金属材料，前者的过氧化物酶(TNPs)的酶活性要明显增强，且稳定性高、成本效益高，可以大规模加以生产应用。
本发明利用DNA水凝胶在遭受信号触发时会发生凝胶-溶胶转变或信号控制的刚性变化，将具有过氧化物酶(TNPs)活性的生物模拟酶封装在DNA水凝胶中，通过DNA水凝胶对靶标分子的响应改变凝胶的状态，特异性地释放被包埋的酶，实现可视化信号输出。其中，生物模拟酶的使用可以更加稳定地实现信号放大，由此可用于检测痕量目标物；而水凝胶包覆层不仅保证了信号输出会特异性的随着目标物的浓度/量的变化而发生相应变化，而且能给模拟酶提供一个更加稳定的环境有利于模拟酶长期保持催化活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本检测方法的原理设计图。
图2是互补短链的设计与竞争能力验证。
图3是Cu/Au/Pt-DNA水凝胶对不同浓度MC-LR的响应情况。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明提供一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其包含：水凝胶包覆层和被包覆在该水凝胶包覆层内部的生物模拟酶；
所述生物模拟酶为由贵金属或过渡金属复合的具有过氧化物酶活性的生物模拟酶；
所述水凝胶包覆层包含直链聚合物骨架、第一短链DNA，第二短链DNA和MC-LR适配体；所述第一短链DNA、第二短链DNA分别为按照所述MC-LR适配体的碱基序列并依据碱基互补配对原则所设计，使其分别能够与所述MC-LR适配体的部分碱基产生互补配对；
其中，所述第一短链DNA接枝在所述直链聚合物骨架形成含DNA的第一骨架，所述第二短链DNA接枝在所述直链聚合物骨架形成含DNA的第二骨架；借助所述MC-LR适配体作为交联桥，使所述含DNA的第一骨架和所述含DNA的第二骨架产生交联，形成所述水凝胶包覆层。
其中：所述生物模拟酶为Au、Pt复合形成的具有过氧化物酶活性的Au/Pt，或为Cu与Au、Pt复合形成的具有过氧化物酶活性的Cu/Au/Pt。使用具有过氧化物酶活性的生物模拟酶取代天然TNPs，可提高酶稳定性、催化环境耐受性、降低成本。生物模拟酶TNPs可催化H2O2使TMB(四甲基联苯胺)发生颜色变化的反应。
其中：直链聚合物骨架为直链聚丙烯酰胺骨架、羧甲基纤维素骨架、N-异丙基丙烯酰胺骨架或聚乙烯醇骨架等，这些直链/线状聚合物只要满足易于供短链DNA接枝连接即可。
其中：MC-LR适配体的序列为：5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TACCCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’。在设计第一短链DNA和第二短链DNA时，需要保证设计出来的第一短链DNA和第二短链DNA既能够和适配体稳定杂交，又能够保证其结合能力弱于MC-LR与适配体的结合能力，使制得的DNA水凝胶在遇到MC-LR时，MC-LR能够与适配体结合，使适配体与第一短链DNA和第二短链DNA断开，导致水凝胶的结构瓦解，将包埋的生物模拟酶TNPs释放出来。
如图1所示，为本发明开发的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶应用在MC-LR检测的原理图。
以MC-LR的适配体作为DNA水凝胶的交联桥，根据碱基互补配对原则设计与适配体部分互补的两条DNA短链(SA、SB)，两条短链DNA(SA、SB)分别被枝接在直链聚丙烯酰胺骨架上形成P-SA和P-SB，当加入适配体之后，P-SA和P-SB分别与适配体杂交，形成含DNA的水凝胶包覆层，该包覆层可将具有过氧化物酶活性的生物模拟酶Cu/Au/Pt包覆在内部。当这种结构体系的水凝胶遇到MC-LR时，MC-LR与适配体结合(将适配体从DNA短链SA、SB上竞争下来)，使适配体二级结构发生改变，从而破坏适配体与短链DNA(SA、SB)的杂交，导致交联结构被破坏、导致水凝胶结构瓦解(与适配体已结合的MC-LR失去破坏能力)，释放包埋的生物模拟酶Cu/Au/Pt TNPs。随后，Cu/Au/Pt TNPs催化H2O2氧化TMB，TMB被氧化后产生肉眼可见的颜色变化，且最终呈现的颜色与MC-LR的量直接相关，MC-LR越多，被其瓦解的水凝胶结构越多，释放的生物模拟酶也越多，因此可根据溶液最后的颜色实现MC-LR的可视化检测，如采用紫外-可见分光光度计可对MC-LR进行定量检测。
以下结合本发明的具体实施例进行说明。
实施例1
本实施例制备一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其中的生物模拟酶为具有过氧化物酶活性的Cu/Au/Pt，外部的水凝胶包覆层使用的直链聚合物骨架为直链聚丙烯酰胺骨架。以下是本实施例DNA水凝胶的制备方法：
步骤一：Cu/Au/Pt TNPs的制备方法：
采用“一锅法”合成了具有过氧化物酶活性的Cu/Au/Pt TNPs生物模拟酶。将12μLCuSO4﹒5H2O(0.1mol/L)与25μL柠檬酸三钠(0.1mol/L)加入到10mL超纯水中，混匀后再加入500μL KBH4(25mmol/L)，搅拌15min后，将25μL HAuCl4(0.1mol/L)和25μL K2PtCl4(0.1mol/L)分别滴加到上述混合液中，搅拌20min后即可获得Cu/Au/Pt TNPs。
步骤二：第一短链DNA和第二短链DNA的设计
设计原则包括①-②：
①第一短链DNA、第二短链DNA分别为按照所述MC-LR适配体的碱基序列并依据碱基互补配对原则所设计，使其分别能够与所述MC-LR适配体的部分碱基产生互补配对。
②设计的第一短链DNA(命名为SA)、第二短链DNA(命名为SB)既要满足能和适配体稳定杂交，又要满足MC-LR能成功将SA、SB从适配体上竞争下来(参见后续对此进行的验证)。
根据以上原则，在NUPACK网站上，按照MC-LR适配体的高亲和区域(5’-ATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3’)碱基序列，最终设计得到如下序列的短链DNA(SA、SB)：
Figure BDA0002402598480000091
步骤三：基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶的制备：
Cu/Au/Pt-DNA水凝胶制备方法分为两个步骤：
(1)将第一短链DNA(SA)、第二短链DNA(SB)分别溶解于PBS(pH＝7.4)缓冲液中，配制成终浓度为300μmol/L的储备液。
分别配制25％的丙烯酰胺溶液、10％的过硫酸铵(APS)和5％的N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)溶液。其中过硫酸铵为聚合引发剂，TEMED作为聚合反应催化剂。
将5μL的SA(300μmol/L)与2.4μL丙烯酰胺(25％)剧烈混合后，在真空干燥箱中真空反应10min，加入2.1μL的过硫酸铵(10％)、和4.2μL的TEMED(5％)及1.3μL的PBS(pH＝7.4)，剧烈混合真空反应15min后，得到接枝了SA的线状(直链)高分子聚合产物P-SA。采用同样的方法制得接枝了SB的线状(直链)高分子聚合产物P-SB。
(2)将P-SA，P-SB按1：1的比例混合，加入PBS(pH＝7.4)缓冲溶液，再加入4μLCu/Au/Pt TNPs，再加入作为交联桥的适配体溶液(2μL35μmol/L)，剧烈混合后，在65℃下反应5min，重复一次该剧烈混合并在65℃下反应5min的过程，冷却至室温形成水凝胶，即基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶。
实施例2
在本实施例中，对实施例1中设计得到第一短链DNA(SA)和第二短链DNA(SB)与适配体的结合竞争力是否满足设计原则中的第①-②点进行验证。验证方法如下：
(1)样品准备：
Figure BDA0002402598480000101
注：加入MC-LR之前，先将混合物95℃变性5min，冷却至室温后4℃放置20min，加入MC-LR后，37℃孵育40min后置于-20℃冰箱保存，待测样。
(2)分别取上表中的样品200μL于比色皿中，上圆二色谱仪进行测定。圆二色谱仪器参数设置如下：测定波长范围：200-350nm，扫描速度100nm/min，响应时间4s，带宽2.0nm，扫描模式：连续。基线校正：PBS溶液。
(3)数据分析：
将得到的圆二原始数据导入origin作图，结果如图2所示。
由图2所示，其纵坐标为圆二色光谱，由图2可知：
①MC-LR的Apt在280nm和245nm处有明显的正负峰形，与基线的交轴约在260nm处，为标准的B型DNA。
②当加入与Apt互补的SA和SB后，Apt的峰在280nm处的正峰发生红移，在245nm处的负峰发生蓝移，基本也是B型DNA，但峰形明显减小，说明Apt与SA、SB结合且使Apt的二级结构发生了变化。
③当在Apt+SA+SB的复合体系中加入MC-LR后，相比于Apt+SA+SB的峰形，其峰形明显变高，其原因为MC-LR与Apt结合，使原本杂交在Apt上的SA、SB互补链脱落，Apt恢复其原有构型，同时由于游离SA、SB的存在，使其峰形高于Apt的峰形。
由此说明，所涉及的短链DNA(SA、SB)符合预先的设计要求。
实施例3
本实施例是将实施例1制备的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶用于水体中MC-LR的定量检测，检测方法为：
取实施例1制备的Cu/Au/Pt-DNA水凝胶10μL于1.5mL一次性离心管中，加入待测的样品溶液(含MC-LR)，置于37℃下孵育40min后。在混合体系中加入198μL H2O(pH＝3)，以及终浓度分别为26.64mmol/L的TMB和48mmol/L的H2O2，室温下反应后，加入浓盐酸终止反应。采用紫外-可见分光光度计测量特定波长(最优为452nm)下的吸光度值。
依据已知MC-LR浓度的标准溶液系列，分别按照前述方法，测取452nm波长的吸光度值，绘制浓度-吸光度标准曲线，进行定量测定。
如图3所示，选择浓度为0.00μg/L、0.04μg/L、0.40μg/L、4.00μg/L的样品溶液，按照上述方法，测定样品溶液在波长为350nm-550nm时的吸光度曲线，确定最大吸光度的波长为452nm。分光光度计定量测量技术为目前熟知的常规技术，故在此不再赘述。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其特征在于，其包含：水凝胶包覆层和被包覆在该水凝胶包覆层内部的生物模拟酶；
所述生物模拟酶为由贵金属或过渡金属复合的具有过氧化物酶活性的生物模拟酶；
所述水凝胶包覆层包含直链聚合物骨架、第一短链DNA、第二短链DNA和MC-LR适配体；所述第一短链DNA、第二短链DNA分别为按照所述MC-LR适配体的碱基序列并依据碱基互补配对原则所设计，使其分别能够与所述MC-LR适配体的部分碱基产生互补配对；
其中，所述第一短链DNA接枝在所述直链聚合物骨架形成含DNA的第一骨架，所述第二短链DNA接枝在所述直链聚合物骨架形成含DNA的第二骨架；借助所述MC-LR适配体作为交联桥，使所述含DNA的第一骨架和所述含DNA的第二骨架产生交联，形成所述水凝胶包覆层。
2.根据权利要求1所述的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其特征在于，所述生物模拟酶为Au、Pt复合形成的Au/Pt TNPs，或者所述生物模拟酶为Cu与Au、Pt复合形成Cu/Au/Pt TNPs。
3.根据权利要求1所述的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其特征在于，所述直链聚合物骨架为直链聚丙烯酰胺骨架、羧甲基纤维素骨架、N-异丙基丙烯酰胺骨架或聚乙烯醇骨架。
4.根据权利要求1所述的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其特征在于，所述MC-LR适配体的序列为：5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTCATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；选择其高亲和区域设计与适配体部分互补的第一短链DNA和第二短链DNA，所述MC-LR适配体的高亲和区域序列为：5’-ATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3’。
5.根据权利要求4所述的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其特征在于，所述第一短链DNA的序列为：5’-Acrydite-TTT TTT GGG CAT AAT GAG-3’；所述第二短链DNA的序列为：5’-Acrydite-TTT TTT GTA ATT GTC ATG-3’。
6.一种用于检测微囊藻毒素-LR的试剂组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶、过氧化物氧化剂和还原性显色剂。
7.根据权利要求6所述的试剂组合物，其特征在于，所述过氧化物氧化剂为H2O2、所述还原性显色剂为四甲基联苯胺TMB。
8.一种用于检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
步骤1：取一定量的权利要求1-5任一项所述的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，加入待测的样品溶液，置于30-40℃下孵育0.5-2h；
步骤2：向混合体系中加入双氧水H2O2、显色剂TMB，用缓冲液调节pH至弱酸性，室温下反应后，加入浓盐酸终止反应；
步骤3：采用比色检测方法，进行定量测定。
9.根据权利要求8所述的基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，其特征在于，步骤3采用紫外-可见分光光度计测特定波长下的吸光度值，依据已知浓度的标准溶液系列绘制标准曲线，进行定量测定。
10.一种基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
S1:制备具有过氧化物酶活性的生物模拟酶Cu/Au/Pt TNPs：
将可溶性铜盐与络合剂在水中混合，然后加入足量的还原剂，搅拌反应后，再加入适量金酸或金酸盐、以及适量铂酸或铂酸盐，再次搅拌反应，制得具有过氧化物酶活性的生物模拟酶Cu/Au/Pt TNPs；
S2:准备适配体和第一短链DNA、第二短链DNA：
所述MC-LR适配体的序列为：5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCATAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；所述第一短链DNA的序列为：5’-Acrydite-TTT TTT GGG CAT AAT GAG-3’；所述第二短链DNA的序列为：5’-Acrydite-TTT TTT GTAATT GTC ATG-3’；
S3:制备基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶，本步骤包括：
S31:将第一短链DNA、第二短链DNA分别溶于缓冲液中，分别得到第一短链DNA的溶液和第二短链DNA的溶液；
S32:准备聚合物单体的溶液，所述聚合物单体能够聚合生成能供DNA接枝连接的直链聚合物；
将第一短链DNA的溶液与聚合物单体的溶液共混，在真空环境下，加入聚合引发剂和催化剂，得到接枝有第一短链DNA的直链聚合物；
将第二短链DNA的溶液与聚合物单体的溶液共混，在真空环境下，加入聚合引发剂和催化剂，得到接枝有第二短链DNA的直链聚合物；
S33:将接枝有第一短链DNA的直链聚合物与接枝有第二短链DNA的直链聚合物混合，加入步骤S1制备的生物模拟酶Cu/Au/Pt TNPs，再加入作为交联桥的适配体溶液，充分混合反应，冷却至室温，得到所述基于生物模拟酶信号放大的DNA水凝胶。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述金酸为氯金酸，所述金酸盐为氯金酸盐；所述铂酸为四氯铂酸或六氯铂酸，所述铂酸盐为四氯铂酸盐或六氯铂酸盐。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S32中，所述聚合物单体的溶液为丙烯酰胺溶液，所述聚合引发剂为过硫酸铵溶液，所述催化剂为N,N,N,N-四甲基乙二胺溶液。
CN202010151505.3A 2020-03-06 2020-03-06 一种基于生物模拟酶信号放大的dna水凝胶及其应用 Active CN111298836B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010151505.3A CN111298836B (zh) 2020-03-06 2020-03-06 一种基于生物模拟酶信号放大的dna水凝胶及其应用
AU2020101877A AU2020101877A4 (en) 2020-03-06 2020-08-18 DNA hydrogel based on signal amplification of biomimetic enzymes and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010151505.3A CN111298836B (zh) 2020-03-06 2020-03-06 一种基于生物模拟酶信号放大的dna水凝胶及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111298836A true CN111298836A (zh) 2020-06-19
CN111298836B CN111298836B (zh) 2023-03-31

Family

ID=71156875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010151505.3A Active CN111298836B (zh) 2020-03-06 2020-03-06 一种基于生物模拟酶信号放大的dna水凝胶及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN111298836B (zh)
AU (1) AU2020101877A4 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111793239A (zh) * 2020-07-20 2020-10-20 南开大学 一种具有大孔结构的高强度dna水凝胶的制备方法
CN113267529A (zh) * 2021-05-12 2021-08-17 江西师范大学 一种温度型生物传感器及利用温度型生物传感器检测目标适体的方法
CN113311161A (zh) * 2021-04-14 2021-08-27 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒
CN114236124A (zh) * 2021-12-16 2022-03-25 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112980009B (zh) * 2021-03-16 2022-10-25 华南理工大学 一种纳米复合多孔凝胶支架及其构建方法与应用
CN114414337B (zh) * 2022-01-21 2023-11-10 山东大学 一种基于dna凝胶的铅离子快速检测方法
CN114858791B (zh) * 2022-05-05 2024-05-14 川北医学院 一种裸眼可视化检测硫化氢的方法
CN117599807A (zh) * 2023-11-22 2024-02-27 云南大学 一种基于三金属纳米酶构建比色传感器检测新城疫病毒的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103113877A (zh) * 2013-01-11 2013-05-22 长春理工大学 一种检测水中微囊藻毒素-lr的荧光探针
CN103804590A (zh) * 2013-12-19 2014-05-21 沈阳药科大学 一种dna水凝胶及其在过氧化物检测中的应用
CN103983777A (zh) * 2014-05-07 2014-08-13 大连理工大学 一种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色检测方法
CN105784995A (zh) * 2016-02-25 2016-07-20 厦门大学 Dna智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素b1的方法
CN106370868A (zh) * 2016-09-23 2017-02-01 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的spr传感器及其制备方法和应用
CN106525796A (zh) * 2016-11-08 2017-03-22 北京化工大学 一种可循环使用的用于检测微囊藻毒素的荧光传感器及其应用方法
WO2018017828A1 (en) * 2016-07-21 2018-01-25 Jason Dexter Biocatalyst comprising photoautotrophic organisms producing recombinant enzyme for degradation of harmful algal bloom toxins
CN109696430A (zh) * 2019-03-01 2019-04-30 长江师范学院 一种测定微囊藻毒素浓度的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103113877A (zh) * 2013-01-11 2013-05-22 长春理工大学 一种检测水中微囊藻毒素-lr的荧光探针
CN103804590A (zh) * 2013-12-19 2014-05-21 沈阳药科大学 一种dna水凝胶及其在过氧化物检测中的应用
CN103983777A (zh) * 2014-05-07 2014-08-13 大连理工大学 一种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色检测方法
CN105784995A (zh) * 2016-02-25 2016-07-20 厦门大学 Dna智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素b1的方法
WO2018017828A1 (en) * 2016-07-21 2018-01-25 Jason Dexter Biocatalyst comprising photoautotrophic organisms producing recombinant enzyme for degradation of harmful algal bloom toxins
CN106370868A (zh) * 2016-09-23 2017-02-01 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的spr传感器及其制备方法和应用
CN106525796A (zh) * 2016-11-08 2017-03-22 北京化工大学 一种可循环使用的用于检测微囊藻毒素的荧光传感器及其应用方法
CN109696430A (zh) * 2019-03-01 2019-04-30 长江师范学院 一种测定微囊藻毒素浓度的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FANGFANG WANG ET AL.: ""Colorimetric detection of microcystin-LR based on disassembly of orient-aggregated gold nanoparticle dimers"", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
PIAN WU ET AL.: ""One-pot synthesized Cu/Au/Pt trimetallic nanoparticles as a novel enzyme mimic for biosensing applications"", 《RSC ADVANCES》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111793239A (zh) * 2020-07-20 2020-10-20 南开大学 一种具有大孔结构的高强度dna水凝胶的制备方法
CN111793239B (zh) * 2020-07-20 2022-11-04 南开大学 一种具有大孔结构的高强度dna水凝胶的制备方法
CN113311161A (zh) * 2021-04-14 2021-08-27 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒
CN113311161B (zh) * 2021-04-14 2023-12-22 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒
CN113267529A (zh) * 2021-05-12 2021-08-17 江西师范大学 一种温度型生物传感器及利用温度型生物传感器检测目标适体的方法
CN113267529B (zh) * 2021-05-12 2022-10-25 江西师范大学 一种温度型生物传感器及利用温度型生物传感器检测目标适体的方法
CN114236124A (zh) * 2021-12-16 2022-03-25 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒
CN114236124B (zh) * 2021-12-16 2023-06-09 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种基于等温扩增和Cas14a双重放大的检测肌酸激酶同工酶的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020101877A4 (en) 2020-09-24
CN111298836B (zh) 2023-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111298836B (zh) 一种基于生物模拟酶信号放大的dna水凝胶及其应用
CN104007092B (zh) 一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法
CN113789366B (zh) CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其制备方法和应用
Croué et al. Characterization and copper binding of humic and nonhumic organic matter isolated from the South Platte River: evidence for the presence of nitrogenous binding site
Klotzbach et al. Effects of hydrophobic modification of chitosan and Nafion on transport properties, ion-exchange capacities, and enzyme immobilization
CN111286526B (zh) 一种荧光检测信号放大体系
Wu et al. Cu/Au/Pt trimetallic nanoparticles coated with DNA hydrogel as target-responsive and signal-amplification material for sensitive detection of microcystin-LR
Saam et al. O2 reactivity of flavoproteins: dynamic access of dioxygen to the active site and role of a H+ relay system in D-amino acid oxidase
CN105132524A (zh) ExoIII辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应用于Hg2+检测
Sode et al. Construction of a molecular imprinting catalyst using target analogue template and its application for an amperometric fructosylamine sensor
CN109092364A (zh) 一种铜金属有机骨架模拟酶材料及其制备与应用
Zhu et al. Smartphone-assisted bioenzyme-nanozyme-chromogen all-in-one test strip with enhanced cascade signal amplification for convenient paraoxon sensing
WO1988000339A1 (en) Oxygen concentration probe
CN111118111A (zh) 一种葡萄糖的快速检测方法
WO2017155172A1 (ko) 콜레스테롤 검출용 탄소 점-헤모글로빈 복합체
Luo et al. Manipulation of the bioactivity of glucose oxidase via raft‐controlled surface modification
Lee et al. One-Pot electrochemical fabrication of high performance amperometric enzymatic biosensors using polypyrrole and polydopamine
Wang et al. A sensing platform for on-site detection of glutathione S-transferase using oxidized Pi@ Ce-doped Zr-based metal-organic frameworks (MOFs)
Fazrin et al. The Selectivity and Stability of Epithelial Sodium Channel (ENaC) Aptamer as an Electrochemical Biosensor
CN112316492A (zh) 可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法
Sato et al. Functional monomers and polymers. XXXV. Oxidation of hydroquinone catalyzed by Cu (II)–polyelectrolyte complexes
US7232861B2 (en) Enzyme-mimicking polymers
CN108241012A (zh) 基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法及其应用
Ozoner et al. Enzyme based phenol biosensors
CN107356588A (zh) 一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant